Summary
Identifikasjon av genetisk varianter bidra til komplekse menneskelig sykdom tillater oss å identifisere romanen mekanismer. Her viser vi en multiplex genotyperingteknologi tilnærming til kandidat gener eller genet sti analyse som maksimerer dekningen til lav pris og er mottakelig for kohort-baserte studier.
Abstract
Komplekse sykdommer er ofte understøttet av flere vanlige genetisk varianter som bidrar til sykdom mottakelighet. Her beskriver vi en kostnadseffektiv tag single nukleotid polymorfisme (SNP) tilnærming med en multiplex genotyperingteknologi analysen massespektrometri, undersøke genet veien foreninger i klinisk kohorter. Vi undersøker mat allergi kandidat locus Interleukin13 (IL13) som et eksempel. Denne metoden maksimerer effektivt dekning ved å utnytte delte sammenhengen ulikevekt (LD) innenfor et område. Valgte LD SNPs deretter utformes i en multiplex analysen, slik at opptil 40 forskjellige SNPs skal analyseres samtidig øke kostnadseffektivitet. Polymerasekjedereaksjons (PCR) brukes til å forsterke målet loci, etterfulgt av single nukleotid utvidelse, og amplicons er deretter målt ved hjelp av matrix-assistert laser desorpsjon/ionisering-tid av flight(MALDI-TOF) massespektrometri. Rå produksjon er analysert med genotype ringe programvare, med streng kvalitetskontroll definisjoner og avskjær, og høy sannsynlighet genotyper er bestemt og for dataanalyse.
Introduction
I menneskelige komplekse sykdom, genetisk varianter bidrar til sykdom mottakelighet og kvantifisere disse variantene kan være nyttige for forståelsen patogenesen, identifiserer pasienten høyrisikogrupper og behandling respons. Løftet om presisjon medisin er faktisk avhengig utnytte genomisk informasjon for å identifisere pasienten undergrupper1. Dessverre innen komplekse sykdom biologi, der sykdommen fenotyper er understøttet av betydelig genetisk heterogenitet og lav penetrance variabel expressivity, kohort størrelse krav for genomet hele tilnærminger til å identifisere roman kandidater er ofte prohibitively store2. Alternativt begynner en målrettet kandidat genet tilnærming med en en priori hypotese om bestemte gener/stier i sykdom etiologi3. Sti analyseverktøy brukes vanligvis til å undersøke i Patofysiologien ved en identifiserte målet loci, genererer mange kandidat stier å bli utforsket. Her viser vi en multiplex genotyperingteknologi tilnærming slik at etterforskningen av titalls til hundrevis av SNPs med ett analysen, egnet til menneskelig kohort studier4. Denne tilnærmingen er relativt høy lakkeringsverksteder, tillater hundrevis til tusenvis av DNA-prøver å være genotyped for romanen oppdagelsen studier og undersøkelser av bestemte stier. Metodene som er nevnt her er nyttig for å identifisere risiko alleler og tilknytning med klinisk trekk i en relativt rask og billig måte. Denne plattformen er svært fordelaktig for sortering og diagnostiske formål5,6, og mer nylig for mikrobielle infeksjoner7 og humant papillomavirus8.
Denne protokollen begynner med valg av gener for etterforskning, dvs., regionene mål, typisk fastsettes gjennom litteratur søker, eller en priori hypoteser for engasjement i sykdommen prosessen; eller kanskje valgte for replikering som ledende sammenslutninger av en oppdagelse genomet hele association (GWA) studie. Fra Gen sett velge forskeren en raffinert over koden SNPs. Dvs brukes den sammenhengen ulikevekt (LD) eller korrelasjon mellom varianter i regionen til å identifisere en representant "tag SNP" for en gruppe med SNPs i høy LD, kjent som en haplotype. Den høye LD i regionen betyr at SNPs er ofte arvet sammen slik at genotyperingteknologi en SNP er tilstrekkelig til å representere variasjonen på alle SNPs i haplotype. Alternativt, hvis følger på en endelig liste med SNPs fra mange områder, f.eks., replikering for en GWA studie, denne prosessen kan være unødvendig. For multiplex genotyperingteknologi, må analysen deretter være utformet rundt disse målene slik at forsterkningen primerne er ulik masse de forlengelsen primerne og produkter å produsere interpretable masse spectra. Disse parameterne er lett implementert av en multiplex genotyperingteknologi analysen design verktøyet. Revers primerne fra denne designen brukes til målet markører av interesse og forsterke sekvensen som inneholder av SNP. Utvidelse primerne knytte direkte proksimale til SNPs og en enkelt, masse endring, "terminator"-base som er komplementære til av SNP er lagt. Terminator basen forhindrer ytterligere utvidelse av DNA. Masse-endring av basen kan fragmenter ulike av én base kan oppdages av massespektrometri. Platen inneholder genotyperingteknologi kjemi brukes deretter til en chip for måling på en massespektrometri plattform. Etter bruker riktig kvalitetskontroll rå genotyperingteknologi samtaler registrert av systemet, kan dataene eksporteres og brukt til statistisk analyse for å teste for tilknytning sykdom fenotyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Det genetiske materialet brukes her var etisk godkjent for bruk av Office for barn HREC (menneskelige forskning etikk) (CDF/07/492), Institutt for Human Services HREC (10/07) og Royal Children's Hospital (RCH) HREC (27047).
1. design multiplex analysen
- Forberede en SNP liste analysen design.
- Inn målregion taggeren funksjon Haploview (https://www.broadinstitute.org/haploview/downloads). Bruk LD (korrelasjon, r2) mellom SNPs spenner målregion for å generere en liste over SNPs, som gir full dekning av ønsket område med færrest nødvendig varianter. Generere en liste over SNPs slik at alle alleler overføres er korrelert over en brukerdefinert grense (f.eks., r2 ≥0.8).
- Identifikasjon av egnet sekvenser for fremover, bakover og utvidelse primere
- Angi genererte listen over SNPs i analysen design verktøyet av valget.
Merk: Instruksjonene nedenfor gjelder analysen design verktøyet brukes til å generere representant resultater, som angitt i Tabellen for materiale. - Når utformingsverktøyet analysen er startet, velg Nytt genotyperingteknologi Design. Angi et navn for analysen design i feltet Navnet .
- Gir listen SNP genereres i trinn 1.1.1 ved å klikke på knappen merket Redigere skriving med rs eller FASTA til venstre for knappen.
Merk: SNPs kan angis i en tekstliste referanse (rs) SNP IDer eller lastet opp i FASTA format, eller filformatet SNP-gruppen brukes av verktøyet. Laste opp filer i disse formatene, velg knappen Filopplasting . Den øvre grensen av varianter som kan utformes til en enkelt analysen, kalt "Vel," er 40 SNPs. Det er mulig å angi SNPs som en prioritet for design før løpe; Dette vil bli utformet først. Kontroll SNPs kan angis: for eksempel analysen å oppdage kjønn ved eksempel blanding ups eller en kontroll for å fastslå tilstrekkelig malen ble lagt hvis arbeider med lav eller dårlig kvalitet DNA. Det bør imidlertid bemerkes at bruk av kontroll og prioritet SNPs kan redusere antall SNPs som kan utformes i én godt. - Velg alternativet høy multipleksing iPLEX forhåndsinnstilt på forhåndsinnstilling -menyen. Menyen organisme , Velg organismen som DNA skal genotyped stammer. For representant resultatene presenteres her, var dette menneske.
Merk: Mus og storfe organismer er også kompatibel med verktøyet. Man kan også velge andre hvis arbeider med en alternativ organisme som plante eller mikrobe; men kan automatisert trinnene for å finne proksimale SNPs og optimal primer områder ikke tilgjengelig på grunn av en referanse genom. - Velg det nyeste bygge av genomet eller en alternativ bygge om nødvendig menyen i kjemi på Database -menyen. Velg iPLEX og angi høyeste multipleksing for feltet Multiplex nivå : 40. Nå velger du Begynner å kjøre. "Trinn 1" i verktøyet vil starte.
Merk: Under trinn 1 verktøyet henter og formater SNP sekvenser. Her, kan feil inneholde formatering av filen FASTA der tilfelle FASTA filen bør være sjekket og formateres etter behov. En annen feil er SNP rs tall som er slått sammen med en annen rs nummer, som tilfellet hvor retten skal søkes i en SNP database som den NCBI dbSNP å identifisere nye SNP rs nummeret. Sekvenser rundt av SNP søkes det etter alle kjente proksimale SNPs som kan forstyrre primer design. Potensielle PCR primer områder sammenlignes mot genomet å unngå ikke-spesifikk forsterkning på grunn av flere treff i genomet. - Venter på ferdigstillelse av "Trinn 2" i utformingsverktøyet som proksimale SNPs vil bli identifisert.
Merk: Hvis bruker en organisme som ikke støttes av dette trinnet, kommentere sekvenser med proksimale SNPs i IUPAC merknad Hvis denne informasjonen er tilgjengelig. Det er sjelden feil i dette trinnet; Imidlertid kan feil oppstå hvis feil referanse organisme eller genomet ble valgt, eller hvis cDNA sekvenser ble registrert enn genomisk DNA. For å optimalisere trinn 2 under Avanserte innstillinger, er det mulig å filtrere ut SNPs basert på en befolkning hvis arbeider i en bestemt populasjon. Sjeldne SNPs kan også filtreres av unntatt de med en frekvens under 1%. SNPs som ikke har statusen godkjent eller ikke har befolkningen informasjon kan endelig også utelates hvis ønskelig. - Venter på ferdigstillelse av "Trinn 3" i utformingsverktøyet som identifiserer optimal primer regioner. Hvis foretrukket primer steder har blitt identifisert, eller hvis arbeider med en annen organisme, manuelt input primer steder av kommentere inndatasekvensen (SNP gruppe filer) med foretrukket primer regioner med store bokstaver og resten av sekvensen i nedre Case, velge Bevare tilfelle menyen avanserte innstillinger for dette trinnet.
Merk: Feil for trinn 2 og 3 kan inkludere: (1) A proksimale SNP blokkerer utformingen av en primer med løsning å maskere en ikke-mal base og bestille en oligo en universell base som Isonine, eller designe to primere, med hver av alleler av proxim Al SNP, eller design en primer med det vanlige allelet bare. (2) en annen vanlig feil er å identifisere et unikt sted for primer med løsningen er å endre hvor amplicon for å identifisere et unikt område. Standard er verktøyet som brukes for denne utredningen, 80-120 bp. Dette kan endres fra 60-400 bp i dialogen Avanserte innstillinger under Amplicon lengde innstillingene i "3. Identifisere Optimal Primer områder"og også under kategorien Amplicon "4. Design analyser." Kontroller begge er endret. Det bør imidlertid bemerkes at øke lengden på amplicon når bruker dårligere DNA ikke er anbefalt. - Venter på ferdigstillelse av analysen design trinnet ("trinn 4" design verktøyet), her verktøyet skal gi optimal pass skille mellom utvidelse primerne og alleler på alle SNPs i multiplex design. Når dette trinnet er fullført, kan du eksportere filen Oligo orden, som er formatert for enkel bestilling gjennom en oligo bestilling av valg.
Merk: Forsterkning primere (fremover (F) og omvendt (R)) er designet for å produsere en optimal amplicon størrelse 80 til 120 bp. Forsterkning primer masse må avvike fra den filtype primeren og dens fabrikat å unngå motstridende resultater i mass spekteret og for PCR ytelsen. Utvidelse primer skal 15 til 30 nukleotider lang (4500-9,000 Da), utformet slik at 3 slutten vil legge direkte ved siden av polymorfisme. Alle disse innstillingene angis automatisk i verktøyet brukes til å generere representant resultatene.
- Angi genererte listen over SNPs i analysen design verktøyet av valget.
- Eksportere design fra de valgte verktøyet og orden primerne fra en oligomer leverandør: 25 nmol av PCR primere (forover og bakover) og 100 nmol av hver forlengelsen primerne. Se tabell 1 for primerne brukes til å generere representant resultatene.
2. genotyperingteknologi (1-2 dager)
- Forberede forsterkning primere.
- Hvis lyofilisert primere bestilt, Rekonstituer med molekylær klasse vann. Bruk en konsentrasjon av 100 μM/μL forover og bakover grunning og 500 μM/μL for utvidelsen.
- Bassenget forover og bakover grunning for hver multiplex analysen i en lager primer blanding, inneholder hver primer på en konsentrasjon på 0,5 mM.
Merk: For eksempel, en 400 μL primer pool for 400 reaksjoner:
2 μL av hver primer, i en konsentrasjon av 100 μM/μL, kreves for lager primer bassenget. For en 30-plex analysen med 60 forover og bakover grunning, totalt 120 μL primer ville være nødvendig (konsentrert primer bassenget). 280 μL molekylær-grade vann legges deretter lage en endelig mengde 400 μL primer blande.
- Forsterkning med Polymerase kjedereaksjon (PCR)
- Gjøre en master blanding for PCR som inneholder 100 nM i primer mix beskrevet ovenfor, 500 μM av dNTPs, 2 mM av MgCl2og 0,5 U av en DNA polymerase enzym. 1 U kreves for større enn 26-plex analyser. Se tabell 2.
- Tilsett 4 μL av denne blandingen i hver brønn av 384-vel PCR plate, sammen med 1 μL genomisk DNA i en konsentrasjon av 5-10 ng/μL.
Merk: kvalitetskontroll bør også inkluderes på plate, som en ikke-mal-kontroll og en positiv kontroll som tidligere utført med analysen (under en prøvekjøring). Hvis kjører flere plater, flere DNA prøver den andre plate(s), f.eks., i tre eksemplarer, bør kjøres som teknisk kontroller for Inter plate variasjon. - Sentrifuge platen på 200 x g for 1 min ved romtemperatur med en plate cover som sikrer alle flytende finnes på bunnen av platen.
- Kjøre PCR med følgende thermocycler: 4 min incubation 94 ° c å aktivere DNA polymerase; 45 sykluser av følgende (rødsprit 94 ° c for 20 s, annealing på 56 ° C for 30 s og utvidelse ved 72 ° C i 1 min) og deretter en endelig utvidelse ved 72 ° C i 3 min. henvis til PCR programmet i tabell 3.
- Utføre agarose gel geleelektroforese DNA amplifikasjon er vellykket. Bruk 1 µL PCR produktet (med 3 µL av lasting buffer) på en 2% (w/v) agarose gel, bestående av agarose pulver og 0,5% Tris Borate EDTA (TBE) buffer, og kjøre på 45 min 100 V.
- Reker alkalisk fosfatase (SAP) rensing trinn
Merk: Dette trinnet brukes til å fjerne kommunefritt nukleotider. SAP enzymet kløyver fosfat grupper for å forhindre overflødig primer og kommunefritt dNTPs forstyrrer i kommende forlengelsen reaksjonen.- Gjøre en master blande inneholder 1,7 enheter/μL av reker alkalisk fosfatase (SAP) enzym, 10 x SAP buffer og utgjør volumet med molekylær-grade vann. Se Tabell 4.
- Legge til 2 μL av nystekte opp SAP master mix hver brønn av plate, allerede inneholder 5 μL PCR reaksjonen. Sentrifuge kort og gå tilbake til thermocycler på 37 ° C i 40 minutter og deretter på 85 ° C i 5 minutter for enzym inaktivering. Se tabell 5.
- Primer forlengelsen reaksjon
Merk: Konsentrasjonen av filtypen primerne i forlengelsen primer mix må justeres etter størrelse (lineær Primer justering-LPA). Dette er fordi det er en invers sammenheng i topp intensitet (på til masse spectra) og produkt massen. Justering av filtypen primer konsentrasjonen korrigerer for dette forholdet å produsere toppene av lik intensiteter. Justert primere brukt til å generere representant resultatene er gitt i tabeller 6 og 7. Volumene gitt er å generere 1,5 mL forlengelsen primer mix.- Beregne fortynning faktorer for hver primer benytter en gradient algoritmen, tilgjengelig fra Agena biovitenskap ("lineær Primer justering"), som justerer for masse og konsentrasjonen av primer og antall primere i multiplex reaksjonen (se Tabeller 6 og 7). Angi UEP massen for hver primer i feltet UEP_MASS av lineær Primer justering arket.
Merk: Masse justert konsentrasjonen for primer vil bli automatisk beregnet i cellen med toppteksten "Målet reaksjon konsentrasjon (µM)." Volumet av primer legges til primer bassenget vil være produksjonen i cellen under toppteksten "Volum lager Primer legges til bassenget (µL)." Volumet av vann legges til primer bassenget utgjør de beregnede konsentrasjonene er utgang til cellen ved siden av teksten "volumet av PCR klasse RNase gratis H2O lagt Primer bassenget (µL)." - Ta volumet av hver primer som er angitt i filen lineær Primer justering og utgjør en primer pool. Legg volumet av vann beregnet av algoritmen å fortynne primer bassenget som i trinn 2.4.1.
Merk: Hvis metoden gradient algoritmen er utilgjengelig, en annen metode er å dele primerne i lav og høy masse og legge til dobbel konsentrasjonen av høy masse primerne i forhold til lav masse gruppen. Tre eller fire grupper kan være nødvendig for en høy-plex analysen (det vil si mer enn 19 SNPs). Men vil denne metoden ikke gi som optimal samtale priser som metoden gradient algoritme. - Samle filtypen master mix. For lav plex analysen (1-18 plex), legge 0,2 μL buffer, 0.1 μL oppsigelse blanding, 0.94 μL LPA justert primer mix og 0.0205 μL av enzym (forberedt på is). For høy plex analysen (19-36 plex), legge dobbel konsentrasjon av avslutning blanding og enzym (avslutning blanding 0,2 μL og iPLEX enzymet 0.041 μL). Se tabell 8.
- Legge til 2 μL forlengelsen reaksjonen master blanding til platen fra forrige reaksjonen, nå bringer det totale volumet til 9 μL per brønn. Sentrifuge kort og plasser i thermocycler: 94 ° C i en 30 s første inkubering, 40 sykluser av 1 x 94 ° C for 5 s med 5 x (52 ° C i 5 s, etterfulgt av 80 ° C i 5 s), og deretter 72 ° C for 3 min. se tabell 9.
- Beregne fortynning faktorer for hver primer benytter en gradient algoritmen, tilgjengelig fra Agena biovitenskap ("lineær Primer justering"), som justerer for masse og konsentrasjonen av primer og antall primere i multiplex reaksjonen (se Tabeller 6 og 7). Angi UEP massen for hver primer i feltet UEP_MASS av lineær Primer justering arket.
- Harpiks rensing.
Merk: Overflødig salter kan nå fjernes fra reaksjon med bruk av harpiks.- Legge til 16 μL deionisert vann i brønnene av Hentet plate, bringe volumet i platen opp til 25 μL.
- Bruke harpiks, vanligvis 6 mg smilehull harpiks platen (kjøpes separat), jevnt til hele platen. La skal tørke i harpiks smilehull plate for 20 min ved romtemperatur før påføring av reaksjon-platen. Etter tillegg av harpiks, rotere platen i 5 minutter ved romtemperatur enten for hånd eller med en suspensjon mikser på sakte fart (f.eks., 7,5 rpm).
Merk: Før lasting genotyperingteknologi analytt på genotyperingteknologi chip, prøver og oppsettet analysen må være innspill til port. Dette kan oppnås ved hjelp av filen Design Sammendrag fra analysen utformingsverktøyet.
- Mål på en massespektrometri plattform.
- Sentrifuge platen 3200 x g i 5 min å unngå bruk av harpiks til masse spectra chip.
- Last opp platen oppsettet av prøver til systemets programvaregrensesnitt før run.
Merk: Trinn 2.6.3 skal kun utføres av opplært personale. - Bruke genotyperingteknologi analytt blanding fra platen til genotyperingteknologi chip med en dispensering system. Last chip på MALDI-TOF systemet generere til masse spectra fra analytt blandingen, som kan deretter tolkes ved hjelp av plattformen programvaregrensesnitt.
Merk: Systemet genererer til masse spectra leder korte pulser av UV-lys på hver "pute," tilsvarer en enkelt brønn av genotyperingteknologi plate, av masse spectra chip. Denne puls resulterer i desorpsjon og ioniseringen i analytt med. Disse ionisert DNA molekyler er så drevet til toppen av vakuumrør av et høyspenning elektrostatiske felt, skiller ut lettere ioner, som reise raskere og nå detektoren først fra de tyngre ionene. «Tiden for flygningen"av disse analytter er registrert av systemet, som massen av hver DNA fragment kan bestemmes og dermed nukleotid base i av SNP kan konkluderes.
3. genotyperingteknologi Data
Merk: kvalitetskontroll og data tolkning er ikke fokus på notatet metodikk. Imidlertid dekker følgende kort tolkning av til masse spectra.
- Manuell inspeksjon og kvalitetskontroll av masse spectra.
Merk: De rå masse spectra er generert av systemet og analysert med programvaren som er oppført i Tabellen for materiale. En Gaussian blanding klynging metoden brukes denne utgangen probabilistisk genotyperingteknologi ringer.- Åpne analyseprogramvare. Velg Typer Analyzer. Fra fil -menyen, velg Åpne brønner fra filen og Velg XML-filen med spektrum data generert i trinn 2.6.3. Chip navnet for Kjør skal være synlig, velge den og en "rødt lys"-panelet i 384-vel platen vises med en liste over SNPs i valgt godt. Her velger du Kaller klynge tomter til å vise en scatterplot datapunkter for hver SNP.
Merk: Det anbefales at en "ingen call" resultatet brukes for lav intensitet SNPs. I programmet brukes for representant resultatene er en klynging omfanget cut-off av 5, som er høyere enn standard, foreslått for streng kvalitetskontroll. Denne innstillingen kan justeres i størrelsen Cutoff feltet under Parametere i ruten Innlegg behandling klynger . Velg Autocluster verktøy å kjøre en klynge analyse . - Utføre manuell inspeksjon av genotype samtaler ved å undersøke det kartesiske tomter i ruten for behandling av Post. I ruten analysen Velg SNP av interesse og klikk på kategorien Etterbehandling klynger , en klynge med genotype klynging tomt vil vises med eksempel IDer og tilsvarende genotyper for av SNP.
- Undersøk genotype samtale klynger og vurdere hvor godt hvert individuelle kall klynger med de øvrige samtalene for av SNP. Programvaren gir noen grense linjer på tomten for hver genotype for veiledning; se eksempel på en genotype samtaler klynge tomt fra en IL13 SNP (figur 1). Hvis samtalen ikke klynge tett med andre samtaler og sitter tydelig utenfor en klynge, eller hvis den har svært lav intensitet, høyreklikk datapoint og velg Endre kaller manuelt sette det ingen Ring.
- For å sikre høy kvalitet genotyperingteknologi data brukes til nedstrøms, utelukke SNPs og personer med samtale priser under en QC terskel, f.eks 90%. Når nødvendige justeringer er gjort til samtaledata, eksportere data for statistiske programmer. I programmet brukes til å generere representant resultatene (vist i Tabellen for materiale) oppnås dette med Plate Data valg fra Vis-menyen og velge Lagre som.
- Åpne analyseprogramvare. Velg Typer Analyzer. Fra fil -menyen, velg Åpne brønner fra filen og Velg XML-filen med spektrum data generert i trinn 2.6.3. Chip navnet for Kjør skal være synlig, velge den og en "rødt lys"-panelet i 384-vel platen vises med en liste over SNPs i valgt godt. Her velger du Kaller klynge tomter til å vise en scatterplot datapunkter for hver SNP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med protokollen beskrevet ovenfor, vi genotyped merke SNPs over Th2 immun genet IL13 i en kohort av mat allergi tilfeller og kontroller9. Vi brukt logistisk regresjonsanalyse, justert for opphav og andre potensielle covariates, å teste om genetisk variantene i regionen rundt økt mat allergi risiko. Tabell 10 9 viser at en variant rs1295686 er knyttet til utfordring-bevist matallergi og vi bekreftet dette forening i en replikering kohort bruker samme multiplekset genotyperingteknologi tilnærming. En meta-analyse av resultatene fra to kohortene gitt av sammenslutning av IL13 med FA (Tabell 11)9. Vi genetisk utledes og justert for opphav i analysen en anen informativ SNP markør-panelet, tilpasset fra en publisert panelet10. Vi genotyped panelet bruker samme multiplekset analysen tilnærming.
Den tilknyttede varianten, rs1295686, er identifisert som en astma risiko loci11 og forbundet med andre allergiske immunologiske parametere12, noe som tyder på det kan være en generell allergisk sykdom risiko loci tidligere. Neste trinn vil være å gjennomføre ytterligere studier, som differensial uttrykk analyse, kartlegging fysisk interaksjon med en chromatin fange metode, fine tilordning av regionen og haplotype analyse, feste punkt funksjonelle varianten og karakterisere biologien bak observert foreningen med matallergi.
Figur 1: kartesiske klynge tomten for IL13 SNP-rs1295686. Gul klynger representerer homozygous genotype Etterlyser A-allelet, blå for G allelet og grønn for heterozygote samtaler. Noen genotype samtaler som ikke klynge med enten til homozygous eller heterozygote masse spectra ble satt til "ingen samtale."
Tabell 1: Primer sekvenser brukes til å generere representant resultatene for IL13. Navnkolonnen viser SNP-IDen, hvor godt (som nevnt tidligere, "Vel" tallet henviser til IDen for multiplex analysen), og type primer (F for fremover, R for omvendt og UEP for utvidelse primer). Kolonnene til neste inneholder en rekke primer, størrelsen på primer og hvilken rensing. Det bør bemerkes at SPINK5 og en anen Informative markører (AIM) panel var genotyped bruker samme analysen selv om disse resultatene ikke diskuteres presentert representant resultatene. SNPs i _CEU og _CHB se målet SNPs for nordeuropeisk fra Utah og Han-kineserne Beijin Kina bestander fra 1000 genomer prosjektet henholdsvis. Klikk her for å laste ned denne filen.
| Master Mix | Lav Plex (≤26 SNPer) | Høy Plex (> 26 SNP) | |||
| Reagens | CONC. i 5 µL | × 1 | × 200 | × 1 | × 200 |
| Vann (vaskebuffer) | 1.9 | 380 | 1.8 | 360 | |
| Buffer | 1 × (2 mM MgCl2) | 0,5 | 100 | 0,5 | 100 |
| MgCl2 | 2 mM | 0,4 | 80 | 0,4 | 80 |
| dNTPs | 500 ΜM | 0,1 | 20 | 0,1 | 20 |
| Primer blanding ** | 100 nM | 1 | 200 ** | 1 | 200 ** |
| Taq utvalg | 0,5 U / 1 U | 0,1 | 20 | 0,2 | 40 |
| Totalt | 4 ΜL | 800 ΜL | 4 ΜL | 800 ΜL | |
| ** allerede fortynnet med deionisert H20 som beskrevet i 2.1.2 | |||||
Tabell 2: reagenser og konsentrasjoner kreves for å gjøre forsterkningen PCR primer bland. Master mix volumene gis for 200 reaksjoner fordi 400 (nok til å dekke en 384-vel plate) ikke vil passe inn i et 1,5 µL rør og dermed 2 x 200 bør gjøres i separate rør. Volumer som er angitt under lav Plex bør brukes hvis multiplex analysen "Vel" inneholder mindre enn eller lik 26 SNPs, hvis større enn 26 SNPs i godt Bruk høy pleksisettet volumer.
| Thermocycler forhold |
| 94 ° C i 4 min |
| 45 sykluser av (94 ° C 20 s, 56 ° C 30 s, 72 ° C 1 min) |
| 72 ° C i 3 min |
| 4 ° C tak |
Tabell 3: Thermocycler betingelser for forsterkning PCR.
| Master Mix | × 1 | × 410 |
| Vann (vaskebuffer) | 1,53 | 627.3 |
| 10 × buffer | 0,17 | 69,7 |
| SAP enzym (1,7 U/µL) | 0,3 | 123 |
| Totalt | 2 ΜL | 820 ΜL |
Tabell 4: reagenser og konsentrasjoner for master blanding for SAP reaksjonen. Master mix volumer er angitt for 410 reaksjoner å dekke en 384-vel plate med en margin for pipettering feil.
| Thermocycler forhold |
| 37 ° C i 40 min |
| 85 ° C i 5 min |
| 4 ° C tak |
Tabell 5: Thermocycler vilkår som kreves for SAP reaksjonen.
| # | Utvidelse primere | Opprinnelige lager konsentrasjon (µM) | Div. | UEP_ MASS | Målet reaksjon konsentrasjon (µM) | EXT Primer bassenget konsentrasjon (µM) | Volum lager Primer legges til bassenget (µL) |
| 1 | rs36110_CHB | 500 | 4359.8 | 0.560 | 5.36 | 16.09 | |
| 2 | rs10488619_CHB | 500 | 4546 | 0.602 | 5,76 | 17.29 | |
| 3 | rs1986420_CEU | 500 | 4761.1 | 0.648 | 6.21 | 18.62 | |
| 4 | rs2934193_CEU | 500 | 4964.3 | 0.690 | 6.61 | 19.82 | |
| 5 | rs4968382_CEU | 500 | 5047.3 | 0.707 | 6.77 | 20.30 | |
| 6 | rs1227647_CEU | 500 | 5136.4 | 0.724 | 6,93 | 20.80 | |
| 7 | rs1402851_CEU | 500 | 5338.5 | 0.763 | 7,30 | 21.91 | |
| 8 | rs4705054 | 500 | 5476.6 | 0.788 | 7.55 | 22.64 | |
| 9 | rs6928827 | 500 | 5678.7 | 0.824 | 7,89 | 23.68 | |
| 10 | rs9325072 | 500 | 5762.8 | 0.839 | 8.03 | 24.10 | |
| 11 | rs4841401_CHB | 500 | 5853.9 | 0.855 | 8.18 | 24.55 | |
| 12 | rs11098964_CHB | 500 | 6052.9 | 0.888 | 8,50 | 25.51 | |
| 13 | rs2416504_CHB | 500 | 6174 | 0.908 | 8.69 | 26.08 | |
| 14 | rs1860933 | 500 | 6264.1 | 0.923 | 8.83 | 26,50 | |
| 15 | rs2193595_CHB | 500 | 6391.2 | 0.943 | 9,03 | 27.08 | |
| 16 | rs1519260_CHB | 500 | 6469.2 | 0.955 | 9.14 | 27.43 | |
| 17 | rs11184898_CHB | 500 | 6588.3 | 0.973 | 9.32 | 27.95 | |
| 18 | rs679832_CEU | 500 | 6757.4 | 0.998 | 9,56 | 28.68 | |
| 19 | rs326626_CEU | 500 | 6765.4 | 1.000 | 9,57 | 28.71 | |
| 20 | rs1612904 | 500 | 6873.5 | 1.015 | 9.72 | 29.17 | |
| 21 | rs862942 | 500 | 6960.5 | 1.028 | 9.84 | 29.53 | |
| 22 | rs2486448_CHB | 500 | 7169.7 | 1.058 | 10.13 | 30.38 | |
| 23 | rs4824001_CEU | 500 | 7341.8 | 1.081 | 10.35 | 31,06 | |
| 24 | rs6552216_CEU | 500 | 7465.9 | 1.098 | 10.51 | 31.54 | |
| 25 | rs1488299_CHB | 500 | 7620 | 1.119 | 10.71 | 32.13 | |
| 26 | rs1347201_CHB | 500 | 7626 | 1.119 | 10.72 | 32.15 | |
| 27 | rs315280_CHB | 500 | 7747 | 1.135 | 10,87 | 32.60 | |
| 28 | rs11203006_CHB | 500 | 7834.1 | 1.146 | 10.97 | 32.92 | |
| 29 | rs4240793_CHB | 500 | 8036.3 | 1.172 | 11.22 | 33.66 | |
| 30 | rs9325071 | 500 | 8219.4 | 1.194 | 11.43 | 34.30 | |
| 31 | rs12678324_CEU | 500 | 8394.5 | 1.215 | 11.64 | 34.91 | |
| 32 | rs4653130_CEU | 500 | 8455.5 | 1.223 | 11.71 | 35.12 | |
| 33 | rs9275596 | 500 | 8537.6 | 1.232 | 11.80 | 35.39 | |
| 34 | rs12595448_CHB | 500 | 8603.6 | 1.240 | 11.87 | 35.62 | |
| Volumet av PCR klasse Rnase gratis H2O være lagt Primer bassenget (µL) | 561.78 | ||||||
Tabell 6: Vel 1 justert primere brukt til å generere representant resultatene. En tabell med filtypen primere justert etter størrelse, inkludert mål konsentrasjonen, volumet som ble brukt i primer bassenget og endelige konsentrasjon for hver innføring i primer bassenget for godt 1. Volumet av vann å endelige volumet er gitt nederst i tabellen. Det totale volumet av primer var 1,5 mL.
| # | Utvidelse primere | Opprinnelige lager konsentrasjon (µM) | Div. | UEP_ MASS | Målet reaksjon konsentrasjon (µM) | EXT Primer bassenget konsentrasjon (µM) | Volum lager Primer legges til bassenget (µL) |
| 1 | rs10515597 | 500 | 4482.9 | 0.588 | 5.63 | 16.89 | |
| 2 | rs2759281_CEU | 500 | 4921.2 | 0.681 | 6.52 | 19.57 | |
| 3 | rs17641748 | 500 | 5080.3 | 0.713 | 6.83 | 20.48 | |
| 4 | rs1698042_CEU | 500 | 5201.4 | 0.737 | 7.05 | 21.16 | |
| 5 | rs5753625_CHB | 500 | 5411.6 | 0.776 | 7.43 | 22.30 | |
| 6 | rs3912537_CEU | 500 | 5811.8 | 0.848 | 8.12 | 24.35 | |
| 7 | rs6141319_CEU | 500 | 5883.8 | 0.860 | 8,23 | 24.70 | |
| 8 | rs1002587_CEU | 500 | 6026.9 | 0.884 | 8.46 | 25.39 | |
| 9 | rs1295686 | 500 | 6172 | 0.908 | 8.69 | 26.07 | |
| 10 | rs16877243_CEU | 500 | 6386.2 | 0.942 | 9.02 | 27.05 | |
| 11 | rs1103811 | 500 | 6595.3 | 0.974 | 9,33 | 27.98 | |
| 12 | rs6510332_CEU | 500 | 6790.4 | 1.003 | 9.61 | 28.82 | |
| 13 | rs6595142_CHB | 500 | 6874.5 | 1.016 | 9.72 | 29.17 | |
| 14 | rs4484738_CEU | 500 | 6966.5 | 1.029 | 9.85 | 29.55 | |
| 15 | rs1432975 | 500 | 7028.6 | 1.038 | 9.94 | 29.81 | |
| 16 | rs10879311_CEU | 500 | 7317.8 | 1.078 | 10.32 | 30.97 | |
| 17 | rs864481 | 500 | 7416.9 | 1.092 | 10,45 | 31.35 | |
| 18 | rs1295687 | 500 | 7447.8 | 1.096 | 10.49 | 31.47 | |
| 19 | rs12644851_CHB | 500 | 7634 | 1.120 | 10,73 | 32.18 | |
| 20 | rs4265409_CHB | 500 | 7926.2 | 1.158 | 11.09 | 33.26 | |
| 21 | rs2927385_CHB | 500 | 7997.2 | 1.167 | 11.17 | 33.52 | |
| 22 | rs1538956_CHB | 500 | 8286.4 | 1.202 | 11.51 | 34.54 | |
| Volumet av PCR klasse Rnase gratis H2O være lagt Primer bassenget (µL) | 899.42 | ||||||
Tabell 7: Vel 2 justert primere brukt til å generere representant resultater. En tabell med filtypen primere justert etter størrelse, inkludert mål konsentrasjonen, volumet som ble brukt i primer bassenget og endelige konsentrasjon for hver innføring i primer bassenget for godt 2. Volumet av vann å endelige volumet er gitt nederst i tabellen. Det totale volumet av primer var 1,5 mL.
| Master Mix | Lav Plex (1-18) | Høy Plex (19-36) | ||
| Reagens | × 1 | × 410 | × 1 | × 410 |
| Vann (vaskebuffer) | 0.7395 | 303.195 | 0.619 | 253.79 |
| Buffer | 0,2 | 82 | 0,2 | 82 |
| Oppsigelse blanding | 0,1 | 41 | 0,2 | 82 |
| Primer blanding (LPA justert) | 0,94 | 385.4 | 0,94 | 385.4 |
| iPLEX enzym * | 0.0205 | 8.405 | 0.041 | 16.81 |
| Totalt | 2 ΜL | 820 ΜL | 2 ΜL | 820 ΜL |
Tabell 8: reagenser og konsentrasjoner for utvidelse reaksjonen master mix. I dette tilfellet bør volumene for lav-Plex reaksjoner brukes hvis det er 18 eller færre SNPs i brønnen. 19 eller flere SNPs bruke høy Plex reaksjoner volumene. Dette er annerledes enn SNP kravene til lav-plex og høy-plex forsterkning PCR master mix i tabell 2.
| Thermocycler forhold |
| 94 ° C for 30 s |
| 40 sykluser av (94 ° C 5 s, (5 sykluser av 52 ° C 5 s, 80 ° C 5 s)) |
| 72 ° C i 3 min |
| 4 ° C tak |
Tabell 9: Thermocycler betingelser for utvidelse reaksjonen
| Mat allergiske tilfeller vs ikke-mat allergiske kontroller | |||||
| SNP | A1 | P | ELLER | L95 | U95 |
| rs1295686 | A | 0.003 | 1.75 | 1.2 | 2,53 |
| rs2243297 | A | 0,13 | 2.1 | 0,8 | 5.51 |
| rs1295687 | G | 0,19 | 1,63 | 0.78 | 3.41 |
| rs2243211 | A | 0.22 | 1.45 | 0,8 | 2.64 |
| rs1295683 | T | 0,25 | 1.32 | 0,82 | 2.13 |
| rs2243248 | G | 0,51 | 1.21 | 0.69 | 2.11 |
| rs2243300 | T | 0,51 | 1,19 | 0,7 | 2,02 |
| rs1800925 | T | 0,6 | 1.11 | 0,75 | 1,63 |
| rs3091307 | G | 0,62 | 1.1 | 0,75 | 1.6 |
Tabell 10: Variant rs1295686 av det IL13 locus er knyttet til utfordring-bevist matallergi. Logistisk regresjonsanalyse, justert for opphav, sex og tilstedeværelsen av atopisk eksem, avslørte at variant rs1295686 er forbundet med utfordringen bevist matallergi i discovery kohort (n = 367 tilfeller og 156 Allergifrie kontroller). SNP-kolonnen viser markører undersøkt, A1-kolonnen viser det mindre allelet, brukes alleler referanse for foreningen testen. Kolonnen P viser P-verdiene fra regresjonsanalysen, OR kolonnen viser tilsvarende odds forholdstallene og L95 og U95 er nedre og øvre grensene for 95% konfidensintervall fra analyse. Data gjengitt Ashely et al., 20179.
| A. tilbakelegging: mat allergiske tilfeller vs ikke-mat allergiske kontroller | B. Meta-analyse-oppdagelsen og replikasjon | ||||||||||
| SNP | A1 | ELLER | L95 | U95 | P | P | P(R) | ELLER | OR(R) | Q | Jeg |
| rs1295686 | A | 1.37 | 1.03 | 1.82 | 0,03 | 0,0005 | 0.0006 | 1.5 | 1.5 | 0.31 | 3.32 |
| rs1295687 | C | 1.1 | 0,68 | 1,78 | 0,7 | 0,3 | 0,3 | 1.24 | 1.24 | 0,38 | 0 |
Tabell 11: Replikering i en uavhengig befolkning bekrefter tilknytning mellom IL13 variant rs1295686 og utfordring-bevist matallergi. Logistisk regresjon, korrigert for opphav hovedkomponentene, sex og atopisk eksem, i en uavhengig befolkning (n = 203 mat allergiske tilfeller og 330 Allergifrie kontroller) bekreftet tilknytningen mellom variant rs1295686 og matallergi. Meta-analyse ble deretter gjennomført, som det høyeste nivået av bevis for at en tilknytning mellom SNP og utfallet, med lite bevis for heterogenitet størrelser faktisk mellom de to populasjonene på denne SNP. Her kolonnene er som Tabell 10, med flere P(R) og OR(R) verdier for tilfeldige effekter meta-analyse modellen vs faste effekter modell (P og). Q og jeg er P-verdien for Cochrane testen og jeg-indeksen henholdsvis, begge er tiltak av heterogenitet i effekt størrelser mellom studiene. Data gjengitt Ashely et al., 20179.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her viser vi metoden multiplex genotyperingteknologi bruker massespektrometri. Representant resultatene ble generert bruker PCR sammen med MALDI-TOF massespektrometri4 med analysen kjemi oppført i Tabell for materiale13. Med denne plattformen generert vi totalt 11,295 genotyper på 1,255 individer for 9 SNPs innen 40 timer i laboratoriet.
Vi illustrerer nytten av teknikken med å besvare genetisk hypoteser ved å generere og analysere SNP dataene for kandidaten genet IL13 i en oppdagelsen klinisk kohort phenotyped for matallergi og med uavhengige replikering. Plattformen er relativt solid å lavere DNA kvalitet og krever minimal utgangsmaterialet, en inngang kun 10 ng. Avgjørende skritt i protokollen inkluderer følgende: forsiktig feilsøking av analysen utformingen å sikre maksimal SNP inkludering i de multiplex analyser, vellykket forsterkning av regionene målet under forsterkning PCR, vellykket single nukleotid filtypen under Filtype reaksjon og lasting av oppsettet analysen og prøve plate i analyseprogramvare for programvaren å tilordne nøyaktig masse spectra dataene.
Som tidligere nevnt er utformingsverktøyet analysen kompatibel med bruk av mus og storfe polymorfismer, i tillegg til menneske. For andre organismer som mikrobe eller plante, kan "andre" velges i "Organisme"-menyen. Men vil automatisert trinnene for å finne proksimale SNPs og identifisere optimal primer områder ikke være tilgjengelig.
Under utformingen, hvis en proksimale SNP blokkerer identifikasjon av et optimalt primer område, en kan enten fjerne av SNP fra design og velger en annen i høy LD (f.eks, r2 = 1), eller velge å lage to primere, en med referanse allelet av SNP og en alternativ allelet, eller designe en primer med det vanlige allelet eller maskering av SNP en universell Base (f.eksInosine). Hvis det er et problem med å identifisere et unikt sted for primer, kan man endre amplicon lengde innstillingene for å finne et unikt område. Standardinnstillingen er 80-120 bp, men dette kan endres fra 60-400 bp. Det bør imidlertid bemerkes at hvis arbeider med dårligere DNA (f.eksfra FFPE vev), det ikke er ideelt å lengre amplicon.
Feil under analysen design trinn i verktøyet kan være høy hårnål eller primer dimer potensielle. Begge innstillingene kan bli enklere for å prøve en accommodate design. Det anbefales imidlertid at grensene ikke er avslappet under 0,8; Start med 0,9 om denne innstillingen er tilstrekkelig til å redde SNPs og redusere til 0,8 bare hvis det er nødvendig. I avanserte innstillinger er det mulig å endre antall design iterasjoner (opptil 10) under kategorien Multiplex "4. Design analyser", samt beste gjentakelse utvalgskriteriene Høyeste gjennomsnittlige Multiplex eller Færrest avviser av lav Plex. Øke antall design iterasjoner kan være fordelaktig fordi verktøyet vil ta den første SNP i rekkefølgen de ble gitt og vil utforme en analysen. Det tester så om det neste SNP er kompatibel for samme multiplex analysen. Dermed rekkefølgen av SNPs saken. Flere gjentakelser alternativet valgt, vil programvaren tilfeldig rekkefølge SNPs og prøve andre gjentakelser. Dette kan øke antall SNPs kunne være utformet i hver multipleks eller kan redusere antall SNP avviser. Men vil det også komme en tid kostnad, som verktøyet design vil ta mye lengre tid på dette trinnet.
Multiplex genotyperingteknologi er en rask og rimelig metode for undersøkelse av loci rundt. Metoden er strømlinjeformet og tillater kjøring av ca 760 prøver av opp til 40-plex SNPs i 10 timer, tillater titusenvis av genotyper genereres på mindre enn en dag14. Til masse spectra kan lett analyseres med verktøy levert av plattformen.
Noen begrensninger-plattformen omfatter et estimerte tap av 5-10% av SNPs som mislykkes designprosessen analysen. Dette kan noen ganger korrigeres med en alternativ kode eller proxy SNP. Bred instituttets SNP merknader og Proxy søk (SNAP) databasen er et slikt verktøy som forenkler identifikasjon av proxy SNPs15. En annen begrensning av systemet er at det er en målrettet plattform og derfor tillater ikke for omfattende romanen funn, som oppnås med genom hele tilnærminger. Tilnærmingen bruker koden-SNP nærhet for å maksimere dekning over gener, kan videre fine-kartlegging studier, senere være nødvendig å bestemme nøyaktig kausale varianten.
Multiplex genotyperingteknologi er fortsatt en nyttig plattform for avhør av sykdom forbundet SNPs i GWA studie tilnærminger eller hypotese drevet kandidat og sti genet leting. Framtidige applikasjoner for plattformen er sannsynligvis romanen bruk for diagnostikk og screening i felt som kreft og klinisk virologi. Total er multiplex genotyperingteknologi med massespektrometri en rask, kostnadseffektiv og pålitelig medium gjennomstrømming metode for genotyperingteknologi kandidat loci.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne har ingen takk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Genomic DNA | - | - | 1 μL at a concentration of 5-10 ng/μL |
| Primers: forward and reverse amplification and extension | IDT | - | see manuscript section 1.2.1 on design of primers |
| Deionized water | E.g. Milli-Q water | - | deionized with 18.2 MΩ.cm resistivity |
| Genotyping reagent kit. iPLEX Gold Chemistry reagent set | Agena Bioscience | #10148-2 | includes all reagents for reactions in 2.2.1, 2.3.1 and 2.4.2 , chip and resin |
| PCR plates (384-well) | Abgene | #ABGAB-1384 | For the MassARRAY system plates by Abgene are compatible |
| Micropipettes | single and 8-channel | ||
| Centrifuge | compatible with 384-well plates | ||
| Thermocycler | compatible with PCR programs as detailed in 2.2.4, 2.3.2 and 2.4.3 | ||
| Dimple resin plate | Agena Bioscience | 6mg, 384-well | |
| Plate rotator | |||
| MassARRAY Analyzer 4 System | Agena Biosciences | MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization – time of flight) Mass Spectrometer. | |
| RS1000 Nanodispenser | Agena Biosciences | ||
| Assay Design Suite | Agena Biosciences | Tool used to design the multiplex genotyping assays | |
| Hot Start Taq | DNA polymerase enzyme | ||
| Resin | Agena Biosciences | Supplied with iPLEX kit |
References
- Aronson, S. J., Rehm, H. L. Building the foundation for genomics in precision medicine. Nature. 526 (7573), 336-342 (2015).
- Ball, R. D. Designing a GWAS: power, sample size, and data structure. Genome-Wide Association Studies and Genomic Prediction. , 37-98 (2013).
- Kwon, J. M., Goate, A. M.
- Oeth, P., Mistro, G. D., Marnellos, G., Shi, T., van den Boom, D. Qualitative and quantitative genotyping using single base primer extension coupled with matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MassARRAY). Single Nucleotide Polymorphisms: Methods and Protocols. , 307-343 (2009).
- Pusch, W., Kostrzewa, M. Application of MALDI-TOF mass spectrometry in screening and diagnostic research. Current pharmaceutical design. 11 (20), 2577-2591 (2005).
- Su, K. Y., et al. Pretreatment epidermal growth factor receptor (EGFR) T790M mutation predicts shorter EGFR tyrosine kinase inhibitor response duration in patients with non-small-cell lung cancer. Journal of clinical oncology. 30 (4), 433-440 (2012).
- Singhal, N., Kumar, M., Kanaujia, P. K., Virdi, J. S. MALDI-TOF mass spectrometry: an emerging technology for microbial identification and diagnosis. Frontiers in microbiology. 6, 791 (2015).
- Cricca, M., et al. High-throughput genotyping of high-risk Human Papillomavirus by MALDI-TOF Mass Spectrometry-based method. New Microbiologica. 38 (2), 211-223 (2015).
- Ashley, S., et al. Genetic Variation at the Th2 Immune Gene IL13 is Associated with IgE-mediated Paediatric Food Allergy. Clinical & Experimental Allergy. 47 (8), 1032-1037 (2017).
- Bousman, C. A., et al. Effects of NRG1 and DAOA genetic variation on transition to psychosis in individuals at ultra-high risk for psychosis. Translational psychiatry. 3 (4), e251 (2013).
- Moffatt, M. F., et al. A large-scale, consortium-based genomewide association study of asthma. New England Journal of Medicine. 363 (13), 1211-1221 (2010).
- Granada, M., et al. A genome-wide association study of plasma total IgE concentrations in the Framingham Heart Study. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 129 (3), 840-845 (2012).
- Oeth, P., et al. iPLEX assay: Increased plexing efficiency and flexibility for MassARRAY system through single base primer extension with mass-modified terminators. Sequenom application note. 27, (2005).
- Ellis, J. A., Ong, B. The MassARRAY System for Targeted SNP Genotyping. Genotyping: Methods and Protocols. , 77-94 (2017).
- Johnson, A. D., et al. SNAP: A web-based tool for identification and annotation of proxy SNPs using HapMap. Bioinformatics. 24 (24), 2938-2939 (2008).
