Summary
ここでは、JC 1 染料を使用して保護エージェントの有無を低酸素/再酸素化にさらされた後細胞のミトコンドリア膜電位を評価するプロトコルを提案する.
Abstract
閉塞した冠動脈のタイムリーかつ効率的な再灌流は、ST セグメント患者における心筋梗塞サイズを減らすための最善の戦略は、心筋梗塞を高架です。ただし、さらに心筋細胞死、再灌流障害として知られている現象で発生することができます再灌流自体。ミトコンドリア膜電位の低下 (MMP)、またはミトコンドリア脱分極とミトコンドリア膜透過性遷移孔 (mPTP) の開口部は再灌流障害の最後のステップとして、広く認められてを担当ミトコンドリアと心筋細胞死。JC 1 は MMP の値によってミトコンドリアに蓄積される脂溶性カチオン染料です。MMP が高いより JC 1 はミトコンドリアに蓄積されます。緑からの蛍光発光シフトによるミトコンドリアの JC 1 の増加量を反映できる (~ 530 nm) 赤 (~ 590 nm)。したがって、赤/緑の蛍光強度比の低減は、ミトコンドリアの脱分極を示すことができます。ここでは、我々 は MMP を測定する JC 1 の利点やフローサイトメトリーによる検出に再酸素化低酸素後のヒトの心筋細胞における mPTP の開口部を取る。
Introduction
冠動脈心疾患は、死の世界の主要な原因です。治療の選択肢の虚血性損傷を減らすことと st 患者の梗塞サイズを制限する心筋梗塞を高架は via 初回経皮的冠動脈インターベンション (PCI)1、タイムリーかつ効果的な心筋再灌流 2。ただし、再灌流は、最終梗塞サイズ3の 30% までを占めることができます追加の損傷を引き起こします。それは普遍的にミトコンドリア膜透過性遷移孔 (mPTP) がだけ虚血/再灌流時のミトコンドリアの損傷および細胞死の中心ではないことを認めたが (私/R)、心保護4信号の収束先ではまた,5. mPTP 開口部は内部のミトコンドリア膜電位 (MMP)4の脱分極もたらす、我々 検出 5, 5 ', を用いた mPTP 開口 1 '6'-テトラクロロ-m--1、6、3、3 '-エチル-imidacarbocyanineiodide (JC 1) 試金。
JC 1 アッセイは、定性と定量は、cytofluorimetric メソッドと単一ミトコンドリア6のレベルで MMP を分析することによってさらに検証されています。オレンジ色発光 (590 ± 17.5 nm) マトリックスで通常 MMP; とミトコンドリアの赤を産する集計形式として存在する JC 1MMP の損失と JC 1 は 530 ± 15 nm の発光と蛍光グリーンを生成する単量体のフォームに変換されます。したがって、赤/緑の蛍光強度比の減少は、虚血/再灌流などの条件で MMP の削減可能性 (私/R)。
JC-1 に加え MMP もローダミン 123 と 3, 3 '-dihexyloxadicarbocyanine ヨウ化 [DiOC6(3)] など脂溶性陽イオン膜透過性と研究されています。しかし、これらの 2 つのプローブと比較して、JC 1 MMP の分析信頼性の高いものです。ローダミン 123 (特にモード7、8を焼入) で比較的貧しい感度と貧しい人々 の特異性があります。ローダミン 123 のシフトは時々 観察検出する研究者または機器のハードが非常に小さいです。以外にも、単一のセルにローダミン 123 の異なるミトコンドリア結合部位がある、だからそれは、異なる蛍光排出量9を必要があります。DiOC6(3) は MMP を検出するためお勧めできませんのいずれかとして、それは血しょう膜10の脱分極に敏感に反応します。
したがって、ここで我々 は保護剤の有無を低酸素/再酸素化にさらされた後 HCMs MMP を評価するために JC 1 アッセイを使用します。
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Protocol
1. 試薬および解決の準備
- ひと心筋細胞 (HCMs) 完全培地を準備するには、製造元の指示に従って細胞成長培地 500 mL に細胞成長培地補足ミックスの 25 mL を追加します。4 ° C で使用する前に 37 ° C に暖かい店。
- Tongxinluo (TXL) ソリューションを準備 TXL 無血清/グルコースの超微粉体を溶解することによりダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM) と DMEM (詳細についてを参照してください11) を追加して TXL の 400 μ G/ml の濃度を調整します。4 ° C で使用する前に 37 ° C に暖かい店。
- 暗闇の中で 15 mL 遠心管中のバッファー (5 x) を染色株式の 1 mL、4 mL の超純水水原液 (200 x) JC 1 25 μ L を追加することで JC 1 作業溶液 5 mL を準備します。数回上下混合物をピペット、37 ° C 使用する前に暖かい。
- 24 mL の超純水水を 50 mL 遠心管中のバッファー (5 x) を染色株式 6 mL に追加することによって染色バッファーの作業の 30 mL を準備します。このソリューションの氷を使用します。
2. 低酸素/再酸素化モデルの確立
- 6 ウェル プレートでホーチミン完全培地でよくごと板 1.0 x 10 の5セル。37 ° C で 5% CO2と 95% 空気の入ったセルのインキュベーターで約 70% の confluency に到達する成長します。
- リン酸バッファー生理食塩水 (PBS) で HCMs を洗ってください。さまざまな治療法を公開 (400 μ G/ml TXL か)/グルコース無血清 DMEM 37 ° C で 5% CO2と 95% 空気の入ったセルのインキュベーターで低酸素の前に 30 分の 2 mL に
- 遊離酸素を清掃し 18 時間 (図 1 a)、低酸素症と嫌気性中11,12,の酸素分圧を測定する指標を誘導する、気密・低酸素瓶 (2.5 L) 触媒装備 HCMs を孵化させなさい13、37 ° C で 5% CO2と 95% 空気の入ったセルのインキュベーターで
注: それは瓶の中の遊離酸素を清掃する触媒の約 1.5 時間かかります。したがって、jar ファイルを開く前に、HCMs は 19.5 h の jar ファイルに保存されます。平地環境で水色から低酸素状態 (図 1 b) で白と淡いに嫌気性のインジケーターの色が変わります。 - HCMs を 37 ° c 2 h 5% CO2と 95% 空気を含む設定インキュベーターに 6 ウェル プレートを移動することによって reoxygenate します。
3 フローサイトメトリー用 HCMs の準備
- 37 ° C に 0.25% トリプシン エチレンジアミン四 edta 溶液と PBS を温める
- 各ウェルから培地を吸引、1 ml の PBS のセルを洗浄し、井戸の壁に沿って 0.25% トリプシンの 0.5 mL を追加します。
- すべて HCMs がほとんど戸建 (約 1 分) までは、37 ° C で孵化させなさい。
- トリプシンを中和するために井戸に DMEM 完全培地 (10% 牛胎児血清を DMEM 培地) の 1 つの mL を追加します。15 mL 遠心チューブに細胞懸濁液を転送して、室温で 3 分間 500 × g で遠心分離によって HCMs をペレットします。
- 慎重にペレットを乱すことがなく、上清を吸引します。
- 各管に 0.5 mL ホーチミン完全培地の JC 1 作業溶液 0.5 mL を加えます。上下にピペッティングによる、HCMs 再懸濁します。
- 蛍光指示薬の漂白を防止するアルミ箔で全体の管をカバーし、分間インキュベート HCMs (5% CO2と 95% の空気を含む 37 ° C) で通常の状態で 20。
- 4 ° C で 3 分間 500 × g で遠心分離によってペレット HCMs
- 2 mL の冷たい JC 1 染色バッファーで 2 回 HCMs を洗い流してください。
- HCMs を 300 μ L のサンプル チューブ (12 mm × 75 mm) の冷たい染色バッファーの最終巻で再懸濁し、セルを使用して、30 分以内で分析。
注: は、肯定的な制御のための 20 μ M の濃度で 1 時間 HCMs を処理するカルボニル シアン m-クロロフェニル ヒドラゾン (CCCP)、呼吸の電子伝達系の強力な阻害剤を使います。
4. 流れの Cytometer セットアップ
- 流れの cytometer を起動し、ソフトウェアがそれに接続されていることを確認します。
- 流体工学のスタートアップを実行、ストリームを開始し、打ち切りを設定します。
- 流れの cytometry ソフトウェアで 2 つのドット プロット ウィンドウを開きます。
- 選択転送それぞれのサイズとその粒度の面で細胞の特徴を表す最初のドット プロットの Y 軸上の X 軸 (FSC) 光と側方散乱光 (SSC) に散在。
- JC 1 色素細胞内の蛍光強度を測定するために使用 2 番目のドット プロットに対数目盛を使用して X 軸 Y 軸の FITC (530 ± 30 nm) では、PE (575 ± 26 nm) 検出のチャネルを選択します。
5 フローサイトメトリー測定とデータ解析を流れ
- チューブを arm をサポートし、空白(HCMs 染色されていない JC 1) 位置へのアンロードをクリックして管のサンプルします。ロードチューブ サポート アームを作業位置に戻りますをクリックします。
- 空白のサンプル チューブの懸濁液から粒子を収集し、さらに最初のドット プロット (図 3) の分析細胞集団 (P1) をゲートのレコードをクリックします。
- 他のサンプル チューブに HCMs を収集し、セルのドットが 2 番目のドット プロットの中心部にあることを確認への蛍光チャネルの電圧を調整することにより測定を最適化します。
- 各サンプル チューブの統計情報を表示し、緑の蛍光強度の赤蛍光強度の比で割って各サンプルの Mmp を計算します。
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Representative Results
MMP の変化を評価する JC 1 アッセイを実行する前に、実験実施研究者によって設定条件を正常に確認するを強くお勧めします。低酸素/再酸素化 (H ・ R) が大幅 HCMs (アネキシン V +/PI±) のアポトーシスを誘導した流れ cytometry 結果 (図 2)、正常群と比較して示すように、私のセル ベースのモデルを確立した我々 を示す/R (45.00 ± 2.13% 対。11.50 正常群、 p ± 0.18% < 0.05)。Tongxinluo、心保護効果を持つ中国の伝統医学を防ぐ HCMs H/R の状態でのアポトーシス ( p , H/R 群 45.00 ± 2.13% 対 24.50 ± 1.13% < 0.05)。
CCCP は電子輸送鎖の電子キャリアの正常な活動の間に確立されたプロトンの勾配 (MMP の損失) の連結を解くことによってミトコンドリアの酸化的リン酸化を抑制することが protonophore です。その結果、奏効した CCCP HCMs が肯定的な制御として設定されました。図 4に示すとおり、CCCP 投与群で赤/緑の比はほぼゼロだった。アポトーシス分析から結果に一貫した、H/R 投与群表示正常群と比較して有意に低い赤/緑比 (健常群p 5.64 ± 0.21 対 0.69 ± 0.07 < 0.05) Tongxinluo 逆にこのような比率と変更 (2.92 ± 0.22 0.69 ± 0.07 pH/R 群対 < 0.05)。
図 1。低酸素/再酸素化 (H ・ R) モデルの確立します。A. 材料 H/R モデルを確立するために必要B. 瓶の中の低酸素環境の確認。平地環境で水色から低酸素状態で白と淡いに嫌気性のインジケーターの色が変わります。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2。フローサイトメトリーによる低酸素症/再酸素化 (H ・ R) モデルの確立の検証します。正常群と比較して、ヒトの心筋細胞のアポトーシス率高かった H/R グループ Tongxinluo この変更を逆にしながら (*p < 通常対 0.05; # p < H/R 対 0.05; n = 3)11。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3。さらなる分析のための FSC ドット プロット対 SSC の細胞集団 (P1、赤) をゲーティングします。セル人口の整合性は、側方散乱 (SSC) と前方散乱 (FSC) を使用して評価されます。光を減らした (門の外、P1、黒)、細胞破片散乱、除外されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4。ひと心筋細胞における潜在的なミトコンドリア膜の評価します。正常群と比較して、H/R グループが Tongxinluo は、この傾向を逆転しながら大幅に低い赤/緑比を表示 (赤:; no 蛍光セル青、赤い蛍光性の細胞蛍光グリーンで紫色のセル。負の制御、空白なしの汚損;肯定的な制御、細胞 CCCP;p < 通常; 対 0.05#p < H/R; 対 0.05n = 3)11。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、JC 1 染料を使用して JC 1 アッセイによって H/r. 検出にさらされた後細胞の MMP を評価するプロトコルを提案する、セルの MMP はミトコンドリアのサイズ、形状、および単一成分蛍光に影響を及ぼすかもしれない密度などの要因から独立して14をを信号します。したがって、JC 1 アッセイの結果は比較的信頼性の高いです。その上、それは、便利で JC 1 分析を実行する時間を節約。この試金は材料と試薬の低要件、一般的に、MMP 測定する細胞の剥離から、染色を行う未満 1.5 h です。
研究者が信頼でき、満足のいく結果を取得する場合、JC 1 アッセイを実行するとき、いくつかの重要なステップを誇張することはできません。まず、流れの cytometer で収集しているまでは、JC 1 が読み込まれたセルを冷たい染色バッファーに格納する必要があります。温度 MMP の安定性にかなりの効果があり部屋の温度で短時間後多く 1 つのサンプルの値を変化させます。さらに、予備実験をお勧めします pretreating 時間と、CCCP の濃度を決定する肯定的な制御の赤/緑の比率があることを確認 〜 0。注目すべきはそのカルボニル シアン 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP)、酸化的リン酸化を阻害する、MMP を排除することができますも、CCCP に代わるもので、10肯定的な制御の設定にも使用できます。
JC 1 アッセイは、主要な制限その他の螢の JC 1 併用はできません、その蛍光の発光にまたがる緑、黄、および赤の波長のスペクトルの一部です。また、JC 1 アッセイは mPTP の開口部を占めるどうカルセイン acetoxymethylester15,16または1817,も遺伝子操作を使用するなど、1 つまたは複数の方法を組み合わせる必要があります。MMP の減少。つまり ATP 感受性 K+チャンネル19,20のような他のミトコンドリアの毛穴の開口部は、ミトコンドリアの脱分極につながることができます。
JC 1 アッセイに最適ですより粗い「はい/いいえ」ミトコンドリアが主かどうかを評価の目的と評価 (例えば、アポトーシス関連実験)8円偏波します。それはまた様々 なニューロン21、22肝細胞、腎細胞23ミトコン ドリアも24など心筋細胞以外の細胞型で MMP を測定に適用されています。要約すると、H/r. 後 HCMs で MMP の検出の迅速, 簡便かつ高感度法について述べる
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この研究は、国立キー研究と開発中国プログラム (第 2017YFC1700503) からの補助金によって支えられた国家の基本的な研究プログラム (973 プログラム) 中国 (No.2012CB518602)、中国の国家自然科学基金 (号 81370223号 81573957)、北京連合医学の大学 (2016-1002-01-02) の院生の革新的な研究財団。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1 | Beyodtime, China | C2006 | In the kit there are JC-1 stock solution (200×), stock staining buffer (5×) and CCCP(10mM) |
| Tongxinluo ultrafine powder | Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co., China | 071201 | |
| Annexin V-FITC/PI Kit | Becton-Dickinson, USA | 556547 | |
| DMEM | Life Technologies, Grand Island Biological Company, USA | 11966-025 | |
| Human cardiac myocyte | Promocell, Germany | C-12810 | |
| Myocyte Growth Medium (SupplementMix) |
Promocell, Germany | C-39275 | |
| Myocyte Growth Medium (Ready-to-use) | Promocell, Germany | C-22070 | used with Myocyte Growth Medium SupplementMix |
| GENbox | BioMérieux, Marcy l’Etoile, France | 96127 | 2.5L |
| Catalyst (AnaeroPack) | MITSUBISHI GAS CHEMICAL COMPANY, INC. , Japan | C-1 | |
| Anaerobic indicator | BioMérieux, Marcy l’Etoile, France | 96118 | |
| Flow cytometer | Becton-Dickinson, USA | FACSAria 2 | |
| BD FACSDiva Software | Becton-Dickinson, USA | Version8.0.1 | |
| Sample tube | Corning science, USA | 352054 | 12*75mm |
| PBS | Hyclone, USA | SH30256.01 |
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