Summary
Aquí, presentamos un protocolo para prueba de virulencia de la planta con el patógeno de la planta grisea de Magnaporthe. Este informe contribuirá a la proyección a gran escala de los patotipos de aislamientos de hongos y servir como un excelente punto de partida para la comprensión de los mecanismos resistentes de las plantas durante la reproducción molecular.
Abstract
Las plantas poseen un potente sistema para defenderse de posibles amenazas por hongos patógenos. Plantas agrícola importantes, sin embargo, las medidas actuales para combatir estos patógenos han demostrado ser demasiado conservadoras, y por lo tanto, no suficientemente eficaz y puede potencialmente riesgos ambientales. Por lo tanto, es extremadamente necesario identificar los factores de resistencia del hospedante para ayudar a controlar enfermedades de las plantas naturalmente a través de la identificación de germoplasma resistente, el aislamiento y caracterización de genes de resistencia y la reproducción molecular de cultivares resistentes. En este sentido, es necesario establecer un método de inoculación precisa, rápida y a gran escala para criar y desarrollar los genes de resistencia de la planta. El arroz explosión patógeno hongo Magnaporthe grisea causas enfermedad severa síntomas y pérdidas de rendimiento. Recientemente, M. grisea ha emergido como un organismo modelo para estudiar los mecanismos de las interacciones planta-hongo patógeno. Por lo tanto, se presenta el desarrollo de un método de prueba de virulencia de planta que es específico para M. grisea. Este método proporciona para spray de inoculación con una suspensión conidial e hirió a inoculación con cubos de micelio o gotas de la suspensión conidial. El paso clave del método de inoculación hiriente para hojas de arroz separado es hacer heridas en las hojas de la planta, que evita cualquier interferencia causada por resistencia a la penetración host. Este spray/hiriendo a protocolo contribuye a la proyección rápida, precisa y en gran escala de los patotipos de aislamientos de M. grisea . Este integrado y método de infección sistemática planta servirá como un excelente punto de partida para obtener una perspectiva amplia de temas en Fitopatología.
Introduction
Ráfaga del arroz, causada por M. grisea, es una de las más graves enfermedades de variedades de arroz en todo el mundo1,2. El proceso por el cual M. grisea infecta plantas hospederas incluye una producción de conidios y accesorio de la superficie, una germinación de conidias y formación de apresorio, una formación de la peg de penetración y diferenciación de la hifa infecciosas, y una enfermedad 3. todas estas etapas son comunes en muchos otros hongos patógenos de plantas, y, de hecho, un bloqueo de cualquier sola etapa previene la infección de plantas hospederas. Debido a su importancia económica y maleabilidad genética, M. grisea surgió como un organismo modelo para estudiar los mecanismos de la planta-hongo patógeno interacciones1,4. Por lo tanto, estudiar las bases moleculares de estas etapas de desarrollo de M. grisea ayudarán a dilucidar los mecanismos moleculares subyacentes la patogenicidad de hongos y la identificación de genes diana de candidato para la proyección y diseño de la novela fungicidas5.
Informes recientes sobre la infección de M. grisea se han centrado en los mecanismos moleculares de las etapas de la penetración, sobre todo la conidiation, la formación de apresorio, las clavijas de la penetración y el crecimiento infeccioso3, 6. por lo tanto, es esencial desarrollar un protocolo detallado para probar infección de M. grisea . Adjunto, presentamos un método detallado para una prueba de infección que utiliza análisis de infección mediada por el aerosol con una suspensión conidial y la inoculación de heridas con tapones miceliales de M. grisea. En este informe, el protocolo se centra en el cultivo de cepas, la preparación de la solución conidiation para la fumigación y la micelial mediada por el enchufe de la inoculación de plantas con M. grisea. Estos pasos se describen en detalle más adelante y una vista esquemática que muestra el flujo de trabajo del método y una lesión típica se muestran en las figuras 1 y 2, respectivamente.
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Protocol
1. aerosol de inoculación con una suspensión de conidios de M. grisea
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Cultura fungicida para M.grisea
- Preparar el medio de cultivo agar (OTA) de avena tomate cepas fúngicas.
- Pesan 30-50 g de harina de avena, añadir a 800 mL de agua destilada/desionizada (ddH2O) y hervir la mezcla durante 30 minutos en la olla eléctrica.
- Filtrar el jugo de avena hervida en el vaso a través de un trozo de Gasa.
- Agregar 150 mL de jugo de tomate y 20 g de agar para el filtrado en el vaso de precipitados y agregar ddH2O hasta 1.000 mL.
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Preparación de materiales experimentales
- Empapar unas 50 semillas de cultivares de arroz (Oryza sativa) Lijiangxintuan-heigu (LTH) en Dec2O para 3 d o remoje unas 50 semillas de cebada (Hordeum vulgare cv oro promesa) ddH2O aproximadamente 1 d.
- Envolver las semillas de arroz o cebada en una gasa húmeda y germinar en papel de filtro humedecido en cerca de 30 platos de Petri con un diámetro de 10 cm x 10 cm a 28 ° C. El tiempo de germinación de semilla de arroz es alrededor de 2-3 d, el tiempo de germinación de semilla de cebada es alrededor d 2. La humedad relativa en el invernadero es aproximadamente 70%.
- Planta las plantas de semillero del arroz o de cebada en macetas utilizando encapsulamiento suelo esterilizado y el riego y luego cubrirlas con una capa de aislante de vermiculita.
- Coloque las plantas en un invernadero adecuado o crecimiento gabinete a 25 ° C por aproximadamente 1 ~ 2 semanas.
- Cortar 3 capas de papel de filtro en los círculos con tijera quirúrgica estéril (cada círculo debe tener un diámetro de 8 cm) y colocar sobre placas de plástico estériles de 100 mm.
- Añadir ddH2O a cada plato para remojar el papel de filtro.
- Asegúrese de que el papel de filtro esté completamente húmedo pero sin agua adicional.
- Eliminar cualquier exceso de agua con una bomba de vacío.
- Coloque 2 mondadientes estériles en la placa de cultivo para el arroz/cebada hojas; espacio los escarbadientes ~ 2-3 cm de separación.
- Recoger las hojas del arroz 2 semanas después de la siembra las semillas o tomar las hojas de la cebada 7 d después de la siembra de las semillas.
- Con 4 a 6 hojas plántulas de arroz/cebada, corte la parte inferior del tallo en ~ 5 cm de la tapa y recoger las hojas.
-
Protocolo de inoculación de aerosol
- La cultura la cepa fúngica en las placas de la OTA en una incubadora termostática (25 ° C) d ~ 4.
- Añadir 2 mL de ddH2O usando un 0.5 - pipeta de 5 mL en cada placa de 4 días de edad.
- Con un asa de inoculación, raspar el micelio de la cepa de tipo salvaje de M. grisea y la cepa mutante en restos de micelio.
- Recoger los restos de micelio y transferirlo a una placa nueva de OTA. Tomar la ruina del micelio y el golpe seco en la mesa de trabajo limpia.
- Cubra la placa con 3 capas de gasa para asegurar la humedad necesaria para el crecimiento de los conidios en un invernadero a 25 ° C en el día (14 h) y a 23 ° C en la noche (10 h) durante 24-48 h.
- Añadir 2 mL de ddH2O a cada plato y raspar suavemente los conidios con torundas de algodón estériles, seguidas de una filtración a través de 2 capas de papel de lente. Tenga cuidado de no rayar la superficie del medio de cultivo.
- Transferir la suspensión de conidios en un nuevo tubo de 50 mL con una pipeta de 100-1.000 μl.
- Centrifugar durante 5 minutos a un mínimo de 5.000 x g a 25 ° C.
- Quite el sobrenadante y resuspender el precipitado para dar 2 x 104 conidios por mL en un 0,025% (v/v) solución de Tween-20. La solución de Tween-20 es generalmente alrededor 10-20 mL.
- Verter la suspensión de esporas en un rociador de mano.
- Esterilización aproximadamente 10 mL de la suspensión conidial en las hojas de arroz de las plántulas de 2 semanas de edad arroz o cebada hojas de plántulas de cebada 7 días de edad e incúbelos a 25 ° C en una cámara oscura, húmeda de ~ 24 h. aerosol las plantas control con 0,025% (v/v) solución de Tween-20.
- Transferir las hojas en otra cámara húmeda bajo luz fluorescente a 25 ° C para un fotoperíodo de 12 h.
- Registrar los síntomas de la enfermedad a los 5 días después de la inoculación. Examinar las hojas de arroz enfermas/cebada ~ 6 cm de longitud. La evaluación estándar está según el sistema de puntuación para la resistencia de la explosión del Instituto Internacional de investigación de arroz (IRRI). Los detalles del sistema de puntuación para la resistencia de la explosión se muestran en la tabla 1.
- Fotografiar las hojas para evaluar la infección de las cepas probadas. La infección fue determinada por el número de lesiones por 3,6 cm2.
2. herida de inoculación con cubos de micelio o gotas de la suspensión Conidial de M. grisea
- Utilizando una aguja anatómica, rasque tres heridas largo 2-3 cm en las venas principales de las hojas de arroz/cebada individual; Tenga cuidado de no para penetrar en las hojas.
- Poner las hojas raspadas en palillos de dientes y un 0,02% (v/v) solución de Tween-20 en las hojas para formar una capa de gotitas de aerosol.
- Cortar un enchufe micelial de 0,5 x 0,5 cm para cada cepa de M. grisea (cepas del tipo salvaje, mutante, complemento y otras cepas de prueba) de una placa OTA.
- Poner los tapones miceliales o gotas de 25 μl de la suspensión conidial en los heridos deja e incubar las hojas a 25 ° C en cámara húmeda durante 3-8 días.
- Examinar las lesiones en inoculación tras 5-7 días. El método de examen es el mismo como lo fue para el método de inoculación del aerosol (ver paso 1.3.13).
- Examinar las hojas de arroz enfermas/cebada ~ 6 cm de longitud y fotografiarlos para evaluar la infección de las cepas probadas. La infección fue determinada por el número de lesiones por 3,6 cm2.
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Representative Results
El flujo de trabajo para la técnica se muestra en la figura 1. Los ensayos de infección de la planta fueron realizados en 14 días de edad susceptibles de arroz (o. sativa cv CO-39) o las hojas de cebada de 7 días de edad susceptible (H. vulgare cv oro promesa)7,8,9. Para comprobar una infección en las hojas de arroz, una suspensión conidial (1.0 x 105 esporas/mL) de la cepa de tipo salvaje de M. grisea P131 y la cepa mutante de eliminación Com1 fueron preparados y luego rocía las vainas de las hojas de los 14 días de edad susceptibles CO-39 plantas de semillero, que luego se mantuvieron en cámara húmeda durante 5 d10. El inoculado P131 CO-39 hojas muestra las lesiones sólidas típicas del añublo del arroz, pero las hojas inoculadas Com1 demostraron defectos obvios de la infección y no podrían provocar una infección completa (figura 2A). La cepa de tipo salvaje P131 es una variedad obtenida por usted-Liang Peng en 198818. El mutante nulo MoKMT2H (ΔMoKMT2H) fue obtenido por Cao et al. en nuestro laboratorio utilizando un objetivo gene recambio estrategia11. El Com1 mutante fue aislado por Yang et al. en laboratorio10 de usted-Liang Peng.
Para comprobar si M. grisea ΔMoKMT2H podría infectar a las células huésped a través de heridas, desgastado hojas de arroz de tipo salvaje plantas fueron inoculadas con enchufes miceliales de ΔMoKMT2H mediante el método del aerosol o herida método11. Las hojas que fueron inoculados en aerosol con ΔMoKMT2H no revelaron defectos evidentes en la infección de ΔMoKMT2H en comparación con la cepa salvaje/P131-tipo; sin embargo, se observaron defectos obvios de las hojas inoculadas con ΔMoKMT2H a través de las heridas (figura 2A). Para probar aún más la infección de la planta con las hojas de cebada, sanos o heridos hojas (cv oro promesa) se inocularon con gotitas conidiales o enchufes miceliales, respectivamente, de Com1, ΔMoKMT2Ho P131. En inoculación después de 5 d, las lesiones de la ráfaga arroz típico habían desarrollado completamente en las hojas inoculadas con la cepa P131, o ΔMoKMT2H mientras que las lesiones menos y más pequeñas fueron encontradas en las hojas inoculadas con el mutante de Com1 (figura 2 B).
Figura 1 : Un esquema que ilustra la infección de la planta. Semillas fueron germinadas en el suelo en macetas de plástico (2 de 50 mm x 50 mm de profundidad, con un agujero de drenaje), dos semillas por maceta y las plantas fueron cultivadas en un invernadero. La cultura e inoculaciones del hongo blast M. grisea fueron cultivadas en placas de OTA. Los conidios pulverización el método de inoculación, la suspensión de conidios fue suspendida en un 0,02% (v/v) solución de Tween-20 y pulveriza sobre las plantas de arroz/cebada. Para el método de inoculación rayados, las hojas de la planta de arroz raspado/cebada fueron puestas en las placas de plástico y luego inoculadas por un enchufe micelial o la suspensión de conidios. Y entonces, todas las hojas de la planta tratada fueron cultivados en oscuridad durante 24 h y cultivadas de luz de 12 h. Finalmente, se registró el número de colonias dentro de las unidades de 3,6 cm2 . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Com1 y MoKMT2H son necesarios para una formación del conidio y patogenicidad en las hojas de arroz. (A) este panel muestra la inoculación de arroz hojas mediante el spray de conidios (izquierda) o enchufe micelial (derecha) con conidios de la P131 de tipo salvaje de M. grisea , mutante Com1o ΔMoKMT2H. Hojas típicas se observaron 7 d después de la inoculación micelial mediada por el enchufe, que se llevó a cabo en las hojas de arroz erosionada. Las lesiones típicas se observaron 5 d después de la inoculación micelial mediada por enchufe. (B) cebada hojas fueron inoculadas mediante conidios spray (izquierda) o el enchufe micelial (derecha). Como control de tratamiento simulado, se asperjó el mismo volumen de un 0,025% (v/v) solución de Tween-20. Para la inoculación de la herida, se ha modificado la figura de P131 de Cao et al. 11. la MoKMT2H en los hongos ascomiceto es un homólogo funcional de Ash1, que está implicado en la metilación de H3K4 y H3K3611. La barra = 1 cm. Los mutantes de Δcom1 se redujeron significativamente en virulencia en el arroz y la cebada plántulas10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Escala | Descripción |
| 1 | Pequeñas manchas marrones del tamaño de la punta de |
| 2 | Redondeado ligeramente alargado, necrótica gris manchitas, unos 1-2 mm de diámetro, con un margen marrón distinto. Las lesiones se encuentran principalmente en las hojas superiores |
| 3 | Tipo de lesión es igual a 2, pero un número significativo de lesión son en hojas de theupper |
| 4 | Lesiones típicas blast susceptibles, 3 mm o más, que infecta a menos de 4% del área de laurel |
| 5 | Las lesiones típicas blast susceptibles, 3 mm o más, que menos que 4-10% del área foliar |
| 6 | Lesiones típicas blast susceptibles, 3 mm o más, que menos de 11-25% del área foliar |
| 7 | Las lesiones típicas blast susceptibles, 3 mm o más, que menos que 26-50% del área foliar |
| 8 | Las lesiones típicas blast susceptibles, 3 mm o más, que menos de 51-75% de la superficie de hojas, muchas hojas muertos |
| 9 | Lesiones típicas blast susceptibles, 3 mm o más, que infecta a más de 75% del área foliar |
Tabla 1: un sistema de puntuación para la resistencia de la explosión. La tabla se cita desde el Instituto Internacional de investigación de arroz (IRRI).
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Discussion
Genes de resistencia a la enfermedad de planta juegan un papel esencial en la prevención de infecciones por patógenos, incluyendo hongos patógenos1,12. Ráfaga del arroz se ha utilizado como modelo para comprender la naturaleza de las estructuras de población de patógeno y a la identificación de genes de resistencia de planta4. Por lo tanto, es necesario examinar el genotipo de resistencia a la enfermedad y avirulencia genotipos de las principales variedades de plantas agrícolas en gran escala para identificar plantas resistentes a las enfermedades que se pueden cultivadas continuamente. Además, las ventajas de los genotipos de avirulencia del patógeno de campo requieren la distribución racional de los diferentes genotipos resistentes de host variedades12,13. Sin embargo, los métodos de inoculación comúnmente interfieren con la proyección de resistencia y patógeno identificación14,15,16,17.
Aquí, presentamos un método rápido y exacto para probar para la infección de la planta. Este método de inoculación es adecuado para la identificación de plantas resistentes a durante los ensayos de cría y del fenotipo de una población de progenie durante la clonación de genes de resistencia. Aquí, hemos establecido un método para inocular plantas heridos deja con M. grisea. Porque la resistencia del huésped desempeña un papel importante en la prevención de la propagación de un agente patógeno, este método en vitro , que produce heridas en el arroz probado deja e inoculado la ráfaga del arroz en la herida, es conveniente para la creación de una infección directamente en las hojas sin tener que penetrar la epidermis de la hoja y la pared celular epidérmica. Además, este método de inoculación es conveniente para las edades diferentes de la hoja. Los resultados de la inoculación son estables y precisos. El método de inoculación de heridas puede utilizarse para la inoculación con micelio para determinar la patogenicidad de cepas de hongos que producen sólo pequeñas cantidades de conidios.
Este protocolo contribuirá aún más a nuestra comprensión de los mecanismos patogénicos que se conservan en hongos, así como los factores específicos del patógeno que permitan un hongo para resistir y para suprimir la inmunidad innata de su anfitrión13. Sin embargo, la inoculación de heridas no es aplicable cuando se trata de determinar el tipo de un invasión conidios y micelio expansión. Pero en estado natural, el método de inoculación del aerosol puede reflejar mejor la patogenicidad de un patógeno. El método de inoculación del aerosol es fácil de operar y ayuda a mejorar la eficiencia en el trabajo. Tomados en conjunto, estos resultados lo que indica un método de inoculación precisa y estable son necesarios para la investigación plantas genes de resistencia y la determinación de patogenicidad.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el proyecto especial de investigación científica de la Universidad de agricultura de Beijing (YQ201603) y el proyecto científico de la Comisión de Educación de Beijing (KM201610020005).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Filter paper | GE Healthcare brand(Sweden) | 10311387 | |
| 50-mL tube | CORNING(Amercia) | 430290 | |
| Centrifuge | Eppendorf(Amercia) | 5804R | |
| Culture dish | Thermofisher(Amercia) | 150326 | |
| 0.5-5 mL pipette | Eppendorf | 4920000105 | |
| 100-1000uL pipette | Eppendorf | 4920000083 | |
| Vacuum pump | Leybold | D25B | |
| Dissection needle | FST | 26000-35 | |
| Incubator | MEMMERT | PYX313 | |
| Inoculation ring | Greiner Bio One | 731175 |
References
- Li, W. T., et al. A natural allele of a transcription factor in rice confers broad-spectrum blast resistance. Cell. 170 (1), 114-126 (2017).
- Chi, M. H., Park, S. Y., Kim, S., Lee, Y. H. A novel pathogenicity gene is required in the rice blast fungus to suppress the basal defenses of the host. PLoS Pathogens. 5 (4), 1000401 (2009).
- Jia, Y., Valent, B., Lee, F. N. Determination of host responses to Magnaporthe grisea.on detached rice leaves using a spot inoculation method. Plant Disease. 87 (2), 129-133 (2003).
- Ebbole, D. J. Magnaporthe as a model for understanding host-pathogen interactions. Annual Review of Phytopathology. 45, 437-456 (2007).
- Hamer, J. E., Talbot, N. J. Infection-related development in the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Current Opinion in Microbiology. 1 (6), 693-697 (1998).
- Howard, R. J., Valent, B. Breaking and entering: host penetration by the fungal rice blast pathogen Magnaporthe grisea. Annual Review of Microbiology. 50, 491-512 (1996).
- Chen, X. L., et al. N-Glycosylation of Effector Proteins by an α-1,3- Mannosyltransferase Is Required for the Rice Blast Fungus to Evade Host Innate Immunity. The Plant Cell. 26 (3), 1360-1376 (2014).
- Zhang, Y., et al. M.ARG1, MoARG5,6 and MoARG7 involved in arginine biosynthesis are essential for growth, conidiogenesis, sexual reproduction, and pathogenicity in Magnaporthe oryzae. Microbiological Research. 180, 11-22 (2015).
- Du, Y. X., et al. A serine/threonine-protein phosphatase PP2A catalytic subunit is essential for asexual development and plant infection in Magnaporthe oryzae. Current Genetics. 59 (1-2), 33-41 (2013).
- Yang, J., et al. A novel protein com1 is required for normal conidium morphology and full virulence in Magnaporthe oryzae. Molecular Plant-Microbe Interactions. 23 (1), 112-123 (2010).
- Cao, Z. J., et al. An ash1-like protein MoKMT2H null mutant is delayed for conidium germination and pathogenesis in Magnaporthe oryzae. BioMed Research International. 2016, 1575430 (2016).
- Bryan, G. T., et al. A single amino acid difference distinguishes resistant and susceptible alleles of the rice blast resistance gene Pi-ta. The Plant Cell. 12 (11), 2033-2045 (2000).
- Zhou, J. M. Plant pathology: a life and death struggle in rice blast disease. Current Biology. 26 (18), 843-845 (2016).
- Guo, M., et al. MoGrr1, a novel F-box protein, is involved in conidiogenesis and cell wall integrity and is critical for the full virulence of Magnaporthe oryzae. Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (19), 8075-8088 (2015).
- Talbot, N. J. On the trail of a cereal killer: Exploring the biology of Magnaporthe grisea. Annual Review of Microbiology. 57, 177-202 (2009).
- Wilson, R. A., Talbot, N. J. Under pressure: investigating the biology of plant infection by Magnaporthe oryzae. Nature Reviews Microbiology. 7, 185-195 (2009).
- Jia, Y. L., Lee, F. N., McClung, A. Determination of Resistance Spectra of the Pi-ta and Pi-k Genes to U.S. Races of Magnaporthe oryzae Causing Rice Blast in a Recombinant Inbred Line Population. Plant Disease. 93, 639-644 (2009).
- Peng, Y. L., Shishiyama, J. Temporal sequence of cytological events in rice leaves infected with Pyricularia oryzae. Canadian Journal of Botany. 66 (4), 730-735 (1988).
