Summary
זיהוי של וריאציות גנטיות לתרום מחלות אנושיות מורכבות מאפשר לנו לזהות מנגנונים חדשניים. . הנה, נדגים הגישה מולטיפלקס genotyping של המועמד גנים או מסלול מפענוח ממקסם את הכיסוי במחיר נמוך, הוא נוטה מחקרי עוקבה מבוסס.
Abstract
מחלות מורכבות הן לעיתים קרובות ביסודה על ידי מספר גרסאות גנטי נפוץ שתורמים הרגישות למחלה. כאן, אנו מתארים גישה פולימורפיזם (הסנ פ) נוקלאוטיד יחיד של תג חסכונית באמצעות assay מרובבת genotyping של ספקטרומטר מסה, לחקור את הגן שיוכי מסלול קליני גדודים. אנחנו חוקרים את לוקוס המועמד אלרגיה למזון Interleukin13 (IL13) כדוגמה. שיטה זו הגדלת ביעילות את הכיסוי על-ידי ניצול משותף תאחיזה לא שוויונית (LD) בתוך אזור. SNPs LD הנבחר ואז נועדו לתוך מרובבת assay, המאפשרים עד 40 SNPs שונים להיות מנותח בו זמנית, לחיזוק משתלמת. תגובת שרשרת פולימראזית (PCR) משמש כדי להגביר את לוקוסים היעד, ואחריהם סיומת נוקלאוטיד יחיד, ואת amplicons ואז נמדדים באמצעות לייזר בסיוע מטריקס desorption/יינון-שעה של ספקטרומטר מסה flight(MALDI-TOF). הפלט גולמי ניתוח עם גנוטיפ מתקשר התוכנה, באמצעות חתך-offs, והגדרות בקרת איכות מחמירים, סבירות גבוהה אחרים ובאים פלט עבור ניתוח נתונים.
Introduction
מחלות אנושיות מורכבות, וריאציות גנטיות לתרום רגישות למחלות, לכימות גרסאות אלה עשויה להיות שימושית עבור פתוגנזה הבנה, זיהוי קבוצות מטופלים בסיכון גבוה, המגיבים לטיפול. אכן, ההבטחה של דיוק רפואה הוא תלוי ניצול מידע גנטי כדי לזהות קבוצות המטופל1. לרוע המזל, בתוך החלל ביולוגיה מחלה מורכבת, שבו המחלה פנוטיפים הם ביסודה על ידי ניכר הטרוגניות גנטית, penetrance נמוך, אקספרסיביות משתנה, עוקבה גודל דרישות עבור גישות הגנום כולו לזהות את הרומן המועמדים הם לעתים קרובות מדי גדול2. לחלופין, בגישה ג'ין המועמד יישוב מתחיל השערה אפריורי על גנים ספציפיים/מסלולים המחלה אטיולוגיה3. כלי ניתוח מסלול משמשות כדי לחקור הפתופיזיולוגיה של לוקוסים היעד מזוהה, יצירת מסלולים רבים המועמד כדי להבטיח את הזמנתכם. נדגים כאן בגישה genotyping מרובבת ומאפשר החקירה של עשרות למאות SNPs עם אחד assay, מתאים מחקרי עוקבה האנושי4. גישה זו היא גבוהה יחסית דרך-put, המתיר מאות אלפי דגימות די אן איי להיות genotyped ללימודי הרומן גילוי, חקירה של מסלולים ספציפיים. השיטות המתוארות כאן שימושיים עבור מזהה סיכון אללים ואגודות שלהם עם תכונות קליני באופן מהיר וזול יחסית. פלטפורמה זו היה מועיל מאוד סינון ואבחון למטרות5,6, ועוד לאחרונה, זיהום מיקרוביאלי7 ו וירוס הפפילומה האנושי8.
פרוטוקול זה מתחיל עם מבחר של קבוצת גנים לחקירה, כלומר., אזורי היעד, נקבע בדרך כלל דרך חיפוש ספרות, או אפריורי השערות על מעורבות תהליך המחלה; . או אולי מסומנת לצורך שכפול כמו אגודות מחקר הגנום כולו האגודה (GWA) גילוי המוביל. מקבוצת ג'ין, החוקר יבחר רשימה מעודן של תג SNPs. כלומר, תאחיזה לא שוויונית (LD), או קורלציה, בין גרסאות באזור משמש לזיהוי נציג 'תג הסנ פ' עבור חבורה של SNPs ב LD גבוהה, המכונה haplotype. תעודת הזהות גבוהה של האזור אומר כי SNPs לעיתים קרובות יורשים ביחד כך genotyping הסנ פ אחת מספיקה לייצג את הווריאציה-SNPs כל ב- haplotype. לחלופין, אם עוקב אחרי רשימה סופית של SNPs מאזורים רבים, למשל., שכפול למחקר GWA, תהליך זה עשוי להיות מיותרים. עבור מרובבת genotyping, וזמינותו ואז להיות מתוכננים סביב היעדים הללו כך תחל ההגברה של שונות המוני לאלה של תחל סיומת, מוצרים כדי לייצר interpretable המוני ספקטרה. פרמטרים אלה מיושמות בקלות על ידי כלי עיצוב genotyping מרובבת וזמינותו. תחל ואחורה של עיצוב זה ישמש כדי למקד את סמני עניין ומגבירים את רצף המכיל את הסנ פ. תחל סיומת לצרף proximal ישירות SNPs ומצורפת בסיס יחיד, מסה-לאחרונה, 'שליחות קטלנית' משלים הסנ פ. הבסיס המחסל מונע נוסף הרחבה של ה-DNA. המסה-השינוי של הבסיס מאפשר שברי שונות על ידי בסיס יחיד שהוא זוהה על ידי ספקטרומטר מסה. הצלחת המכיל את הכימיה genotyping ואז חלה על שבב למדידה על פלטפורמה ספקטרומטר מסה. לאחר החלת המתאים פקדים איכות השיחות raw genotyping שזוהה על-ידי המערכת, הנתונים יכול להיות ייצוא ולא המשמש לניתוח סטטיסטי כדי לבדוק את הקשר עם מחלת פנוטיפים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
החומר הגנטי הסעיפים אתית אושרה לשימוש על ידי המשרד עבור ילדים HREC (האדם מחקר ועדת האתיקה) (CDF/07/492), המחלקה HREC שירותי אנוש (10/07), חולים (RCH רויאל לילדים) HREC (27047).
1. עיצוב וזמינותו מרובבת
- הכינו רשימה הסנ פ לעיצוב וזמינותו.
- קלט אזור היעד לתוך הפונקציה תג'ר של Haploview (https://www.broadinstitute.org/haploview/downloads). השתמש את תעודת הזהות (קורלציה, r2) בין SNPs המתפרסות על-פני אזור היעד כדי ליצור רשימה של SNPs, אשר מספק כיסוי מלא של האזור הרצוי עם המספר הנמוך ביותר של גרסאות הנדרש. ליצור רשימה של SNPs כזה כי כל אללים ללכידה נמצאים בקורלציה מעל לסף מסוים על-ידי המשתמש (למשל., r2 ≥0.8).
- זיהוי של רצפי מתאים לפנים לאחור, הארכת תחל
- הזן את רשימת SNPs שנוצר לתוך כלי העיצוב של בחירה וזמינותו.
הערה: ההוראות הבאות חלות על כלי העיצוב assay המשמש ליצירת התוצאות נציג, כמפורט בטבלה של חומרים. - לאחר הושק כלי העיצוב assay, לבחור עיצוב Genotyping חדש. הזן שם עבור העיצוב assay לתוך השדה שם עיצוב .
- לספק את הרשימה הסנ פ שנוצרה בשלב 1.1.1 על-ידי לחיצה על לחצן ערוך קלט טקסט המסומנת להוראות ר' או FASTA שבצד הלחצן.
הערה: SNPs יכול להיות נכנסו כרשימת טקסט של הפניה (rs) הסנ פ מזהי הועלתה בפורמט FASTA או בתבנית קובץ קבוצה הסנ פ בשימוש בכלי. כדי להעלות קבצים בתבניות אלה, בחר בלחצן העלאת קובץ . הגבול העליון של משתנים זה ניתן לעצב לתוך assay יחיד, כינה 'ובכן,' הוא 40 SNPs. . זה ניתן לציין SNPs כי הם בראש סדר העדיפויות העיצוב לפני תחילת המרוץ; אלה יהיה תוכנן קודם. שליטה SNPs ניתן לציין: לדוגמה, נוספה הנועד לזהות מיגדרית במקרה של מדגם mix ups או פקד כדי לקבוע תבנית זו מספקת אם עובד עם איכות נמוך ועניים הדנ א. עם זאת, יש לציין כי באמצעות שליטה ועדיפות SNPs יכול להפחית את המספר של SNPs זה יכול להיות מעוצב יחיד טוב. - מתפריט ' קביעה מוגדרת מראש ', בחר באפשרות iPLEX ריבוב גבוה מראש . מתפריט ' טהור ', בחר האורגניזם שממנו נובע ה-DNA כדי להיות genotyped. לקבלת תוצאות נציג המובאת כאן, זה היה האדם.
הערה: העכבר ואורגניזמים שור תואמים גם הכלי. אחד יכול גם לבחור אחרים אם עובד עם אורגניזם אלטרנטיביות כגון צמח או חיידק; עם זאת, השלבים אוטומטית למציאת proximal SNPs ואזורי פריימר אופטימלי לא תהיה זמינה בשל היעדר התייחסות הגנום. - בתפריט מסד נתונים , בחר build העדכני של הגנום, או של בניה אלטרנטיבית אם נדרש, ' מתפריט ' כימיה . בחר iPLEX והזן עבור השדה רמת מולטיפלקס , הרמה הגבוהה ביותר של ריבוב: 40. עכשיו בחר להתחיל לרוץ. "שלב 1" של הכלי תחל.
הערה: במהלך שלב 1, הכלי מאחזר ומעצבת את רצפי הסנ פ. . הנה, שגיאות עשויות לכלול עיצוב של הקובץ FASTA בו במקרה שקובץ FASTA צריך להיות בדק, מחדש במידת הצורך. שגיאה נוספת היא הסנ פ ר' מספרים מוזגו עם עוד מספר ר', שבו צריך לחפש את התיק מספר ר' במסד נתונים הסנ פ כגון dbSNP של NCBI כדי לזהות את מספר ר' הסנ פ החדש. רצפים סביב הסנ פ הם חיפשו בכל SNPs proximal ידוע שעלולה להפריע העיצוב תחל. אפשריות פריימר PCR מושווים כנגד הגנום להימנע שאינם ספציפיים הגברה עקב מספר רב של להיטים הגנום. - ממתינים השלמה של "שלב 2" של כלי העיצוב שבו יזוהו SNPs הפרוקסימלית.
הערה: אם משתמש אורגניזם שאינו נתמך על-ידי שלב זה, להוסיף ביאורים של רצף באמצעות צינתור SNPs ב סיסטמטי ביאור אם מידע זה זמין. יש לעתים רחוקות שגיאות במהלך שלב זה; עם זאת, שגיאות עלולה להתרחש אם הפניה הלא אורגניזם או גנום נבחר, או אם cDNA רצפים הוזנו במקום הדנ א. כדי למטב את שלב 2, תחת הגדרות מתקדמות, זה אפשרי לסנן SNPs בהתבסס על אוכלוסיה אם עובד בתוך אוכלוסיה ספציפית. SNPs נדיר גם וניתן לסנן על ידי אלה עם תדירות מתחת 1%. לבסוף, SNPs אין מצב מאומתים או אין מידע אוכלוסייה יכול לא ייכללו גם אם רצונך בכך. - ממתינים השלמה של אזורים "שלב 3" של כלי העיצוב שמזהה פריימר אופטימלית. אם העדיף פריימר מיקומים זוהו, או אם עובד עם אורגניזם שונים, באופן ידני קלט פריימר מיקומים על-ידי הוספת ביאורים על רצף הקלט (את קבצי קבוצת הסנ פ) עם האזורים המועדפת פריימר באותיות רישיות ושאר הרצף התחתון במקרה, בחר לשמר את התיק ' מתפריט ' הגדרות מתקדמות ' בשלב זה.
הערה: שגיאות עבור שלבים 2 & 3 עשויים לכלול: (1) A proximal הסנ פ חוסם את העיצוב של פריימר עם הפתרון להיות מסיכה עם בסיס שאינם מתבנית, סדר oligo עם בסיס אוניברסלי כמו Isonine, או, עיצוב שני צבעי יסוד, אחד עם כל אחד אללים של proxim al הסנ פ, או עיצוב פריימר אחד עם אלל נפוץ רק. (2) עוד שגיאה נפוצה היא הכשל לזהות אתר ייחודי עבור ומהצמיגים עם הפתרון כדי לשנות את אורך אמפליקון כדי לזהות אתר ייחודי. בכלי המשמש עבור נייר זה, ברירת המחדל היא לחץ דם 80-120. זה יכול להשתנות מ- 60 עד 400 bp בדיאלוג הגדרות מתקדמות תחת ההגדרות אמפליקון אורך ב "3. לזהות אזורים פריימר אופטימלית"גם תחת הכרטיסיה אמפליקון של"4. עיצוב מבחני." ודא שניהם משתנים. עם זאת, יצוין כי הגדלת אורך אמפליקון בעת שימוש השפיל הדנ א אינה מומלצת. - ממתינים לסיום השלב עיצוב assay ("שלב 4" של העיצוב הכלי), כאן הכלי שואפת לספק מעבר אופטימלית הפרדה בין תחל את הסיומת של אללים של כל SNPs בעיצובים מרובבת. לאחר השלמת השלב זה, לייצא את הקובץ Oligo סדר, אשר מעוצב עבור הזמנת קל דרך oligo הזמנת ספק של בחירה.
הערה: הגברה תחל (קדימה (נ), הפוכה (R)) נועדו ליצור גודל של האופטימלית אמפליקון של 80 עד 120 bp. פריימר הגברה מסה חייב נבדלים של פריימר מאריך את המוצר שלה כדי למנוע תוצאות סותרות בספקטרום מסה ו עבור הביצועים הכוללים של ה-PCR. סיומת ומהצמיגים צריך להיות 15 אל 30 נוקלאוטידים ארוך (4,500-9,000 דא), תוכנן כך הקצה 3' מייחסים סמוכים ישירות לאתר של פולימורפיזם. כל ההגדרות האלה נקבעות באופן אוטומטי הכלי המשמש ליצירת התוצאות נציג.
- הזן את רשימת SNPs שנוצר לתוך כלי העיצוב של בחירה וזמינותו.
- לייצא את העיצוב תחל שבחרת הכלי וסדר של ספק אוליגומר: 25 nmol של כל אחד תחל PCR (ואחורה) ולאחר nmol 100 של כל אחד תחל הסיומת. ראה טבלה 1 צבעי בסיס המשמש ליצירת התוצאות נציג.
2. genotyping (1-2 ימים)
- הכנת תחל הגברה.
- אם תחל lyophilized שהוזמנו, לשקם במים ברמה המולקולרית. השתמש ריכוז של 100 μM/μL עבור תחל ואחורה ו- 500 μM/μL עבור סיומת.
- בריכת תחל קדמי & הפוך עבור כל assay מרובבת לתוך תערובת פריימר מניות, המכיל כל תחל בריכוז של 0.5 מ מ.
הערה: לדוגמה, בריכה פריימר 400 μL 400 תגובות:
2 μL של כל פריימר, על ריכוז של 100 μM/μL, נדרש עבור מאגר מניות פריימר. עבור 30-פלקס assay עם 60 תחל ואחורה, יהיה סכום כולל של 120 μL של פריימר הנדרש (הבריכה פריימר מרוכז). 280 מים ברמה מולקולרית μL אז ניתן להוסיף כדי להפוך נפח סופי של 400 μL של פריימר לערבב.
- הגברה באמצעות פולימראז תגובת שרשרת (PCR)
- להכין תערובת הבסיס ה-PCR המכיל 100 ננומטר של המיקס פריימר שתוארו לעיל, 500 μM של dNTPs, 2 מ מ של MgCl2, ו- 0.5 U של אנזים ה-DNA פולימראז. 1 U נדרש עבור גדול ממבחני 26-ה-plex. עיין בטבלה 2.
- להוסיף 4 μL של שילוב זה כל טוב של הלוח PCR 384-ובכן, יחד עם μL 1 של ה-DNA גנומי-ריכוז של 5-10 ng/μL.
הערה: בקרת איכות צריך להיכלל גם על הצלחת, כגון פקד שאינם מתבנית של פקד חיובי ביצע בעבר עם וזמינותו (במהלך מבצע בדיקה). אם מפעיל לוחות מרובים, DNA מספר דגימות מן plate(s) אחרים, למשל., כן, צריכה לפעול כפקדי טכני עבור ההשתנות הבין-plate. - Centrifuge את הצלחת ב g x 200 עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר עם כיסוי לצלחת במקום כדי להבטיח כל נוזל נכלל בחלק התחתון של הבארות צלחת.
- הפעל את ה-PCR עם התנאים thermocycler הבאים: הדגירה 4 דקות ב 94 ° C כדי להפעיל את ה-DNA פולימראז; 45 מחזורי הבאות (דנטורציה ב 94 ° C עבור 20 s, חישול ב 56 ° C s 30, ואת סיומת ב 72 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה), ואז סיומת הסופי ב-72 מעלות במשך 3 דקות עיין לתוכנית ה-PCR בטבלה3.
- לבצע agarose בג'ל כדי להבטיח שהגברה הדנ א הוא מוצלח. השתמש µL 1 של מוצר ה-PCR (עם µL 3 טעינת מאגר) על 2% (w/v) agarose ג'ל, שנעשו על ידי ערבוב אבקת agarose, 0.5% EDTA בוראט טריס (TBE) מאגר, ולרוץ 45 min ב- 100 וולט.
- שלב טיהור Phosphatase אלקליין (SAP) שרימפס
הערה: שלב זה משמש כדי להסיר נוקלאוטידים טריטוריה. האנזים SAP cleaves פוספט קבוצות כדי למנוע עודף פריימר dNTPs טריטוריה מהתערבות התגובה ההרחבה הקרובה.- להפוך אמן לערבב המכילה יחידות 1.7/μL של האנזים שרימפס אלקליין פוספטאז (SAP), מאגר SAP x 10 ולהמציא לאמצעי אחסון עם מים ברמה המולקולרית. עיין בטבלה 4.
- להוסיף 2 μL של טרי את SAP מאסטר שילוב כל טוב של הצלחת, כבר המכיל 5 μL פי התגובות PCR. צנטריפוגה בקצרה וחוזרים thermocycler ב 37 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות ולאחר מכן ב 85 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות עבור אנזים איון. עיין בטבלה 5.
- התגובה הארכת תחל
הערה: ריכוז תחל סיומת בתערובת פריימר סיומת שתישמר לפי גודל (ליניארי פריימר ההתאמה – LPA). זה כי יש הופכי בין עוצמת שיא (על ספקטרום המונית), מוצר המוני. ההתאמה של ריכוז פריימר הרחבת מתקן עבור מערכת היחסים הזאת לייצר הפסגות של עוצמות שווה. מותאם תחל המשמש ליצירת הנציג התוצאות הינם מסופקים בטבלאות 6 & 7. אמצעי האחסון המסופקים הם להפיק 1.5 מ של סיומת פריימר מיקס.- לחשב דילול גורמים עבור כל תחל תוך שימוש באלגוריתם הדרגתיות, זמין מ אגנה החיים ('ליניארי פריימר התאמת'), אשר מתאימה עבור מסה וריכוז של פריימר, ואת המספר הכולל של תחל בהתגובה מרובבת (ראה טבלאות 6 & 7). הזן המסה UEP כל פריימר לתוך השדה UEP_MASS הגיליון התאמת פריימר ליניארי.
הערה: ריכוז מסה מנוכי עונתיות עבור ומהצמיגים באופן אוטומטי יחושבו בתא עם הטקסט בכותרת העליונה "היעד התגובה ריכוז (מיקרומטר)." הנפח של פריימר שיתווספו למאגר פריימר יהיה הפלט בתא מתחת לטקסט הכותרת "אמצעי אחסון מלאי פריימר שיתווספו למאגר (µL)." נפח המים שיתווספו למאגר פריימר כדי לפצות את ריכוזי מחושב הוא פלט על התא בסמוך לטקסט "נפח של PCR כיתה RNase חינם H2O להיות הוסיף פריימר בריכה (µL)". - לקחת את הנפח של כל פריימר כפי שצוין בקובץ ה-התאמת פריימר ליניארי ולהמציא בריכה פריימר. להוסיף נפח המים מחושב על ידי האלגוריתם כדי לדלל את הבריכה פריימר כפי שנקבע בשלב 2.4.1.
הערה: אם השיטה אלגוריתם הדרגתיות אינה זמינה, שיטה נוספת היא לחלק את תחל מסה נמוכה ו מסה גבוהה ולהוסיף להכפיל את הריכוז של תחל מסה גבוהה יחסית הקבוצה מסה נמוכה. שלוש או ארבע קבוצות עשויות להידרש וזמינותו גבוהים-פלקס (כלומר, יותר מ 19 SNPs). עם זאת, שיטה זו לא תניב כמו אופטימלית להתקשר לארץ כשיטת אלגוריתם הדרגתיות. - להרכיב את התמהיל אב של סיומת. וזמינותו plex נמוך (1-18 plex), להוסיף μL 0.2 המאגר, μL 0.1 של סיום ערבוב, 0.94 μL של המיקס פריימר LPA מותאם ו μL 0.0205 של אנזים (להכין על הקרח). וזמינותו plex גבוהה (19-36 plex), הוסיפו ריכוז כפול של סיום ערבוב, אנזים (סיום ערבוב 0.2 μL ו- iPLEX האנזים 0.041 μL). עיין בטבלה 8.
- להוסיף 2 μL של המיקס מאסטר של התגובה סיומת לצלחת התגובה הקודמת, עכשיו להביא את הנפח הכולל 9 μL לכל טוב. צנטריפוגה בקצרה ולמקם thermocycler: 94 ° C עבור 30 s הראשונית דגירה, 40 מחזורי 1 פרק 94 ° C 5 s עם 5 x (52 ° C 5 s, ואחריו 80 ° C 5 s), ולאחר מכן 72 מעלות צלזיוס במשך 3 דק. עיין בטבלה9.
- לחשב דילול גורמים עבור כל תחל תוך שימוש באלגוריתם הדרגתיות, זמין מ אגנה החיים ('ליניארי פריימר התאמת'), אשר מתאימה עבור מסה וריכוז של פריימר, ואת המספר הכולל של תחל בהתגובה מרובבת (ראה טבלאות 6 & 7). הזן המסה UEP כל פריימר לתוך השדה UEP_MASS הגיליון התאמת פריימר ליניארי.
- שרף-טיהור.
הערה: עודפי מלחים עכשיו ניתן להסיר את התגובה עם השימוש של שרף.- להוסיף 16 μL של מים יונים הבארות של צלחת שאוחזרו, מביאים את אמצעי האחסון הצלחת עד 25 μL.
- החל שרף, בדרך כלל 6 מ"ג של גומת חן שרף את לוחית (נרכש בנפרד), באופן שווה כל הצלחת. השאר שרף להתייבש בצלחת גומת חן שרף במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר לפני החלת לצלחת התגובה. לאחר תוספת של השרף, לסובב לוח עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר או ביד או עם מערבל ההשעיה במהירות איטית (למשל., 7.5 סל ד).
הערה: לפני טעינה של analyte genotyping על גבי השבב genotyping, הדגימות ואת וזמינותו הפריסה חייב להיות קלט לתוך ממשק התוכנה. זו יכולה להיות מושגת באמצעות הקובץ עיצוב סיכום של כלי העיצוב וזמינותו.
- מדידה על פלטפורמה ספקטרומטר מסה.
- Centrifuge את הצלחת ב- 3,200 g x עבור 5 דקות כדי להימנע ליישום של שרף השבב ספקטרה המוני.
- להעלות את הפריסה צלחת של דגימות של המערכת ממשק התוכנה לפני המרוץ.
הערה: שלב 2.6.3 צריך לבצע אך ורק על ידי צוות מיומן. - החל את התערובת analyte genotyping מהצלחת השבב genotyping עם מערכת שחולק. לאחר מכן, טען את השבב לתוך המערכת MALDI-תוף כדי ליצור ספקטרום המונית מתוך התערובת analyte, ואז יכול להתפרש בסיועם של ממשק התוכנה של הפלטפורמה.
הערה: המערכת יוצר ספקטרום המונית על ידי הפניית פולסים קצרים של אור UV-כל 'pad,' המתאים לבאר בודדת של צלחת genotyping, של השבב ספקטרה המוני. הדופק את התוצאה desorption יינון של analyte. אלה מיונן DNA מולקולות ואז מונעות לחלק העליון של שפופרת הוואקום על-ידי שדה אלקטרוסטטי מתח גבוה, להפריד את יוני בהיר יותר, אשר לנוע מהר יותר ולהגיע הגלאי ראשון, מן היונים כבד יותר. "שעת הטיסה" של analytes אלה נרשמות על ידי המערכת, שממנו המסה של כל שבר דנ א יכול להיקבע, כך שניתן להסיק הבסיס נוקלאוטיד נוכח הסנ פ.
3. genotyping נתונים
הערה: בקרת איכות פרשנות הנתונים אינם המוקד של נייר המתודולוגיה הזו. עם זאת, להלן בקצרה יכסה פרשנות הספקטרום המוני.
- בקרת איכות של ספקטרה המוני, בדיקה ידנית.
הערה: ספקטרום המוני גולמי שנוצר על-ידי המערכת, ניתח עם התוכנה, כפי שמפורט בטבלה של חומרים. תערובת גאוסיאנית קיבוץ באשכולות שיטת מוחל על פלט זה כדי לבצע שיחות genotyping הסתברותית.- פתח את תוכנת ניתוח. בחר Typer מנתח. בתפריט קובץ , בחר בארות פתוח מקובץ ובחר קובץ ה-xml עם הנתונים קשת הנוצר בשלב 2.6.3. שם צ'יפ עבור ההפעלה צריך להיות גלוי, בחר בה ולאחר חלונית "רמזור" של צלחת 384-ובכן תוצג רשימה של SNPs ב שנבחר היטב. מכאן, לבחור קוראים אשכול מתווה כדי להציג את scatterplot של נקודות נתונים עבור כל הסנ פ.
הערה: מומלץ כי תוצאה 'אין שיחה' להיות מיושם עבור בעצימות נמוכה SNPs. בתוכנה המשמשת עבור התוצאות נציג, ניתוק מגניטודה קיבוץ באשכולות של 5, שהוא גבוה יותר מאשר ברירת המחדל, הוא הציע לבקרת איכות מחמירים. הגדרה זו ניתן להתאים הפסקת גודל שדה תחת פרמטרים בחלונית פוסט עיבוד אשכולות . בחר Autocluster בכרטיסיה כלים להפעלת ניתוח האשכולות. - לבצע בדיקה ידנית של גנוטיפ שיחות על ידי בחינת מתווה קרטזי בחלונית עיבוד פוסט. בחלונית Assay, בחר את הסנ פ של הריבית ולחץ על הכרטיסיה שלאחר עיבוד אשכולות , מגרש אשכול עם גנוטיפ קיבוץ באשכולות יהיה גלוי עם אחרים המתאימים עבור הסנ פ ומזהים מדגם.
- לבחון את האשכולות השיחה גנוטיפ ולהעריך עד כמה כל שיחה בודדים אשכולות עם שיחות אחרות עבור הסנ פ. התוכנה מספקת כמה קווי גבול על המגרש עבור כל גנוטיפ להנחיה; ראה דוגמה של מגרש אשכול גנוטיפ שיחות IL13 הסנ פ (איור 1). אם השיחה לא אשכול בחוזקה עם שיחות אחרות ויושב בבירור מחוץ אשכול, או אם יש לה בעצימות נמוכה מאוד, לנקודות של קליק ימני ובחר שינוי להתקשר עם זה באופן ידני לא להתקשר.
- כדי להבטיח איכות גבוהה genotyping הנתונים משמשים לניתוח במורד הזרם, הכללת SNPs ויחידים עם להתקשר לארץ מתחת לסף מסוים QC, למשל 90%. לאחר התאמות נעשו את נתוני השיחות, לייצא את הנתונים עבור יישומים סטטיסטיים. בתוכנה המשמשת כדי להפיק את התוצאות נציג (המופיעות בטבלה של חומרים) זו מושגת עם מבחר צלחת נתונים מתוך תפריט תצוגה ובחירה באפשרות Save As.
- פתח את תוכנת ניתוח. בחר Typer מנתח. בתפריט קובץ , בחר בארות פתוח מקובץ ובחר קובץ ה-xml עם הנתונים קשת הנוצר בשלב 2.6.3. שם צ'יפ עבור ההפעלה צריך להיות גלוי, בחר בה ולאחר חלונית "רמזור" של צלחת 384-ובכן תוצג רשימה של SNPs ב שנבחר היטב. מכאן, לבחור קוראים אשכול מתווה כדי להציג את scatterplot של נקודות נתונים עבור כל הסנ פ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
עם הפרוטוקול המתואר לעיל, אנו genotyped לתייג SNPs ברחבי הגן המערכת החיסונית Th2 IL13 במדגם של מזון אלרגיה מקרים ופקדים9. אנחנו מוחלים ניתוח רגרסיה לוגיסטית, יותאם ממוצא ואת covariates פוטנציאליים אחרים לבדוק אם גרסאות גנטיים בתוך האזור של עניין גדל הסיכון לאלרגיה למזון. טבלה 10 9 מראה rs1295686 variant אחד מזוהה עם אלרגיה למזון מוכחת אתגר וידאנו. עמותה זו במדגם שכפול באמצעות אותו מרובב genotyping הגישה. מטא אנליזה של תוצאות שני גדודים סיפק ראיות חזקות של התאחדות IL13 פא (טבלה 11)9. אנו גנטית להסיק, יותאם ממוצא בניתוח באמצעות שושלת אינפורמטיבי הסנ פ סמן לוח, מ שפורסמה בלוח10. אנחנו genotyped לוח באמצעות אותו מרובב assay הגישה.
Variant משויך, rs1295686, מזוהה לוקוסים הסיכון לאסטמה11 בעבר ומקושרת עם אחרים פרמטרים אימונולוגי אלרגית12, רומז שייתכן לוקוסים סיכון מחלות אלרגיות כלליות. השלבים הבאים יהיה לערוך יותר מחקרים, כגון ניתוח ביטוי דיפרנציאלי, מיפוי האינטראקציות פיזי עם שיטת לכידה כרומטין, משובח מיפוי של האזור ולאחר ניתוח haplotype, להצמיד הצבע הגרסה הפונקציונלית ולאפיין הביולוגיה שמאחורי העמותה נצפתה עם אלרגיה למזון.
איור 1: אשכול קרטזי העלילה rs1295686 IL13 הסנ פ. אשכולות צהוב מייצגים גנוטיפ homozygous שיחות אלל A, כחול אלל G, ו ירוק עבור שיחות משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים. כמה גנוטיפ שיחות כי לא אשכול עם או homozygous או משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים המוני ספקטרום הוגדרו "אין קריאה".
טבלה 1: פריימר רצפים המשמש ליצירת התוצאות נציג עבור IL13. העמודה שם מכיל את מזהה הסנ פ, המספר טוב (כפי שהוזכר קודם לכן, המספר "גם" מתייחס למזהה של וזמינותו מרובבת), סוג של פריימר (F עבור forward, R עבור הפוכה ו UEP עבור תחל הסיומת). העמודות הבאה מכילים את רצף פריימר, לגודל של פריימר ואת סוג טיהור. יצוין, כי SPINK5 , לוח ממוצא אינפורמטיבי סמנים (AIM) היו genotyped שימוש וזמינותו אותו למרות תוצאות אלו לא דנו עם התוצאות נציג שהוצגו. SNPs המסתיימת ב- _CEU ו- _CHB עיין SNPs המטרה עבור האירופאים הצפוני של יוטה ו הסינים באוכלוסיות Beijin, סין מפרויקט הגנום 1000 בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
| מיקס מאסטר | Plex נמוכה (≤26 SNPs) | Plex גבוהה (> הסנ פ 26) | |||
| מגיב | Conc. ב 5 µL | × 1 | × 200 | × 1 | × 200 |
| מים (יונים) | 1.9 | 380 | 1.8 | 360 | |
| מאגר | 1 × (2 מ מ MgCl2) | 0.5 | 100 | 0.5 | 100 |
| MgCl2 | 2 מ מ | 0.4 | 80 | 0.4 | 80 |
| dNTPs | 500 ΜM | 0.1 | 20 | 0.1 | 20 |
| פריימר מיקס * * | 100 ננומטר | 1 | 200 * * | 1 | 200 * * |
| . אנזימים | 0.5 U / 1 U | 0.1 | 20 | 0.2 | 40 |
| סה | 4 ΜL | 800 ΜL | 4 ΜL | 800 ΜL | |
| * * כבר מדולל עם יונים H20 כמפורט 2.1.2 | |||||
בטבלה 2: ריאגנטים וריכוזי הנדרש כדי להפוך את פריימר הגברה PCR לערבב. אמצעי האחסון מיקס מאסטר ניתנים עבור 200 תגובות כי 400 (מספיק כדי לכסות את צלחת 384-טוב) לא יתאימו לתוך צינור 1.5 µL ובכך 2 x 200 צריכה להיעשות צינורות נפרדת. אמצעי האחסון שצוין תחת נמוך Plex אמור לשמש אם וזמינותו מרובבת "ובכן" מכיל פחות מאו שווה ל- 26 SNPs, אם הגדול מ- 26 SNPs נמצאים בשימוש גם ה-Plex גבוהה כרכים.
| תנאי Thermocycler |
| 94 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות |
| 45 מחזורי (94 מעלות 20 s, s ° 56 C 30, 72 ° C 1 דקות) |
| 72 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות |
| להחזיק 4 ° C |
טבלה 3: תנאים Thermocycler עבור ה-PCR הגברה.
| מיקס מאסטר | × 1 | × 410 |
| מים (יונים) | 1.53 | 627.3 |
| מאגר 10 × | 0.17 | 69.7 |
| SAP אנזים (1.7 U µL) | 0.3 | 123 |
| סה | 2 ΜL | 820 ΜL |
בטבלה 4: ריאגנטים ובתמצית על המיקס ראשיים עבור התגובה SAP- מיקס מאסטר כרכים ניתנת לתגובות 410 לכסות את צלחת 384-ובכן עם שוליים לטעויות pipetting.
| תנאי Thermocycler |
| 37 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות |
| 85 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות |
| להחזיק 4 ° C |
טבלה 5: Thermocycler התנאים הנדרשים לקיום התגובה SAP.
| # | הארכת תחל | ריכוז מניות המקורי (מיקרומטר) | חיובים שונים | UEP_ מסה | ריכוז התגובה היעד (מיקרומטר) | EXT-פריימר-בריכה-ריכוז (מיקרומטר) | נפח פריימר מניות שיתווספו אל הבריכה (µL) |
| 1 | rs36110_CHB | 500 | 4359.8 | 0.560 | 5.36 | 16.09 | |
| 2 | rs10488619_CHB | 500 | 4546 | 0.602 | בכ-5.76 | 17.29 | |
| 3 | rs1986420_CEU | 500 | 4761.1 | 0.648 | 6.21 | 18.62 | |
| 4 | rs2934193_CEU | 500 | 4964.3 | 0.690 | 6.61 | 19.82 | |
| 5 | rs4968382_CEU | 500 | 5047.3 | 0.707 | 6.77 | 20.30 | |
| 6 | rs1227647_CEU | 500 | 5136.4 | 0.724 | 6.93 | 20.80 | |
| 7 | rs1402851_CEU | 500 | 5338.5 | 0.763 | 7.30 | 21.91 | |
| 8 | rs4705054 | 500 | 5476.6 | 0.788 | 7.55 | 22.64 | |
| 9 | rs6928827 | 500 | 5678.7 | 0.824 | 7.89 | 23.68 | |
| 10 | rs9325072 | 500 | 5762.8 | 0.839 | 8.03 | 24.10 | |
| 11 | rs4841401_CHB | 500 | 5853.9 | 0.855 | 8.18 | 24.55 | |
| 12 | rs11098964_CHB | 500 | 6052.9 | 0.888 | 8.50 | 25.51 | |
| 13 | rs2416504_CHB | 500 | 6174 | 0.908 | 8.69 | 26.08 | |
| 14 | rs1860933 | 500 | 6264.1 | 0.923 | 8.83 | 26.50 | |
| 15 | rs2193595_CHB | 500 | 6391.2 | 0.943 | 9.03 | 27.08 | |
| 16 | rs1519260_CHB | 500 | 6469.2 | 0.955 | 9.14 | 27.43 | |
| 17 | rs11184898_CHB | 500 | 6588.3 | 0.973 | 9.32 | 27.95 | |
| 18 | rs679832_CEU | 500 | 6757.4 | 0.998 | 9.56 | 28.68 | |
| 19 | rs326626_CEU | 500 | 6765.4 | 1.000 | 9.57 | 28.71 | |
| 20 | rs1612904 | 500 | 6873.5 | 1.015 | 9.72 | 29.17 | |
| 21 | rs862942 | 500 | 6960.5 | 1.028 | 9.84 | 29.53 | |
| 22 | rs2486448_CHB | 500 | 7169.7 | 1.058 | 10.13 | 30.38 | |
| 23 | rs4824001_CEU | 500 | 7341.8 | 1.081 | 10.35 | 31.06 | |
| 24 | rs6552216_CEU | 500 | 7465.9 | 1.098 | 10.51 | 31.54 | |
| 25 | rs1488299_CHB | 500 | 7620 | 1.119 | 10.71 | 32.13 | |
| 26 | rs1347201_CHB | 500 | 7626 | 1.119 | 10.72 | 32.15 | |
| 27 | rs315280_CHB | 500 | 7747 | 1.135 | 10.87 | 32.60 | |
| 28 | rs11203006_CHB | 500 | 7834.1 | 1.146 | 10.97 | 32.92 | |
| 29 | rs4240793_CHB | 500 | 8036.3 | 1.172 | 11.22 | 33.66 | |
| 30 | rs9325071 | 500 | 8219.4 | 1.194 | 11.43 | 34.30 | |
| 31 | rs12678324_CEU | 500 | 8394.5 | 1.215 | 11.64 | 34.91 | |
| 32 | rs4653130_CEU | 500 | 8455.5 | 1.223 | 11.71 | 35.12 | |
| 33 | rs9275596 | 500 | 8537.6 | 1.232 | 11.80 | 35.39 | |
| 34 | rs12595448_CHB | 500 | 8603.6 | 1.240 | 11.87 | 35.62 | |
| עוצמת הקול של ה-PCR כיתה Rnase חינם H2O להיות הוסיף פריימר בריכה (µL) | 561.78 | ||||||
טבלה 6: 1. ובכן תחל מנוכי עונתיות המשמש ליצירת התוצאות נציג. טבלה של הארכת תחל מותאם לפי גודל, לרבות ריכוז היעד, האחסון המשמש בריכה פריימר ולאחר הריכוז הסופי לכל פריימר בבריכה פריימר טוב 1. כמות המים הדרושה כדי לפצות עוצמת הקול הסופי מסופק בחלק התחתון של הטבלה. הנפח הכולל של הבריכה פריימר היה 1.5 מ.
| # | הארכת תחל | ריכוז מניות המקורי (מיקרומטר) | חיובים שונים | UEP_ מסה | ריכוז התגובה היעד (מיקרומטר) | EXT-פריימר-בריכה-ריכוז (מיקרומטר) | נפח פריימר מניות שיתווספו אל הבריכה (µL) |
| 1 | rs10515597 | 500 | 4482.9 | 0.588 | 5.63 | 16.89 | |
| 2 | rs2759281_CEU | 500 | 4921.2 | 0.681 | 6.52 | 19.57 | |
| 3 | rs17641748 | 500 | 5080.3 | 0.713 | 6.83 | 20.48 | |
| 4 | rs1698042_CEU | 500 | 5201.4 | 0.737 | 7.05 | 21.16 | |
| 5 | rs5753625_CHB | 500 | 5411.6 | 0.776 | 7.43 | 22.30 | |
| 6 | rs3912537_CEU | 500 | 5811.8 | 0.848 | 8.12 | 24.35 | |
| 7 | rs6141319_CEU | 500 | 5883.8 | 0.860 | 8.23 | 24.70 | |
| 8 | rs1002587_CEU | 500 | 6026.9 | 0.884 | 8.46 | 25.39 | |
| 9 | rs1295686 | 500 | 6172 | 0.908 | 8.69 | 26.07 | |
| 10 | rs16877243_CEU | 500 | 6386.2 | 0.942 | 9.02 | 27.05 | |
| 11 | rs1103811 | 500 | 6595.3 | 0.974 | 9.33 | 27.98 | |
| 12 | rs6510332_CEU | 500 | 6790.4 | 1.003 | 9.61 | 28.82 | |
| 13 | rs6595142_CHB | 500 | 6874.5 | 1.016 | 9.72 | 29.17 | |
| 14 | rs4484738_CEU | 500 | 6966.5 | 1.029 | 9.85 | 29.55 | |
| 15 | rs1432975 | 500 | 7028.6 | 1.038 | 9.94 | 29.81 | |
| 16 | rs10879311_CEU | 500 | 7317.8 | 1.078 | 10.32 | 30.97 | |
| 17 | rs864481 | 500 | 7416.9 | 1.092 | 10.45 | 31.35 | |
| 18 | rs1295687 | 500 | 7447.8 | 1.096 | 10.49 | 31.47 | |
| 19 | rs12644851_CHB | 500 | 7634 | 1.120 | 10.73 | 32.18 | |
| 20 | rs4265409_CHB | 500 | 7926.2 | 1.158 | 11.09 | 33.26 | |
| 21 | rs2927385_CHB | 500 | 7997.2 | 1.167 | 11.17 | 33.52 | |
| 22 | rs1538956_CHB | 500 | 8286.4 | 1.202 | 11.51 | 34.54 | |
| עוצמת הקול של ה-PCR כיתה Rnase חינם H2O להיות הוסיף פריימר בריכה (µL) | 899.42 | ||||||
טבלה 7: 2 טוב תחל מנוכי עונתיות המשמש ליצירת תוצאות נציג. טבלה של הארכת תחל מותאם לפי גודל, לרבות ריכוז היעד, האחסון משמש פריימר בריכה, וריכוז הסופי עבור כל פריימר בבריכה פריימר טוב 2. כמות המים הדרושה כדי לפצות עוצמת הקול הסופי מסופק בחלק התחתון של הטבלה. הנפח הכולל של הבריכה פריימר היה 1.5 מ.
| מיקס מאסטר | Plex נמוך (1-18) | Plex גבוהה (19-36) | ||
| מגיב | × 1 | × 410 | × 1 | × 410 |
| מים (יונים) | 0.7395 | 303.195 | 0.619 | 253.79 |
| מאגר | 0.2 | 82 | 0.2 | 82 |
| סיום מיקס | 0.1 | 41 | 0.2 | 82 |
| מיקס פריימר (LPA מנוכה) | 0.94 | 385.4 | 0.94 | 385.4 |
| אנזים iPLEX * | 0.0205 | 8.405 | 0.041 | 16.81 |
| סה | 2 ΜL | 820 ΜL | 2 ΜL | 820 ΜL |
טבלה 8: ריאגנטים וריכוזי עבור התגובה סיומת מאסטר מיקס. במקרה זה אמצעי האחסון לתגובות נמוך-פלקס אמור לשמש אם ישנם 18 או פחות SNPs בבאר. לשימוש SNPs 19 או יותר אמצעי האחסון תגובות Plex גבוהה. זה שונה לדרישות הסנ פ נמוכה-פלקס, גבוהה-plex של מיקס מאסטר PCR הגברה מפורט בטבלה מס ' 2.
| תנאי Thermocycler |
| 94 ° C ל 30 s |
| 40 מחזורי (s ° 94 ג 5, (5 מחזורים של 52 ° C 5 s, s 80 ° C 5)) |
| 72 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות |
| להחזיק 4 ° C |
טבלה 9: Thermocycler תנאי התגובה סיומת
| אלרגיות מזון תיקים לעומת שאינם מזון פקדים אלרגית | |||||
| הסנ פ | A1 | P | או | L95 | U95 |
| rs1295686 | A | 0.003 | 1.75 | 1.2 | 2.53 |
| rs2243297 | A | 0.13 | 2.1 | 0.8 | 5.51 |
| rs1295687 | G | 0.19 | 1.63 | 0.78 | 3.41 |
| rs2243211 | A | 0.22 | 1.45 | 0.8 | 2.64 |
| rs1295683 | T | 0.25 | 1.32 | 0.82 | 2.13 |
| rs2243248 | G | 0.51 | 1.21 | 0.69 | 2.11 |
| rs2243300 | T | 0.51 | 1.19 | 0.7 | 2.02 |
| rs1800925 | T | 0.6 | 1.11 | 0.75 | 1.63 |
| rs3091307 | G | 0.62 | 1.1 | 0.75 | 1.6 |
טבלה 10: Rs1295686 משתנה של IL13 לוקוס מזוהה עם אלרגיה למזון מוכחת אתגר. ניתוח רגרסיה לוגיסטית, יותאם מוצאה, מין ונוכחות של אקזמה אטופית, חשף את rs1295686 משתנה מזוהה עם אתגר מוכחת אלרגיה למזון במדגם גילוי (n = המקרים 367 ופקדים אלרגית 156). העמודה הסנ פ מפרטת את סמני נבחנות, העמודה A1 מפרטת אלל קטין, משמש אלל הפניה עבור הבדיקה האגודה. העמודה P מפרטת את ערכי-P מניתוח הרגרסיה, העמודה או מפרטת את יחס הסיכויים המתאים, L95 ו- U95 הגבולות העליון והתחתון של הסמך 95% מן הניתוח. נתונים מרובה לאשלי. et al., 20179.
| א ניתוח שכפול: אלרגיות מזון תיקים לעומת שאינם מזון פקדים אלרגית | B. מטא אנליזה – גילוי של שכפול | ||||||||||
| הסנ פ | A1 | או | L95 | U95 | P | P | P(R) | או | OR(R) | Q | . אני |
| rs1295686 | A | 1.37 | 1.03 | 1.82 | 0.03 | 0.0005 | 0.0006 | 1.5 | 1.5 | 0.31 | 3:32 אם כן |
| rs1295687 | C | 1.1 | 0.68 | 1.78 | 0.7 | 0.3 | 0.3 | 1.24 | 1.24 | 0.38 | 0 |
טבלה 11: שכפול של אוכלוסיה עצמאית מאשרת את הקשר בין IL13 variant rs1295686, אלרגיה למזון מוכחת אתגר. רגרסיה לוגיסטית, תיקן ממוצא הרכיבים העיקריים, סקס, אקזמה אטופית, בתוך אוכלוסיה עצמאית (n = 203 מקרים אלרגית מזון ופקדים אלרגית 330) אישרה האגודה rs1295686 משתנה בין אלרגיה למזון. מטא-אנליזה נערך לאחר מכן, אספקת הרמה הגבוהה ביותר של ראיות עבור שיוך בין הסנ פ לבין התוצאה, עם מעט עדויות של הטרוגניות מידות בתוקף בין שתי האוכלוסיות-זו הסנ פ. כאן העמודות הן לפי טבלה 10, עם P(R) נוספות, OR(R) ערכי של המטא-אנליזה אפקטים אקראיים דגם לעומת הדגם אפקטים קבועים (P ו- OR). Q ואני הם ערך P עבור הבדיקה קוקרן, אני-האינדקס בהתאמה, שניהם מדדים של הטרוגניות אפקט הגדלים בין המחקרים. נתונים מרובה לאשלי. et al., 20179.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
. הנה, נדגים את השיטה של genotyping מרובבת באמצעות ספקטרומטר מסה. התוצאות נציג נוצרו באמצעות PCR לזווג עם MALDI-TOF ספקטרומטר מסה4 בכימיה assay המופיעים בטבלה של חומרים13. עם פלטפורמה זו, יצרנו סך של 11,295 אחרים על אנשים 1,255 בגין 9 SNPs בתוך 40 h במעבדה.
אנו ממחישים את התועלת של הטכניקה עונה השערות גנטית על-ידי יצירת וניתוח נתונים הסנ פ עבור הגן המועמד IL13 במדגם גילוי קלינית phenotyped מזון, עם שכפול עצמאי. פלטפורמת חזקות יחסית ל DNA באיכות נמוכה ודורש חומר המוצא מינימלי, קלט של היחידה 10 ng. שלבים קריטיים בפרוטוקול כוללים את הפריטים הבאים: פתרון בעיות זהיר של תהליך העיצוב assay כדי להבטיח מקסימלי הסנ פ להיכלל מבחני מרובבת, הגברה מוצלחת של האזורים היעד במהלך הגברה PCR, יחיד מוצלחת הרחבה נוקלאוטיד במהלך התגובה סיומת, ואת הטעינה של הפריסה צלחת assay ודגימת לתוך התוכנה ניתוח על מנת שהתוכנה להקצות במדויק את הנתונים ספקטרה המוני.
כאמור, כלי העיצוב וזמינותו היא תואמת השימוש בעכבר פולימורפיזמים שור, בנוסף האדם. עבור אורגניזמים אחרים כגון חיידק או צמח, "אחר" ניתן לבחור בתפריט "טהור". עם זאת, השלבים אוטומטיים לצורך חיפוש מקורב SNPs זיהוי אזורים פריימר אופטימלי לא יהיה זמין.
במהלך תהליך העיצוב, אם הסנ פ הפרוקסימלית חוסם את הזיהוי של האופטימלית פריימר אזור, אחד יכול גם להסיר את הסנ פ העיצוב ובחר עוד ב LD גבוהה (למשל, r2 = 1), או בחר לעצב שני צבעי יסוד, אחד עם ההפניה אלל את הסנ פ ואחד עם אלל חלופי, או עיצוב פריימר אחד עם אלל נפוצות או מיסוך של הסנ פ עם בסיס אוניברסלי (למשל, Inosine). אם יש בעיה עם זיהוי אתר ייחודי עבור ומהצמיגים, אחד יכול לשנות את הגדרות אורך אמפליקון למצוא אתר ייחודי. הגדרת ברירת המחדל היא 80-120 bp אבל זה יכול להיות שונה מ- bp 60-400. עם זאת, יצוין כי אם עובד עם DNA מפורק (למשל, מרקמות FFPE), זה לא אידיאלי להאריך את אורך אמפליקון.
שגיאות במהלך השלב עיצוב וזמינותו של הכלי עשוי לכלול סיכת ראש גבוהה או פריימר דיימר פוטנציאליים. שתי ההגדרות תוכלו להיות רגועים לנסות את accommodate עיצובים עם זאת, מומלץ כי סף לא רגועות מתחת 0.8; להתחיל עם 0.9 כדי לראות אם הגדרה זו מספיקה להציל את SNPs להפחית ל- 0.8 במידת הצורך בלבד. הגדרות מתקדמות, זה ניתן לשנות את מספר האיטראציות עיצוב (עד 10) תחת הלשונית מולטיפלקס "4. עיצוב מבחני", כמו גם הקריטריונים לבחירת איטראציה הטוב הגבוה הממוצע מולטיפלקס או המצומצמות דוחה על ידי ה-Plex נמוך. הגדלת מספר האיטראציות עיצוב יכול להיות יתרון כי הכלי ייקח את הסנ פ הראשון לפי הסדר שהם שסופקו, יתכננו וזמינותו. ואז בודקת אם הסנ פ הבא הוא תואם לוזמינותו מולטיפלקס אותו. לפיכך, הסדר של החומר SNPs. עם האפשרות חזרות מרובות שנבחרו, התוכנה אקראי הסדר של SNPs ונסה איטראציות אחרים. זה עשוי להגדיל את מספר SNPs מסוגל להיות מתוכננים לתוך כל בתי קולנוע או עשויה להקטין את מספר הסנ פ דוחה. עם זאת, זה גם יבוא בעלות זמן, כמו כלי העיצוב ייקח עוד הרבה זמן בשלב זה.
Genotyping מרובבת היא גישה מהירה ובמחיר לחקירה לוקוסים עניין. השיטה הוא יעיל ומאפשר הפעלה של 760 כ דגימות של עד 40-פלקס SNPs בשעות 10, המתיר עשרות אלפי אחרים שיווצר פחות יום אחד14. ספקטרום המוני ניתן לנתח בקלות עם כלים שסופקו על-ידי הפלטפורמה.
הגבלות מסוימות פלטפורמת כוללות אובדן המשוערת של 5-10% של SNPs שתיכשל תהליך העיצוב וזמינותו. לפעמים ניתן לתקן זאת על-ידי בחירה של תג חלופי או proxy הסנ פ. מסד הנתונים הסנ פ ביאור במכון ו- Proxy חיפוש (SNAP) הוא כלי אחד כזה, המאפשרת זיהוי של ה-proxy SNPs15. הגבלה נוספת של המערכת הוא זה היא פלטפורמה יישוב, ולכן אינו מאפשר גילוי הרומן נרחב, כפי מושגת עם גישות הגנום כולו. יתר על כן, הגישה של משתמש תג-הסנ פ proxies להגדיל את הכיסוי ברחבי הגנים, פיין-מיפוי מחקרים עשוי לאחר מכן להיות נחוץ כדי לקבוע את הווריאציה סיבתי מדויק.
Genotyping מרובבת הוא עדיין פלטפורמה שימושי עבור חקירת מחלות הקשורות SNPs מזוהה גישות המחקר GWA או השערה המונעת על ידי המועמד ועל מסלול חקר גנים. יישומים עתידיים עבור פלטפורמת נוטים להיות הרומן שימושים ולכלי ההקרנה בתחומים כגון סרטן, וירולוגיה קליניים. באופן כללי genotyping מרובבת עם ספקטרומטר מסה היא שיטה בינונית-תפוקה מהירה, חסכונית ואמינה עבור genotyping המועמד לוקוסים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים לא תודות לך
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Genomic DNA | - | - | 1 μL at a concentration of 5-10 ng/μL |
| Primers: forward and reverse amplification and extension | IDT | - | see manuscript section 1.2.1 on design of primers |
| Deionized water | E.g. Milli-Q water | - | deionized with 18.2 MΩ.cm resistivity |
| Genotyping reagent kit. iPLEX Gold Chemistry reagent set | Agena Bioscience | #10148-2 | includes all reagents for reactions in 2.2.1, 2.3.1 and 2.4.2 , chip and resin |
| PCR plates (384-well) | Abgene | #ABGAB-1384 | For the MassARRAY system plates by Abgene are compatible |
| Micropipettes | single and 8-channel | ||
| Centrifuge | compatible with 384-well plates | ||
| Thermocycler | compatible with PCR programs as detailed in 2.2.4, 2.3.2 and 2.4.3 | ||
| Dimple resin plate | Agena Bioscience | 6mg, 384-well | |
| Plate rotator | |||
| MassARRAY Analyzer 4 System | Agena Biosciences | MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization – time of flight) Mass Spectrometer. | |
| RS1000 Nanodispenser | Agena Biosciences | ||
| Assay Design Suite | Agena Biosciences | Tool used to design the multiplex genotyping assays | |
| Hot Start Taq | DNA polymerase enzyme | ||
| Resin | Agena Biosciences | Supplied with iPLEX kit |
References
- Aronson, S. J., Rehm, H. L. Building the foundation for genomics in precision medicine. Nature. 526 (7573), 336-342 (2015).
- Ball, R. D. Designing a GWAS: power, sample size, and data structure. Genome-Wide Association Studies and Genomic Prediction. , 37-98 (2013).
- Kwon, J. M., Goate, A. M.
- Oeth, P., Mistro, G. D., Marnellos, G., Shi, T., van den Boom, D. Qualitative and quantitative genotyping using single base primer extension coupled with matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MassARRAY). Single Nucleotide Polymorphisms: Methods and Protocols. , 307-343 (2009).
- Pusch, W., Kostrzewa, M. Application of MALDI-TOF mass spectrometry in screening and diagnostic research. Current pharmaceutical design. 11 (20), 2577-2591 (2005).
- Su, K. Y., et al. Pretreatment epidermal growth factor receptor (EGFR) T790M mutation predicts shorter EGFR tyrosine kinase inhibitor response duration in patients with non-small-cell lung cancer. Journal of clinical oncology. 30 (4), 433-440 (2012).
- Singhal, N., Kumar, M., Kanaujia, P. K., Virdi, J. S. MALDI-TOF mass spectrometry: an emerging technology for microbial identification and diagnosis. Frontiers in microbiology. 6, 791 (2015).
- Cricca, M., et al. High-throughput genotyping of high-risk Human Papillomavirus by MALDI-TOF Mass Spectrometry-based method. New Microbiologica. 38 (2), 211-223 (2015).
- Ashley, S., et al. Genetic Variation at the Th2 Immune Gene IL13 is Associated with IgE-mediated Paediatric Food Allergy. Clinical & Experimental Allergy. 47 (8), 1032-1037 (2017).
- Bousman, C. A., et al. Effects of NRG1 and DAOA genetic variation on transition to psychosis in individuals at ultra-high risk for psychosis. Translational psychiatry. 3 (4), e251 (2013).
- Moffatt, M. F., et al. A large-scale, consortium-based genomewide association study of asthma. New England Journal of Medicine. 363 (13), 1211-1221 (2010).
- Granada, M., et al. A genome-wide association study of plasma total IgE concentrations in the Framingham Heart Study. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 129 (3), 840-845 (2012).
- Oeth, P., et al. iPLEX assay: Increased plexing efficiency and flexibility for MassARRAY system through single base primer extension with mass-modified terminators. Sequenom application note. 27, (2005).
- Ellis, J. A., Ong, B. The MassARRAY System for Targeted SNP Genotyping. Genotyping: Methods and Protocols. , 77-94 (2017).
- Johnson, A. D., et al. SNAP: A web-based tool for identification and annotation of proxy SNPs using HapMap. Bioinformatics. 24 (24), 2938-2939 (2008).
