Summary
Denne protokol beskriver calorespirometry, direkte og samtidig måling af både varmeafledning og respiration, som giver noninvasive tilgang for at vurdere energimetabolisme. Denne teknik bruges til at vurdere bidraget fra både aerobe og anaerobe veje til energi udnyttelse ved at overvåge den samlede cellulære energi flow.
Abstract
Mange cellelinjer anvendes i grundlæggende biologiske og biomedicinsk forskning opretholde energi homeostase gennem en kombination af både aerobe og anaerobe respiration. Det omfang, som begge veje bidrage til landskabet af cellulære energiproduktion er imidlertid konsekvent overset. Transformerede celler dyrkes i mætte niveauer af glukose ofte vise en nedsat afhængighed på oxidativ fosforylering for ATP produktion, der er udlignet af en stigning i substrat-niveau fosforylering. Dette skift i metaboliske poise tillader celler til at formere sig på trods af tilstedeværelsen af mitokondrie toksiner. I forsømme den ændrede metaboliske poise af transformerede celler, resultater fra en farmaceutisk screening kan mistolkes siden den potentielt mitotoxic virkninger kan ikke påvises ved hjælp af model cellelinjer kulturperler i overværelse af høje glukose koncentrationer. Denne protokol beskriver bindingen af to kraftfulde teknikker, respirometri og kalorimetri, som giver mulighed for kvantitative og noninvasive vurdering af både aerobe og anaerobe bidrag til cellulære ATP produktion. Både aerobe og anaerobe respirations generere varme, som kan blive overvåget via kalorimetri. I mellemtiden, måle hastigheden af iltforbrug kan vurdere omfanget af aerob respiration. Når både varmeafledning og iltforbruget måles samtidigt, kan calorespirometric forholdet bestemmes. Den eksperimentelt opnåede værdi kan derefter sammenlignes med den teoretiske oxycaloric tilsvarende og omfanget af den anaerobe respiration kan bedømmes. Således giver calorespirometry en unik metode til at analysere en bred vifte af biologiske spørgsmål, herunder udvikling af lægemidler, mikrobiel vækst og grundlæggende bioenergetik under både normoxic og hypoksiske betingelser.
Introduction
I biologiske systemer, den varme-release eller enthalpi ændring under stofskiftet er typisk overvåges enten direkte (via direkte kalorimetri) eller indirekte via O2 forbrug og/eller CO2 produktion (via respirometri). Desværre, når disse teknikker anvendes i isolation, kritiske oplysninger går tabt, såsom bidrag af anaerobe veje til cellulære metabolisme. Calorespirometry er en effektiv teknik, der bygger på den samtidige måling af både varmeafledning og respiration. Calorespirometric pionerarbejde undersøgt det anaerobe stofskifte i fuldt iltet pattedyrceller og demonstreret samtidige bidrag af både aerobe og anaerobe veje til energi homøostase trods de transformerede celler er i en fuldt iltet miljø1. Calorespirometry er siden blevet anvendt til en bred vifte af biologiske spørgsmål. Nogle eksempler kan nævnes studiet af dyrs energetik på lavt iltindhold, virkningerne af både herbicid og østrogen på gællerne af muslinger, metabolismen af terrestriske organismer og mikrobielle nedbrydning af organisk jord sag2, 3 , 4 , 5 , 6. calorespirometry har desuden afsløret hvordan metaboliske forkonditionering før frysning forbedrer kryopræservering af pattedyr celler7. Hver tilgang, både kalorimetri og respirometri, selvstændigt har øget vores viden om cellulært og kropsligt bioenergetik. Grundlæggende biologiske spørgsmål, der kan besvares ved hjælp af calorespirometry er dog stadig relativt uudforsket.
Hesss lov fastslår, at den samlede enthalpi ændring af en reaktion er uafhængig af vej mellem første og sidste. F.eks. den samlede enthalpi ændring for en biokemisk pathway er summen af ændringen i enthalpies af alle reaktioner i vejen. Kalorimetri tilbyder en real-time tilgang til måling af cellulære varmeproduktion, som ukritisk registrerer både aerobe og anaerobe veje. Dette er baseret på det fundament, at ingen energi udveksles i systemet undtagen gennem væggene af de eksperimentelle ampule8. En ændring i varmeafledning er lig med ændringen i enthalpi frigivet fra alle metaboliske reaktioner i ampule. Således, en negativ enthalpi korrelerer til et tab af varme fra systemet. Udtømmende forskning i de sidste fire årtier har karakteriseret den termodynamiske landskab af både katabolisme og anabolisme. Dette er repræsenteret ved en støt stigning i forskningsartikler fundet under søgeudtryk "biologiske" og "Calorimetri" som indekseret af USA 's nationale bibliotek af Medicine (NLM) på National Institutes of Health (PubMed). Søgningen viser sig før 1970, ialt 27 publikationer reference biologiske kalorimetri; i mellemtiden, i 2016 alene, 546 publikationer udnyttet teknikken.
Kolorimetriske metoder er veletableret at bestemme varmeproduktion. Dog gives mere fleksibilitet til at løse den respirometric værdi. Respirometric måling kan bestå af O2, CO2, eller både O2 og CO2. Yderligere, måling af O2 eller CO2 kan opnås ved hjælp af forskellige teknikker, herunder optrodes, Clark-type elektroder og afstemmelige diode laser absorption spektroskopi7,9,10 ,11. Mens CO2 produktion er en værdifuld måling i mange respirometric undersøgelser, udnytter medium for kulturperler celler ofte en bicarbonic buffersystem for pH kontrol12,13. For at undgå komplikationer af CO2 måling i ordningen bikarbonat, udnytter følgende protokol for calorespirometry af celler i kultur O2 som den eneste respirometric parameter.
Samtidige med at måle ilt flux, visse respirometers (Se Tabel af materialer) er designet til detaljerede vurderinger af mitokondrie-funktionen. Substrat-uncoupler-inhibitor-titreringer (SUIT) protokoller er veletableret og er forenelige med forsøg på at måle membran potentielle eller reaktive ilt arter (ROS) dannelse14. Den præsenterede protokol for calorespirometry af intakt celler er kompatibel med indførelsen af kemiske uncouplers såsom carbonyl cyanid-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) og F0F1-ATP syntase hæmmer oligomycinets. Gennem tilsætning af FCCP, kan iltforbrug være frakoblet fra ATP produktion, som er nyttige til at vurdere virkningen af potentielle therapeutics mitokondrie indvinding15. Derudover belyser tilføjelsen af oligomycinets omfanget af lækage respiration. Således er respirometric målingerne udføres under calorespirometry kompatibel med omfattende protokoller designet til yderligere belyse mitokondrie fysiologi.
Samtidig måling af både varmeafledning og ilt flux giver mulighed for beregning af calorespirometric (CR) forholdet. Dette forhold er derefter sammenlignet med den Thornton konstant eller den teoretiske oxycaloric tilsvarende, som svinger mellem-430 til-480 kJ mol-1 afhængig af cellelinie eller væv af interesse og supplerede carbon substrater1, 16. således er forholdet mere negative CR afslører øgede bidrag fra anaerob veje til samlet metaboliske aktivitet. For eksempel, spænder CR-forholdet for rutinemæssig muskel væv respiration uden aktive udførelsen af arbejdet fra-448 til-468 kJ mol-1, som er inden for rækkevidde af de teoretiske oxycaloric svarende17,18. I mellemtiden, pattedyr kræftceller kulturperler i medium, der er højt indhold af glucose vise forbedrede mælkesyre gæring efter glykolyse og lav relativt mitokondrie engagement19. Denne fænotype resultater i CR nøgletal i rækken af-490 at-800 kJ mol-1, demonstrere en øget inddragelse af den anaerobe veje i den cellulære metabolisme som anført af mere negative CR nøgletal1,7, 16,20.
Både kommercielle og almennyttige celle og væv distributører i øjeblikket tilbud cellelinjer fra over 150 arter, med næsten 4.000 cellelinjer afledt af mennesker. Udødeliggjort cellelinjer er praktiske værktøjer for hurtigt vurdering af toksiciteten af potentielle therapeutics, hvoraf mange kan direkte eller indirekte forstyrre mitokondriets funktioner. Ved hjælp af transformerede celler under stof screening kan være af begrænset prædiktive værdi delvis på grund af effekten Warburg, kendetegnende for mange kræftformer. Ofte, kræftformer generere ATP fra substrat-niveau fosforylering og opretholde redox balance gennem produktion af laktat uden fuldt engagerende mitochondriet under aerobe betingelser19. Farmaceutisk udvikling er notorisk bekostelig og ineffektiv, med ca 8 ud af 9 forbindelser afprøvet i humane kliniske forsøg ikke at opnå marked godkendelse21. Mens potentielle therapeutics kan passere indledende screening på grund af lav cytotoksicitet i cellelinjer, er det muligt, at nogle af disse forbindelser er mitotoxic. Uden en passende metode til at påvise, hvordan disse toksiner kan forringe energibalancen i primærelementer, der ikke viser effekten Warburg, er kritiske oplysninger ofte over kiggede, flaskehalsproblemer terapeutisk udvikling i tidlige stadier.
Calorespirometry er en praktisk, noninvasive tilgang til at analysere metaboliske aktivitet i en bred vifte af biologiske prøver, herunder celler og væv. Kernen i den præsenterede protokol er kompatibel med en række applikationer. En komplikation, men er blevet identificeret. Udødeliggjort celler er ofte dyrkes i en glucose-frit medium suppleret med galactose at øge bidraget fra oxidativ fosforylering (OXPHOS) til energiproduktion, for at bevidstgøre celler til potentielle mitotoxins22, 23. Denne metabolisk omprogrammering synes at overskygge analyse når prøverne er placeret i rustfrit stål ampuller bruges af NA48-15. Celler dyrkes i en glucose medium fortsat at engagere sig i høje metaboliske aktivitet i flere timer. I mellemtiden, celler dyrkes i galactose medium formindske varmeproduktion inden for 30 min. af deres placering i ampule, at foretage målinger begrænset til tidlige eksperimenterende tidspunkter. Denne adfærd, hindrer desværre, mulighed for at vurdere deres cellulære spredning. Trods denne særlige begrænsninger, de fleste programmer er kompatible med calorespirometric analyse og metaboliske oplysninger kan opnås ved denne tilgang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. cellekultur
- Vedligeholde menneskelige hepatocellulært carcinom (HepG2) celler i Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) som indeholder 10% føtal bovint serum (FBS) og yderligere substrater (10 mM glukose, 2 mM glutamin og 1 mM pyruvat) ved 37 ° C i en celle kultur inkubator (5% CO2 , 95% luft, 100% fugtighed).
Bemærk: Brug ovenstående DMEM formulering, når DMEM der henvises til i senere trin for respirometri og kalorimetri. - Plade celler på 1 x 106 celler pr. 100 mm kultur plade og subkultur dem hver 7 dage eller før nå 90% confluency og forny mediet hver 3-4 dage.
- Udføre eksperimenter, når cellerne er 60-80% sammenflydende.
2. forberedelse af Respirometer og Na48
- Med pipette overfoeres 2,2 mL af DMEM i respirometer kammer, Sæt proppen helt, og justere det med prop spacer værktøj at muliggøre optimal ilt diffusion fra luft til medium.
- Rør konstant ved 37 ° C indtil iltkoncentration (blå trace) og ilt flux (rød trace) er stabil. Sikre respirometer's software er programmeret til at redegøre for ilt opløseligheden af det medium, der anvendes i forsøget.
Bemærk: Forskellige medier har forskellige ilt opløselighed koefficienter (f.eks.DMEM = 0,92). - Efter stabilisering af koncentrationen af ilt i DMEM kammer er åben, skal du vælge en stabil del af oxygen koncentrationen spor og kalibrere det for 100% luft mætning.
- Kalibrere for 0% ilt at vælge en stabil del af oxygen koncentrationen spor, når ingen ilt er til stede i salen. Udføre dette trin efter 20 µL titrering af 230 mM natrium dithionite eller efter alle ilt forbruges af den biologiske prøve i slutningen af et eksperiment.
- Efter 100% luft kalibrering af respirometer, lukke proppen og sikre, at er ingen bobler til stede i salen.
Bemærk: en lille stigning i ilt flux vil blive opdaget i den lukkede afdeling som polarographic ilt sensor (POS) forbruger ilt for at måle ilt partialtrykket. - Efter ~ 10 min af proppen bliver lukket, bekræfte, at respirometer er klar til HepG2 celler ved at observere en stabil ilt flux.
Bemærk: NA48 bruges her udnytter rustfrit stål ampuller og kræver en ampul skal anvendes som reference. - Tilsættes 2,5 mL H2O (dH2O) [tilsvarende mængde som prøverne (trin 4)] til reference ampule af NA48 og spænd hætten, ved hjælp af tænger, hvis nødvendigt. Rengør den forseglede ampul med luftstrøm og langsomt sænke ampule til position 1 i reference-kanal af NA48. Forblive på position 1 indtil biologisk prøve er parat.
3. forberedelse af HepG2 celler til respirometri og kalorimetri
- Bekræfte, at respirometer og NA48 er forberedt og kalibreret. Varm DMEM og trypsin til 37 ° C i et vandbad.
- Føje DMEM til en frisk 100-mm plade og plads i rugemaskine til ækvilibrering medium for både CO2 og temperatur.
Bemærk: Dette medie vil bruges til kalorimetri eksperimentet, så den passende mængde afhænger af antallet af ampuller, der skal bruges. - Bekræfte med en inverteret lysmikroskop at cellerne er på 60-80% sammenflydende, så vask 100-mm plade 2 x med 10 mL af stuetemperatur fosfatbufferet saltopløsning (PBS).
- Tilføj 3 mL af 37 ° C trypsin til 100-mm plade af celler og Inkuber dem i 7-10 minutter ved 37 ° C i celle kultur inkubator. Neutralisere trypsin med 3 mL af 37 ° C DMEM og suspendere af forsigtigt pipettering det ~ 20 gange med 5 mL pipette.
- Overføre 6 mL resuspenderet celler i DMEM og trypsin i en steril 15 mL konisk slange og centrifugeres i 5 min. ved 175 x g. Fjern væsken uden at forstyrre den celle pellet.
- Resuspenderes celle i ~ 5 mL af DMEM og med pipette overfoeres det grundigt for at sikre, at cellerne er tilstrækkeligt adskilt fra hinanden.
- Fjerne ~ 100 µL af den godt blandede prøve og udføre en grundig celletal udnytter alle 8 felter på en hemocytometer til at bestemme det samlede antal celler. Derefter beregne volumen til resuspension af celler for at generere ~ 2 x 106 celler pr. 50 µL.
Bemærk: Dette vil sikre, at 2 x 106 celler føjes til hver afdeling af respirometer med minimal medium forskydning. - Der centrifugeres celler for 5 min. ved 175 x g. Resuspend pellet i den beregnede mængde af DMEM fra trin 3.7.
- Udføre en celletal for at bestemme lydstyrken skal injicere 2 x 106 celler pr. afdeling i respirometer (dette bør være ~ 50 µL). Gemme celler til respirometric måling på is indtil klar.
- Mens koncentreret celle prøven er på isen, bestemme den fortynding, der kræves for at producere en koncentration på 1 x 105 celler/mL for kalorimetri.
- Proeven blandes godt og forberede hver ampul ~ 3 mL af celler ved 1 x 105 celler/mL i DMEM.
Bemærk: DMEM anvendt til prøveopløsning skal være afbalancerede medium forberedt i trin 3.3.
4. kalorimetri
- Sikre at NA48 er sluttet til computeren og de kolorimetriske signal i µW er observerbare og stabil.
- Tilføje 2,5 mL af celler ved 1 x 105 celler/mL (~2.5 x 105 celler) at hver ampul, er at sikre tilstrækkelig luft mellem låget på ampul og medium at give mulighed for gas diffusion.
- Straks spænd hætten, ved hjælp af tænger, hvis nødvendigt. Rengør den forseglede ampule, ved hjælp af luftstrømmen til at fjerne nogen eksterne snavs, og langsomt sænke ampule til position 1 af NA48. Registrere den tid ampule er sænket til position 1.
- Tillad ampule at sidde på position 1 i 15 min.
Bemærk: Denne 15 min periode celler er til at blive injiceret i respirometer (trin 5). Dette sikrer, at den samme tidsinterval bruges til varmeproduktion og iltforbrug, når CR forholdet bestemmes. - Efter 15 min på position 1, langsomt sænke både reference- og prøveopløsningerne ampuller til position 2. Registrere den tid ampuller blev sænket og foranstaltning i mindst 30 min.
5. respirometri
- I løbet af 15 min. interval hvor ampule er i position 1 i NA48, Begynd de respirometric undersøgelser.
- Celle proeven blandes grundigt ved pipettering for at sikre en ensartet løsning og injicere < 50 µL af den celle prøve i hver afdeling af respirometer for en endelig koncentration på ~ 2 x 106 celler/kammer. Registrere den tid, cellerne injiceres i respirometer.
- Efter injektionen, er HepG2 celler konstant rørte ved 37 ° C. Vent mindst 20-30 min for både en stabilisering af ilt flux og et støt fald i koncentrationen af ilt.
- Vælg fanen O2 flux per V på højre side af skærmen og fremhæve en stabil del af ilt flux. Vælg mærker, derefter statistik og registrere data for O2 flux per V. Denne registrering vil blive brugt i beregningen af CR-forholdet.
Bemærk: Trin 5.5 og 5.6 er valgfri. Rende respiration og maksimal afkoblede respiration vil blive afsløret ved titreringer af oligomycinets og FCCP. - Injicér 1 µL af 4mg/mL oligomycinets til hvert kammer og tillade ~ 10 min for ilt flux stabilisering. Optag stabil lækage åndedræt sats ved at følge trin udføres i 5.4 ved at fremhæve en stabil del af ilt flux spor efter oligomycinets tilsætning.
- Titreres 2-µL injektioner af 0,2 mM FCCP ind i kamrene, giver mulighed for ilt flux stabilisering efter hver injektion. Fortsætte titreringer indtil maksimal flux er nået, som det fremgår af en mindre nedgang i den efterfølgende FCCP titrering. Optage den stabile åndedræt sats under maksimal flux.
6. beregning af Calorespirometric Ratio
- Udføre en afsluttende celletal for prøver forberedt på ~ 1 x 105 celler/mL udnytter alle 8 felter af en hemocytometer til at bestemme det samlede antal celler føjes til ampule (2,5 mL).
- Bestemme en tid til at optage målinger fra både NA48 og respirometer hvor stabil signaler er til stede på samme tidspunkter. Reference tid registreret når en ampule blev sænket til position 2 og tidspunktet for indsprøjtning af celler i respirometer.
- Optage varmeproduktion ved at placere markøren over sporingen viser varmeydelse til den respekterede ampule angivet i skridt og hurtig som µW/millioner celler. Indsamle ilt forbrugsdata og sikre, at det er udtrykt i pmol O2 x s-1 x millioner celler.
- For at beregne CR ratio, først konvertere µW til kJ/s, og derefter opdele kJ/s over mol af O2/s at opnå CR forholdet udtrykt som kJ/mol O2. Bemærk: CR-forholdet er præsenteret i kJ/mol O2.
(Se supplerende fil 1)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Reproducerbarhed af calorespirometric målinger afhænger af en korrekt og konsekvent prøveforberedelse. Prøver forberedt fra cellekultur bør ikke anvendes hvis pladerne er tilgroet, da celletal kan blive unøjagtig på grund af sammenklumpning. Yderligere, reduceret varme strømme på grund af begrænset substrat diffusion i klumpet cellerne kan forekomme. Når du bruger vedhængende celler, er det derfor afgørende at vælge en plade med confluency mellem 60-80% og ændre medium 24 timer forud for forsøget.
Ordentlig instrumental kalibrering og vedligeholdelse er også afgørende for informative og reproducerbare calorespirometric målinger. Ved at følge producentens etableret rengøring protokol for respirometer, omfattende vasker med ethanol er gennemført for at sikre, at resterende hydrofobe uncouplers og hæmmere er fjernet og ikke på kompromis målinger af delvist hæmmende eller frakobling mitokondrier. Når respirometer kammer opererer inden prøven måling, skal både koncentrationen af ilt og ilt flux spor være stabil som vist i figur 1. Hvis POS har brug for sensor service, vil ilt flux ikke stabilisere som det ses i figur 2. Målinger bør ikke udføres, når POS ikke er ordentligt serviceret. Derudover bør ampuller udnyttes i NA48 være renset, steriliseret og tørret før brug, som biologisk forurening kan interferere med varmeproduktion af prøven.
Celle prøver er udarbejdet efter korrekt kalibrering og forberedelse af både respirometer og NA48. Først, standsede i respirometer er lukket og salen er kontrolleret for at sikre ingen luftbobler er til stede. Derefter er HepG2 celler koncentreret til ~ 2 x 106/50 µL til respirometri og straks lagt på is. For kalorimetri fortyndes HepG2 celler fra koncentreret prøven i afbalancerede DMEM på ~ 1 x 105 celler/mL. Efter celler er grundigt blandet af pipettering, tilsættes 2,5 mL af suspensionen til en steril ampul. Ampule er tæt lukket, og eventuelle eksterne rester er fjernet ved at blæse ampul med en strøm af luft fra en luftpumpe. Ampule er derefter langsomt sænkede til position 1, hvor det stadig i 15 min. Efter 15 min har bestået, både reference- og prøveopløsningerne ampuller derefter langsomt sænkes til position 2 og målinger kan begynde at være optaget når den varmeydelse er stabil (figur 3).
En endelige celletal er udført efter cellerne er føjet til både NA48- og respirometer til at bestemme det præcise antal celler tilføres NA48. Varmeproduktion er derefter udtrykt pr. million celler. Hvis HepG2 celler er kulturperler i mangel af glucose og galactose suppleres for at øge mitokondrie engagement, cellerne formere sig ikke inde NA48, men i stedet reducere deres metaboliske aktivitet efter ca 30 min i en ampule. Dette begrænser CR beregning til den tidligste tidspunkt, hvor varmeafledningen blev målt (figur 4).
Det er afgørende at registrere den tid, cellerne føjes til ampule så at målinger af varmeforbrug produktion og ilt er indsamlet på samme tidspunkter. Hvis denne forholdsregel ikke er taget, kan vigtige eksperimentelle fejl indføres i bestemmelsen af CR-forholdet. I perioden 15-min mens ampule er på position 1 i NA48, cellerne er tilstrækkeligt blandet af pipettering dem, og 2 x 106 celler injiceres i respirometer via en Hamilton sprøjte. Ilt flux stabiliserer efter ca 15 min og oxygen koncentrationen falder støt (figur 5). Igen er det kritisk, at tidspunktet for prøven injektion er registreret til dataanalyse. Stabiliseret ilt flux af celler fungerer som surrogat for iltforbrug ved beregning af CR-forholdet. Yderligere titreringer er udført for at vurdere den leak respiration (1 µL oligomycinets) angivet af en dråbe til en lavere ilt flux og den maksimale afkoblede respiration (3-5 titreringer af 2 µL FCCP) angivet ved undladelse af at øge respiration efter successive FCCP titreringer. En ufuldstændig frakobling eller en hæmning af åndedræt kan ikke være overholdt, hvis FCCP materiel er udløbet (figur 6).
Figur 1:100 % luft kalibrering af respirometer og status for polarographic ilt sensor (POS). Signaler til iltkoncentrationen (blå linje) og ilt flux (rød linje) stabiliseres begge, inden 100% luft kalibrering. De stabile linjer angiver, at respirometer er klar til kalibrering. Kalibreringen bør udføres i DMEM, og ikke i H2O. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: POS har behov for service. Efter stabilisering af koncentrationen af ilt (blå trace) undlader ilt flux (røde spor) at stabilisere. POS bør ikke anvendes til forsøg og service bør anvendes som beskrevet af fabrikanten. En øget ustabilitet af ilt flux korrelerer med øget efterspørgsel efter POS service. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Ca 2,5 x 105 HepG2 celler dyrkes i glucose medium viser tegn på spredning i NA48. Indlæser ~2.5 x 105 HepG2 celler kulturperler i overværelse af glukose per ampule genererer en konstant varmeproduktion af -20 til-28 µW ved hjælp af indstillingen 30-µW på instrumentet og en øget varmeproduktion med tiden korrelerer med cellulære spredning inde ampule. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Ca 2,5 x 105 HepG2 celler dyrkes i galactose medium ikke formere sig og varme produktion falder over tid. Indlæser ~2.5 x 105 HepG2 celler dyrkes i galactose pr. ampule resulterer i en øjeblikkelig varmeproduktion af ~-20 µW. Men varmeproduktion falder over tid og begrænser CR-ratio målinger til de tidlige tidspunkt punkter i forsøget. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: rutine, sammenkædet, og lække respiration HepG2 celler. Når celler blev injiceret ind i respirometer, nedsat iltkoncentration støt (blå trace). Efter stabilisering af ilt flux (røde spor) under den rutinemæssige respiration intakt celler, blev oligomycinets tilføjet til at hæmme F0F1-ATP syntase. Det angives ved stabilisering af ilt flux efter oligomycinets tilføjelse, som afslører lækage respiration. Ca 3-5 titreringer af FCCP skal udføres, at koble respiration fra ATPsyntesen og til at afsløre elektron transport system (ETS) kapacitet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: mislykket frakobling af HepG2 celle respiration. Efter tilsætning af celler flux ilt stabiliseret (røde spor) under rutinemæssige respiration og oxygen koncentrationen støt faldet (blå linje). Titrering af FCCP resulterede i en ufuldstændig frakobling og eventuel hæmning, forhindrer den maksimal ETS kapacitet fra at være nået. FCCP blev sandsynligvis er forurenet eller forringet fra langtidsopbevaring. Hvis observeret, skal en frisk FCCP bestand forberedes. Bekræft også, at oligomycinets ikke hæmmer ETS kapacitet under frakobling. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Formålet med calorespirometry er at kvantitativt vurdere bidragene fra aerobe og anaerobe veje til metaboliske aktivitet og få et sammensat billede af cellulære energi flux. Dette opnås ved en samtidig måling af varmeafledning og ilt flux efterfulgt af en sammenligning af de beregnede CR forholdet med den teoretiske oxycaloric tilsvarende. Flere kritiske trin skal anses for reproducerbare og pålidelige data. Vedligeholdelse af en steril, sund cellekultur er kritisk. Forurening med bakterier eller svampe kan resultere i ulovligt handlede varme produktion eller ilt forbrug, rendering CR forholdet meningsløs. Yderligere, forkert celle tæller, dårlig prøve blanding, eller klumpet celler kan også resultere i en unøjagtig CR ratio. Et kritisk skridt med hensyn til respirometer er korrekt prøveforberedelse, så indsprøjtning er under 50 µL i volumen. Denne diskenhed sikrer en minimal mængde af medium er fordrevet fra salen og iltforbrug er korrekt tilskrives 2 x 106 celler. Når rutinemæssig respiration er observeret, er den foreslåede protokol kompatibel med to ekstra titreringer (oligomycinets og FCCP), som belyser lækage respiration og ETS kapacitet af mitokondrier. Til denne ansøgning, kan overdreven tilsætning af FCCP hæmme respiration og forhindre maksimal flux; mindst 3-5 titreringer bør derfor udføres forud for at nå det maksimal afkoblede respiration.
Vedligeholdelse og korrekt kalibrering af både respirometer og NA48 er afgørende for calorespirometry. Titrering protokol til baggrunden iltforbrug er stærkt anbefales og er udført med trinvis titreringer af dithionite at nå nedsat iltindhold i kammeret. Dette er en afgørende foranstaltning til at bekræfte tætsluttende kamre og korrigere for ilt tilbage diffusion i kamre, især hvis målingerne udføres på et lavt iltindhold spændinger. Derudover udfører en omrører test før tilsætning af celler kan give oplysninger om lydhørhed af producentorganisationer. Hvis lydhørhed er dårlig eller ilt flux er ikke stabil (figur 2), service til POS er påkrævet. Forkert rengøring respirometer kamre kan efterlade rester i de mængder hæmmere eller uncouplers, som kan påvirke efterfølgende forsøg. Luftbobler i den lukkede afdeling er også i stand til at blande sig i målingerne og kan indføres under lukning af salen eller under prøven injektion, hvis luftbobler er til stede i sprøjten. Den NA48 protokol er mere direkte, men det er også modtagelige for eksperimentel fejl. For eksempel, vil forkert forsegling af ampule tillade fordampning at forekomme som massivt ændrer varme flow.
En af begrænsningerne af denne metode er, at ikke alle celler kan være kulturperler i suspension og mange cellelinjer er vedhængende til celle kultur plade eller substrat. For at udføre eksperimenter, har tilknyttede celler til enzymatisk forrykke sig fra plade ved hjælp af dissociation agenter såsom trypsin. Celler i denne stat kan ikke være i den logaritmiske vækstfase og deres fysiologi kan ændres. Således forstyrret efterfølgende analyse via NA48- og respirometer for nylig trypsinized celler kan vurdere cellulære aktiviteter. Yderligere er en begrænsning i præsenteres kolorimetriske protokollen sedimentation af celler i de lukkede ampuller, der kan føre til lokale hypoxi omkring celler på grund af langsom ilt diffusion i vandige opløsninger. Vi har besluttet, at ~ 3 x 105 celler er den øvre grænse, der er kompatible med de ampuller, brugt i denne protokol. Øge antallet af celler kan generere en hypoksiske miljø fra sedimentation af celler, at kompromittere resultatet. Således er optimering kritisk, hvis en anden cellelinje er undersøgt og alternative metoder bør betragtes som stigende den medium density reducere sedimentation af celler24. Ampuller er tilgængelige i tilladelsen omrøring; Det er imidlertid afgørende for at sikre en minimal signal / støj-forhold er til stede under omrøring. Derudover kalorimetre udover en ansat i denne protokol er kompatibel med calorespirometry og deres kapaciteter kan være, ud over hvad vi har præsenteret. En anden begrænsning af calorespirometric analyse via en to-kammer respirometer er den manglende evne til en høj overførselshastighed analyse, der ville være mest relevante for farmaceutisk udvikling. Denne begrænsning dog opvejes af kapacitet for en høj opløsning karakterisering af den sammensatte indflydelse på respiratorisk kæde og mitokondriel fysiologi.
Kapacitet til både høj opløsning og samtidig måling af varme output og ilt flux fra samme prøve er en betydelig styrke af denne metode. En potentiel guldstandarden når du bruger vedhængende celler ville være at både kultur og analysere celler dyrkes på microcarrier perler i suspension. Denne metode ville undgå de negative virkninger af dissociation fra kultur celleoverfladen og giver mulighed for analyse af cellulære funktioner i forskellige faser af vækstkurven (logaritmiske fase vs kontakt-inhiberet fase7). Desværre kan bruger microcarrier perler være problematisk på grund af den høje omrøring hastighed kræves i respirometer og potentialet for slibning af perler sammen med celler under opsigt bar. På trods af disse begrænsninger forbliver en bred vifte af applikationer forenelig med calorespirometry. Især er denne metode klar til at bedre lette farmaceutisk udvikling ved hurtigt at identificere mitotoxic forbindelser i kulturperler celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde var delvis finansieret af National Science Foundation grant CHE-160944 til Mary E. Konkle og Michael A. Menze.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HepG2 Cells | American Type Culture Collection | HB-8065 | Cells used for calorespirometry |
| O2k-Respirometer | Oroboros Instruments | 10022-02 | Respirometer |
| LKB 2277 thermal activity monitor (TAM) | Thermometric AB | Thermometric was purchased by TA Instruments | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Thermofisher Scientific | 11360070 | 100x solution added to DMEM medium |
| Fetal Bovine Serum - Premiuim Select | Atlanta Biologicals | S11550 | Added to 10% in DMEM medium |
| Trypsn-EDTA (0.25%) | Thermofisher Scientific | 25200072 | Cell dissociation reagent |
| Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes | Sigma Aldrich | O4876 | Mitochondrial Inhibitor |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma Aldrich | C2920 | Mitochondrial Uncoupler |
| Corning 100 mm TC-Treated Culture Dish | Corning Corporation | 430167 | Tissue culture dish |
| Glucose, powder | Thermofisher Scientific | 15023021 | Glucose for DMEM medium |
| Galactose, powder | Fischer Scientific | BP656500 | Galactose for DMEM medium |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermofisher Scientific | 25030081 | Glutamine for DMEM medium |
| DMEM, no glucose | Thermofisher Scientific | 11966025 | Cell culture medium |
References
- Gnaiger, E., Kemp, R. B. Anaerobic metabolism in aerobic mammalian cells: information from the ratio of calorimetric heat flux and respirometric oxygen flux. Biochimica et Biophysica Acta. 1016, 328-332 (1990).
- Barros, N., Gallego, M., Feijoo, S. Calculation of the specific rate of catabolic activity (Ac) from the heat flow rate of soil microbial reactions measured by calorimetry: significance and applications. Chemistry & Biodiversity. 1, 1560-1568 (2004).
- Cheney, M. A., Fiorillo, R., Criddle, R. S. Herbicide and estrogen effects on the metabolic activity of Elliptio complanata measured by calorespirometry. Comparative Biochemistry and Physiology - Part C: Pharmacology, Toxicology and Endocrinology. 118, 159-164 (1997).
- Wadso, L., Hansen, L. D. Calorespirometry of terrestrial organisms and ecosystems. Methods. 76, 11-19 (2015).
- Gnaiger, E. Animal energetics at very low oxygen: information from calorimetry and respirometry. Strategies for Gas Exchange and Metabolism. Woakes, A. J., Grieshaber, M. K., Bridges, C. R. , Cambridge University Press. London. 149-171 (1991).
- Barros, N., Hansen, L. D., Pineiro, V., Perez-Cruzado, C., Villanueva, M., Proupin, J., Rodriguez-Anon, J. A. Factors influencing the calorespirometric ratios of soil microbial metabolism. Soil Biology and Biochemistry. 92, 221-229 (2016).
- Menze, M. A., Chakraborty, N., Clavenna, M., Banerjee, M., Liu, X. H., Toner, M., Hand, S. C. Metabolic preconditioning of cells with AICAR-riboside: improved cryopreservation and cell-type specific impacts on energetics and proliferation. Cryobiology. 61, 79-88 (2010).
- Webb, P. Human Calorimetry. , ABC-CLIO, LCC. Santa Barbara, CA. In Volume 7 of Endocrinology and Metabolism Series (1985).
- Neven, L. G., Lehrman, N. J., Hansen, L. D. Effects of temperature and modified atmospheres on diapausing 5th instar codling moth metabolism. Journal of Thermal Biology. 42, 9-14 (2014).
- Brueckner, D., Solokhina, A., Krahenbuhl, S., Braissant, O. A combined application of tunable diode laser absorption spectroscopy and isothermal micro-calorimetry for calorespirometric analysis. Journal of Microbiological Methods. 139, 210-214 (2017).
- Hasan, S. M. K., Manzocco, L., Morozova, K., Nicoli, M. C., Scampicchio, M. Effects of ascorbic acid and light on reactions in fresh-cut apples by microcalorimetry. Thermochimica Acta. 649, 63-68 (2017).
- Criddle, R. S., Fontana, A. J., Rank, D. R., Paige, D., Hansen, L. D., Breidenbach, R. W. Simultaneous measurement of metabolic heat rate, CO2 production, and O2 consumption by microcalorimetry. Analytical Biochemistry. 194, 413-417 (1991).
- Criddle, R. S., Breidenbach, R. W., Rank, D. R., Hopkin, M. S., Hansen, L. D. Simultaneous calorimetric and respirometric measurements on plant-tissues. Thermochimica Acta. 172, 213-221 (1990).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods in Molecular Biology. 810, 25-58 (2012).
- Grimm, D., Altamirano, L., Paudel, S., Welker, L., Konkle, M. E., Chakraborty, N., Menze, M. A. Modulation of cellular energetics by galactose and pioglitazone. Cell and Tissue Research. , (2017).
- Hansen, L. D., Macfarlane, C., McKinnon, N., Smith, B. N., Criddle, R. S. Use of calorespirometric ratios, heat per CO2 and heat per O2, to quantify metabolic paths and energetics of growing cells. Thermochimica Acta. 422, 55-61 (2004).
- Chinet, A., Clausen, T., Girardier, L. Microcalorimetric determination of energy expenditure due to active sodium-potassium transport in the soleus muscle and brown adipose tissue of the rat. The Journal of Physiology. 265, 43-61 (1977).
- Paul, R. J. Physical and biochemical energy balance during an isometric tetanus and steady state recovery in frog sartorius at 0 degree C. Journal of General Physiology. 81, 337-354 (1983).
- Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123, 309-314 (1956).
- Kemp, R. B. Importance of the calorimetric-respirometric ratio in studying intermediary metabolism of cultured mammalian cells. Thermochimica Acta. 172, 61-73 (1990).
- Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates? Nature Reviews Drug Discovery. 3, 711-715 (2004).
- Kamalian, L., Chadwick, A. E., Bayliss, M., French, N. S., Monshouwer, M., Snoeys, J., Park, B. K. The utility of HepG2 cells to identify direct mitochondrial dysfunction in the absence of cell death. Toxicology in Vitro. 29, 732-740 (2015).
- Rossignol, R., Gilkerson, R., Aggeler, R., Yamagata, K., Remington, S. J., Capaldi, R. A. Energy substrate modulates mitochondrial structure and oxidative capacity in cancer cells. Cancer Research. 64, 985-993 (2004).
- Fontana, A. J., Hansen, L. D., Breidenbach, R. W., Criddle, R. S. Microcalorimetric measurement of aerobic cell-metabolism in unstirred cell-cultures. Thermochimica Acta. 172, 105-113 (1990).
