Summary
Определение генетических вариантов, способствующих сложных заболеваний человека позволяет нам выявить новых механизмов. Здесь мы продемонстрировать мультиплекс генотипирования подход к кандидату генов или гена путь анализа, который максимизирует покрытия при низких затратах и поддается на основе когортных исследований.
Abstract
Сложные заболевания часто подкрепляются несколько общие генетические варианты, которые способствуют восприимчивость к болезням. Здесь мы описываем экономически тег единичных нуклеотидных Однонуклеотидный полиморфизм подход с использованием мультиплексных генотипирования пробирного с масс-спектрометрии, расследовать ген путь ассоциаций в клинической когорт. Мы исследуем пищевой аллергии кандидат Локус Interleukin13 (IL13) в качестве примера. Этот метод эффективно увеличивает охват, воспользовавшись общих связей неравновесия (LD) в пределах региона. Выбранный LD ОНП затем предназначены в мультиплексированных пробирного, позволяя до 40 различных SNPs анализируемым одновременно, повышение эффективности затрат. Полимеразной цепной реакции (ПЦР) используется для усиления целевой локусов, следуют единичных нуклеотидных расширение, и ампликонов затем измеряются с помощью матрицы с помощью лазерной десорбции/ионизации время flight(MALDI-TOF) масс-спектрометрии. Необработанный вывод анализируется с генотипом, программного обеспечения, используя определения строгого контроля качества и обрезков, и высокой вероятностью генотипов, определяются и выход для анализа данных.
Introduction
В сложных заболеваний человека генетических вариантов способствуют восприимчивость к болезням и количественной оценки этих вариантов могут быть полезны для понимания патогенеза, выявление пациентов группы высокого риска и лечение ответчиков. Действительно обещание медицины точности зависит от использования геномной информации для выявления больного подгруппы1. К сожалению в сложное заболевание биологии пространстве, где болезнь фенотипов подкрепляются существенной генетической гетерогенностью, низкой пенетрантностью и переменной экспрессивность, когорты размер требования для генома общесекторальных подходов к идентификации Роман кандидаты, часто чрезмерно большой2. Кроме того подход гена целевых кандидата начинается с априори гипотезы о конкретных генов/путей в этиологии болезней3. Инструменты анализа пути обычно используются для изучения патофизиологии выявленных Целевой локусов, создавая многочисленные пути кандидат, чтобы изучить. Мы демонстрируем здесь мультиплексированных генотипирования подход, позволяющий для расследования десятков до сотен SNPs с одной assay, подходит для человека когортные исследования4. Этот подход является относительно высокой через положили, позволяя сотни тысяч образцов ДНК быть генотипируемого для исследования Роман обнаружения и расследования конкретных путей. Методы, описанные здесь полезны для выявления риска аллелей и их ассоциации с клинических признаков сравнительно быстрой и экономичной основе. Эта платформа была весьма выгодным для скрининга и диагностических целей5,6и совсем недавно, для микробной инфекции7 и вирусом папилломы человека8.
Этот протокол начинается с выбора набора генов, для проведения расследования, т.е., целевых регионах, обычно определяется путем поиска литературы, или априори гипотезы для участия в процессе болезни; или возможно выбранных для репликации как ведущие ассоциации исследования генома всей ассоциации (GWA) обнаружения. Из набора генов исследователь будет выбрать изысканные список тегов ОНП. То есть взаимосвязь равновесия (LD), или корреляции, среди вариантов в регионе используется для идентификации представителя «тег SNP» для группы ОНП в высокой LD, известный как гаплотип. Высокая LD региона означает, что ОНП часто наследуются вместе таким образом, что генотипирование один SNP достаточна для представляют собой вариации на всех ОНП в гаплотип. Кроме того если после на окончательный список SNPs из многих регионов, например., репликация для изучения GWA, этот процесс может оказаться ненужным. Для мультиплексных генотипирования assay затем должны быть направлены вокруг этих целей, такие, что амплификации грунты различных массовых тем, расширение праймеров и продукцию производить интерпретируемых массовые спектров. Эти параметры легко осуществляются мультиплексированных генотипирования пробирного дизайн инструмента. Прямого и обратного праймеры от этой конструкции будет использоваться для целевых маркеры интерес и усилить последовательность, содержащую SNP. Расширение праймеры прикрепить непосредственно проксимальнее полиморфизмов и добавляется один, масса изменение, Терминатор база, которая дополняет SNP. База Терминатор предотвращает дальнейшее расширение ДНК. Масса модификация базы позволяет фрагменты, отличающихся единую базу, чтобы быть обнаружены с помощью масс-спектрометрии. Затем пластина, содержащие химии генотипирования применяется к чип для измерения на платформе масс-спектрометрии. После применения надлежащего контроля качества сырья генотипирования призывы, обнаруженных системой, данные можно экспортировать и использованы для статистического анализа для проверки для ассоциации с болезнью фенотипов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Генетический материал, используемый в настоящем документе этически был одобрен для использования управлением для детей HREC (человека Комитет по этике исследований) (СГО/07/492), Кафедра HREC человека услуг (10/07) и Королевский Детская больница (РЧ) HREC (27047).
1. Проектирование мультиплексированных Assay
- Подготовка списка SNP пробирного дизайн.
- Ввод целевого региона в теггер функции Haploview (https://www.broadinstitute.org/haploview/downloads). Используйте LD (корреляции r2), между SNP, охватывающих целевого региона для создания списка SNPs, который обеспечивает полный охват желаемого региона с наименьшее количество необходимых вариантов. Создать список SNPs, таким образом, что все аллели быть захвачен связаны выше порога, определяемые пользователем (например., r2 ≥0.8).
- Определение подходящих последовательностей для вперед, реверс и расширение грунтовки
- Введите сгенерированный список ОНП в Пробирной дизайн инструмент выбора.
Примечание: Приведенные ниже инструкции применяются к пробирного средство проектирования, используемое для создания представительных результатов, как указано в Таблице материалов. - После запуска средство проектирования пробирного выберите Новый генотипирования дизайн. Введите имя для пробирного дизайна в Дизайн имя поля.
- Предоставьте список SNP, созданный на шаге 1.1.1, нажав на кнопку Редактировать ввода текста с инструкции rs или FASTA слева от баттона.
Примечание: SNP может быть введен как текстовый список ссылок (РС) SNP идентификаторы или загружены в формате FASTA, или формат файла SNP группы используется инструментом. Чтобы загрузить файлы в этих форматах, выберите кнопку Загрузить файл . Верхний предел вариантов, которые могут быть разработаны в единый пробирного, называется «хорошо», является 40 SNP. Это позволяет указать SNPs, которые являются приоритетными для дизайна перед началом выполнения; Сначала они будут разрабатываться. ОНП управления могут быть указаны: например, проба для выявления гендерной в случае образец микс ups или элемент управления, чтобы определить, что достаточно шаблон был добавлен если работы с низким или плохого качества ДНК. Следует, однако, отметить, что с помощью контроля и приоритет SNPs может уменьшить количество SNPs, которые могут быть разработаны в единый хорошо. - Пресет меню выберите вариант высокий мультиплексирования iPLEX пресет . Из организма меню выберите организма, от которого наследует ДНК, чтобы быть генотипируемого. Для представителя результаты, представленные здесь это было человека.
Примечание: Мыши и говядину организмы также совместимы с инструментом. Один если можно также выбрать другие работы с альтернативной организма как завод или микробов; Однако автоматизированных шаги для нахождения проксимальной полиморфизмов и оптимального грунтовка областях не будет доступна из-за отсутствия ссылок генома. - В меню база данных выберите Последняя сборка генома, или альтернативного построения, при необходимости, из меню « химии ». Выберите iPLEX и Мультиплексной уровня поля, введите высокий уровень мультиплексирования: 40. Теперь выберите Начать работать. «Шаг 1» инструмента начнется.
Примечание: Во время шага 1, инструмент извлекает и форматы последовательности SNP. Здесь ошибки может включать форматирование FASTA файла, в котором случае FASTA файл следует проверять и переформатирован в случае необходимости. Другая ошибка — SNP rs чисел, которые были объединены с другим номером РС, в котором случае номер РС должен выполняться поиск в базе данных SNP как NCBI dbSNP определить новый номер РС SNP. Последовательности вокруг SNP Поиск для любых известных проксимальной SNPs, которые могли бы помешать конструкции праймера. Потенциальные PCR праймер сайты сравниваются геном избежать неспецифических амплификации благодаря несколько хитов в геноме. - Дождаться завершения «Шаг 2» дизайн инструмента, в котором будут определены проксимальной SNP.
Примечание: Если организм, который не поддерживается этим шагом, аннотируйте последовательности с проксимальных полиморфизмов в ИЮПАК аннотации, если эта информация доступна. Есть редко ошибки во время этого шага; Однако могут возникать ошибки, если был выбран неправильно ссылку организма или геном, или последовательностях cDNA были введены вместо геномной ДНК. Чтобы оптимизировать шаг 2, в разделе Дополнительные параметры, можно отфильтровать SNP основанные на население, если работа в рамках конкретной группы населения. Редкие SNPs быть отфильтрованы, исключив те с частотой ниже 1%. Наконец SNP, которые не имеют статус проверенного или не имеют информации по вопросам народонаселения также могут быть исключены при желании. - Дождаться завершения «Шаг 3» дизайн инструмента, который определяет оптимальную грунтовка регионов. Если предпочитаемый праймера места были определены, или если работа с другой организм, вручную вводить праймера места путем пометки входной последовательности (SNP группы файлов) с предпочтительным грунтовка регионов в верхнем регистре и остальная часть последовательности в нижнем Сохранить случае случае, выберите в меню Дополнительные параметры для этого шага.
Примечание: Ошибки шаги 2 и 3 могут включать: (1) A проксимальной SNP блокирование дизайн праймера с раствором, чтобы маска с базой non шаблона и заказать oligo с универсальной базой, как Isonine или, дизайн двух праймеров, один с каждым из аллелей proxim Аль SNP, или, Дизайн один грунт с общей аллель только. (2) еще одна распространенная ошибка является неспособность определить уникальный сайт для грунтовки с решения, чтобы изменить длину ампликон для того, чтобы определить уникальный сайт. Инструмент, используемый для этого документа по умолчанию используется 80-120 bp. Это может быть изменено от 60-400 bp в диалоге Дополнительные параметры под Amplicon длина параметры «3. Определить оптимальные области грунт» и также на вкладке ампликон «4. Дизайн Assays.» Убедитесь, что оба изменяются. Следует, однако, отметить, что увеличение длины amplicon при использовании деградации ДНК не рекомендуется. - Дождаться завершения шага дизайн пробирного («шаг 4» дизайна инструмент), здесь инструмент призван обеспечить оптимальный перевал разделение между расширение грунты и аллели всех ОНП в мультиплексированном конструкции. После завершения этого шага, экспортируйте файл Oligo порядка, который отформатирован для легкий заказ через oligo заказа поставщика выбора.
Примечание: Усиление грунтовки (вперед (F) и обратного (R)) предназначены для получения оптимального ампликон размер от 80 до 120 bp. Грунтовка усиления масс должен отличаться от расширения грунта и его продукт, чтобы избежать противоречивых результатов в массовых спектр и для общей производительности ПЦР. Грунтовка расширение должно быть 15 до 30 нуклеотидов длинные (4500-9000 Da), таким образом, что 3' конца будет прикрепить непосредственно прилегающих к сайт полиморфизм. Все эти параметры устанавливаются автоматически в инструмент, используемый для создания представительных результатов.
- Введите сгенерированный список ОНП в Пробирной дизайн инструмент выбора.
- Экспортировать дизайн из выбранного инструмента и порядок праймеры от поставщика олигомера: 25 нмоль каждого из праймеры PCR (вперед и назад) и 100 нмоль каждого из расширения грунтовки. Для грунтовки, используемый для создания представительных результатов см. таблицу 1 .
2. генотипирования (1-2 дня)
- Подготовьте амплификации грунтовки.
- Если были заказаны лиофилизированные грунты, воссоздать с молекулярного уровня воды. Используйте в концентрации 100 мкм/мкл для прямого и обратного грунты и 500 мкм/мкл для расширения.
- Бассейн вперед и обратного Праймеры для калибровочных мультиплексированных в складе грунтовка смеси, содержащие каждый грунт в концентрации 0,5 мм.
Примечание: К примеру, 400 мкл грунтовка бассейн для 400 реакций:
2 мкл каждого праймера, в концентрации 100 мкм/мкл, необходим для пула запасов грунт. Для 30-plex assay с 60 прямого и обратного грунты, будет в общей сложности 120 мкл грунта требуется (концентрированный грунтовка бассейн). Затем будут добавлены 280 мкл воды молекулярно класса сделать окончательный объем 400 мкл грунтовки смешивают.
- Усилители с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР)
- Сделать мастер смесь для ПЦР, содержащие 100 Нм смеси праймера подробно выше, 500 мкм дНТФ, 2 мм MgCl2и 0,5 U фермента ДНК-полимеразы. 1 U необходим для более чем 26-plex анализов. Обратитесь к таблице 2.
- Добавьте 4 мкл этой смеси в каждой скважине 384-ну ПЦР пластины, наряду с 1 мкл геномной ДНК в концентрации 5-10 нг/мкл.
Примечание: контроль качества также должны быть включены на плите, как элемент управления-шаблон и позитивный элемент управления, который ранее выступал с assay (во время выполнения теста). Если запущено несколько пластин, несколько ДНК образцов из других знаке, например., в трех экземплярах, должен выполняться как технические элементы управления между plate изменчивости. - Центрифуга пластину на 200 x g 1 мин при комнатной температуре с крышкой пластины для обеспечения все жидкости содержится в нижней части тарелка скважин.
- Запустите ПЦР с соблюдением следующих условий Термоциклер: 4 мин инкубации на 94 ° C для активации ДНК-полимераза; 45 циклов следующее (денатурация при 94 ° C для 20 s, отжиг на 56 ° C 30 s, и расширение в 72 ° C в течение 1 мин) и затем окончательное расширение при 72 ° C для 3 мин обратитесь к программе ПЦР в таблице 3.
- Выполняйте геля агарозы для обеспечения что амплификации ДНК является успешным. Использовать 1 мкл ПЦР продукта (с 3 мкл буфера погрузки) на геле агарозы 2% (w/v), сделал, смешивая порошок агарозы и буфер Tris Борат ЭДТА (КЭ) 0,5% и запустить по 45 мин 100 V.
- Шаг очистки креветок щелочной фосфатазы (SAP)
Примечание: Этот шаг используется для удаления неинкорпорированных нуклеотидов. SAP фермента расщепляет фосфатные группы для предотвращения избыточного грунт и неинкорпорированных дНТФ от вмешательства в предстоящих расширения реакции.- Сделайте мастер mix содержащие 1.7 единиц/мкл фермента щелочной фосфатазы креветок (SAP), 10 x буфер SAP и составляют тома с молекулярного уровня воды. Обратитесь к таблице 4.
- Добавить 2 мкл свежеприготовленные вверх SAP мастер смесь для каждой скважины пластины, уже содержащий 5 мкл от реакции PCR. Центрифуга для кратко и вернуться к Термоциклер при 37 ° C 40 мин и затем на 85 ° C за 5 мин для инактивации ферментов. Обратитесь к таблице 5.
- Грунтовка расширения реакции
Примечание: Концентрация расширение грунтовки в смеси праймера расширения должны быть скорректированы по размеру (линейный грунтовка перестройки – LPA). Это потому, что есть обратная связь в пика интенсивности (на массовые спектры) и продукта массы. Регулировка концентрации грунтовка расширение исправляет для этого отношения производить вершины равной интенсивности. Скорректированы грунты, используемый для создания представитель результаты предоставляются в таблицах 6 и 7. Объемах должны генерировать 1,5 мл смеси праймера расширение.- Вычислить разрежения факторов для каждого праймера, с использованием градиента алгоритма, доступные от Agena бионаукам («Настройка линейной грунтовка»), который настраивает для массы и концентрация праймера и общее количество грунтовки в мультиплексированном реакции (см. В таблицах 6 и 7). Введите UEP массы для каждого праймера в поле UEP_MASS листа линейной грунтовка перестройки.
Примечание: Масса скорректированной концентрации для грунтовки будет автоматически рассчитывается в ячейку с текстом заголовка «Целевой реакции концентрацию (мкм).» Объем грунта будут добавлены в пул грунтовка будет выводить в ячейки под текст заголовка «Фондовой букварь тома будут добавлены в пул (мкл).» Объем воды будут добавлены в пул грунтовка составляют расчетные концентрации выводится в ячейку рядом с текстом «объем ПЦР класс РНКазы бесплатно H2O быть добавлены грунтовка бассейн (мкл)». - Возьмите объем каждого праймера, как указано в файле линейной грунтовка перестройки и составляют пул грунт. Добавьте объем воды, алгоритм, чтобы размыть грунт бассейн, как определено в шаге 2.4.1.
Примечание: Если градиентный алгоритм метода недоступен, другой метод является разделить на низкой массы и высокой массы праймеры и добавить двойной концентрации высокой массы грунты по отношению к группе низкой массы. Три или четыре группы, которые могут потребоваться для высоких plex assay (то есть, более чем 19 SNPs). Однако этот метод не даст как оптимальные тарифы как метод градиентный алгоритм. - Соберите расширение основной микс. Для низких plex assay (1-18 plex) добавьте 0.2 мкл буфера, 0.1 мкл прекращение смеси, 0.94 мкл смеси праймера LPA скорректирована и 0.0205 мкл фермента (подготовленных на льду). Для высокой plex assay (19-36 plex) добавьте двойной концентрации смеси прекращение и фермента (прекращение смесь 0,2 мкл и iPLEX фермента 0,041 мкл). Обратитесь к таблице 8.
- Добавьте 2 мкл расширения реакции мастер смеси к пластине из предыдущей реакции, общий объем теперь достигло 9 мкл на хорошо. Центрифуга для кратко и место в Термоциклер: 94 ° C за 30 s первоначальный инкубации, 40 циклов 1 x 94 ° c за 5 s с 5 x (52 ° C за 5 s, а затем 80 ° C за 5 s) и затем 72 ° C для 3 мин см. в таблице 9.
- Вычислить разрежения факторов для каждого праймера, с использованием градиента алгоритма, доступные от Agena бионаукам («Настройка линейной грунтовка»), который настраивает для массы и концентрация праймера и общее количество грунтовки в мультиплексированном реакции (см. В таблицах 6 и 7). Введите UEP массы для каждого праймера в поле UEP_MASS листа линейной грунтовка перестройки.
- Очистки смолы.
Примечание: Избыток солей теперь могут быть удалены из реакции с использованием смолы.- Добавьте 16 мкл деионизованной воды скважин проверено пластины, чего объем в пластину до 25 мкл.
- Примените смолы, обычно 6 мг ямочка Смола плиты (приобретается отдельно), равномерно по всей пластине. Оставьте смолы для просушки в пластину ямочка смолы для 20 мин при комнатной температуре перед применением к пластине реакции. После добавления смолы, повернуть пластину для 5 мин при комнатной температуре от руки или с смесителем подвеска с медленной скоростью (например., 7,5 об/мин).
Примечание: Перед загрузкой генотипирования аналита микросхему генотипирования, образцы и пробирного макет должен быть вклад в программный интерфейс. Это достигается с помощью файла дизайн резюме от пробирного дизайн инструмента.
- Измерения на платформе масс-спектрометрии.
- Центрифуга пластину на 3200 x g на 5 минут, чтобы избежать применения смолы для массового спектры чип.
- Загрузите макет пластины образцов интерфейс программного обеспечения системы до запуска.
Примечание: Шаг 2.6.3 должна выполняться только квалифицированным персоналом. - Применять смесь аналита генотипирования от пластины для генотипирования чип с системой дозирования. Далее загрузите чип на MALDI-TOF системы для создания массовых спектров от аналита смесь, которая затем может интерпретироваться с помощью программного интерфейса платформы.
Примечание: Система генерирует массового спектры, направляя короткие импульсы Ультрафиолета на каждом «pad,» соответствует один колодец генотипирования пластины, массового спектры чипа. Этот пульс приводит к ионизации аналита и десорбции. Эти ионизированный ДНК молекул затем propelled в верхней части вакуумной трубки высокого напряжения электростатического поля, выделяя легкие ионы, которые передвигаться быстрее и достигнуть извещателя во-первых, от более тяжелых ионов. «Время полета» эти аналитов регистрируются в системе, из которой масса каждого фрагмента ДНК может определяться и таким образом может быть выведено базе нуклеотидов, присутствующих на SNP.
3. генотипирования данных
Примечание: контроль качества и интерпретации данных, являются не в центре внимания этой методологии бумаги. Однако следующие будут вкратце опишу интерпретации спектров массы.
- Ручной проверки и контроля качества массового спектров.
Примечание: Сырой массы спектры генерируются системой и проанализированы с помощью программного обеспечения, перечисленных в Таблица материалов. Смесью Гаусса, метод кластеризации применяется к этот выход вероятностные генотипирования звонить.- Откройте программное обеспечение для анализа. Выберите Typer анализатора. В меню файл выберите Открытых колодцев из файла и выберите XML-файл с данными спектра, созданные на шаге 2.6.3. Имя чип для запуска должна быть видна, выберите его и панель «светофор» 384-ну пластины будет отображаться список ОНП в выбранной хорошо. Отсюда выберите Вызвать кластера участков для просмотра рассеяния точек данных для каждого SNP.
Примечание: Рекомендуется применить результат «без вызова» для низкой интенсивности SNP. В программное обеспечение, используемое для представителя результаты кластеризации отсечения величины 5, которая выше, чем по умолчанию, предлагается для строгого контроля качества. Этот параметр может корректироваться в Cutoff величины поля в разделе Параметры панели Пост обработки кластеров . Выберите Autocluster из вкладки инструменты для запуска кластерного анализа. - Выполните ручной проверки генотип вызовов путем изучения декартовых участки в области обработки Post. В панели Assay выберите SNP интерес и нажмите на вкладке Постобработки кластеры , кластер участок с генотипом кластеризации будет видна с образец удостоверения и соответствующие генотипы для SNP.
- Изучить генотипа вызов кластеры и оценить, насколько хорошо каждый индивидуальный вызов кластеры с другими вызовами для SNP. Программное обеспечение предоставляет некоторые линии границы на участке для каждого генотипа для руководства; Смотрите пример генотип вызовы кластера участка от IL13 SNP (рис. 1). Если вызов не плотно кластера с другими вызовами и четко сидит вне кластера, или если он имеет очень низкой интенсивности, щелкните правой кнопкой мыши объект datapoint и выберите Изменить вызов вручную установить его нет , вызов.
- Чтобы обеспечить высокое качество генотипирования данных используется для анализа ниже по течению, исключите полиморфизмов и лиц с тарифы ниже порога КК, например , 90%. После того, как были сделаны соответствующие корректировки для вызова данных, экспортируйте данные для статистических приложений. В программное обеспечение, используемое для создания представительных результатов (перечислены в Таблице материалы) это достигается с Табличке данных выбором из меню Вид и выберите Сохранить как.
- Откройте программное обеспечение для анализа. Выберите Typer анализатора. В меню файл выберите Открытых колодцев из файла и выберите XML-файл с данными спектра, созданные на шаге 2.6.3. Имя чип для запуска должна быть видна, выберите его и панель «светофор» 384-ну пластины будет отображаться список ОНП в выбранной хорошо. Отсюда выберите Вызвать кластера участков для просмотра рассеяния точек данных для каждого SNP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
С протоколом, описанных выше мы генотипируемого тег SNPs через Th2 иммунного гена IL13 в когорте пищевой аллергии дела и управления9. Мы прикладной анализ логистической регрессии, скорректированные с учетом происхождения и других потенциальных ковариат проверить ли генетические варианты в рамках региона интерес увеличился риск аллергии еды. Таблица 10 9 показывает, что один вариант rs1295686 ассоциируется с вызов доказанные пищевой аллергии, и мы подтвердили, что эта ассоциация в когорте репликации с использованием тех же мультиплексированных генотипирования подход. Мета анализ результатов из двух когорты представили убедительные доказательства ассоциации IL13 с FA (Таблица 11)9. Мы генетически выведен и приспособлены для родословную в анализе панели родословной информативный SNP маркер, взято из опубликованных группы10. Мы генотипируемого панели, используя тот же мультиплексированных пробирного подход.
Связанные вариант, rs1295686, ранее определены как риск астмы локусов11 и связанные с других аллергических иммунологические параметры12, предполагая, что это может быть локусов риска общие аллергические заболевания. Следующие шаги бы для проведения дальнейших исследований, таких как анализ дифференциального выражения, сопоставление физических взаимодействий с методом захвата хроматина, штраф сопоставление региона, и анализ гаплотипа, приколоть пункт функциональный вариант и характеризовать Биология за наблюдаемые ассоциации с пищевой аллергией.
Рисунок 1: участок декартовых кластера для IL13 SNP rs1295686. Желтая кластеры представляют гомозиготных генотип призывы к A аллеля, синий G аллелей и зеленый гетерозиготных звонков. Были установлены несколько генотип вызовов, которые не кластер с гомозиготной или гетерозиготных массового спектры призывом «нет.»
Таблица 1: Грунтовка последовательности используется для создания представительных результаты для IL13. Столбец имя содержит идентификатор SNP, хорошо номер (как упоминалось ранее, «хорошо» число относится к ID мультиплексированных assay) и тип грунта (F для вперед, R для обратного и UEP для расширения грунтовка). Следующий столбцы содержат последовательность праймера, размер типа Очистка и грунтовка. Следует отметить, что генотипируемого с помощью же assay, хотя эти результаты не обсуждаются с результатами представленных представителем SPINK5 и группа родословной информативный маркеры (AIM). ОНП, заканчивающийся в _CEU и _CHB ссылаются на цель полиморфизмов для северных европейцев из Юты и ханьских китайцев в Пекин, Китай населения от 1000 геномов проекта соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
| Мастер микс | Низкая Plex (≤26 SNP) | Высокая Plex (> 26 SNP) | |||
| Реагент | Высококонцентрированные в 5 мкл | × 1 | × 200 | × 1 | × 200 |
| Вода (деионизированная) | 1.9 | 380 | 1.8 | 360 | |
| Буфер | 1 × (2 мм MgCl2) | 0.5 | 100 | 0.5 | 100 |
| 2 MgCl | 2 мм | 0.4 | 80 | 0.4 | 80 |
| дНТФ | 500 МКМ | 0.1 | 20 | 0.1 | 20 |
| Грунтовка смеси ** | 100 Нм | 1 | 200 ** | 1 | 200 ** |
| Taq-полимеразы | 0.5 U / 1 U | 0.1 | 20 | 0.2 | 40 |
| Итого | 4 МКЛ | 800 МКЛ | 4 МКЛ | 800 МКЛ | |
| ** уже разбавляется деионизованной H20 как указано в пункте 2.1.2 | |||||
Таблица 2: реактивы и концентрации, необходимых для амплификации PCR праймер смешать. Главный микс томов даны для 200 реакции, потому что 400 (достаточно, чтобы крышка 384-ну) не поместится в трубу 1,5 мкл и таким образом в отдельных труб следует 2 x 200. Объемы, указанные под низким Plex должны использоваться если мультиплексированных assay «Велл» содержит меньше или равна 26 ОНП, если более чем 26 ОНП в хорошо использовать высокие Plex томов.
| Термоциклер условия |
| 94 ° C 4 мин |
| 45 циклов (94 ° C 20 s, s 56 ° C 30, 72 ° C 1 мин) |
| 72 ° C для 3 мин |
| Провести 4 ° C |
Таблица 3: Термоциклер условия для амплификации PCR.
| Мастер микс | × 1 | × 410 |
| Вода (деионизированная) | 1.53 | 627.3 |
| буфер 10 × | 0.17 | 69,7 |
| SAP фермента (1.7 U/мкл) | 0,3 | 123 |
| Итого | 2 МКЛ | 820 МКЛ |
Таблица 4: реактивы и концентрации для основной смеси для SAP реакции. Главный микс томов даны для 410 реакции на 384-ну накладка с запасом для дозирования ошибки.
| Термоциклер условия |
| 37 ° C 40 мин |
| 85 ° C за 5 мин |
| Провести 4 ° C |
Таблица 5: Термоциклер условия, необходимые для SAP реакции.
| # | Расширение праймеры | Оригинальные акции концентрация (мкм) | Разное. | UEP_ МАССА | Целевой реакции концентрация (мкм) | EXT грунтовка бассейн концентрация (мкм) | Объем фондового грунт, чтобы быть добавлены в пул (мкл) |
| 1 | rs36110_CHB | 500 | 4359.8 | 0.560 | 5.36 | 16.09 | |
| 2 | rs10488619_CHB | 500 | 4546 | 0.602 | 5.76 | 17.29 | |
| 3 | rs1986420_CEU | 500 | 4761.1 | 0.648 | 6.21 | 18.62 | |
| 4 | rs2934193_CEU | 500 | 4964.3 | 0.690 | 6.61 | 19,82 | |
| 5 | rs4968382_CEU | 500 | 5047.3 | 0.707 | 6.77 | 20.30 | |
| 6 | rs1227647_CEU | 500 | 5136.4 | 0.724 | 6.93 | 20,80 | |
| 7 | rs1402851_CEU | 500 | 5338.5 | 0.763 | 7.30 | 21.91 | |
| 8 | rs4705054 | 500 | 5476.6 | 0.788 | 7.55 | 22.64 | |
| 9 | rs6928827 | 500 | 5678.7 | 0.824 | 7.89 | 23.68 | |
| 10 | rs9325072 | 500 | 5762.8 | 0.839 | 8.03 | 24.10 | |
| 11 | rs4841401_CHB | 500 | 5853.9 | 0.855 | 8.18 | 24,55 | |
| 12 | rs11098964_CHB | 500 | 6052.9 | 0.888 | 8.50 | 25.51 | |
| 13 | rs2416504_CHB | 500 | 6174 | 0.908 | 8.69 | 26.08 | |
| 14 | rs1860933 | 500 | 6264.1 | 0.923 | 8.83 | 26,50 | |
| 15 | rs2193595_CHB | 500 | 6391.2 | 0.943 | 9.03 | 27.08 | |
| 16 | rs1519260_CHB | 500 | 6469.2 | 0.955 | 9.14 | 27,43 | |
| 17 | rs11184898_CHB | 500 | 6588.3 | 0.973 | 9.32 | 27,95 | |
| 18 | rs679832_CEU | 500 | 6757.4 | 0,998 | 9.56 | 28.68 | |
| 19 | rs326626_CEU | 500 | 6765.4 | 1.000 | 9.57 | 28.71 | |
| 20 | rs1612904 | 500 | 6873.5 | 1.015 | 9.72 | 29.17 | |
| 21 | rs862942 | 500 | 6960.5 | 1.028 | 9.84 | 29.53 | |
| 22 | rs2486448_CHB | 500 | 7169.7 | 1.058 | 10.13 | 30.38 | |
| 23 | rs4824001_CEU | 500 | 7341.8 | 1.081 | 10.35 | 31.06 | |
| 24 | rs6552216_CEU | 500 | 7465.9 | 1,098 | 10.51 | 31.54 | |
| 25 | rs1488299_CHB | 500 | 7620 | 1.119 | 10.71 | 32.13 | |
| 26 | rs1347201_CHB | 500 | 7626 | 1.119 | 10.72 | 32,15 | |
| 27 | rs315280_CHB | 500 | 7747 | 1,135 | 10.87 | 32.60 | |
| 28 | rs11203006_CHB | 500 | 7834.1 | 1.146 | 10,97 | 32,92 | |
| 29 | rs4240793_CHB | 500 | 8036.3 | 1.172 | 11.22 | 33,66 | |
| 30 | rs9325071 | 500 | 8219.4 | 1.194 | 11.43 | 34.30 | |
| 31 | rs12678324_CEU | 500 | 8394.5 | 1.215 | 11.64 | 34.91 | |
| 32 | rs4653130_CEU | 500 | 8455.5 | 1.223 | 11.71 | 35.12 | |
| 33 | rs9275596 | 500 | 8537.6 | 1,232 | 11.80 | 35.39 | |
| 34 | rs12595448_CHB | 500 | 8603.6 | 1.240 | 11.87 | 35,62 | |
| Объем ПЦР класс РНКазы бесплатно H2O быть добавлены грунтовка бассейн (мкл) | 561.78 | ||||||
Таблица 6: Ну 1 скорректированный грунты, используется для создания представительных результатов. Таблица расширение грунтовки регулируется размер, включая целевой концентрация, объем используемых в грунт бассейн и конечная концентрация для каждого праймера в бассейне грунтовка для скважины 1. Объем воды, необходимых чтобы до окончательного объема предоставляется в нижней части таблицы. Общий объем пула грунт-1,5 мл.
| # | Расширение праймеры | Оригинальные акции концентрация (мкм) | Разное. | UEP_ МАССА | Целевой реакции концентрация (мкм) | EXT грунтовка бассейн концентрация (мкм) | Объем фондового грунт, чтобы быть добавлены в пул (мкл) |
| 1 | rs10515597 | 500 | 4482.9 | 0.588 | 5.63 | 16.89 | |
| 2 | rs2759281_CEU | 500 | 4921.2 | 0.681 | 6.52 | 19,57 | |
| 3 | rs17641748 | 500 | 5080.3 | 0.713 | 6.83 | 20.48 | |
| 4 | rs1698042_CEU | 500 | 5201.4 | 0.737 | 7.05 | 21.16 | |
| 5 | rs5753625_CHB | 500 | 5411.6 | 0.776 | 7.43 | 22.30 | |
| 6 | rs3912537_CEU | 500 | 5811.8 | 0.848 | 8.12 | 24.35 | |
| 7 | rs6141319_CEU | 500 | 5883.8 | 0.860 | 8.23 | 24,70 | |
| 8 | rs1002587_CEU | 500 | 6026.9 | 0.884 | 8.46 | 25.39 | |
| 9 | rs1295686 | 500 | 6172 | 0.908 | 8.69 | 26.07 | |
| 10 | rs16877243_CEU | 500 | 6386.2 | 0,942 | 9.02 | 27.05 | |
| 11 | rs1103811 | 500 | 6595.3 | 0,974 | 9.33 | 27,98 | |
| 12 | rs6510332_CEU | 500 | 6790.4 | 1,003 | 9.61 | 28.82 | |
| 13 | rs6595142_CHB | 500 | 6874.5 | 1.016 | 9.72 | 29.17 | |
| 14 | rs4484738_CEU | 500 | 6966.5 | 1.029 | 9.85 | 29.55 | |
| 15 | rs1432975 | 500 | 7028.6 | 1.038 | 9.94 | 29.81 | |
| 16 | rs10879311_CEU | 500 | 7317.8 | 1.078 | 10.32 | 30,97 | |
| 17 | rs864481 | 500 | 7416.9 | 1.092 | 10.45 | 31.35 | |
| 18 | rs1295687 | 500 | 7447.8 | 1.096 | 10.49 | 31,47 | |
| 19 | rs12644851_CHB | 500 | 7634 | 1,120 | 10.73 | 32.18 | |
| 20 | rs4265409_CHB | 500 | 7926.2 | 1,158 | 11.09 | 33,26 | |
| 21 | rs2927385_CHB | 500 | 7997.2 | 1,167 | 11.17 | 33,52 | |
| 22 | rs1538956_CHB | 500 | 8286.4 | 1.202 | 11.51 | 34.54 | |
| Объем ПЦР класс РНКазы бесплатно H2O быть добавлены грунтовка бассейн (мкл) | 899.42 | ||||||
Таблица 7: хорошо 2 скорректированные грунты, используемый для создания представительных результатов. Таблица расширение грунтовки регулируется размер, включая целевой концентрация, объем используемых в грунт бассейн и конечная концентрация для каждого праймера в бассейне грунт хорошо 2. Объем воды, необходимых чтобы до окончательного объема предоставляется в нижней части таблицы. Общий объем пула грунт-1,5 мл.
| Мастер микс | Низкая Plex (1-18) | Высокая Plex (19-36) | ||
| Реагент | × 1 | × 410 | × 1 | × 410 |
| Вода (деионизированная) | 0.7395 | 303.195 | 0.619 | 253.79 |
| Буфер | 0.2 | 82 | 0.2 | 82 |
| Прекращение микс | 0.1 | 41 | 0.2 | 82 |
| Грунтовка микс (LPA с поправкой) | 0,94 | 385.4 | 0,94 | 385.4 |
| iPLEX фермента * | 0.0205 | 8.405 | 0,041 | 16.81 |
| Итого | 2 МКЛ | 820 МКЛ | 2 МКЛ | 820 МКЛ |
Таблица 8: Реагенты и концентрации для расширения реакции master mix. В этом случае томов для Low-Plex реакций должны использоваться если есть 18 или меньше ОНП в колодец. Для 19 или более SNPs использовать тома реакций высоких Plex. Это отличается от SNP требованиями низкой plex и высокой plex амплификации PCR мастер смеси, подробно изложены в таблице 2.
| Термоциклер условия |
| 94 ° C за 30 s |
| 40 циклов (94 ° C 5 s, (5 циклов 52 ° C 5, 80 ° C 5 сек)) |
| 72 ° C для 3 мин |
| Провести 4 ° C |
Таблица 9: Термоциклер условия для расширения реакции
| Пищевой аллергией дела против непродовольственных аллергических элементов управления | |||||
| SNP | А1 | P | ИЛИ | L95 | U95 |
| rs1295686 | A | 0.003 | 1.75 | 1.2 | 2,53 |
| rs2243297 | A | 0,13 | 2.1 | 0,8 | 5.51 |
| rs1295687 | G | 0.19 | 1.63 | 0.78 | 3.41 |
| rs2243211 | A | 0,22 | 1.45 | 0,8 | 2,64 |
| rs1295683 | T | 0.25 | 1,32 | 0,82 | 2.13 |
| rs2243248 | G | 0.51 | 1.21 | 0,69 | 2.11 |
| rs2243300 | T | 0.51 | 1.19 | 0,7 | 2.02 |
| rs1800925 | T | 0.6 | 1.11 | 0.75 | 1.63 |
| rs3091307 | G | 0.62 | 1.1 | 0.75 | 1.6 |
Таблица 10: Вариант rs1295686 из IL13 Локус ассоциируется с вызов доказанные Пищевая аллергия. Анализ логистической регрессии, скорректированные с учетом происхождения, пола и наличие атопической экземы, показали, что вариант rs1295686 связан с проблемой доказано пищевой аллергии в когорте обнаружения (n = 367 случаях и 156 Неаллергические контроля). SNP столбец перечислены маркеры изучаются, А1 колонка незначительные аллель, используется как аллель ссылка для теста ассоциации. P столбец перечислены значения P с помощью регрессионного анализа, или столбце перечислены соответствующие отношения шансов и L95 и U95 нижнего и верхнего пределов 95% доверительный интервал от анализа. Данные воспроизводятся Ashely et al., 20179.
| А. репликации анализ: пищевой аллергией дела против непродовольственных аллергических элементов управления | B. мета анализ – открытие и репликации | ||||||||||
| SNP | А1 | ИЛИ | L95 | U95 | P | P | P(R) | ИЛИ | OR(R) | Q | Я |
| rs1295686 | A | 1.37 | 1.03 | 1.82 | 0,03 | 0,0005 | 0,0006 | 1.5 | 1.5 | 0.31 | 3.32 |
| rs1295687 | C | 1.1 | 0,68 | 1,78 | 0,7 | 0,3 | 0,3 | 1.24 | 1.24 | 0,38 | 0 |
Таблица 11: Репликация в независимой населения подтверждает связь между IL13 вариант rs1295686 и вызов доказанные Пищевая аллергия. Логистической регрессии, исправлены происхождение основных компонентов, секс и атопической экземы, в независимой населения (n = 203 случаях аллергические продовольствия и 330 Неаллергические контроля) подтвердил связь между вариант rs1295686 и пищевой аллергии. Мета анализ тогда проводилась, обеспечивая высочайший уровень доказательств для ассоциации между SNP и результатов, с мало что свидетельствует о неоднородности в силу размеров между двух групп населения в этом SNP. Здесь столбцы согласно таблице 10, с дополнительным P(R) и OR(R) значения для мета анализа случайных эффектов модель против модель фиксированных эффектов (P и или). Q и P-значение для испытаний Кокрановской и я индекс соответственно, оба являются меры неоднородности в силу размеров между исследованиями. Данные воспроизводятся Ashely et al., 20179.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы демонстрируем метод мультиплексированных генотипирования с помощью масс-спектрометрии. Представитель результаты были получены с помощью ПЦР в паре с MALDI-TOF масс-спектрометрии4 с Пробирной химии, перечисленных в Таблица материалов13. С этой платформы мы создали в общей сложности 11,295 генотипов на 1,255 лиц за 9 ОНП в течение 40 часов в лаборатории.
Мы проиллюстрировать полезность технику в отвечая генетических гипотез путем создания и анализа SNP данных кандидата гена IL13 в когорте обнаружение клинических phenotyped для пищевой аллергии и с независимыми репликации. Платформа является сравнительно устойчивы к снижению качества ДНК и требует минимального исходного материала, ввод только 10 нг. Важнейшие шаги в протоколе включают следующее: тщательное устранение неполадок процесса проектирования пробирного обеспечить максимальное включение SNP в мультиплексированном анализов, успешное усиление целевых регионах во время амплификации PCR, успешный сингл расширение нуклеотида во время расширения реакции и загрузка макета пластины пробы и образцы в анализ программного обеспечения для программное обеспечение точно назначать массового спектров данных.
Как упоминалось ранее, пробирного дизайн инструмент совместим с использованием мыши и говядину полиморфизмы, кроме человека. Для других организмов, таких как Микроб или завод «других» можно выбрать в меню «Организм». Однако автоматизированных шаги для нахождения проксимальной полиморфизмов и выявления областей оптимального грунт не будет доступна.
Во время процесса проектирования, если проксимальной SNP блокирует выявление оптимального грунтовка области, можно либо удалить SNP от проектирования и выберите другой высокой LD (например, r2 = 1), или выбрать для разработки двух праймеров, один с ссылкой аллель SNP и один с альтернативной аллеля, проектирование одного праймера с общей аллеля или маскировки SNP с универсальной базы (например, инозин). Если есть проблема с определением уникальный сайт для грунтовки, можно изменить параметры длины ампликон найти уникальный сайт. Значение по умолчанию составляет 80-120 bp, но это может быть изменено из bp 60-400. Следует, однако, отметить, что, если работа с деградации ДНК (например, из FFPE ткани), это не идеальный увеличить длину ампликон.
Ошибки на этапе анализа дизайн инструмента может включать высокие шпильки или потенциальных димера праймера. Обе настройки могут быть ослаблены попробовать размещение конструкции. Однако рекомендуется, что пороговые значения не смягчены ниже 0,8; Начните с 0,9, чтобы увидеть, если этот параметр является достаточно, чтобы спасти полиморфизмов и уменьшить до 0,8 только при необходимости. В дополнительных настройках можно изменить количество итераций дизайна (до 10) во вкладке мультиплекс «4. Дизайн Assays», а также лучшие критерии отбора итерации Наивысший средний мультиплексный или Наименьшее отвергает низкой Plex. Увеличение числа итераций дизайна может быть выгодным, потому что инструмент примет первый SNP в том порядке, они были предоставлены и будет разрабатывать assay. Затем он проверяет, если следующий SNP совместим для же мультиплекс assay. Таким образом порядок SNPs материи. С несколько итераций выбранным параметром программное обеспечение будет случайный порядок полиморфизмов и попробовать другие итерации. Это может увеличить количество SNP могут быть разработаны в каждого мультиплекса или может уменьшить количество отвергает SNP. Однако он также будет прийти ценой времени, как средство проектирования займет гораздо больше времени на этот шаг.
Мультиплексированных генотипирования представляет собой быстрый и доступный подход для расследования локусов интерес. Этот метод является рационализация и позволяет работает приблизительно 760 образцов до 40-plex ОНП в 10 часов, позволяя десятки тысяч генотипов создаваемого менее чем за один день14. Массовые спектры может быть легко проанализирован с инструментами, предоставляемые платформой.
Некоторые ограничения для платформы включают оценкам потери 5-10% SNPs, которые удастся пробирного процесс проектирования. Иногда это можно исправить путем выбора альтернативного тега или прокси SNP. База данных широкой институт SNP аннотацию и прокси Поиск (SNAP) является одним из таких инструментов, что облегчает выявление прокси SNPs15. Еще одно ограничение системы является что это целевой платформы и поэтому не допускает обширные новые открытия, как достичь с геном общесекторальных подходов. Кроме того как подход использует тег SNP прокси для максимального покрытия через гены, штраф картографические исследования впоследствии может потребоваться определить точный причинной вариант.
Мультиплексированных генотипирования-прежнему полезной платформой для допроса заболевание связанное ОНП, выявленных в GWA исследование подходов или гипотеза инициативе кандидата и путь гена разведки. Будущих приложений для платформы, скорее всего быть Роман используется для диагностики и отбора в таких областях, как рак и клинической вирусологии. В целом мультиплексированных генотипирования с масс-спектрометрия является методом средне-пропускная способность быстро, экономически эффективные и надежные для генотипирования кандидат локусов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы имеют без подтверждений.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Genomic DNA | - | - | 1 μL at a concentration of 5-10 ng/μL |
| Primers: forward and reverse amplification and extension | IDT | - | see manuscript section 1.2.1 on design of primers |
| Deionized water | E.g. Milli-Q water | - | deionized with 18.2 MΩ.cm resistivity |
| Genotyping reagent kit. iPLEX Gold Chemistry reagent set | Agena Bioscience | #10148-2 | includes all reagents for reactions in 2.2.1, 2.3.1 and 2.4.2 , chip and resin |
| PCR plates (384-well) | Abgene | #ABGAB-1384 | For the MassARRAY system plates by Abgene are compatible |
| Micropipettes | single and 8-channel | ||
| Centrifuge | compatible with 384-well plates | ||
| Thermocycler | compatible with PCR programs as detailed in 2.2.4, 2.3.2 and 2.4.3 | ||
| Dimple resin plate | Agena Bioscience | 6mg, 384-well | |
| Plate rotator | |||
| MassARRAY Analyzer 4 System | Agena Biosciences | MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization – time of flight) Mass Spectrometer. | |
| RS1000 Nanodispenser | Agena Biosciences | ||
| Assay Design Suite | Agena Biosciences | Tool used to design the multiplex genotyping assays | |
| Hot Start Taq | DNA polymerase enzyme | ||
| Resin | Agena Biosciences | Supplied with iPLEX kit |
References
- Aronson, S. J., Rehm, H. L. Building the foundation for genomics in precision medicine. Nature. 526 (7573), 336-342 (2015).
- Ball, R. D. Designing a GWAS: power, sample size, and data structure. Genome-Wide Association Studies and Genomic Prediction. , 37-98 (2013).
- Kwon, J. M., Goate, A. M.
- Oeth, P., Mistro, G. D., Marnellos, G., Shi, T., van den Boom, D. Qualitative and quantitative genotyping using single base primer extension coupled with matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MassARRAY). Single Nucleotide Polymorphisms: Methods and Protocols. , 307-343 (2009).
- Pusch, W., Kostrzewa, M. Application of MALDI-TOF mass spectrometry in screening and diagnostic research. Current pharmaceutical design. 11 (20), 2577-2591 (2005).
- Su, K. Y., et al. Pretreatment epidermal growth factor receptor (EGFR) T790M mutation predicts shorter EGFR tyrosine kinase inhibitor response duration in patients with non-small-cell lung cancer. Journal of clinical oncology. 30 (4), 433-440 (2012).
- Singhal, N., Kumar, M., Kanaujia, P. K., Virdi, J. S. MALDI-TOF mass spectrometry: an emerging technology for microbial identification and diagnosis. Frontiers in microbiology. 6, 791 (2015).
- Cricca, M., et al. High-throughput genotyping of high-risk Human Papillomavirus by MALDI-TOF Mass Spectrometry-based method. New Microbiologica. 38 (2), 211-223 (2015).
- Ashley, S., et al. Genetic Variation at the Th2 Immune Gene IL13 is Associated with IgE-mediated Paediatric Food Allergy. Clinical & Experimental Allergy. 47 (8), 1032-1037 (2017).
- Bousman, C. A., et al. Effects of NRG1 and DAOA genetic variation on transition to psychosis in individuals at ultra-high risk for psychosis. Translational psychiatry. 3 (4), e251 (2013).
- Moffatt, M. F., et al. A large-scale, consortium-based genomewide association study of asthma. New England Journal of Medicine. 363 (13), 1211-1221 (2010).
- Granada, M., et al. A genome-wide association study of plasma total IgE concentrations in the Framingham Heart Study. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 129 (3), 840-845 (2012).
- Oeth, P., et al. iPLEX assay: Increased plexing efficiency and flexibility for MassARRAY system through single base primer extension with mass-modified terminators. Sequenom application note. 27, (2005).
- Ellis, J. A., Ong, B. The MassARRAY System for Targeted SNP Genotyping. Genotyping: Methods and Protocols. , 77-94 (2017).
- Johnson, A. D., et al. SNAP: A web-based tool for identification and annotation of proxy SNPs using HapMap. Bioinformatics. 24 (24), 2938-2939 (2008).
