Summary
Identifiering av genetiska varianter bidrar till komplexa mänskliga sjukdomar tillåter oss att identifiera nya mekanismer. Här visar vi ett multiplex genotypning förhållningssätt till kandidatgener eller gen väg analys som maximerar täckning till låg kostnad och är mottagliga för kohort-baserade studier.
Abstract
Komplexa sjukdomar bygger ofta flera vanliga genetiska varianter som bidrar till sjukdom mottaglighet. Här beskriver vi en kostnadseffektiv tagg single nucleotide polymorphism (SNP) strategi med en multiplexade genotypning analys med masspektrometri, för att undersöka gen väg föreningar i kliniska kohorter. Vi undersöker det mat allergi kandidat locus Interleukin13 (IL13) som exempel. Den här metoden maximerar effektivt täckning genom att utnyttja delade linkage disequilibrium (LD) inom en region. Valda LD SNP är sedan utformade i en multiplex assay, möjliggör upp till 40 olika SNP analyseras samtidigt, öka kostnadseffektiviteten. Polymeras-kedjereaktion (PCR) används för att förstärka de målet loci, följt av enda nukleotid förlängning, och amplikoner mäts sedan med hjälp av matris-assisted laser desorption och jonisering-tid för flight(MALDI-TOF) masspektrometri. Råa utdata analyseras med genotypen att kalla programvara, använda sträng kvalitetskontroll definitioner och cut-off och hög sannolikhet genotyper bestäms och utgång för dataanalys.
Introduction
I komplexa sjukdomar hos människan, genetiska varianter bidrar till sjukdom mottaglighet och kvantifiera dessa varianter kan vara användbara för förståelsen patogenes, identifiera patientgrupper med hög risk, och behandling responders. Löftet om precision medicin är faktiskt beroende av att utnyttja genomisk information för att identifiera patientundergrupper1. Tyvärr inom komplex sjukdom biologi utrymmet, där sjukdomen fenotyper stöds av betydande genetisk heterogenitet, låg penetrans och variabel expressivitet, kohort storlek krav för genome-wide metoder att identifiera roman kandidaterna är ofta oöverkomligt stor2. Alternativt börjar en riktad kandidat gene strategi med en förhand hypotes om specifika gener/vägar i sjukdom etiologi3. Väg analysverktyg används ofta att undersöka patofysiologin bakom en identifierade målet loci, genererar många kandidat vägar att utforska. Här visar vi en multiplexade genotypning strategi som ger för utredning av tiotals till hundratals SNP med en analys, anpassade till människans kohort studier4. Detta synsätt är relativt hög genom-sätt, tillåter hundratals till tusentals DNA-prover vara genotypbestämts för roman upptäckten studier och utredningar av specifika vägar. De metoder som beskrivs här är användbara för att identifiera risk alleler och deras sammanslutningar med kliniska drag på ett relativt snabbt och billigt sätt. Denna plattform har varit mycket fördelaktigt för screening och diagnostiska ändamål5,6, och mer nyligen, för mikrobiell infektion7 och humant papillomvirus8.
Detta protokoll börjar med urval av en uppsättning gener för undersökningen, dvs., målregionerna, vanligtvis bestäms genom litteratur du söker, eller förhand hypoteser för inblandning i sjukdomsprocessen; eller kanske valda för replikering som ledande sammanslutningar av en upptäckt genome-wide association (GWA) studie. Från gen uppsättningen väljer forskaren en förfinad lista med etiketten SNP. Det vill säga är den linkage disequilibrium (LD), eller korrelation, bland varianter i regionen används för att identifiera en representant 'tag SNP' för en grupp av SNP i höga LD, känd som en haplotyp. Högt LD i regionen innebär att SNP ofta ärvs tillsammans så att genotypning en SNP är tillräcklig för att representera variationen på alla SNP i haplotypen. Alternativt, om följande på en slutgiltig lista av SNP från många regioner, t.ex., replikering för en GWA studie, denna process kan vara onödigt. Multiplexade genotypning, måste ett test sedan utformas runt dessa mål så att förstärkning primers av olika massa med förlängning primers och produkter att producera tolkningsbara massa spectra. Dessa parametrar genomförs enkelt av ett multiplexade genotypning analys designverktyg. Framåt och bakåt primers från denna design används för att rikta markörerna av intresse och förstärka den sekvens som innehåller SNP. Förlängning primers bifoga direkt proximalt SNP och en enda, massa modifierade, 'terminator' base som är ett komplement till SNP läggs. Terminator basen förhindrar ytterligare förlängning av DNA. Mass-ändring av basen kan fragment skiljer sig genom en enda bas att upptäckas av masspektrometri. Plattan innehåller genotypning kemi tillämpas sedan på ett chip för mätning på en masspektrometri plattform. Efter tillämpa lämpliga kvalitetskontroller på raw genotypning samtal detekteras av systemet, kan data exporteras och användas för statistisk analys för att testa om associering med sjukdom fenotyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Det genetiska materialet som används häri var etiskt godkänd för användning av kontoret för barn HREC (mänskliga forskningsetisk kommitté) (CDF/07/492), Institutionen för mänskliga tjänster HREC (10/07) och Royal Children's Hospital (RCH) HREC (27047).
1. utforma multiplexa analysen
- Förbereda en SNP-lista för analysens design.
- In målregionen i tagger funktionen av Haploview (https://www.broadinstitute.org/haploview/downloads). Använda LD (korrelation, r2) mellan SNP som spänner över målregionen att generera en lista av SNP, som ger full täckning av önskad region med det minsta antalet nödvändiga varianter. Generera en lista av SNP sådan att alla alleler fångas är korrelerade en användardefinierad tröskelvärdet (t.ex., r2 ≥0, 8).
- Identifiering av lämpliga sekvenser för framåt, bakåt och förlängning grundfärger
- Ange listan genererade av SNP i verktyget test design val.
Anmärkning: Följande instruktioner gäller för verktyget test design används för att generera de representativa resultat, som anges i Tabellen för material. - När verktyget test design har lanserats, Välj Ny genotypning Design. Ange ett namn för analysens design i fältet Namn .
- Ge listan SNP som genereras i steg 1.1.1 genom att klicka på knappen märkt Redigera textinmatning med instruktioner rs eller FASTA till vänster om knappen.
Obs: SNP kan anges som en textlista över referens (rs) SNP IDs eller uppladdade i FASTA format eller formatet SNP gruppen används av verktyget. För att ladda upp filer i dessa format, Välj knappen Filuppladdning . Den övre gränsen av varianter som kan utformas i en enda analys, kallas 'Ja,' är 40 SNP. Det är möjligt att ange SNP som är en prioritet för design innan körningen; dessa kommer att utformas först. Kontroll SNP kan anges: till exempel en analys att upptäcka kön vid prov mix ups eller en kontroll för att fastställa tillräckliga mallen lades om arbetar med låg eller dålig kvalitet DNA. Det bör dock noteras att använda kontroll och prioritering SNP kan minska antalet SNP som kan utformas till en enda väl. - Välj alternativet hög Multiplexing iPLEX förinställning på menyn förinställning . Från menyn Organism , Välj organismen som DNA vara genotypbestämts kommer ifrån. För representativa resultat presenteras här, var detta mänskliga.
Obs: Mus och bovin organismer är också kompatibel med verktyget. Man kan också välja andra om arbetar med en alternativ organism som växt eller mikrob; de automatiserade steg för att hitta proximala SNP och optimal primer områden kommer dock inte tillgänglig på grund av avsaknad av en referens genomet. - På databas -menyn väljer du den senast bygga av genomet eller en alternativt bygga om så krävs, från menyn kemi . Välj iPLEX och för Multiplex nivå fältet, ange den högsta nivån av multiplexing: 40. Nu Välj Börja köra. ”Steg 1” i verktyget kommer att inledas.
Obs: Under steg 1, verktyget hämtar och format de SNP-sekvenserna. Här kan fel innehålla formatering av FASTA filen där fall FASTA filen kontrolleras och formateras om så behövs. Ett annat fel är SNP rs siffror som har sammanfogats med ett annat rs-nummer, i vilket fall rs numret ska sökas i en SNP databas såsom NCBI'S dbSNP att identifiera nya SNP rs-nummer. Sekvenser runt SNP är sökte någon känd proximala SNP som kan störa primer design. Potentiell PCR primer platser jämfört mot genomet att undvika icke-specifik förstärkning på grund av flera träffar i genomet. - Invänta slutförandet av ”steg 2” av designverktyget där proximala SNP identifieras.
Obs: Om du använder en organism som inte stöds av detta steg, kommentera sekvenserna med proximala SNP i IUPAC-anteckning om denna information är tillgänglig. Det finns sällan fel under detta steg; dock kan fel uppstå om den fel referens organismen eller genomet var markerad, eller om cDNA sekvenser hänfördes snarare än genomiskt DNA. För att optimera steg 2, under Avancerade inställningar är det möjligt att filtrera bort SNP baserat på en befolkning om arbetar inom en viss befolkning. Sällsynt SNP kan också filtreras genom att utesluta dem med en frekvens lägre än 1%. Slutligen, SNP som inte har statusen Godkänd eller inte har befolkningsdatasystemet kan också uteslutas om så önskas. - Invänta slutförandet av ”steg 3” av designverktyget som identifierar optimal primer regioner. Om program primer platser har identifierats, eller om arbetar med en annan organism, manuellt insatsen primer platser av kommentera ingående sekvensen (SNP gruppfiler) med grundfärgen regionerna i versaler och resten av sekvensen i lägre fall, Välj Bevara fall från menyn Avancerade inställningar för det här steget.
Obs: Fel för steg 2 och 3 kan omfatta: (1) A proximala SNP blockerar utformningen av en primer med den lösningen är att maskera med en icke-mall bas och beställa en oligo med en universell bas som Isonine eller designa två primers, en med var och en av allelerna av långväga Al SNP, eller design en primer med den vanliga allelen endast. (2) ett annat vanligt fel är misslyckandet med att identifiera en unik plats för primern med den lösningen är att ändra amplikon längden för att identifiera en unik plats. I verktyget används för detta papper, är standard 80-120 bp. Detta kan ändras från 60-400 bp i dialogrutan Avancerade inställningar under amplikon längd inställningar i ”3. Identifiera Optimal Primer områden ”och också under fliken amplikon ” 4. Design analyser ”. Se till att båda byts. Det bör dock noteras att öka längden på ospädd när använda degraderat DNA inte rekommenderas. - Invänta slutförandet av assay design steg (”steg 4” design verktyg), här verktyget syftar till att ge optimal pass separation mellan förlängning primers och allelerna för alla SNP multiplexade gemenskapsmönster. När detta steg är klar, exportera filen Oligo ordning, som är formaterad för enkel beställning genom en oligo beställning leverantör av val.
Obs: Förstärkning primers (framåt (F) och bakåt (R)) är utformad för att producera en optimal kopiestorlek 80 till 120 bp. Förstärkning primern massan måste skilja sig från förlängning primer och dess produkt att undvika motstridiga resultat i masspektrum och för PCR-prestanda. Förlängning primer bör vara 15-30 nukleotider långa (4 500-9 000 Da), utformad så att den 3'-änden fäster i direkt anslutning till webbplatsen polymorfism. Alla dessa inställningar ställs in automatiskt i verktyget används för att generera de representativa resultat.
- Ange listan genererade av SNP i verktyget test design val.
- Exportera designen från valda verktyg och ordning primers från leverantören som oligomer: 25 nmol av varje PCR primers (framåt och bakåt) och 100 nmol varje förlängning primers. Se tabell 1 för primers används för att generera de representativa resultat.
2. genotypning (1-2 dagar)
- Förbereda förstärkning primers.
- Om frystorkade primrar beställdes, Beredes med vatten för molekylär användning. Använda en koncentration på 100 μM/μL för framåt och bakåt primers och 500 μM/μl för förlängning.
- Pool framåt & omvänd primers för varje multiplex assay in ett lager primer mixen, som innehåller varje primer vid en koncentration av 0,5 mM.
Obs: till exempel, en 400 μL primer pool för 400 reaktioner:
2 μL av varje primer, med en koncentration på 100 μM/μL, krävs för lager primer poolen. För en 30-plex assay med 60 framåt och bakåt grundfärger, totalt 120 μL av primer vore krävs (koncentrerad primer poolen). 280 μL molekylär-grade vatten skulle sedan läggas till göra en slutlig volym av 400 μL av primer blanda.
- Förstärkning med Polymerase Chain Reaction (PCR)
- Göra en master mix för PCR innehållande 100 nM primer mix detaljerade ovan, 500 μM av dNTP, 2 mM med MgCl2och 0,5 U av en DNA-polymerase enzym. 1 U krävs för större än 26-plex analyser. Se tabell 2.
- Tillsätt 4 μL av denna blandning till varje brunn av 384-väl PCR-plattan, tillsammans med 1 μL av genomisk DNA med en koncentration på 5-10 ng/μl.
Obs: kvalitetskontroller bör också ingå på plattan, som en icke-mall kontroll och en positiv kontroll som har tidigare utfört väl med analysen (under en provkörning). Om kör flera plattor, flera DNA prover från de andra skylt(ar), t.ex., i tre exemplar, bör köras som tekniska kontroller för Inter plate variabilitet. - Centrifugera plattan vid 200 x g för 1 min i rumstemperatur med en plate cover för att säkerställa all vätska finns längst ned i plattan brunnarna.
- Köra PCR med följande termocyklern villkor: 4 minuters inkubation vid 94 ° C att aktivera DNA polymerase; 45 cykler av följande (denaturering vid 94 ° C i 20 s, glödgning vid 56 ° C i 30 s och förlängning vid 72 ° C i 1 min) och sedan en sista förlängning på 72 ° C under 3 min. Refer till PCR-program i tabell 3.
- Utföra agaros gelelektrofores för att säkerställa DNA förstärkning är framgångsrika. Använd 1 µL av PCR-produkten (med 3 µL av lastning buffert) på en 2% (w/v) agarosgel, görs genom att blanda agar pulver och 0,5% Tris Borat EDTA (TBE) bufferten, och kör för 45 min vid 100 V.
- Räkor alkaliskt fosfatas (SAP) reningssteg
Obs: Detta steg används för att ta bort unincorporated nukleotider. SAP enzymet klyver fosfatgrupper för att förhindra överskott primer och personbolag dNTP från inblandning i kommande förlängning reaktionen.- Gör en master mix som innehåller 1,7 enheter/μL av räkor alkaliskt fosfatas (SAP) enzym, 10 x SAP buffert och fyll till märket med molekylär-grade vatten. Se tabell 4.
- Lägg till 2 μL av den nygjorda upp SAP master mix till varje brunn av plattan, som redan innehåller 5 μl av PCR-reaktionen. Centrifugera kort och återgå till termocyklern vid 37 ° C i 40 min och sedan vid 85 ° C i 5 min för enzym inaktivering. Se tabell 5.
- Primer filändelsen reaktion
Obs: Koncentrationen av förlängning primers i förlängningen primer mix måste justeras efter storlek (linjär Primer justering – LPA). Detta beror på att det finns ett omvänt förhållande i peak intensitet (på massa spektra) och produkt massa. Justering av filändelsen primer koncentrationen korrigerar för detta förhållande att producera topparna av lika stödnivåer. Justerade primers används för att generera företrädare lämnas resultat i tabellerna 6 & 7. De volymer som anges är att generera 1,5 mL filändelsen primer mix.- Beräkna utspädningsfaktorer för varje primer med en gradient algoritm, tillgänglig från Agena biovetenskaper ('linjär Primer justering'), som justerar för massa och koncentrationen av primer, och det totala antalet grundfärger i multiplexade reaktionen (se Bord 6 & 7). Ange UEP massan för varje primer i fältet UEP_MASS av linjära Primer justering arket.
Obs: Massa justerade koncentrationen för primern kommer att beräknas automatiskt i cell med rubriken ”reaktion målkoncentration (µM)”. Volymen av primer som ska läggas till primer poolen kommer att sändas ut i cellen under rubriken ”volym lager Primer som ska läggas till Pool (µL)”. Volymen vatten som ska läggas till primer poolen för att kompensera de beräkna koncentrationerna är utgång till cellen bredvid texten ”volymen av PCR-Grade RNase gratis H2O vara lagt Primer Pool (µL)”. - Ta volymen av varje primer som anges i filen linjär Primer justering och göra upp en primer pool. Lägga till volymen vatten som beräknas av algoritmen att späda primer poolen vilket anges i steg 2.4.1.
Obs: Om metoden gradient algoritm är tillgänglig, en annan metod är att dela primers i låg vikt och hög massa och Lägg dubbla koncentrationen av hög massa primers i förhållande till gruppen låg massa. Tre eller fyra grupper kan krävas för en hög-plex assay (det vill säga fler än 19 SNP). Dock kommer att denna metod inte ge som optimal samtalspriser som metoden gradient algoritm. - Montera förlängning huvudmixen. För den låga plex assay (1-18 plex), lägga till 0.2 μL buffert, 0.1 μl av uppsägning mix, 0,94 μL av LPA justerat primer mixen och 0.0205 μL av enzym (beredd på is). För den höga plex assay (19-36 plex), lägga till dubbel koncentration av uppsägning mix och enzym (uppsägning mix 0,2 μL och iPLEX enzym 0,041 μL). Se tabell 8.
- Tillsätt 2 μL av huvudmixen förlängning reaktion till plattan från den tidigare reaktion, nu att föra den totala volymen till 9 μl per brunn. Centrifugera kort och placera i termocyklern: 94 ° C för en 30 s inledande inkubation, 40 cykler av 1 x 94 ° C för 5 s med 5 x (52 ° C för 5 s, följt av 80 ° C för 5 s), och sedan 72 ° C under 3 min. se tabell 9.
- Beräkna utspädningsfaktorer för varje primer med en gradient algoritm, tillgänglig från Agena biovetenskaper ('linjär Primer justering'), som justerar för massa och koncentrationen av primer, och det totala antalet grundfärger i multiplexade reaktionen (se Bord 6 & 7). Ange UEP massan för varje primer i fältet UEP_MASS av linjära Primer justering arket.
- Harts rening.
Obs: Överskott salter kan nu tas bort från reaktionen med användning av harts.- Tillsätt 16 μl avjoniserat vatten till brunnarna av Hämtad plattan, föra volymen i plåt upp till 25 μL.
- Tillämpa harts, vanligtvis 6 mg dimple harts plattan (köps separat), jämnt till hela plattan. Låt massan torka i harts dimple plattan för 20 min i rumstemperatur innan du applicerar till reaktion plattan. Efter tillsats av harts, rotera plattan för 5 min i rumstemperatur antingen för hand eller med en fjädring mixer med låg hastighet (t.ex., 7,5 rpm).
Obs: Före lastningen genotypning analyten på genotypning chip, proverna och analys layout måste matas in i programvarugränssnitt. Detta kan uppnås med hjälp av Design Sammanfattning filen från assay designverktyget.
- Mätning på en masspektrometri plattform.
- Centrifugera plattan vid 3,200 x g i 5 min för att undvika tillämpning av kåda på masspektrum chip.
- Ladda upp plattan layouten av prover till systemets programvarugränssnitt innan run.
Obs: Steg 2.6.3 bör endast utföras av utbildad personal. - Applicera genotypning analyten blandningen från plattan till genotypning chip med en dispenseringssystem. Nästa, läsa chip på MALDI-TOF-systemet att generera masspektra från analyten blandningen, som sedan kan tolkas med hjälp av plattformens programvarugränssnitt.
Obs: Genererar systemet masspektra genom att rikta korta pulser av UV-ljus på varje 'pad,' motsvarar en enda brunn av genotypning plattan, masspektra chip. Denna puls resulterar i desorption och jonisering av analyten. Dessa joniserat DNA molekyler framdrivas sedan till toppen av vakuumrör av en hög spänning elektrostatiskt fält, separera ut lättare joner, som färdas snabbare och når detektorn först från tyngre jonerna. ”Tiden för flygningen” av dessa analyter registreras av systemet, som massan av varje DNA-fragment kan fastställas och således en nukleotid bas närvarande vid SNP kan utläsas.
3. genotypning Data
Obs: kvalitetskontroll och tolkning av data är inte fokus i denna metodik papper. Dock täcker följande kort tolkning av masspektrum.
- Manuell inspektion och kvalitetskontroll av masspektrum.
Obs: De råa masspektrum är genereras av systemet och analyseras med programvara som förtecknas i Tabell för material. En Gaussisk blandning klustring metod tillämpas denna utgång probabilistiska genotypning samtal.- Öppna programvaran för analys. Välj Typer Analyzer. Från menyn Arkiv , Välj Öppna brunnar från fil och välj XML-filen med spectrum data genereras i steg 2.6.3. Namnet chip för körningen ska vara synlig, markerar du den och ett ”trafikljus” rutan i plattan med 384 brunnar kommer att visas med en lista över SNP i den valda väl. Här väljer du Ring kluster tomter att visa ett spridningsdiagram datapunkter för varje SNP.
Obs: Det rekommenderas att ett 'inga samtal' resultat tillämpas för låg intensitet SNP. I den programvara som används för representativa resultat, föreslås en klustring magnitud cut-off 5, vilket är högre än standard, för sträng kvalitetskontroll. Denna inställning kan justeras i magnitud Cutoff fältet under parametrar i fönstret Inlägg bearbetning kluster . Välj fliken verktyg att köra en klusteranalys autoclusteren . - Utföra manuell inspektion av genotyp samtal genom att undersöka den kartesiska tomter i fönstret inlägg bearbetning. I fönstret Assay Välj SNP av intresse och klicka på fliken Efterbehandling kluster , en kluster tomt med genotyp kluster kommer att vara synlig med prov-ID och motsvarande genotyper för SNP.
- Undersöka de genotyp samtal kluster och bedöma hur väl varje enskilda samtal-kluster med andra samtal för SNP. Programvaran ger vissa gränslinjerna på tomten för varje genotyp för vägledning; Se exempel på en genotyp samtal kluster tomt från en IL13 SNP (figur 1). Om samtalet inte kluster tätt med andra samtal och sitter tydligt utanför ett kluster, eller om den har mycket låg intensitet, rätt klick datapoint och välja Ändra ringa manuellt ställa in den att nr Ring.
- För att säkerställa hög kvalitet genotypning data används för efterföljande analys, utesluta SNP och individer med samtalspriser tröskelvärdet en QC, t.ex. 90%. När lämpliga justeringar har gjorts till samtalsdata, exportera data för statistiska program. I programmet används för att generera de representativa resultat (anges i Tabell för material) uppnås detta med Platta Data urval från Visa-menyn och välja Spara som.
- Öppna programvaran för analys. Välj Typer Analyzer. Från menyn Arkiv , Välj Öppna brunnar från fil och välj XML-filen med spectrum data genereras i steg 2.6.3. Namnet chip för körningen ska vara synlig, markerar du den och ett ”trafikljus” rutan i plattan med 384 brunnar kommer att visas med en lista över SNP i den valda väl. Här väljer du Ring kluster tomter att visa ett spridningsdiagram datapunkter för varje SNP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med protokollet som beskrivs ovan, tagga vi genotypbestämts SNP genom Th2 immuna genen IL13 i en kohort av mat allergi fall och kontroller9. Vi tillämpade logistisk regressionsanalys, justerat för härstamning och andra potentiella kovariater, att testa om de genetiska varianterna inom regionen av intresse ökad mat allergi risk. Tabell 10 9 visar att en variant rs1295686 är associerad med utmaning-bevisad födoämnesallergi och vi bekräftade denna förening i en replikering kohort med samma multiplex genotypning strategi. En meta-analys av resultaten från de två kohorterna gav starka bevis för associering av IL13 med FA (tabell 11)9. Vi genetiskt slutsatsen och justerat för anor i analysen använder en ancestry informativ SNP markör panel, anpassad från en publicerad panel10. Vi genotypbestämts panelen med samma multiplex assay strategi.
Den associera varianten, rs1295686, har tidigare identifierats som en astma risk loci11 och associerade med andra allergiska immunologiska parametrar12, tyder på att det kan vara en allmän allergisk sjukdom risk loci. Nästa steg skulle vara att utföra ytterligare studier, såsom differentiell uttryck analys, kartläggning fysiska interaktioner med en kromatin fånga metod, fina kartläggning av regionen, och haplotyp analys, fästa peka den funktionella varianten och karakterisera biologin bakom den observerade samband med födoämnesallergi.
Figur 1: kartesiska kluster tomt för den IL13 SNP-rs1295686. Gula kluster representerar homozygot genotyp efterlyser den A allel, blått för den G-allelen och grön för heterozygot samtal. Några genotyp samtal som inte kluster med antingen de homozygota eller heterozygot masspektra sattes till ”inget samtal”.
Tabell 1: Primer sekvenser används för att generera de representativa resultat för IL13. Namnkolumnen innehåller SNP ID, väl numret (som tidigare nämnts avser antalet ”väl” ID för den multiplex assay), och vilken typ av primer (F för framåt, R för omvänd och UEP för förlängning primer). De nästa kolumnerna innehåller sekvensen av primer, primer och rening typ storlek. Det bör noteras att SPINK5 och en Ancestry informativ markörer (AIM) panel var genotypbestämts med samma analys även om dessa resultat inte diskuteras med de presenterade representativa resultaten. SNP slutar i _CEU och _CHB se målet SNP för norra européerna från Utah och Han-kineser i Beijin, Kina populationer från projektet 1000 genomen respektive. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
| Master Mix | Låg Plex (≤26 SNP) | Hög Plex (> 26 SNP) | |||
| Reagens | Konc i 5 µL | × 1 | × 200 | × 1 | × 200 |
| Vatten (avjoniserat) | 1.9 | 380 | 1.8 | 360 | |
| Buffert | 1 × (2 mM MgCl2) | 0,5 | 100 | 0,5 | 100 |
| MgCl2 | 2 mM | 0,4 | 80 | 0,4 | 80 |
| dNTP | 500 ΜM | 0,1 | 20 | 0,1 | 20 |
| Primer mix ** | 100 nM | 1 | 200 ** | 1 | 200 ** |
| Taq polymeras | 0,5 U / 1 U | 0,1 | 20 | 0,2 | 40 |
| Totalt | 4 ΜL | 800 ΜL | 4 ΜL | 800 ΜL | |
| ** redan spädas med avjoniserat H20 som beskrivs i punkt 2.1.2 | |||||
Tabell 2: reagenser och koncentrationer som krävs för att göra den PCR-amplifiering primern blanda. Huvudmixen volymerna ges för 200 reaktioner eftersom 400 (tillräckligt för att täcka en plattan med 384 brunnar) passar inte i ett 1,5 µL rör och således 2 x 200 bör göras i separata rör. Volymer som anges under låg Plex bör användas om den multiplex assay ”Tja” innehåller mindre än eller lika med 26 SNP, om större än 26 SNP är i det väl användandet hög Plex volymer.
| Termocyklern villkor |
| 94 ° C i 4 min |
| 45 cykler (94 ° C 20 s, 56 ° C 30 s, 72 ° C 1 min) |
| 72 ° C under 3 min |
| 4 ° C Håll |
Tabell 3: Termocykler villkor för PCR amplifiering.
| Master Mix | × 1 | × 410 |
| Vatten (avjoniserat) | 1,53 | 627.3 |
| 10 × buffert | 0,17 | 69,7 |
| SAP enzym (1,7 U/µL) | 0,3 | 123 |
| Totalt | 2 ΜL | 820 ΜL |
Tabell 4: reagenser och koncentrationer för huvudmixen för SAP reaktionen. Huvudmixen volymer ges för 410 reaktioner att täcka en 384-well platta med en felmarginal pipettering.
| Termocyklern villkor |
| 37 ° C i 40 min |
| 85 ° C i 5 min |
| 4 ° C Håll |
Tabell 5: Termocykler villkor som krävs för SAP reaktionen.
| # | Utsträckande grundfärg | Ursprungliga lager koncentration (µM) | Misc. | UEP_ MASSA | Målkoncentration reaktion (µM) | EXT Primer Pool koncentration (µM) | Volym lager Primer som ska läggas till Pool (µL) |
| 1 | rs36110_CHB | 500 | 4359.8 | 0,560 | 5,36 | 16.09 | |
| 2 | rs10488619_CHB | 500 | 4546 | 0.602 | 5,76 | 17,29 | |
| 3 | rs1986420_CEU | 500 | 4761.1 | 0.648 | 6,21 | 18,62 | |
| 4 | rs2934193_CEU | 500 | 4964.3 | 0.690 | 6.61 | 19,82 | |
| 5 | rs4968382_CEU | 500 | 5047.3 | 0,707 | 6,77 | 20.30 | |
| 6 | rs1227647_CEU | 500 | 5136.4 | 0.724 | 6,93 | 20.80 | |
| 7 | rs1402851_CEU | 500 | 5338.5 | 0.763 | 7,30 | 21,91 | |
| 8 | rs4705054 | 500 | 5476.6 | 0,788 | 7,55 | 22,64 | |
| 9 | rs6928827 | 500 | 5678.7 | 0.824 | 7,89 | 23.68 | |
| 10 | rs9325072 | 500 | 5762.8 | 0.839 | 8,03 | 24.10 | |
| 11 | rs4841401_CHB | 500 | 5853.9 | 0.855 | 8.18 | 24,55 | |
| 12 | rs11098964_CHB | 500 | 6052.9 | 0,888 | 8,50 | 25,51 | |
| 13 | rs2416504_CHB | 500 | 6174 | 0,908 | 8,69 | 26.08 | |
| 14 | rs1860933 | 500 | 6264.1 | 0.923 | 8,83 | 26,50 | |
| 15 | rs2193595_CHB | 500 | 6391.2 | 0,943 | 9,03 | 27,08 | |
| 16 | rs1519260_CHB | 500 | 6469.2 | 0.955 | 9.14 | 27.43 | |
| 17 | rs11184898_CHB | 500 | 6588.3 | 0,973 | 9.32 | 27,95 | |
| 18 | rs679832_CEU | 500 | 6757.4 | 0.998 | 9,56 | 28,68 | |
| 19 | rs326626_CEU | 500 | 6765.4 | 1.000 | 9,57 | 28,71 | |
| 20 | rs1612904 | 500 | 6873.5 | 1,015 | 9,72 | 29.17 | |
| 21 | rs862942 | 500 | 6960.5 | 1.028 | 9,84 | 29.53 | |
| 22 | rs2486448_CHB | 500 | 7169.7 | 1.058 | 10.13 | 30.38 | |
| 23 | rs4824001_CEU | 500 | 7341.8 | 1.081 | 10,35 | 31,06 | |
| 24 | rs6552216_CEU | 500 | 7465.9 | 1.098 | 10,51 | 31,54 | |
| 25 | rs1488299_CHB | 500 | 7620 | 1.119 | 10,71 | 32.13 | |
| 26 | rs1347201_CHB | 500 | 7626 | 1.119 | 10,72 | 32.15 | |
| 27 | rs315280_CHB | 500 | 7747 | 1.135 | 10,87 | 32,60 | |
| 28 | rs11203006_CHB | 500 | 7834.1 | 1.146 | 10,97 | 32.92 | |
| 29 | rs4240793_CHB | 500 | 8036.3 | 1.172 | 11.22 | 33.66 | |
| 30 | rs9325071 | 500 | 8219.4 | 1.194 | 11,43 | 34.30 | |
| 31 | rs12678324_CEU | 500 | 8394.5 | 1.215 | 11,64 | 34,91 | |
| 32 | rs4653130_CEU | 500 | 8455.5 | 1.223 | 11,71 | 35.12 | |
| 33 | rs9275596 | 500 | 8537.6 | 1.232 | 11,80 | 35,39 | |
| 34 | rs12595448_CHB | 500 | 8603.6 | 1.240 | 11.87 | 35.62 | |
| Mängden PCR-Grade Rnase gratis H2O vara lagt till Primer Pool (µL) | 561.78 | ||||||
Tabell 6: väl 1 justerat primers används för att generera de representativa resultat. En tabell över förlängning primers justeras av storlek, inklusive målet koncentrationen, den volym som används i primer poolen och slutlig koncentration för varje primer i primer poolen för väl 1. Mängden vatten som krävs för att göra till den slutliga volymen finns längst ned i tabellen. Den totala volymen av primer poolen var 1,5 mL.
| # | Utsträckande grundfärg | Ursprungliga lager koncentration (µM) | Misc. | UEP_ MASSA | Målkoncentration reaktion (µM) | EXT Primer Pool koncentration (µM) | Volym lager Primer som ska läggas till Pool (µL) |
| 1 | rs10515597 | 500 | 4482.9 | 0.588 | 5,63 | 16,89 | |
| 2 | rs2759281_CEU | 500 | 4921.2 | 0.681 | 6,52 | 19,57 | |
| 3 | rs17641748 | 500 | 5080.3 | 0,713 | 6.83 | 20,48 | |
| 4 | rs1698042_CEU | 500 | 5201.4 | 0.737 | 7,05 | 21,16 | |
| 5 | rs5753625_CHB | 500 | 5411.6 | 0,776 | 7,43 | 22.30 | |
| 6 | rs3912537_CEU | 500 | 5811.8 | 0.848 | 8.12 | 24.35 | |
| 7 | rs6141319_CEU | 500 | 5883.8 | 0.860 | 8,23 | 24.70 | |
| 8 | rs1002587_CEU | 500 | 6026.9 | 0.884 | 8,46 | 25.39 | |
| 9 | rs1295686 | 500 | 6172 | 0,908 | 8,69 | 26.07 | |
| 10 | rs16877243_CEU | 500 | 6386.2 | 0,942 | 9,02 | 27,05 | |
| 11 | rs1103811 | 500 | 6595.3 | 0.974 | 9.33 | 27,98 | |
| 12 | rs6510332_CEU | 500 | 6790.4 | 1.003 | 9,61 | 28.82 | |
| 13 | rs6595142_CHB | 500 | 6874.5 | 1.016 | 9,72 | 29.17 | |
| 14 | rs4484738_CEU | 500 | 6966.5 | 1.029 | 9,85 | 29,55 | |
| 15 | rs1432975 | 500 | 7028.6 | 1.038 | 9,94 | 29,81 | |
| 16 | rs10879311_CEU | 500 | 7317.8 | 1.078 | 10,32 | 30,97 | |
| 17 | rs864481 | 500 | 7416.9 | 1.092 | 10.45 | 31.35 | |
| 18 | rs1295687 | 500 | 7447.8 | 1.096 | 10,49 | 31.47 | |
| 19 | rs12644851_CHB | 500 | 7634 | 1.120 | 10,73 | 32.18 | |
| 20 | rs4265409_CHB | 500 | 7926.2 | 1.158 | 11.09 | 33,26 | |
| 21 | rs2927385_CHB | 500 | 7997.2 | 1.167 | 11.17 | 33.52 | |
| 22 | rs1538956_CHB | 500 | 8286.4 | 1.202 | 11,51 | 34,54 | |
| Mängden PCR-Grade Rnase gratis H2O vara lagt till Primer Pool (µL) | 899.42 | ||||||
Tabell 7: väl 2 justerade primers används för att generera representativa resultat. En tabell över förlängning primers justeras av storlek, inklusive målet koncentrationen, den volym som används i primer poolen och slutlig koncentration för varje primer i primer poolen för väl 2. Mängden vatten som krävs för att göra till den slutliga volymen finns längst ned i tabellen. Den totala volymen av primer poolen var 1,5 mL.
| Master Mix | Låg Plex (1-18) | Hög Plex (19-36) | ||
| Reagens | × 1 | × 410 | × 1 | × 410 |
| Vatten (avjoniserat) | 0.7395 | 303.195 | 0,619 | 253.79 |
| Buffert | 0,2 | 82 | 0,2 | 82 |
| Uppsägning mix | 0,1 | 41 | 0,2 | 82 |
| Primer mix (LPA justerat) | 0,94 | 385.4 | 0,94 | 385.4 |
| iPLEX enzym * | 0.0205 | 8.405 | 0,041 | 16,81 |
| Totalt | 2 ΜL | 820 ΜL | 2 ΜL | 820 ΜL |
Tabell 8: reagenser och koncentrationer för förlängning reaktionen master mix. I detta fall bör volymer för låg-Plex reaktioner användas om det finns 18 eller färre SNP i brunnen. Använd hög Plex reaktioner volymerna för 19 eller flera SNP. Detta är annorlunda SNP kraven i låg-plex och hög-plex av förstärkning PCR huvudmixen beskrivs i tabell 2.
| Termocyklern villkor |
| 94 ° C i 30 s |
| 40 cykler av (94 ° C 5 s, (5 cykler av 52 ° C 5 s, 80 ° C 5 s)) |
| 72 ° C under 3 min |
| 4 ° C Håll |
Tabell 9: Termocykler villkor för förlängning reaktionen
| Mat allergisk fall vs icke-allergiska livsmedelskontroller | |||||
| SNP | A1 | P | ELLER | L95 | U95 |
| rs1295686 | A | 0,003 | 1,75 | 1.2 | 2,53 |
| rs2243297 | A | 0,13 | 2.1 | 0,8 | 5,51 |
| rs1295687 | G | 0,19 | 1.63 | 0,78 | 3.41 |
| rs2243211 | A | 0,22 | 1,45 | 0,8 | 2,64 |
| rs1295683 | T | 0,25 | 1,32 | 0,82 | 2.13 |
| rs2243248 | G | 0,51 | 1.21 | 0,69 | 2.11 |
| rs2243300 | T | 0,51 | 1.19 | 0,7 | 2,02 |
| rs1800925 | T | 0,6 | 1.11 | 0,75 | 1.63 |
| rs3091307 | G | 0,62 | 1.1 | 0,75 | 1.6 |
Tabell 10: Variant rs1295686 av den IL13 locus är associerad med utmaning-bevisad födoämnesallergi. Logistisk regressionsanalys, justerat för härkomst, kön och förekomst av atopisk eksem, avslöjade den variant rs1295686 är associerad med utmaning bevisad födoämnesallergi i discovery kohorten (n = 367 ärenden och 156 icke-allergiska kontroller). Kolumnen SNP visar markörer som undersöks, kolumnen A1 visar den mindre allelen, används som referens allelen för association test. Kolumnen P listar de P-värdena från regressionsanalysen, kolumnen OR visar de motsvarande oddskvoten och L95 och U95 är de lägsta och övre gränserna för det 95% konfidensintervallet från analysen. Uppgifter som återges från Ashely et al., 20179.
| A. replikering analys: mat allergisk fall vs icke-allergiska livsmedelskontroller | B. metaanalys – upptäckt och replikering | ||||||||||
| SNP | A1 | ELLER | L95 | U95 | P | P | P(R) | ELLER | OR(R) | Q | Jag |
| rs1295686 | A | 1,37 | 1,03 | 1,82 | 0,03 | 0,0005 | 0,0006 | 1.5 | 1.5 | 0,31 | 3,32 |
| rs1295687 | C | 1.1 | 0,68 | 1,78 | 0,7 | 0,3 | 0,3 | 1.24 | 1.24 | 0,38 | 0 |
Tabell 11: Replikering i en oberoende befolkning bekräftar sambandet mellan IL13 variant rs1295686 och utmaning-bevisad födoämnesallergi. Logistisk regression, korrigerat för ancestry huvudkomponenter, sex och atopisk eksem, en oberoende population (n = 203 mat allergisk fall och 330 icke-allergiska kontroller) bekräftade sambandet mellan variant rs1295686 och födoämnesallergi. Meta-analys utfördes sedan, att tillhandahålla den högsta nivån av bevis för en association mellan SNP och resultatet, med lite bevis heterogenitet i praktiken storlekar mellan de två populationerna på denna SNP. Här kolumnerna är enligt tabell 10, med ytterligare P(R) och OR(R) värden för slumpmässiga effekter metaanalysen modell vs den fasta effekter modellen (P och eller). Q och jag är P-värdet för Cochrane testet och jag-index, båda är åtgärder av heterogenitet i effekt storlekar mellan studierna. Uppgifter som återges från Ashely et al., 20179.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här visar vi metoden för multiplexering genotypning med masspektrometri. De representativa resultat genererades med PCR parat med MALDI-TOF masspektrometri4 med assay kemi som förtecknas i Tabell av material13. Med den här plattformen genererat vi totalt 11,295 genotyper 1 255 enskilda för 9 SNP inom 40 h i labbet.
Vi illustrera nyttan av tekniken i svara genetiska hypoteser genom att generera och analysera SNP data för kandidat genen IL13 i en discovery kliniska kohort phenotyped för födoämnesallergi och med oberoende replikering. Plattformen är relativt robust till lägre DNA kvalitet och kräver minimal utgångsmaterial, insatsen av endast 10 ng. Kritiska steg i protokollet omfattar följande: noggrann felsökning av assay designprocessen att säkerställa maximal SNP inkludering i multiplexade analyserna, framgångsrika förstärkning av Regionkommittén mål under förstärkning PCR, framgångsrika singel nukleotid förlängning under förlängning reaktion och lastning av test och prov plattan layouten i analys programvara för programvaran till korrekt tilldela masspektra data.
Som tidigare nämnts är verktyget assay design kompatibelt med användning av mus och bovin polymorfismer, i tillägg till mänskliga. För andra organismer såsom mikrob eller växt, kan ”annat” väljas i menyn ”organismen”. De automatiserade steg för att hitta proximala SNP och identifiera optimala primer områden kan dock inte tillgängliga.
Under designprocessen, om en proximal SNP blockerar identifiering av en optimal primer område, kan antingen ta bort SNP från design och välj en annan i hög LD (t.ex., r2 = 1), eller välja att utforma två primers, en med referens allel av SNP och en med den alternativa allel, utforma en primer med den vanliga allelen eller maskering SNP med en universell bas (t.ex., inosin). Om det finns ett problem med att identifiera en unik plats för primer, kan man ändra amplikon längd inställningarna för att hitta en unik plats. Standardinställningen är 80-120 bp men detta kan ändras från 60-400 bp. Det bör dock noteras att om arbetar med försämrat DNA (t.ex., från FFPE-vävnad), det inte är idealiskt att öka amplikon längden.
Fel under analysens design steg av verktyget kan innehålla höga hårnål eller primer dimer potentiella. Båda inställningarna kan vara avslappnad för att prova en rymma mönster. Det rekommenderas dock att tröskelvärdena inte är avslappnad under 0,8; börja med 0,9 till se om den här inställningen är tillräcklig för att rädda SNP och minska till 0,8 endast om det behövs. I de avancerade inställningarna är det möjligt att ändra antalet design iterationer (upp till 10) under fliken Multiplex ”4. Utforma Assays ”, samt bästa iteration urvalskriterierna till antingen Högsta genomsnittliga Multiplex eller Minsta avvisar av låg Plex. Öka antalet design iterationer kan vara fördelaktigt eftersom verktyget kommer att ta första SNP i den ordning de tillhandahölls och kommer att utforma ett test. Sedan testar om nästa SNP är kompatibel för den samma multiplex assay. Således, ordning SNP ärendet. Med alternativet flera iterationer markerat, kommer att programvaran Slumpa ordning på SNP och prova andra iterationer. Detta kan öka antalet SNP kunna utformas i varje multiplex eller kan minska antalet SNP avvisar. Men kommer det också en tid kostnad, eftersom designverktyget kommer att ta mycket längre på detta steg.
Multiplexade genotypning är en snabb och prisvärd metod för utredning av loci av intresse. Metoden är strömlinjeformad och tillåter driften av cirka 760 prover av upp till 40-plex SNP i 10 timmar, tillåter tiotusentals genotyper som ska genereras i mindre än en dag14. Masspektra kan enkelt analyseras med verktyg som tillhandahålls av plattformen.
Några begränsningar till plattformen inkluderar en beräknad förlust på 5-10% av SNP som misslyckas assay designprocessen. Detta kan ibland korrigeras genom val av ett alternativ tagg eller proxy SNP. Broad Institute's SNP annotering och Proxy Sök (SNAP) databasen är ett sådant verktyg som underlättar identifiering av proxy SNP15. En annan begränsning av systemet är att det är en riktad plattform och därför tillåter inte för omfattande roman upptäckten, som uppnås med genome-wide metoder. Dessutom som metoden använder tagg-SNP proxyservrar för att maximera täckning över gener, behövas fine-mapping studier därefter att avgöra den exakta kausala varianten.
Multiplexade genotypning är fortfarande en användbar plattform för förhör av sjukdomsassocierade SNP identifieras i GWA studie metoder eller hypotes driven väg och kandidat gene utforskning. Framtida applikationer för plattformen är sannolikt nya användningsområden för diagnostik och screening inom områden såsom cancer och klinisk virologi. Övergripande är multiplexade genotypning med masspektrometri en snabb, kostnadseffektiv och pålitlig medium-genomströmning metod för genotypning kandidat loci.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna har inga bekräftelser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Genomic DNA | - | - | 1 μL at a concentration of 5-10 ng/μL |
| Primers: forward and reverse amplification and extension | IDT | - | see manuscript section 1.2.1 on design of primers |
| Deionized water | E.g. Milli-Q water | - | deionized with 18.2 MΩ.cm resistivity |
| Genotyping reagent kit. iPLEX Gold Chemistry reagent set | Agena Bioscience | #10148-2 | includes all reagents for reactions in 2.2.1, 2.3.1 and 2.4.2 , chip and resin |
| PCR plates (384-well) | Abgene | #ABGAB-1384 | For the MassARRAY system plates by Abgene are compatible |
| Micropipettes | single and 8-channel | ||
| Centrifuge | compatible with 384-well plates | ||
| Thermocycler | compatible with PCR programs as detailed in 2.2.4, 2.3.2 and 2.4.3 | ||
| Dimple resin plate | Agena Bioscience | 6mg, 384-well | |
| Plate rotator | |||
| MassARRAY Analyzer 4 System | Agena Biosciences | MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization – time of flight) Mass Spectrometer. | |
| RS1000 Nanodispenser | Agena Biosciences | ||
| Assay Design Suite | Agena Biosciences | Tool used to design the multiplex genotyping assays | |
| Hot Start Taq | DNA polymerase enzyme | ||
| Resin | Agena Biosciences | Supplied with iPLEX kit |
References
- Aronson, S. J., Rehm, H. L. Building the foundation for genomics in precision medicine. Nature. 526 (7573), 336-342 (2015).
- Ball, R. D. Designing a GWAS: power, sample size, and data structure. Genome-Wide Association Studies and Genomic Prediction. , 37-98 (2013).
- Kwon, J. M., Goate, A. M.
- Oeth, P., Mistro, G. D., Marnellos, G., Shi, T., van den Boom, D. Qualitative and quantitative genotyping using single base primer extension coupled with matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MassARRAY). Single Nucleotide Polymorphisms: Methods and Protocols. , 307-343 (2009).
- Pusch, W., Kostrzewa, M. Application of MALDI-TOF mass spectrometry in screening and diagnostic research. Current pharmaceutical design. 11 (20), 2577-2591 (2005).
- Su, K. Y., et al. Pretreatment epidermal growth factor receptor (EGFR) T790M mutation predicts shorter EGFR tyrosine kinase inhibitor response duration in patients with non-small-cell lung cancer. Journal of clinical oncology. 30 (4), 433-440 (2012).
- Singhal, N., Kumar, M., Kanaujia, P. K., Virdi, J. S. MALDI-TOF mass spectrometry: an emerging technology for microbial identification and diagnosis. Frontiers in microbiology. 6, 791 (2015).
- Cricca, M., et al. High-throughput genotyping of high-risk Human Papillomavirus by MALDI-TOF Mass Spectrometry-based method. New Microbiologica. 38 (2), 211-223 (2015).
- Ashley, S., et al. Genetic Variation at the Th2 Immune Gene IL13 is Associated with IgE-mediated Paediatric Food Allergy. Clinical & Experimental Allergy. 47 (8), 1032-1037 (2017).
- Bousman, C. A., et al. Effects of NRG1 and DAOA genetic variation on transition to psychosis in individuals at ultra-high risk for psychosis. Translational psychiatry. 3 (4), e251 (2013).
- Moffatt, M. F., et al. A large-scale, consortium-based genomewide association study of asthma. New England Journal of Medicine. 363 (13), 1211-1221 (2010).
- Granada, M., et al. A genome-wide association study of plasma total IgE concentrations in the Framingham Heart Study. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 129 (3), 840-845 (2012).
- Oeth, P., et al. iPLEX assay: Increased plexing efficiency and flexibility for MassARRAY system through single base primer extension with mass-modified terminators. Sequenom application note. 27, (2005).
- Ellis, J. A., Ong, B. The MassARRAY System for Targeted SNP Genotyping. Genotyping: Methods and Protocols. , 77-94 (2017).
- Johnson, A. D., et al. SNAP: A web-based tool for identification and annotation of proxy SNPs using HapMap. Bioinformatics. 24 (24), 2938-2939 (2008).
