Summary
Desthiobiotin labeling van een synthetische 25-nucleotide RNA oligo, die een motief adenine-rijke element (ARE) bevat, kunt specifieke binding van cytosolische ARE-bindend-proteïne.
Abstract
De in vitro RNA-pulldown is nog steeds grotendeels gebruikt in de eerste stappen van de protocollen die zijn gericht op het identificeren van RNA-bindende proteïnen die specifieke RNA structuren en motieven herkennen. In dit protocol van RNA-pulldown, commercieel gesynthetiseerde sondes van RNA worden aangeduid met een gewijzigde vorm van biotine, desthiobiotin, aan de 3'-eindpunt van de RNA-strand, dat omkeerbaar bindt aan streptavidine en dus kunt elutie van eiwitten onder meer fysiologische voorwaarden. Het RNA-desthiobiotin is geïmmobiliseerd door middel van interactie met daar op magnetische kralen, die worden gebruikt voor pull-down eiwitten die specifiek interactie met de RNA van belang. Niet-gedenatureerd en actieve eiwitten uit de cytosolische afvalfractie mesothelioom cellen worden gebruikt als de bron van eiwitten. De hier beschreven methode kan worden toegepast om de interactie tussen bekende RNA-bindende proteïnen en een 25-nucleotide (nt) lang RNA sonde met een opeenvolging van belang te detecteren. Dit is handig voor het voltooien van de functionele karakterisering van stabiliseren of destabiliserende elementen aanwezig zijn in de molecules van RNA bereikt met behulp van een verslaggever vector assay.
Introduction
Genexpressie en het uiteindelijke niveau van het gen-product kunnen worden strak geregeld beïnvloeden het mRNA stabiliteits- en mRNA vertaling tarief1. Deze post-transcriptional regulerende mechanismen worden uitgeoefend door de interacties van niet-coderende RNA en/of RNA-bindende eiwitten (RBPs) met gerichte mRNA. Het is meestal de 3' niet-vertaalde regio van mRNA (3' UTR - die behoren tot de niet-coderende deel van het genoom2) waarin specifieke cis-regelgevende elementen (CRE), die worden erkend door trans-factoren zoals miRNA of RBPs handelen 3. de best bestudeerde cis-element binnen de 3' UTR, is het motief van adenine-rijke element (ARE), dat wordt erkend door specifieke AU-bindende proteïnen (AUBP), en, op zijn beurt, induceert ofwel mRNA afbraak/deadenylation (zijn-gemedieerde verval) of mRNA stabilisatie4.
De grootte van de 3-' UTR van calretinin is mRNA (CALB2) 573 bp lang en bevat een vermeende AUUUA pentamer, zoals voorspeld door AREsite2, een bioinformatic gereedschap5. In overeenstemming met de aanwezigheid van een vermeende zijn motief, de bepaling van de vector-reporter pmirGLO aangetoond de rol van een stabilisatie van dit element binnen CALB2 mRNA6. Ten slotte de in vitro RNA-pulldown werd gebruikt voor het identificeren van de AUBP die calretinin stabiliseert mRNA via het motief zijn.
Aangezien alle niet-coderende RNAs interactie met eiwitten7, is de in vitro RNA-pulldown een goede manier en een eerste-van-keuze assay voor het identificeren van RNA-interactors om te helpen bij het ontcijferen van de moleculaire mechanismen. Bij deze methode RNA-pulldown werden commercieel gesynthetiseerde RNA sondes, die waren gelabeld met een gewijzigde vorm van Biotine (desthiobiotin) in het terminus 3' van de streng RNA, gebruikt. Het RNA-desthiobiotin is geïmmobiliseerd door middel van interactie met daar op magnetische kralen, die worden gebruikt voor pull-down eiwitten die specifiek interactie met de gebonden-RNA van belang. Niet-gedenatureerd en actieve eiwitten uit de cytosolische afvalfractie mesothelioom cellen worden gebruikt als de bron van eiwitten. Dergelijke RNA-afhankelijke eiwitten worden van de magnetische kralen, uitgevoerd door een 12% SDS-pagina gel, overgebracht naar een membraan en peilden met verschillende antilichamen geëlueerd.
Volgens de standaard streptavidine-Biotine affiniteit zuivering, harde denaturatie voorwaarden moet worden voldaan aan het verstoren van de sterke onomkeerbare Biotine-streptavidine bond om elueer de afhankelijke eiwitten8, kan leiden tot de dissociatie van eiwitcomplexen. In tegenstelling tot biotine, desthiobiotin omkeerbaar bindt aan streptavidine en concurrerend wordt verplaatst met een gebufferde oplossing van biotine, rekening houdend met de zachte elutie van eiwitten, en het vermijden van het isolement van natuurlijk biotinyleerd moleculen9, suggereren dat de techniek ideaal is voor het isoleren van inheemse eiwitcomplexen inheemse omstandigheden.
In vitro bindende voorwaarden en striktheid, die worden bepaald door de zoutconcentratie, reductoren en wasmiddel percentage, moet dicht bij de aanwezigen in het cellulaire kader teneinde waar in vivo interacties. De bindende voorwaarden hierin geïmplementeerd hebben eerder aangetoond zo geschikt is voor de identificatie van de HuR als een AU-bindende eiwit10. Deze aanpak bespaart tijd, omdat optimalisatie van goede bindende voorwaarden kan tijdrovend en uitdagend. Bovendien, deze methode kan worden gebruikt als een startende protocol voor elke RNA-pulldown experiment en geleidelijk kan worden geoptimaliseerd door het veranderen van de concentratie van zouten en detergenten, het wijzigen van het percentage glycerol en andere zouten toe te voegen. Bovendien, we laten zien dat zelfs een korte 25-nucleotide RNA-sonde herbergen een pentamer zijn-motief kan worden gebruikt om aan te tonen van de interactie met een specifieke AUBP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bereiding van cytosolische en nucleaire eiwitoplossing
- Plaat 4 x 106 ACC-MESO-4 cellen in een kolf met cel cultuur van T150 is gegroeid in RPMI - 1640 medium aangevuld met 10% FBS, 1 x penicilline/streptomycine (100 x) en 2 mM L-Glutamine (200 mM). Wanneer cellen bereikt een samenvloeiing van 80-90% (~5-5.5 x 106 cellen), gaat u verder met eiwit extractie van nucleaire en cytosolische breuk.
Opmerking: ACC-MESO-4 cellijn is verkregen uit de RIKEN BioResource centrum11. - Gecombineerd medium, wassen van de cellen door toevoeging van 15 mL 1 x PBS, tilt de plaat zachtjes een paar keer en de PBS 1 x gecombineerd. Voeg 3 mL van 0,25% trypsine-EDTA en de kolf van de cultuur bij 37 ° C gedurende 3 minuten uit te broeden.
Opmerking: Kijk naar de cellen onder de Microscoop voor detachement; Als nog steeds verbonden kraan de kolf tegen de palm van een hand 3 keer. - Voeg 7 mL van RPMI-1640 medium aangevuld met 10% FBS, 1 x penicilline/streptomycine (100 x) en 2 mM L-Glutamine (200 mM), het verzamelen van de cellen in een tube van 15 mL en spin down bij 200 x g gedurende 5 min.
- Medium gecombineerd en resuspendeer de pellet cel met 1,5 mL 1 x PBS, dan breng van de cellen in een tube van 1,5 mL microcentrifuge. Spin down bij 500 x g en 4 ° C gedurende 5 min. negeren het supernatant.
Opmerking: Deze stap vanaf alle centrifugeren stappen bij 4 ° C en houden alle reagentia op ijs. - Resuspendeer de pellet cel met ijskoude 1,5 mL 1 x PBS en draai naar beneden de cellen bij 500 x g en 4 ° C voor 3 min. Verwijder het supernatant.
Opmerking: De vereiste hoeveelheid CER I, CER II en NER reagentia zijn 10, 0,55 en 5 volumes van geschatte cel pellet vol volume, respectievelijk; het volgende protocol wordt ervan uitgegaan dat een volume van 20 µL. Het is raadzaam alleen de benodigde hoeveelheid reagens CER voorbereiding ik. - Voeg 200 µL van ijskoude cytoplasmatische extractie reagens (CER ik) aangevuld met 2 µL 1 x proteïnase inhibitor van de omwenteling, bijvoorbeeldverdunnen 1 tablet van Protease Inhibitor (EDTA-free) in 500 µL van water te verkrijgen van 100 x voorraad. Deze hoeveelheid reagens CER ik volstaat lyse 20 µL van een cel pellet verpakt volume.
- Schatten van het volume van de pellet verpakt cel te vergelijken van de buis met de cel pellet met een 1,5 mL-buis gevuld met 10, 20, 50 of 100 µL van 1 x PBS.
- Resuspendeer de pellet cel door krachtig vortexing de buis voor 15 s en Incubeer de buis op ijs voor 10 min. 11 toevoegen µL van ijskoude cytoplasmatische extractie reagens II (CER II) aan de buis, krachtig vortex voor 5 s, en Incubeer 1 min op ijs.
- Vortex krachtig gedurende 5 s en centrifuge de buis op 16.000 x g- en 4 ° C gedurende 5 min. overbrengen in het supernatant de schone vooraf gekoeld buis op ijs. De bovendrijvende substantie is de cytoplasmatische fractie die zich verder in het RNA-pulldown experiment gebruikt.
- Resuspendeer de resterende pellet in 100 µL van ijskoude nucleaire extractie reagens (NER) aangevuld met 1 µL van proteïnase inhibitor (100 x) en krachtig vortex voor 15 s. Het is raadzaam om alleen de benodigde hoeveelheid NER reagens aangevuld met proteaseinhibitors voorbereiden.
- Incubeer het monster op ijs gedurende 40 minuten met de occasionele vortexing voor 15 s (elke 10 min).
- Centrifugeer de buis bij 16.000 x g gedurende 10 min. overdracht het supernatant (dit is de nucleaire eiwitoplossing) tot een schone vooraf gekoeld koker.
- Onmiddellijk gaan door het meten van de eiwitconcentratie met behulp van de methode bicinchoninic (BCA) (Zie Tabel van materialen). Uitvoeren om te controleren voor eiwit zuiverheid van elke fractie, immunoblotting (Figuur 1) tegen α-tubuline (positieve detectie alleen in de cytosolische breuk) en Poly ADP-ribose polymerase - PARP (positieve detectie alleen in de nucleaire Fractie). Raadpleeg voor eiwit visualisatie, sectie 4.
- Voorbereiden om te houden van de activiteit van het eiwit en hun geboortestaat, 25 µL van aliquots van cytosolische en nucleaire extracten. Module-freeze deze aliquots door ze te plaatsen in vloeibare stikstof voor 5 s en winkel direct bij-80 ° C.
2. etikettering van RNA met Desthiobiotin
- Sondes van RNA commercieel gesynthetiseerd en HPLC gezuiverd. Resuspendeer met nuclease-gratis water op 10 µM.
Let op: Sonde sequenties zijn vermeld in tabel 1. - Gebruik 50 pmol van RNA per RNA-pulldown reactie. Ontdooien en houden alle reagentia op ijs behalve voor PEG 30%, label 3' eindpunt van RNA oligo gewend.
- Breng 5 µL van 10 µM RNA sondes, aangeduid als CALB2 3' UTR (ARE), CALB2 3' UTR (mtARE), en Unrelated-RNA (IRE), in 0,5 mL dun-muur microcentrifuge buizen en broeden in een PCR machine bij 85 ° C voor 5 min. onmiddellijk op ijs de buisjes plaatsen.
Opmerking: Deze stap is belangrijk, zoals het bevordert de ontspanning en de toegankelijkheid van de RNA-sonde voor het labelen. - Voor een enkele 30 µL reactie, toevoegen aan de buis RNA-bevattende de volgende 10 µL-mix: 3 µL van nuclease gratis water, 3 µL van 10 x RNA Ligase reactie Buffer, 1 µL van RNase remmer (40 U/µL), 1 µL van Desthiobiotinylated cytosinetrifosfaat difosfaat (1 mM) , en 2 µL van T4 RNA ligase (20 U/µL).
Opmerking: Master mix A om voor te bereiden 3 monsters in overmaat (3.2), meng 9.6 µL van nuclease gratis water, 9.6 µL van 10 x RNA Ligase reactie Buffer, 3.2 µL van RNase remmer (40 U/µL), 3.2 µL van Desthiobiotinylated cytosinetrifosfaat difosfaat (1 mM) en 6,4 µL van T4 RNA ligase (20 U/µL). - Voeg zorgvuldig 15 µL van PEG 30% voor de reactie. Gebruik een andere tip om te mengen van de reactie. Incubeer de reactie 's nachts bij 16 ° C.
- De volgende dag, bereiden de volgende: 5 M NaCl (vers/nuclease-vrij), chloroform: Isoamylalcohol in 24:1-verhouding (b.v.per reactie - 96 µL chloroform en 4 µL van Isoamylalcohol), ijskoude 100% ethanol en ijskoude 70% ethanol.
- Voeg 70 µL nuclease-vrij water aan het RNA-labeling reactie buizen. Voeg 100 µL van chloroform: isoamyl alcohol en vortex kort. Spin-down op 13.000 x g voor 3 min. zorgvuldig verwijderen alleen de bovenste fase en overdracht aan een nieuwe 1,5 mL nuclease-gratis buis; Raak de lagere fase.
- Voeg 10 µL van 5 M NaCl, 1 µL van glycogeen en 300 µL van ijskoude 100% ethanol. Plaats de buis bij-20 ° C gedurende 2 uur.
Opmerking: Bij deze stap, het experiment kan worden voortgezet op de volgende dag. - Centrifugeer bij 13.000 x g en 4 ° C gedurende 15 min. Verwijder zorgvuldig het supernatant zonder de pellet te verstoren. Voeg 300 µL van ijskoude 70% ethanol en Centrifugeer nogmaals op 13.000 x g en 4 ° C gedurende 5 min.
- Verwijder het supernatant volledig en drogen van de pellet (15 min). Resuspendeer de pellet in 20 µL van nuclease-gratis water.
Opmerking: Ga verder met RNA-pulldown op dezelfde dag. - Incubeer de RNA bij 90 ° C gedurende 2 minuten en plaats op ijs. Plaats de geëtiketteerd-RNA op ijs tijdens de volgende stap van voorwassen van de magnetische kralen van daar.
Opmerking: Een langere incubatietijd kan schade aan de RNA-sonde.
3. RNA-eiwit Pulldown
-
Voorwassen daar-magnetische kralen en incubatie met desthiobiotin-RNA
- Gebruik 50 µL van de magnetische kralen daar per 50 pmol RNA. Dit moet echter worden geoptimaliseerd afhankelijk van het experiment.
- Vortex de buis met streptavidine-magnetische kralen voor 15 s, en snel verwijderen 200 µL (master mix; genoeg voor 3 + 1 reacties) in een schone 1,5 mL safe-lock buis met behulp van knippen Pipetteer tips. Plaats de buis op een magnetische staan zodat de kralen aan de kant van de buis verzamelen en 1 min. verwijderen de resuspensie vloeistof wacht.
- Wassen van de kralen, verwijderen van de buis van de magnetische stand, Voeg 400 µL van 0,1 M NaOH, 0,05 M NaCl-oplossing en zachtjes Pipetteer op en neer meerdere malen. Plaats de buis terug op de magnetische stand. 1 min wachten en de bovendrijvende substantie te verzamelen. Herhaal deze stap opnieuw.
- Wassen van de kralen met 200 µL van 100 mM NaCl. Verwijder het supernatant.
- Voeg 200 µL van 20 mM Tris (pH 7.5), resuspendeer kralen door pipetteren, plaats de buis op de magnetische stand, 1 min wachten en de bovendrijvende vloeistof verwijderen. Herhaal de stap.
- Verwijderen van de buis van de magnetische stand, voeg 200 µL 1 x RNA opnamebuffer en resuspendeer daar magnetische kralen door kort vortexing. Verwijder 50 µL van daar magnetische kralen en voeg aan elke label-RNA-buis met behulp van een gesneden pipette uiteinde. Incubeer de buizen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur op een roller.
-
Binding van eiwitten naar RNA
- Plaatsen van de buizen in een magnetische stand 1 min wachten en de bovendrijvende vloeistof verwijderen.
- 50 µL van 20 mM Tris (pH 7.5) toevoegen aan de kralen en resuspendeer door pipetteren. Plaatsen van de buizen in een magnetische standaard en 1 min wachten bovendrijvende vloeistof verwijderen. Herhaal deze stap.
- Voeg 100 µL van 1 x eiwit-RNA-bindende buffer naar de kralen en resuspendeer door pipetteren.
- In de tussentijd bereidt de volgende mix: 10 µL van 10 x eiwit-RNA-bindende buffer, 30 µL 50% glycerol, 50 µg van cytoplasmatische proteïnen, en nuclease-gratis water maximaal 100 µL.
Opmerking: Voorbereiden master mix B 3 monsters in overmaat (3.3) als volgt: 33 µL van 10 x eiwit-RNA-bindende buffer, 99 µL 50% glycerol, 165 µg cytoplasmatische eiwitten en nuclease-gratis water tot 330 µL. Houd de buis van master mix B op ijs. - Plaats de buizen in magnetische stand, 1 min wachten en het supernatant verzamelen. Voeg 100 µL van master mix B, resuspendeer door zachtjes op en neer pipetteren en voorkomen dat er bubbels. Incubeer reactie buizen voor 60 min bij 4 ° C op een roller.
-
Wassen en elutie
- Plaatsen van de buizen in een magnetische stand, verzamelen het supernatant (die stroom door - FT) en breng kwantitatief over in een nieuwe buis.
Opmerking: Houd deze FT op ijs voor een latere anayse. - Pipetteer 100 µL van het 1 x wassen buffer op de parels, resuspendeer zachtjes terug te zetten in de magnetische standaard, 1 min wachten en de vloeistof wordt weggeworpen. Herhaal deze stap 2 keer.
- Voeg 40 µL van elutie Buffer naar de magnetische kralen, Meng door omhoog en omlaag pipetteren en Incubeer bij 37 ° C op een buis shaker (950 rpm) voor 30 min.
- Plaatsen van de buizen in een magnetische stand 1 min wachten en geëlueerd monster (oftewel eluaat - E) verzameld. Plaatsen op ijs en gebruiken van downstream-analyse.
Opmerking: Bij deze stap elke geteste RNA-sonde bestaat uit een doorstroomtest (FT) en een monster van het eluaat (E).
- Plaatsen van de buizen in een magnetische stand, verzamelen het supernatant (die stroom door - FT) en breng kwantitatief over in een nieuwe buis.
4. polyacrylamide de elektroforese en westerse analyse van de vlek
Opmerking: Zie tabel 2 voor recepten voor de buffers gebruikt in deze sectie. Uitvoeren van een Western blot volgens de Laemmli methode12.
- Handcast 12% SDS-pagina gelen (10-wells, 1.5 mm spacer, 66 µL). Bereiden van een lopend gel-mix: 4 mL van de stockoplossing 30% acrylamide-bisacrylamide, 2.4 mL van lagere Tris buffer, 3.2 milliliters dH2O, 9.6 µL van TEMED, 96 µL van 10% ammoniumnitraat persulfate oplossing (APS). Bereiden van stapelen gel mix: 3,25 milliliters dH2O, 0,5 mL van 30% acrylamide - bisacrylamide stockoplossing, 1.3 milliliters bovenste Tris buffer, 10 µL van TEMED, 20 µL van 10% APS.
- Voeg 16.6 µL van 6 x Laemmli buffer (b.v.14 mL Tris/HCl/SDS pH 6.8 (bovenste Tris buffer), 2 g van SDS, 1,86 g van DTT, 6 mL glycerol en 0,012% bromophenol blauw; opgeslagen bij-20 ° C) in het monster FT en 6,6 µL van 6 x Laemmli buffer in E monster. Incubeer monsters gedurende 5 minuten bij 95 ° C.
- Laden van de monsters (20 µL van FT en geheel Elueer ~ 40 µL) en ze gedurende 30 minuten bij 60 V, verdergaat met 20 V's nachts uitvoeren.
- Met behulp van een semi-droge electroblotting systeem, overdracht van eiwitten op een membraan PVDF voor 80 min op 15 V.
Opmerking: Het membraan PVDF moet worden geactiveerd alvorens eiwit overdracht uit te voeren. Incubeer de membraan in 100% methanol voor 1 min, gevolgd door een 2 min incubatie in ultrazuiver water. - Incubeer de SDS-pagina gel met Coomassie oplossing voor 3 h, gevolgd door de drie stappen van het wassen met ultrazuiver water, elke 30 min na de overdracht eiwit.
- Aan het einde van eiwit overdracht, laat het membraan van de PVDF drogen voor 1 h. activeren het membraan zoals aangegeven in stap 4.5. Het blokkeren van het membraan 1 h met 5% BSA in 1 x TTBS.
- Incubeer het membraan met het eerste antilichaam: HuR of mesothelin, beide verdund 1:1000 in 5% BSA in 1 x TTBS voor 4 uur bij kamertemperatuur of 's nachts bij 4 ° C.
- Wassen van het membraan driemaal gedurende 7 minuten in 1 x TTBS, en broeden met konijn anti-muis horseradish peroxidase (HRP)-geconjugeerd secundair antilichaam verdund 1:10,000 in 5% BSA, 1 x TTBS.
- Visualiseren van eiwitten met behulp van Verbeterde Chemiluminescentie en een digital imager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In dit experiment, was een lang fragment van 25-nt calretinin 3' UTR herbergen zijn motief (CALB2 3' UTR (ARE) 25-nt) gebruikt om te testen of het bindt specifiek aan de mens-antigeen R (HuR) eiwit, een bekende mRNA-stabilisator. Als u wilt testen van de specificiteit van het zijn element, een 25-nt-RNA was sonde CALB2 3' UTR (mtARE) met een mutatie zijn-motief, die eerder af te schaffen het stabilisatie-effect van het zijn motief werd getoond, gebruikte6. De derde RNA probe vertegenwoordigt de negatieve controle, die een 28-nt is niet verwant RNA dat het welomschreven ijzer-responsief element (niet-verbonden RNA (IRE)), bekend om het binden van cytosolische ijzer-responsieve eiwit13,14bevat. Aangezien HuR voornamelijk gelokaliseerd binnen de nucleus maar functies als mRNA-stabilisator in het cytosol15 wordt, werd nucleaire/cytosolische extractie uitgevoerd om te verkrijgen actieve eiwitten uit het cytosol.
Om aan te tonen van de zuiverheid van de nucleaire/cytosolische breuken, werden eiwitten geanalyseerd door westelijke vlek, waaruit bleek dat α-tubuline was alleen gedetecteerd in de cytosolische Fractie, overwegende dat PARP eiwit werd ontdekt slechts in de nucleaire breuk, als verwachte ( Figuur 1). Het eluaat uit de CALB2 3' UTR ARE-sonde aangetoond binding van HuR overwegende dat HuR afwezig was in het eluaat uit de mutant sonde CALB 3' UTR (mtARE). HuR was ook afwezig in het eluaat uit de niet-verbonden RNA sonde die het ijzer-responsieve eiwit (figuur 2A bindt). Om aan te tonen verder de specificiteit tussen de CALB 3' UTR (ARE) en HuR, was het membraan bovendien gesondeerd met anti-mesothelin (MSLN) antilichaam, zoals dit eiwit niet met RNA communiceert. Eluaten van alle drie monsters bleek geen aanwezigheid van mesothelin. Samen genomen, dit geeft aan dat het stabiliserende zijn motief binnen CALB2 3' UTR HuR eiwit specifiek kunt binden.
Coomassie kleuring van de gel (figuur 2B) toont aan dat gelijke hoeveelheden eiwitten werden gebruikt om het broeden met de drie verschillende sondes van RNA. Vanwege de lage hoeveelheid cytosolische extract gebruikt en overdracht aan het membraan, deed deze kleuring niet voldoende zijn voor detectie van eiwitten in het eluaat (E) rijstroken, die anders werden ontdekt door westelijke vlekkenanalyse.
Figuur 1: westelijke vlekkenanalyse van 5 µg van cytosolische en nucleaire eiwitoplossing. PARP eiwit is aanwezig in de nucleaire fractie (N) maar afwezig in de cytosolische (C) breuk. Α-tubuline is aanwezig in de cytosolische fractie (C) maar afwezig in de nucleaire breuk (N). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: westelijke vlek toont dat HuR wordt gevangen door 25-nt CALB2 3' UTR (ARE). A) FT: doorstromen na incubatie met RNA sonde; E: eiwitten geëlueerd na incubatie en binding met RNA sondes. Sondes: CALB2 3' UTR (mtARE) - 25-nt fragment van calretinin 3' UTR waarin 3 gemuteerde nucleotiden binnen het motief zijn; UR RNA (IRE) - 28-nt RNA sonde met een welomschreven ijzer-responsief element dat de ijzer-responsieve eiwitten bindt. Het membraan was verder gesondeerd voor mesothelin (MSLN), een eiwit dat niet met RNA communiceert. B) Coomassie kleuring van de gel na eiwit overdracht, aan te tonen dat gelijke hoeveelheden eiwitten werden geïncubeerd met RNA sondes. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| RNA sonde | Volgorde | Concentratie |
| CALB2 3' UTR (zijn) 25nt | UCGCUGUAUGAUUUAGGCUUCUAUG | 10 ΜM |
| CALB2 3' UTR (mtARE) 25nt | UCGCUGUAUGGUCUGGGCUUCUAUG | 10 ΜM |
| Los van de RNA - IRE 28nt | UCCUGCUUCAACAGUGCUUGGACGGAAC | 10 ΜM |
Tabel 1 : Sequenties van RNA probes
| Lagere Tris buffer voor het uitvoeren van gel | |
| 1.5 M | Tris-Base |
| 0,40% | SDS oplossing |
| addjust pH 8,8 met behulp van HCL (6 mol/L) | |
| opvullen met | dH2O |
| Bovenste Tris voor stapelen gel SDS-pagina | |
| 500 mM | Tris-base |
| 0,4% | SDS oplossing |
| Breng pH op 6,8 met behulp van HCL (6 mol/L) | |
| opvullen met | dH2O |
| 10 x uitvoeren buffer | |
| 250 mM | Tris-base |
| 1.92 M | Glycine |
| Breng de pH aan met behulp van HCL 8.3 (6 mol/L) | |
| opvullen met | dH2O |
| Filter of autoclaaf en winkel bij 4° C | |
| 1 X uitgevoerd buffer | |
| 100 mL | 10 x uitvoeren buffer |
| 0,05% | SDS oplossing |
| Vul aan tot 1 liter met | dH2O |
| 10 x overdracht Buffer | |
| 480 mM | Tris-base |
| 390 mM | Glycine |
| 0,38 procent | SDS oplossing |
| opvullen met | dH2O |
| Opmerking: 0.22 um filteren en bewaren bij 4 ° C | |
| 1 X Transfer buffer (voor een semi-droog systeem) | |
| 20 mL | 10 x overdracht Buffer |
| 40 mL | methanol |
| Vul aan tot 200 mL | dH20 |
| 10 X TBS (Tris-gebufferde zoutoplossing) | |
| 250 mM | Tris-base |
| 1.36 M | NaCl |
| 27 mM | KCl |
| Breng de pH aan 7.4 | |
| opvullen met | dH2O |
| Filter | |
| 1 X TTBS (Tris-buffer zoutoplossing met 0,1 Tween-20) | |
| 1 X | 10 X TBS |
| 0,10% | Tween-20 |
| opvullen met | dH2O |
| RNA opnamebuffer (1 X) | |
| 20 mM | Tris (pH 7.5) |
| 1 M | NaCl |
| 1 mM | EDTA |
| Eiwit-RNA-bindende Buffer (10 x) | |
| 200 mM | Tris (pH 7.5) |
| 500 mM | NaCl |
| 20 mM | MgCl2 |
| 1% | Tween-20 |
| Wassen van de Buffer (1 x) | |
| 20 mM | Tris (pH 7.5) |
| 10 mM | NaCl |
| 0,1% | Tween-20 |
| Elutie Buffer | |
| 4 mM | Biotine |
| 20 mM | Tris (pH 7.5) |
| 50 mM | NaCl |
| Coomassie oplossing | |
| 0,02% | Coomassie G-250 |
| 5% | Aluminiumsulfate-(14-18)-hydraat |
| 10% | EtOH |
| 2% | Orthofosforzuur |
Tabel 2: Recepten
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
3' UTRs behoren tot de niet-coderende genoom3, en alle niet-coderende RNAs kunnen communiceren met eiwitten om te oefenen hun functie7. Wanneer het genoom van zoogdieren bleek te worden pervasively getranscribeerd en een aanzienlijk deel van lang noncoding RNAs16geproduceerd, opkomende bewijzen aangetoond dat deze lange-noncoding RNAs functioneren bij de regulering van de expressie van genen zoals ze met interageren chromatine-remodeling complexen17. Deze kennis werd opgedaan door gebruik te maken van de RNA-pulldown assay. Dus, om te beginnen het ontcijferen van de interactors van een specifieke RNA, de eerste stap zou zijn in vitro biochemische tests zoals RNA-pulldown, als simpel uit te voeren.
Van de nota speelt niet alleen de volgorde motieven, maar ook de secundaire structuur van RNA een cruciale rol in de functionaliteit van het RNA als zij vormen domeinen essentieel voor interactie met eiwitten. De secundaire structuur kan variëren in fysiologische en in vitro voorwaarden, en RNA-pulldown kan leiden tot de identificatie van falsepositives. Bijvoorbeeld, RNA-pulldown EZH2, een onderdeel van de polycomb repressieve complexe 2 (PRC2), geïdentificeerd als een interactor van X inactief specifieke transcript (Xist)18, overwegende dat een recente studie die antisense RNA-zuivering gebruikt in combinatie met massa spectrometrie (RAP-MS) geïdentificeerd andere interactors zoals SHARP (SMRT en HDAC gekoppeld onderdrukker eiwit), SAF-1 (steiger bijlage factor A) en LBR (triplex B receptor)19. Daarom, als geen andere functionele tests de interactie tussen een RNA en een bepaalde proteïne ondersteunt, bevindingen moeten worden verder aangevuld met een aanvullende eiwit-centric aanpak, zoals immunoprecipitating de bepaalde eiwitten, gevolgd door extractie en karakterisatie van de afhankelijke RNA.
De hierin protocol gepresenteerd heeft geweest tweedehands voor speurder HuR binding met het motief zijn in CALB2 3' UTR, die eerder functioneel door pmiRGLO-luciferase assay6 gekenmerkt had. Vanwege de kleine hoeveelheid eiwitten is dit protocol niet geschikt voor downstream analyse zoals massa-spectrometrie waar grotere hoeveelheden eiwit nodig zijn. In plaats daarvan kan het protocol worden gebruikt voor het valideren van de RNA-interactors geïdentificeerd door massaspectrometrie, maar met behulp van een aanzienlijk lager bedrag van eiwitten.
Aangezien de methode werken met RNA, die gevoelig voor aantasting omvat is, is het raadzaam de reiniging van de werkende oppervlakken met een oplossing van RNase-decontaminatie naast standaard goede laboratoriumpraktijken. Indien mogelijk, voorbereiding van RNA labeling en zuivering onder laminaire flow uit te voeren. De zuiverheid van de RNA-oligo kan ook invloed hebben op de bindende voorwaarden; Daardoor waren de commercieel gesynthetiseerde sondes HPLC gezuiverd. Als gewijzigd, langer en uiterst zuivere RNA oligos zijn vereist, pagina zuivering methode gebruiken. Bereiden aliquots van inheemse proteïnen door breuk bevriezing, dus vermijden beschadigen van eiwitten als gevolg van de trage bevriezing aanpak en herhaalde bevriezen en ontdooien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de Zwitserse National Science Foundation Sinergia grant CRSII3 147697, de Stiftung für Angewandte Krebsforschung en Zürich Krebsliga.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NE-PER Nuclear and cytoplasmic extraction kit | Thermo Fisher Scientific | 78833 | |
| Pierce Protease Inhibitor Tablets, EDTA-free | Thermo Fisher Scientific | A32965 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit | Thermo Fisher Scientific | 20164 | Includes magnetic beads and therefore the kit need to be stored at 4 °C |
| Pierce RNA 3’ End Desthiobiotinylation Kit | Thermo Fisher Scientific | 20163 | The kit is a part of the "Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit", and needs to be stored at -20 °C unlike the pull-down kit (4 °C). |
| DynaMag-2, magnetic stand | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Anti - HuR (MOUSE) monoclonal antibody | Thermo Fisher Scientific | - | The antibody is included in the Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit - 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS |
| Anti - α - tubulin (MOUSE) monoclonal antibody | Santa Cruz | 8035 | 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS |
| Anti - PARP (RABBIT) Polyclonal antibody | Cell Signaling | 9542 | 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - goat anti-rabbit secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS |
| Anti - Mesothelin (MOUSE) Monoclonal Antibody | Rockland | 200-301-A87 | |
| Secondary goat anti-rabbit antibody | Cell Signaling | 7074 | |
| Secondary rabbit anti-mouse antibody | Sigma-Aldrich | A-9044 | |
| RPMI - 1640 medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| FBS - Filtrated Bovine Serum | Pan Biotech | P40-37500 | |
| Penicillin - streptomycin (100x) | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| L-Glutamine solution (200 mM) | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco by Life technologies | 25200-056 | |
| Mini-PROTEAN 3 Cell | Bio-Rad | 1653301 | |
| Mini Protean System Glass Plates | Bio-Rad | 1653308 | |
| Mini-PROTEAN Spacer Plates with 1.5 mm integrated spacer | Bio-Rad | 1653312 | |
| Mini-PROTEAN Comb, 10-well, 1.5 mm, 66 µL | Bio-Rad | 1653365 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Modules | Bio-Rad | 1658050 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
| Rotiphorese gel 30 - aqueous 30% acrylamide and bisacrylamide stock solution at a ration of 37.5:1 | Roth | 3029 | |
| 20% SDS | PanReac AppliChem | A3942 | |
| PVDF transfer membrane | Perkin Elmer | NEF1002 | Need to be activated by incubating in pure methanol for 1 min followed by washing in water for 2 min |
| Trans-Blot SD semi-dry transfer cell | Bio-Rad | 1703940 | |
| Clarity Western ECL Substrate | Bio-Rad | 1705061 | |
| FusionFX Digital Imager | Vilber | - | |
| RNA oligo synthesis | Mycrosynth AG, Switzerland | - | the synthesis scale - 0.04 µmol - HPLC purified |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Hydrochloric Acid (HCl) 6 M | PanReac AppliChem | 182883.1211 | |
| Ultra Pure 1 M Tris, pH 7.5 | Thermo Fisher Scientific | 15567027 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 17904 | 50% sterile aliquots to be stored at -20°C |
| Pierce Streptavidin magnetic beads | Thermo Fisher Scientific | 88817 | Please note that these magnetic beads have an average diameter of 1 µm (range from 0.5 - 1.5 µm). Furthermore, Dynabeads-M280 Streptavidin, which are beads of homogenouse size 2.8 µm, are also used in RNA-pulldown but be aware that this may affect purification process. |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Coomassie G-250 | Applichem | A3480 | |
| Aluminiumsulfate-(14-18)-hydrate | Sigma-Aldrich | 368458 | |
| ortho-phosphoric acid | Applichem | A0637 |
References
- Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation. FEBS Letters. 582 (14), 1977-1986 (2008).
- Mayr, C. Evolution and biological roles of alternative 3'UTRs. Trends in Cell Biology. 26 (3), 227-237 (2016).
- Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. The role of the 3' untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells. RNA Biology. 9 (5), 563-576 (2012).
- von Roretz, C., Di Marco, S., Mazroui, R., Gallouzi, I. E. Turnover of AU-rich-containing mRNAs during stress: a matter of survival. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 2 (3), 336-347 (2011).
- Fallmann, J., Sedlyarov, V., Tanzer, A., Kovarik, P., Hofacker, I. L. AREsite2: An enhanced database for the comprehensive investigation of AU/GU/U-rich elements. Nucleic Acids Research. 44, D90-D95 (2016).
- Kresoja-Rakic, J., et al. Posttranscriptional regulation controls calretinin expression in malignant pleural mesothelioma. Frontiers in Genetics. 8 (70), (2017).
- Chu, C., Spitale, R. C., Chang, H. Y. Technologies to probe functions and mechanisms of long noncoding RNAs. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (1), 29-35 (2015).
- Diamandis, E. P., Christopoulos, T. K. The biotin-(strept)avidin system: principles and applications in biotechnology. Clinical Chemistry. 37 (5), 625-636 (1991).
- Hirsch, J. D., et al. Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: Uses for protein labeling, detection, and isolation. Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).
- Thermo Scientific. Magnetic bead technology for better assay development. , Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/brochures/1602577-Magnetic-Bead-Technology-Brochure.pdf (2013).
- Usami, N., et al. Establishment and characterization of four malignant pleural mesothelioma cell lines from Japanese patients. Cancer Science. 97 (5), 387-394 (2006).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Coulson, R. M., Cleveland, D. W. Ferritin synthesis is controlled by iron-dependent translational derepression and by changes in synthesis/transport of nuclear ferritin RNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (16), 7613-7617 (1993).
- Leibold, E. A., Munro, H. N. Cytoplasmic protein binds in vitro to a highly conserved sequence in the 5' untranslated region of ferritin heavy- and light-subunit mRNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (7), 2171-2175 (1988).
- Srikantan, S., Gorospe, M. HuR function in disease. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 17, 189-205 (2012).
- Morris, K. V., Mattick, J. S.
- Rinn, J. L., et al. Functional demarcation of active and silent chromatin domains in human HOX loci by noncoding RNAs. Cell. 129 (7), 1311-1323 (2007).
- Zhao, J., Sun, B. K., Erwin, J. A., Song, J. J., Lee, J. T. Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X chromosome. Science. 322 (5902), 750-756 (2008).
- McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).
