Summary
Bu iletişim kuralı calorespirometry, ısı dağılımı ve enerji metabolizmasını değerlendirmek için invaziv olmayan bir yaklaşım sağlar solunum yolu tarif etmek ve aynı anda ölçümü anlatılmaktadır. Bu teknik enerji kullanımı aerobik ve anaerobik yolları katkısı toplam hücresel enerji akışı izleyerek değerlendirmek için kullanılır.
Abstract
Temel biyolojik ve Biyomedikal araştırmalarda kullanılan birçok hücre çizgiler aerobik ve anaerobik solunum bir birleşimi yoluyla enerji homeostazı korumak. Ancak, hangi hücresel enerji üretim yatay olarak her iki yolları katkıda ölçüde sürekli olarak gözden olduğunu. Dönüştürülmüş hücrelerin glikoz düzeyleri genellikle doyurarak kültürlü azalmış bir bağımlılık Oksidatif fosforilasyon artış substrat düzeyinde fosforilasyon tarafından telafi olduğu ATP üretimi için göster. Metabolik dengeyi bu vardiyada mitokondrial toksinlerin varlığı rağmen çoğalırlar hücreleri sağlar. Değiştirilmiş metabolik dengeyi dönüştürülmüş hücrelerin ihmal, bir ilaç tarama sonuçlarından beri misinterpreted potansiyel olarak mitotoxic etkileri modeli hücre satırları huzurunda yüksek glikoz kültürlü kullanarak algılanmayabilir konsantrasyonları. Bu protokol iki güçlü teknikleri, basınçlırespirometri ve hücresel ATP üretimi aerobik ve anaerobik katkılar nicel ve noninvaziv değerlendirilmesi için sağlayan Kalorimetre, eşleştirme açıklar. Aerobik ve anaerobik solunum Kalorimetre izlenen yolu ile olabilir ısı üretir. Bu arada, oksijen tüketim hızı ölçüm aerobik solunum ölçüde değerlendirebilirsiniz. Isı dağılımı ve oksijen tüketimi aynı anda ölçülen zaman calorespirometric oranı belirlenebilir. Deneysel olarak elde edilen değer o zaman teorik oxycaloric eşdeğer karşılaştırılabilir ve anaerobik solunum ölçüde değerlendirilecektir. Böylece, calorespirometry biyolojik sorular, ilaç geliştirme, mikrobiyal büyüme ve normoxic ve hipoksik koşullar altında temel bioenergetics de dahil olmak üzere geniş bir analiz etmek için benzersiz bir yöntem sağlar.
Introduction
Biyolojik sistemlerde, ısı-yayın veya entalpisi metabolizma sırasında genellikle değişimdir ya doğrudan izlenir (üzerinden doğrudan Kalorimetre) ya da dolaylı olarak O2 tüketimi ve/veya CO2 üretim (via basınçlırespirometri) aracılığıyla. Bu teknikler yalıtım modunda kullanıldığında, ne yazık ki, önemli bilgileri, hücre metabolizması anaerobik yolları katkısını gibi kaybolur. Calorespirometry ısı dağılımı ve solunum eş zamanlı ölçüm dayanır güçlü bir tekniktir. Calorespirometric iş öncü tam oksijenli memeli hücrelerinde anaerobik metabolizma incelenmiş ve eş zamanlı enerji homeostazı olmak dönüştürülmüş hücrelerin rağmen aerobik ve anaerobik yolları katkılarıyla gösterdi bir tam olarak oksijenli ortamı1. Calorespirometry beri çok çeşitli biyolojik sorular uygulanmıştır. Bazı örnekler, düşük oksijen düzeyde hayvan enerji bilimi çalışma, solungaçları bivalvia, karasal organizmaların metabolizma ve organik toprak madde2, mikrobiyal ayrışma herbisit ve östrojen etkileri 3 , 4 , 5 , 6. Ayrıca calorespirometry sahip hücreleri7donma önce ortaya nasıl metabolik Önkoşullanma memeli dondurma geliştirir. Her yaklaşım, diferansiyel ve basınçlırespirometri, hücresel ve organizma bioenergetics ile ilgili bilgilerimizi bağımsız olarak artmıştır. Ancak, calorespirometry kullanılarak yanıtlanabilir temel biyolojik soru nispeten keşfedilmemiş kalır.
Hess'ın hukuk bir reaksiyon toplam entalpi değişimine ilk ve son durumlar arasındaki yolun bağımsız olduğunu belirtir. Örneğin, toplam entalpi değişimi biyokimyasal bir yol için yol içinde bütün tepkiler enthalpies değişikliği toplamı olduğunu. Kalorimetre gelişigüzel aerobik ve anaerobik yolları algılar hücresel ısı üretim ölçmek için gerçek zamanlı bir yaklaşım sunmaktadır. Bu hiçbir enerji sistem dışında deneysel ampul8duvarları üzerinden değiştirilir temel üzerine dayanır. Isı dağılımı bir değişiklik değişiklik tüm metabolik reaksiyonlar ampul içinde serbest entalpi eşittir. Böylece, negatif bir entalpi ısı kaybına yol sistemden karşılıklı olarak ilişkilendirir. Son dört yılda ayrıntılı araştırma katabolizma ve Anabolizma termodinamik peyzaj karakterize. Bu araştırma makaleleri arama terimleri "biyolojik" ve "tarafından Amerika Birleşik Devletleri Ulusal Kütüphane, tıp (NLM) Ulusal Sağlık Enstitüleri (PubMed) adlı dizine gibi Kalorimetre" altında bulunan sürekli bir artış ile temsil edilir. Arama bundan önce 1970, toplam 27 yayınlar başvuru biyolojik Kalorimetre ortaya koymaktadır; Bu arada, 2016 yılında 546 yayınlar tekniği kullanılmıştır.
Isı üretim belirlemek için kurulan calorimetric yöntemlerdir. Ancak, daha fazla esneklik respirometric değer çözmek için verilir. Respirometric ölçüm O2, CO2, ya da hem O2 ve CO2bileşiminden oluşabilir. Ayrıca, O2 veya CO2 ölçüm optrodes, Clark-tip elektrotlar ve akort diyot lazer soğurma spektroskopisi7,9,10 dahil olmak üzere çeşitli teknikler tarafından gerçekleştirilebilir ,11. CO2 üretim birçok respirometric çalışma içinde değerli bir ölçü olsa da, kültürlü hücreler için orta bikarbonik tampon sistemi pH kontrolü12,13kez kullanır. Bikarbonat sisteminde CO2 ölçü komplikasyonları önlemek için tek respirometric parametre olarak O2 hücre kültüründe calorespirometry için aşağıdaki iletişim kuralı kullanır.
Oksijen akı ölçme ile eşzamanlı, belirli respirometers ( Tablo malzemelerigörmek) mitokondriyal işlev detaylı değerlendirmeler için tasarlanmıştır. Substrat-uncoupler-inhibitörü-titrations (SUIT) protokolleri iyi kurulmuş ve membran potansiyeli veya reaktif oksijen türleri (ROS) oluşumu14ölçmek için tasarlanmış deneyler ile uyumlu değildir. Calorespirometry sağlam hücre için sunulan Protokolü karbonil siyanür-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) ve F0F1-ATP sentaz inhibitörü oligomycin gibi kimyasal uncouplers getirilmesi ile uyumludur. FCCP ek, oksijen tüketimi mitokondrial performans15potansiyel tedavi etkisini değerlendirmek yararlı olan ATP üretimden edilişi olabilir. Ayrıca, oligomycin eklenmesi sızıntı solunum ölçüde aydınlatır. Böylece, calorespirometry sırasında gerçekleştirilen respirometric ölçümleri mitokondrial fizyolojisi daha fazla aydınlatmak için tasarlanmış kapsamlı iletişim kuralları ile uyumludur.
Isı dağılımı ve oksijen akışı eş zamanlı ölçüm calorespirometric (CR) oranı hesaplanması için sağlar. Bu oran, daha sonra Thornton's sabit veya-430 bağlı olarak hücre satır veya doku ilgi-480 kJ mol-1 için ve desteklenmiştir karbon yüzeyler1, arasında değişmektedir teorik oxycaloric eşdeğer, karşılaştırılır 16. böylece daha olumsuz bir CR oranı artan anaerobik yolları genel olarak metabolik aktivite katkıları ortaya koymaktadır. Örneğin, rutin kas doku solunum çalışmalarının etkin performans olmadan CR oranı-448-468 kJ mol-1'e hangi teorik oxycaloric eşdeğer17,18aralıkta arasında değişmektedir. Bu arada, memeli kanser hücreleri glikoz yüksek orta kültürlü glikoliz aşağıdaki gelişmiş laktik asit fermantasyonu görüntülemek ve nispeten düşük mitokondrial nişan19. Bu fenotip anaerobik yolları daha olumsuz CR oranları1,7tarafından belirtildiği gibi hücresel metabolizma artan katılımı gösteren-800 kJ mol-1,-490 sonuçlarını CR oranları aralığı içinde 16,20.
Ticari ve kar amacı gütmeyen hücre ve doku distribütörler Şu anda insanların yaklaşık 4.000 hücre hatları ile 150 türler'den fazla teklif hücre hatları türetilmiş. Ölümsüzleştirdi hücre satırlarını hızlı bir şekilde birçoğu mitokondrial fonksiyonları ile doğrudan veya dolaylı olarak engel olabilecek potansiyel therapeutics toksisitesi değerlendirmek için uygun araçlardır. Dönüştürülmüş hücrelerin uyuşturucu tarama sırasında kullanarak sınırlı değeri kısmen Warburg etkisi nedeniyle, birçok kanser damgasını olabilir. Çoğu zaman, kanser ATP substrat düzeyinde fosforilasyon oluşturmak ve tam aerobik koşullar19altında mitokondri çekici olmadan laktat üretim ile redoks dengesini korumak. İlaç geliştirme Rootkitler pahalı ve verimsiz, yaklaşık 8 9 bileşikler için başaramadığı Pazar onay21insan klinik çalışmalarda test dışarı ile. Potansiyel tedavi nedeniyle düşük sitotoksisite başlangıç tarama hücre hatlarında geçebilir, bu bazı bu bileşiklerin mitotoxic vardır mümkündür. Nasıl bu toksinler Warburg etkisi görüntülenmez primer hücre enerji dengede zarar olabilir algılamak için uygun yöntemi kritik bilgi kez, tedavi edici gelişme erken aşamalarında darboğaz aşırı baktı.
Calorespirometry biyolojik örnekleri, hücre ve dokulara da dahil olmak üzere çeşitli metabolik etkinliğini çözümlemeye pratik, invaziv olmayan bir yaklaşımdır. Sunulan Protokolü özünü bir uygulama yelpazesi ile uyumludur. Bir sorun, ancak, tespit edilmiştir. Ölümsüzleştirdi hücreleri genellikle potansiyel mitotoxins22hücrelere duyarlı için Oksidatif fosforilasyon (OXPHOS) enerji üretiminde katkısını artırmak için galaktoz ile takıma glikoz-Alerjik ortamda kültürlü, 23. Bu metabolik yeniden programlama örnekleri Kalorimetresi15tarafından kullanılan paslanmaz çelik ampul yerleştirildiğinde analiz belirsiz görünüyor. Birkaç saat için yüksek metabolik faaliyete girişme hücreleri glikoz ortamda kültürlü devam. Bu arada, galaktoz ortamda kültürlü hücreleri ısı üretim yerleri erken deneysel zaman puan için sınırlı ölçümler yaparak ampul içinde 30 dk içinde azaltın. Bu davranış, ne yazık ki, onların hücresel proliferasyonu değerlendirme imkanı engeller. Belirli bu sınırlamaya rağmen çoğu uygulama calorespirometric analizi ile uyumludur ve bu yaklaşımla ayrıntılı metabolik bilgi elde edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. hücre kültürü
- İnsan hepatosellüler karsinom (HepG2) Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (DMEM) bir hücre kültür kuluçka 37 ° C'de % 10 fetal Sığır serum (FBS) ve ek yüzeylerde (10 mM glikoz, 2 mM glutamin ve 1 mM pyruvate) içeren hücrelerde korumak (%5 CO2 , % 95 hava, nem oranı %100).
Not: Yukarıdaki DMEM formülasyonu DMEM basınçlırespirometri ve diferansiyel için sonraki adımda başvurulduğunda kullanın. - 1 x 106 hücre plaka başına 100 mm Kültür plaka ve alt kültür onları her 7 gün % 90 confluency ulaşan önce hücreleri ve orta her 3-4 gün yenilemek.
- Hücreleri % 60-80 birleşmesi olduğunuzda deneyler gerçekleştirin.
2. Respirometer ve Kalorimetresi hazırlanması
- Damlalıklı DMEM 2,2 mL respirometer odasına tıpa tam olarak yerleştirin ve optimum oksijen difüzyon--dan soluduğumuz hava orta için izin vermek için tıpa spacer aracıyla ayarlayın.
- Oksijen konsantrasyonu (mavi İzle) ve oksijen akı (kırmızı izle) stabildir kadar sürekli olarak 37 ° C'de karıştırın. Respirometer'ın yazılım ortamının deneyde kullanılan oksijen çözünürlük için hesap için programlanmıştır olun.
Not: Farklı oksijen çözünürlük katsayıları farklı ortama sahip (Örneğin, DMEM 0,92 =). - Stabilizasyon odası açık DMEM içinde oksijen konsantrasyonunun sonra oksijen konsantrasyonu izleme istikrarlı bir bölümünü seçmek ve % 100 hava doygunluk için kalibre.
- %0 oksijen oksijensiz odasında olmadığı durumlarda oksijen konsantrasyonu izleme istikrarlı bir bölümünü seçmek için kalibre edin. 20 µL titrasyon 230 mM sodyum dithionite veya tüm oksijen bir deney sonunda biyolojik örnek tarafından tüketilen sonra sonra bu adımı gerçekleştirin.
- Respirometer % 100 hava kalibrasyonu sonra tıpa kapatın ve hava kabarcığı yok odasında mevcut olduğundan emin olun.
Not: oksijen akı hafif bir artış kapalı odasında polarographic oksijen sensörü (POS) oksijen kısmi basıncı ölçmek için oksijen tüketir tespit edilecektir. - ~ 10 dk sonra kapalı olmak tıpa, istikrarlı oksijen akı gözlemleyerek respirometer HepG2 hücreler için hazır olduğundan emin olun.
Not: burada kullanılan Kalorimetresi paslanmaz çelik ampul kullanır ve bir referans olarak kullanmak üzere bir ampul gerektirir. - 2,5 mL H2O (dH2O) [eşit birim örnekleri (adım 4) olarak] Kalorimetresi başvuru ampul ekleyin ve pense kullanarak kap sıkın. Bir hava akımı ile mühürlü ampul temiz ve yavaşça Kalorimetresi referans kanal 1 konumuna ampul indirin. Biyolojik örnek hazırlanan kadar 1 konumunda kalır.
3. HepG2 hücre basınçlırespirometri ve hazırlık Kalorimetre
- Respirometer ve Kalorimetresi hazırlanan ve kalibre onaylayın. Sıcak DMEM ve tripsin 37 ° c su banyosu içinde.
- Bir taze 100-mm plaka ve yer orta CO2 ve sıcaklık için denge sağlamak için kuluçka DMEM ekleyin.
Not: uygun birim kullanılacak ampul sayısına bağlıdır Bu orta Kalorimetre deneme için kullanılacaktır. - Bir ters ışık mikroskobu ile onaylamak hücreleri 60-%80 birleşmesi, 100 mm plaka 2 x 10 mL ile Oda sıcaklığında fosfat tamponlu tuz (PBS) sonra yıkayın.
- 37 ° C tripsin 3 mL hücreleri 100-mm plakasına eklemek ve onları 7-10 dk 37 ° c hücre kültür kuluçka için kuluçkaya. Tripsin 37 ° C DMEM 3 mL ile etkisiz hale getirin ve yavaşça o ~ 20 kez 5 mL damlalıklı ile pipetting tarafından askıya alma.
- Resuspended hücre DMEM ve tripsin 6 mL steril 15 mL konik tüp içine aktarmak ve hücre Pelet bozmadan sıvı 5 dk 175 x g. az kaldırmak için santrifüj kapasitesi.
- Hücre Pelet ~ 5 ml damlalıklı hücreler iyice emin olmak için-yeterince ayrışmış birbirinden ve DMEM resuspend.
- ~ 100 µL iyi karışık örnek kaldırmak ve hücrelerin toplam sayısını belirlemek için bir hemasitometre tüm 8 alanları kullanan bir kapsamlı hücre sayısı gerçekleştirin. Sonra hücrelerin resuspension için ses ~ 2 x 50 µL başına 106 hücre oluşturmak için hesaplamak.
Not: Bu 2 x 106 hücre respirometer ile en az orta yerinden her odası eklenir garanti eder. - 175 x g. Resuspend, 5 min için hücreleri hesaplanan hacmine DMEM adım 3.7 Pelet santrifüj kapasitesi.
- Hacimli (Bu ~ 50 µL olmalıdır) respirometer odasında başına 2 x 106 hücre enjekte etmek için gerekli belirlemek için bir hücre sayısı gerçekleştirin. Respirometric ölçüm için hücreleri buza hazır kadar saklayın.
- Konsantre hücre örneği buza olmakla birlikte, 1 x 105 hücre/mL Kalorimetre için bir konsantrasyon üretmek için gerekli seyreltme belirlemek.
- Örnek karıştırın ve ~ 3 mL 1 x 105 hücre/mL DMEM, hücrelerin her ampul için hazırlanın.
Not: numune dilüsyonu için kullanılan DMEM 3.3 adımda hazırlanan dengelenmiş orta olmalıdır.
4. Kalorimetre
- Kalorimetresi bilgisayara doğru bağlandığından ve µW calorimetric sinyal gözlemlenebilir ve kararlı olduğundan emin olun.
- Ampul kapağı ve orta gaz difüzyon için izin vermek için 1 x 105 hücre/mL (~2.5 x 105 hücreleri) her ampul yeterli hava sağlamak için hücrelerin 2.5 mL arasındadır ekleyin.
- Hemen pense kullanarak kap sıkın. Dış herhangi bir enkaz kaldırmak için hava akımı kullanarak kapalı ampul temiz ve yavaşça Kalorimetresi 1 konumlandırmak için ampul indirin. Yazmak zaman ampul 1 konumuna indirilir.
- Ampul pozisyonu 1 15 dakika oturup izin.
Not: Bu 15 dk süresince, respirometer (5. adım) enjekte edilir hücrelerdir. Bu CR oranı belirlendiğinde zaman aynı aralığı ısı üretimi ve oksijen tüketimi için kullanılmasını sağlar. - 1 konumundaki 15 dk sonra yavaşça başvuru ve örnek ampul pozisyonu 2 için indirin. Zaman ampul indirdi ve ölçmek için en az 30 dakika kayıt.
5. basınçlırespirometri
- Ampul Kalorimetresi 1 konumunda olduğu 15 dk aralığında respirometric çalışmaları başlar.
- Hücre örnek homojen bir çözüm sağlamak ve enjekte pipetting tarafından mix iyice < 50 µL ~ 2 x 106 hücreler/odası son bir konsantrasyon için respirometer her odası içine hücre örneği. Hücreleri respirometer enjekte edilir zaman kaydetmek.
- Enjeksiyon sonra HepG2 hücreler sürekli olarak 37 ° C'de kıpırdandı Oksijen akışı ve oksijen konsantrasyonu sürekli bir düşüş her iki sabitleme için en az 20-30 dakika bekleyin.
- Ekranın sağ O2 akı V başına sekmesinde seçin ve oksijen akı istikrarlı bir bölümünü vurgulayın. İşaretleri, sonra istatistikler ve O2 akı V başına kayıt verilerini seçin. Bu kayıt CR oranı hesaplanmasında kullanılır.
Not: 5.5 ve 5.6 isteğe bağlı adımlardır. Sızıntı solunum ve maksimal edilişi solunum oligomycin ve FCCP titrations tarafından açıklanacak. - 4 mg/mL oligomycin 1 µL her odanın içine enjekte etmek ve izin ~ oksijen akı sabitleme 10 dakikadır. Oligomycin eklenmesinden sonra oksijen akı izleme istikrarlı bir kısmını vurgulayarak 5,4 içinde gerçekleştirilen numaralı adımları izleyerek kayıt istikrarlı sızıntı Solunum oranı.
- 2-µL enjeksiyonları 0.2 bırakmak için oksijen akı sabitleme sonra her enjeksiyon mm FCCP her odasına titre. Maksimal akı ulaşılıncaya kadar titrations sonraki FCCP titrasyon hafif bir düşüş tarafından belirtildiği şekilde devam edin. Kayıt sırasında maksimum akı istikrarlı Solunum oranı.
6. Calorespirometric oranı hesaplanması
- Son hücre sayısı itibariyle hazırlanan numunelerin gerçekleştirmek ~ 1 x 105 hücre/mL ampul (2.5 mL) eklendi hücreleri toplam sayısını belirlemek için bir hemasitometre tüm 8 alanları kullanan.
- Bir süre için kayıt ölçümleri Kalorimetresi ve en istikrarlı sinyalleri aynı zamanlarda mevcut respirometer belirlemek. Ampul 2 ve respirometer içine hücre enjeksiyon zaman konumuna düşürdü kaydedilen saat başvuru.
- Isı üretim adım ve hızlı µW/milyon hücre olarak belirlenen zamanda saygın ampul için ısı çıktısını görüntüleme izleme üzerinde imleci yerleştirerek kaydedin. Oksijen tüketimi veri toplamak ve sağlamak pmol O2 s-1 milyon hücre x x olarak ifade edilir.
- CR oranı hesaplamak için önce µW kJ/s için dönüştürmek ve sonra O2/s kJ/mol O2ifade edilen CR oranı elde etmek için mol üzerinde kJ/s bölebilirsiniz. Not: CR oranı kJ/mol O2içinde sunulur.
(bkz. ek dosya 1)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Calorespirometric ölçümler tekrarlanabilirlik doğru ve tutarlı numune hazırlama üzerinde bağlıdır. Tabakları büyümüş, hücre sayımları topaklanma nedeniyle yanlış olabilir gibi hücre kültürü hazırlanan örnekleri kullanılmamalıdır. Ayrıca, düşük ısı akışı sınırlı substrat difüzyon olmalı hücrelerdeki nedeniyle oluşabilir. Bu nedenle, yapışık hücreleri kullanırken, % 60-80 arasında confluency ile bir kalıbı seçin ve orta deneme önce 24 saat değiştirmek için çok önemlidir.
Uygun enstrümantal kalibrasyon ve bakım da bilgilendirici ve tekrarlanabilir calorespirometric ölçümleri için kritik önem taşımaktadır. Takip ederek üreticinin kurulan respirometer için temizlik iletişim kuralı, etanol ile geniş yıkar kalan hidrofobik uncouplers ve inhibitörleri kaldırılır ve ölçümler tarafından kısmen uzlaşma değil emin olmak için uygulanır inhibe veya uncoupling mitokondri. Respirometer odası örnek ölçü önce çalışırken, oksijen konsantrasyonu ve oksijen akı izlemeler Şekil 1' de gösterildiği gibi kararlı olmalıdır. POS sensör hizmet ihtiyacı ise, oksijen akı Şekil 2' de görüldüğü gibi stabilize değil. POS değil düzgün hizmet verilen zaman ölçümleri yapılmalıdır değil. Ayrıca, Kalorimetresi içinde kullanılan ampul temizlenmesi, sterilize ve biyolojik kirlenme örnek ısı üretimi ile engelleyebilir gibi kullanılmadan önce kurutulmuş.
Hücre örnekleri, doğru kalibrasyon ve respirometer ve Kalorimetresi hazırlanması sonra hazırlanır. İlk olarak, respirometer tıpa kapatılır ve odası yok hava kabarcıkları mevcut olduğundan emin olmak için denetlenir. Sonra HepG2 hücreleri ~ 2 x 106/50 µL basınçlırespirometri için konsantre ve hemen buza yerleştirilir. Kalorimetre için konsantre örnek hücrelerden HepG2 denge DMEM ~ 1 105 hücre/mL x seyreltilmiş. Hücreleri pipetting tarafından iyice karıştırılır sonra 2.5 mL süspansiyon bir steril ampul için eklenir. Ampul sıkı kapalı ve herhangi bir dış enkaz bir hava pompası hava akışı ile ampul uçurarak kaldırılır. Ampul yavaş yavaş nerede 15 dakikadır kalır 1, konumuna indirilir. Sonra 15 dk geçti, başvuru ve örnek ampul sonra yavaş yavaş pozisyonu 2 indirdi ve ölçümler ısı çıkışı (resim 3) istikrarlı bir kez kayıt altına başlayabilirsiniz.
Hücreleri Kalorimetresi ve hücre Kalorimetresi tanıttı kesin sayısını belirlemek için respirometer için eklendikten sonra son hücre sayımı gerçekleştirilir. Isı üretim sonra başına milyon hücre ifade edilir. HepG2 hücreleri glikoz yokluğunda kültürlü ve galaktoz mitokondrial katılımı artırmak için takıma, hücreleri Kalorimetresi içinde prolifere değil, ancak bunun yerine ampul yaklaşık 30 dk sonra metabolizma faaliyetlerini azaltmak. Bu ısı dağılımı ölçülü en erken zaman noktasına CR hesaplama sınırlar (Şekil 4).
Hücreleri ısı üretimi ve oksijen tüketimi ölçümleri aynı zaman noktalarda toplanır için ampul için eklenmiştir süreyi kaydetmek için önemlidir. Bu önlem alınmaz, önemli deneysel hataları CR oranı tayini tanıttı olabilir. 15 dk süresince ampul Kalorimetresi 1 konumunda olmakla birlikte, hücreleri yeterince onları pipetting tarafından karışık ve 2 x 106 hücre Hamilton şırınga respirometer üzerinden enjekte edilir. Sonra yaklaşık 15 dk ve oksijen konsantrasyonu (Şekil 5) giderek azalır oksijen akı stabilize. Yine, bu örnek enjeksiyon saat veri analizi için kaydedilir önemlidir. Hücrelerin stabilize oksijen akı CR oranı hesaplanırken oksijen tüketimi için vekil olarak hizmet vermektedir. Ek titrations sonra solunum artırmak için başarısızlık ile gösterilen bir damla daha düşük oksijen akı ve maksimal edilişi solunum (2 µL FCCP, 3-5 titrations) simgesiyle sızıntı solunum (1 µL oligomycin) değerlendirmek için yapılmaktadır art arda FCCP titrations. Bir eksik uncoupling veya bir inhibisyon solunum olmayabilir FCCP hisse senedi (Şekil 6) süresinin dolmadığını görülmektedir.
Şekil 1: % 100 hava kalibrasyon durumunu polarographic oksijen sensörü (POS) ve respirometer. Sinyaller oksijen konsantrasyonu (mavi çizgi) ve oksijen akı (kırmızı çizgi) için her ikisi de % 100 hava kalibrasyon önce stabilize. İstikrarlı çizgiler respirometer kalibrasyon için hazır olduğunu gösterir. Kalibrasyon-meli var olmak kılınmak DMEM ve H2o Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: POS hizmeti ihtiyacı. Oksijen konsantrasyonu (mavi İzle) sabitleme sonra oksijen akı (kırmızı izle) stabilize etmek başarısız olur. POS deneme için kullanılmamalıdır ve servisi üretici tarafından açıklandığı gibi uygulanmalıdır. Oksijen akı bir artan istikrarsızlık POS hizmeti için artan bir talep ile karşılıklı olarak ilişkilendirir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Yaklaşık 2.5 x 105 HepG2 hücreleri glikoz ortamda kültürlü göstermek işaret-in yayılması Kalorimetresi. ~2.5 x 105 HepG2 hücreleri glikoz ampul başına huzurunda kültürlü yükleme -20 ila 30-µW ayar araç üzerinde kullanarak-28 µW ısıyı sabit üretim oluşturur ve zaman içinde artan ısı üretim hücresel proliferasyonu ile karşılıklı olarak ilişkilendirir ampul içinde. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: Yaklaşık 2.5 x 105 HepG2 hücreleri galaktoz ortamda kültürlü değil çoğalırlar ve ısı zaman içinde üretim azalır. ~2.5 x 105 HepG2 hücreleri galaktoz ampul sonuçlarında bir anında ısı üretimi başına kültürlü yükleme ~-20 µW. Ancak, ısı üretim zaman içinde azalır ve CR oranı ölçümleri erken zaman noktaları denemenin için kısıtlar. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: rutin, edilişi ve sızıntı HepG2 hücre solunum. Hücre respirometer enjekte edildi sonra oksijen konsantrasyonu (mavi İzle) giderek azalmıştır. Sağlam hücre rutin solunum sırasında oksijen akı (kırmızı izle) sabitleme sonra oligomycin F0F1-ATP sentaz etkisizleştirmek için eklendi. Bu oksijen akı sabitleme sonra sızıntı solunum ortaya oligomycin ek simgesiyle gösterilir. Yaklaşık 3-5 titrations FCCP, solunum ATP sentezi üzerinden kaldırın ve elektron taşıma sistemi (ETS) kapasite ortaya çıkarmak için yapılmalıdır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6: başarısız HepG2 hücre solunum uncoupling. Hücreleri eklenmesinden sonra oksijen akı stabilize (kırmızı izle) giderek azalmıştır rutin solunum ve oksijen konsantrasyonu sırasında (mavi çizgi). Bir eksik uncoupling ve nihai inhibisyon, maksimal ETS Kapasite ulaştı--dan önleme FCCP titrasyon sonuçlandı. FCCP büyük olasılıkla kirlenmiş veya uzun süreli depolama ortamından düzeyi düşürülebilir. Eğer gözlenen, taze FCCP stok hazırlanmalıdır. Ayrıca, o oligomycin ETS kapasite uncoupling sırasında inhibe etmez onaylayın. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kantitatif metabolik aktivite aerobik ve anaerobik yolları katkıları değerlendirmek ve hücresel enerji akı bileşik bir görünümünü elde etmek için calorespirometry hedefidir. Bu ısı dağılımı ve oksijen akı hesaplanan CR oranı eşdeğer teorik oxycaloric ile karşılaştırılması ardından eşzamanlı bir ölçü tarafından gerçekleştirilir. Birkaç önemli adımlar için tekrarlanabilir ve güvenilir verileri dikkate alınmalıdır. Steril, sağlıklı hücre kültürü bakımından önemlidir. Kirlenme bakteri ve mantarlar tarafından CR oranı anlamsız işleme kötüye ısı üretim veya oksijen tüketimi, neden olabilir. Ayrıca, uygun olmayan hücre önemli, karıştırma, zavallı örnek veya olmalı hücreleri de yanlış bir CR oranı neden olabilir. Böylece enjeksiyon hacmi 50 µL aşağıda respirometer açısından önemli bir adım doğru örnek hazırlıktır. Bu birimin Orta az miktarda odasından zorla göç ettirilmiş ve oksijen tüketimi doğru 2 x 106 hücrelere atfedilir sağlar. Bir kez rutin solunum gözlenir, hangi sızıntı solunum ve mitokondri ETS kapasitesi aydınlatmak iki ek titrations ile (oligomycin ve FCCP), önerilen protokol uyumludur. Bu uygulama için aşırı FCCP ilavesi solunum inhibe ve maksimal akı önlemek; Bu nedenle, en az 3-5 titrations maksimal edilişi solunum ulaşmadan önce gerçekleştirilmelidir.
Hem respirometer hem de Kalorimetresi doğru kalibrasyon ve bakım calorespirometry için kritik. Titrasyon Protokolü arka plan oksijen tüketimi için şiddetle tavsiye edilir ve dithionite odası içinde azalmış oksijen düzeyleri ulaşmak için step-wise titrations ile gerçekleştirilir. Özellikle ölçümler düşük oksijen gerginlik yapılıyorsa bu sıkıca kapalı chambers onaylamak ve odaları, içine oksijen arka difüzyon için düzeltmek için temel bir önlemdir. Ayrıca, daha önce ek hücre karıştırıcı sınadıktan POS yanıt hakkında bilgi sağlayabilir. Yanıt ise fakir veya oksijen akı değil istikrarlı (resim 2), hizmet POS için gereklidir. Yanlış respirometer odaları temizlik fazlalıklarını inhibitörleri veya sonraki deneyler etkileyebilir uncouplers bırakabilirsiniz. Hava kabarcıkları kapalı odasında Ayrıca ölçümleri ile müdahale yeteneğine ve şırınga içinde hava kabarcıkları varsa odası kapanışı veya örnek enjeksiyon sırasında tanıttı olabilir. Kalorimetresi'nın protokolü daha doğrudan, ama aynı zamanda deneysel hataları için duyarlı. Örneğin, ampul uygunsuz mühürleme buharlaşma ısı akışı ağır değiştiği gerçekleşmesi izin verir.
Bu yöntem sınırlamaları biri tüm hücreleri süspansiyon kültürlü ve birçok hücre hatları hücre kültür plaka veya substrat yapışık. Deneyler gerçekleştirmek için ekli hücrelerin enzimatik plaka kullanımı ile ayrılma ajanlar tripsin gibi yerinden gerek. Bu durumda hücre-ebilmek değil var olmak Logaritmik büyüme aşamasında ve onların fizyolojisi üzerinde değişiklik olabilir. Böylece, daha sonraki analiz yoluyla Kalorimetresi ve respirometer yakın zamanda trypsinized hücre değerlendirmek hücresel aktiviteler bozulur. Ayrıca, bir sunulan calorimetric iletişim kuralı yerel hipoksi nedeniyle yavaş oksijen difüzyon sulu çözümler içinde hücrelerin etrafındaki yol açabilir kapalı ampul hücrelerde sedimantasyon kısıtlamadır. ~ 3 x 105 hücreleri üst sınırı bu protokol için kullanılan ampul ile uyumlu olduğunu belirlediler. Hücre sayısı artan bir hipoksik ortamda sonuçları ödün hücreleri, sedimantasyon oluşturabilirsiniz. Böylece, farklı hücre kültürünü araştırıldı ve alternatif yaklaşımlar Orta yoğunluk artan gibi hücreleri24sedimantasyon azaltmak için düşünülmesi gereken en iyi duruma getirme önemlidir. Ampul bulunmaktadır, bu izni karıştırma; Ancak, en az bir sinyal-gürültü oranı karıştırma sırasında mevcut olduğundan emin olmak için önemlidir. Ayrıca, bu protokol için istihdam bir yanı sıra calorimeters calorespirometry ile uyumludur ve yeteneklerini ne biz sundu ötesinde olabilir. Başka bir calorespirometric analiz üzerinden bir iki-odası respirometer ilaç geliştirme için en uygun olurdu bir yüksek üretilen iş analizi için yetersizlik kısıtlamasıdır. Bu sınırlama, ancak, solunum zinciri ve mitokondrial fizyolojisi kamp'ın etkisi yüksek çözünürlüklü bir karakterizasyonu için kapasitesi ile dengeleniyor.
Bu yöntemin önemli bir gücü yüksek çözünürlüklü ve eşzamanlı ölçme noktalar ısı çıktısı ve oksijen akışı aynı örnekten kapasitesidir. Potansiyel bir altın yapışık hücreleri kullanırken standart her iki kültür olacağını ve microcarrier boncuk süspansiyon üzerinde yetiştirilen hücrelerin analiz. Bu yöntem hücre kültürü yüzey ayrılma olumsuz etkilerini önlemek ve büyüme eğrisi (Logaritmik faz vs iletişim inhibe faz7) farklı aşamalarında hücresel fonksiyonları analiz için izin. Ne yazık ki, microcarrier boncuk kullanarak respirometer ve potansiyeli ile birlikte heyecan çubuğunun altındaki hücreler boncuk taşlama için gerekli yüksek karıştırma hız nedeniyle sorunlu olabilir. Bu sınırlamaları rağmen geniş bir uygulama yelpazesi calorespirometry ile uyumlu kalır. Özellikle, bu yöntem daha hızlı bir şekilde mitotoxic bileşikler kültürlü hücrelerdeki tanımlayarak ilaç geliştirme kolaylaştırmak için hazırlanıyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser kısmen Mary E. Konkle ve Michael A. Menze Ulusal Bilim Vakfı Hibe CHE-160944 tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HepG2 Cells | American Type Culture Collection | HB-8065 | Cells used for calorespirometry |
| O2k-Respirometer | Oroboros Instruments | 10022-02 | Respirometer |
| LKB 2277 thermal activity monitor (TAM) | Thermometric AB | Thermometric was purchased by TA Instruments | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Thermofisher Scientific | 11360070 | 100x solution added to DMEM medium |
| Fetal Bovine Serum - Premiuim Select | Atlanta Biologicals | S11550 | Added to 10% in DMEM medium |
| Trypsn-EDTA (0.25%) | Thermofisher Scientific | 25200072 | Cell dissociation reagent |
| Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes | Sigma Aldrich | O4876 | Mitochondrial Inhibitor |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma Aldrich | C2920 | Mitochondrial Uncoupler |
| Corning 100 mm TC-Treated Culture Dish | Corning Corporation | 430167 | Tissue culture dish |
| Glucose, powder | Thermofisher Scientific | 15023021 | Glucose for DMEM medium |
| Galactose, powder | Fischer Scientific | BP656500 | Galactose for DMEM medium |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermofisher Scientific | 25030081 | Glutamine for DMEM medium |
| DMEM, no glucose | Thermofisher Scientific | 11966025 | Cell culture medium |
References
- Gnaiger, E., Kemp, R. B. Anaerobic metabolism in aerobic mammalian cells: information from the ratio of calorimetric heat flux and respirometric oxygen flux. Biochimica et Biophysica Acta. 1016, 328-332 (1990).
- Barros, N., Gallego, M., Feijoo, S. Calculation of the specific rate of catabolic activity (Ac) from the heat flow rate of soil microbial reactions measured by calorimetry: significance and applications. Chemistry & Biodiversity. 1, 1560-1568 (2004).
- Cheney, M. A., Fiorillo, R., Criddle, R. S. Herbicide and estrogen effects on the metabolic activity of Elliptio complanata measured by calorespirometry. Comparative Biochemistry and Physiology - Part C: Pharmacology, Toxicology and Endocrinology. 118, 159-164 (1997).
- Wadso, L., Hansen, L. D. Calorespirometry of terrestrial organisms and ecosystems. Methods. 76, 11-19 (2015).
- Gnaiger, E. Animal energetics at very low oxygen: information from calorimetry and respirometry. Strategies for Gas Exchange and Metabolism. Woakes, A. J., Grieshaber, M. K., Bridges, C. R. , Cambridge University Press. London. 149-171 (1991).
- Barros, N., Hansen, L. D., Pineiro, V., Perez-Cruzado, C., Villanueva, M., Proupin, J., Rodriguez-Anon, J. A. Factors influencing the calorespirometric ratios of soil microbial metabolism. Soil Biology and Biochemistry. 92, 221-229 (2016).
- Menze, M. A., Chakraborty, N., Clavenna, M., Banerjee, M., Liu, X. H., Toner, M., Hand, S. C. Metabolic preconditioning of cells with AICAR-riboside: improved cryopreservation and cell-type specific impacts on energetics and proliferation. Cryobiology. 61, 79-88 (2010).
- Webb, P. Human Calorimetry. , ABC-CLIO, LCC. Santa Barbara, CA. In Volume 7 of Endocrinology and Metabolism Series (1985).
- Neven, L. G., Lehrman, N. J., Hansen, L. D. Effects of temperature and modified atmospheres on diapausing 5th instar codling moth metabolism. Journal of Thermal Biology. 42, 9-14 (2014).
- Brueckner, D., Solokhina, A., Krahenbuhl, S., Braissant, O. A combined application of tunable diode laser absorption spectroscopy and isothermal micro-calorimetry for calorespirometric analysis. Journal of Microbiological Methods. 139, 210-214 (2017).
- Hasan, S. M. K., Manzocco, L., Morozova, K., Nicoli, M. C., Scampicchio, M. Effects of ascorbic acid and light on reactions in fresh-cut apples by microcalorimetry. Thermochimica Acta. 649, 63-68 (2017).
- Criddle, R. S., Fontana, A. J., Rank, D. R., Paige, D., Hansen, L. D., Breidenbach, R. W. Simultaneous measurement of metabolic heat rate, CO2 production, and O2 consumption by microcalorimetry. Analytical Biochemistry. 194, 413-417 (1991).
- Criddle, R. S., Breidenbach, R. W., Rank, D. R., Hopkin, M. S., Hansen, L. D. Simultaneous calorimetric and respirometric measurements on plant-tissues. Thermochimica Acta. 172, 213-221 (1990).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods in Molecular Biology. 810, 25-58 (2012).
- Grimm, D., Altamirano, L., Paudel, S., Welker, L., Konkle, M. E., Chakraborty, N., Menze, M. A. Modulation of cellular energetics by galactose and pioglitazone. Cell and Tissue Research. , (2017).
- Hansen, L. D., Macfarlane, C., McKinnon, N., Smith, B. N., Criddle, R. S. Use of calorespirometric ratios, heat per CO2 and heat per O2, to quantify metabolic paths and energetics of growing cells. Thermochimica Acta. 422, 55-61 (2004).
- Chinet, A., Clausen, T., Girardier, L. Microcalorimetric determination of energy expenditure due to active sodium-potassium transport in the soleus muscle and brown adipose tissue of the rat. The Journal of Physiology. 265, 43-61 (1977).
- Paul, R. J. Physical and biochemical energy balance during an isometric tetanus and steady state recovery in frog sartorius at 0 degree C. Journal of General Physiology. 81, 337-354 (1983).
- Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123, 309-314 (1956).
- Kemp, R. B. Importance of the calorimetric-respirometric ratio in studying intermediary metabolism of cultured mammalian cells. Thermochimica Acta. 172, 61-73 (1990).
- Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates? Nature Reviews Drug Discovery. 3, 711-715 (2004).
- Kamalian, L., Chadwick, A. E., Bayliss, M., French, N. S., Monshouwer, M., Snoeys, J., Park, B. K. The utility of HepG2 cells to identify direct mitochondrial dysfunction in the absence of cell death. Toxicology in Vitro. 29, 732-740 (2015).
- Rossignol, R., Gilkerson, R., Aggeler, R., Yamagata, K., Remington, S. J., Capaldi, R. A. Energy substrate modulates mitochondrial structure and oxidative capacity in cancer cells. Cancer Research. 64, 985-993 (2004).
- Fontana, A. J., Hansen, L. D., Breidenbach, R. W., Criddle, R. S. Microcalorimetric measurement of aerobic cell-metabolism in unstirred cell-cultures. Thermochimica Acta. 172, 105-113 (1990).
