Summary
Hier präsentieren wir eine Protokoll, die JC-1 Farbstoff verwendet, um die Mitochondrien-Membran-Potential der Zellen beurteilen nach Hypoxie/flussbettfilters mit oder ohne einem Schutzmittel ausgesetzt wird.
Abstract
Zeitnahe und effiziente Reperfusion der verschlossenen Koronararterie ist die beste Strategie zur Verringerung der Größe der myokardialen Infarkt bei Patienten mit ST-Segment Herzinfarkt erhöht. Reperfusion schlechthin kann jedoch im weiteren Cardiomyocyte Tod, ein Phänomen bekannt als Reperfusion Verletzungen führen. Die Eröffnung der mitochondrialen Permeabilität Übergang Pore (mPTP), mit der Abnahme des mitochondrialen Membranpotentials (MMP) oder mitochondriale Depolarisation ist allgemein anerkannt als der letzte Schritt der Reperfusion Verletzungen und ist verantwortlich für Mitochondriale und Cardiomyocyte Tod. JC-1 ist eine lipophile kationischen Farbstoff, der in den Mitochondrien abhängig vom Wert des MMP ansammelt. Je höher die MMP ist, desto mehr JC-1 sammelt sich in den Mitochondrien. Die zunehmende Mengen von JC-1 in den Mitochondrien können durch eine Fluoreszenz Emission Verlagerung von Grün zum Ausdruck kommen (~ 530 nm) bis rot (~ 590 nm). Daher kann die Verringerung der rot/grünen Fluoreszenz Intensitätsverhältnis die Depolarisation der Mitochondrien angegeben. Hier nehmen wir Vorteil von JC-1 MMP Messen oder der Eröffnung des mPTP in menschlichen kardialen Myozyten nach Hypoxie/flussbettfilters, durch Durchflusszytometrie nachgewiesen.
Introduction
Koronarer Herzkrankheit ist die häufigste Todesursache weltweit. Die Therapie der Wahl ist für ischämische Schädigung Reduzierung und Begrenzung Infarkt Größe bei Patienten mit ST-Segment Myokardinfarkt erhöhten rechtzeitige und wirksame myokardialen Reperfusion über primäre perkutane Koronarintervention (PCI)1, 2. Reperfusion verursacht zusätzlichen Schaden, die bis zu 30 Prozent des letzten Infarkt Größe3ausmachen kann. Es ist allgemein anerkannt, dass die mitochondrialen Permeabilität Übergang Pore (mPTP) nicht nur zentral in mitochondrialen Schäden und Zelle Tod während Ischämie/Reperfusion (ich / R), sondern ist auch ein konvergierende Ziel kardioprotektive Signalisierung4 , 5. mPTP Eröffnung Depolarisation der inneren mitochondrialen Membran potenzielle (MMP)4bringen würde, wir haben festgestellt, mPTP Eröffnung mit 5, 5 ', 6, 6 '-Tetrachloro-1, 1, 3, 3′-Tetraethylblei-Imidacarbocyanineiodide (JC-1) Assay.
Die JC-1-Assay ist eine Cytofluorimetric Methode, die sowohl quantitative als auch qualitative, und es wurde weiter durch die Analyse der MMP auf der Ebene eines einzelnen Mitochondrien6validiert. JC-1 existiert als aggregierter Form, eine rote bis orange farbigen Emission (590 ± 17,5 nm) in der Matrix der Mitochondrien mit normalen MMP nachgeben; mit dem Verlust von MMP ist JC-1 in monomerer Form konvertiert, die grünen Fluoreszenz mit einer Emission von 530 nm ± 15 ergibt. Daher deutet eine Abnahme in der rot/grünen Fluoreszenz Intensitätsverhältnis den Rückgang von MMP Bedingungen wie Ischämie/Reperfusion (ich / R).
MMP ist neben JC-1 auch mit Membran durchlässig lipophilen kationen wie Rhodamin 123 und 3, 3′-Dihexyloxadicarbocyanine Jodid [DiOC6(3)] untersucht worden. JC-1 ist jedoch im Vergleich zu diesen zwei Sonden, zuverlässiger für die Analyse von MMP. Rhodamin 123 hat relativ schlechte Sensitivität (insbesondere Quench Modus7,8) und schlechte Spezifität. Die Verschiebung der Rhodamin 123 ist manchmal so klein, dass es schwer für Forscher oder Ausrüstung zu beobachten/zu erkennen. Außerdem in einer einzelnen Zelle, gibt es verschiedene Mitochondrium Bindungsstellen für Rhodamin 123 und so, daß es eventuell unterschiedliche Fluoreszenz Emissionen9. DiOC6(3) wird nicht empfohlen für die Erkennung von MMP entweder so, wie es sensibel auf die Depolarisation der Plasmamembran10 reagiert.
Deshalb verwenden wir hier die JC-1-Assay MMP HCMs bewerten nach Hypoxie/flussbettfilters mit oder ohne einem Schutzmittel ausgesetzt wird.
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Protocol
1. Vorbereitung der Reagenzien und Lösungen
- Bereiten Sie komplette Medium menschlichen kardialen Myozyten (HCMs) durch Zugabe von 25 mL Myozyten Wachstumsmedium Ergänzung Mix 500 ml von Myozyten Wachstumsmedium gemäß den Anweisungen des Herstellers. Shop bei 4 ° C und Warm auf 37 ° C vor der Verwendung.
- Bereiten Sie Tongxinluo (TXL) Lösung durch Auflösen von TXL ultrafeine Pulver in serumfreien/Glukose Dulbeccos Adlers Medium (DMEM) geändert und passen Sie die Konzentration von TXL bis 400 µg/mL durch Zugabe von DMEM (für mehr Details, siehe11). Shop bei 4 ° C und Warm auf 37 ° C vor der Verwendung.
- Bereiten Sie 5 mL der JC-1 funktionierende Lösung durch Zugabe von 25 µL der Stammlösung (200 X), 4 mL Reinstwasser und 1 mL Puffer (5 X) in einem 15 mL Zentrifugenröhrchen im Dunkeln Färbung Lager JC-1 vor. Pipette das Gemisch nach oben und unten mehrmals und vor der Verwendung auf 37 ° C warm.
- Bereiten Sie 30 mL Färbung Puffer zu arbeiten, indem 24 mL Reinstwasser zu 6 mL Puffer (5 X) in einem 50 mL Zentrifugenröhrchen Färbung Lager vor. Verwenden Sie diese Lösung eiskalt.
(2) die Einrichtung von Hypoxie/Flussbettfilters-Modell
- Platte 1,0 x 105 Zellen pro Bohrloch mit HCM komplette Medium für eine 6-well-Platte. Wachsen Sie, eine Konfluenz von ca. 70 % in einer Zelle Inkubator mit 5 % CO2 % bis 95 % Luft bei 37 ° c zu erreichen
- Waschen Sie HCMs mit Phosphat Puffer Kochsalzlösung (PBS). Setzen sie auf unterschiedliche Behandlungen (400 µg/mL TXL oder nicht) in 2 mL/Glukose serumfreien DMEM für 30 min vor Hypoxie in eine Zelle Inkubator mit 5 % CO2 % bis 95 % Luft bei 37 ° C.
- Inkubieren HCMs in einem luftdichten und hypoxischen Glas (2,5 L) mit einem Katalysator ausgestattet um abfangen freien Sauerstoff und induzieren Hypoxie für 18 h (Abbildung 1A) und anaeroben Indikator zur Messung der Sauerstoff-Spannung in die mittleren11,12, 13, in eine Zelle Inkubator mit 5 % CO2 % bis 95 % Luft bei 37 ° C.
Hinweis: Es dauert ca. 1,5 h nach dem Katalysator zu freien Sauerstoff in der Dose zu ergattern. Daher sind die HCMs in Glas für 19,5 h gehalten, bevor das Glas geöffnet wird. Die Farbe des anaeroben Indikator wechselt von hellblau in Inklusieve Umgebung nach blass Weiss in hypoxischen Zustand (Abbildung 1 b). - Reoxygenate HCMs durch Verschieben der 6-well-Platte in einem Inkubator bei 37 ° C mit 5 % CO2 % bis 95 % Luft für 2 h eingestellt.
3. Vorbereitung der HCMs Durchflusszytometrie
- 0,25 % Trypsin-Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) Lösung und PBS auf 37 ° c warm
- Aspirieren Sie Medium aus jedem Brunnen, spülen Sie die Zellen mit 1 mL PBS und 0,5 mL 0,25 % Trypsin entlang der Wand des Brunnens.
- Inkubieren Sie bei 37 ° C, bis alle HCMs fast freistehend (ca. 1 min) sind.
- Fügen Sie 1 mL DMEM komplette Medium (DMEM Medium mit 10 % fötalen Rinderserum) in die Vertiefungen der Trypsin zu neutralisieren. Übertragen Sie die Zellsuspension auf eine 15 mL Zentrifugenröhrchen und pellet HCMs durch Zentrifugieren bei 500 X g für 3 min bei Raumtemperatur.
- Aspirieren Sie sorgfältig den überstand ohne zu stören das Pellet.
- Jedes Rohr 0,5 mL der HCM komplette Medium und 0,5 mL der JC-1 Arbeitslösung hinzufügen. Aufschwemmen der HCMs durch pipettieren rauf und runter.
- Decken Sie die ganze Rohre mit Alufolie zu verhindern, dass Bleichen des Indikators fluoreszierende und inkubieren Sie HCMs unter normalen Bedingungen (bei 37 ° C mit 5 % CO2 % bis 95 % Luft) für 20 min.
- Pellet HCMs durch Zentrifugieren bei 500 X g für 3 min bei 4 ° C.
- HCMs zweimal mit 2 mL eiskaltes JC-1 Färbung Puffer spülen.
- Aufschwemmen Sie HCMs in einem Endvolumen von 300 µL der eiskalte Färbung Puffer in das Probenröhrchen (12 x 75 mm) und verwenden Sie die Zellen für die Analyse innerhalb von 30 Minuten.
Hinweis: Verwenden Sie Carbonyl Zyanid m-Chlorophenyl Hydrazone (CCCP), ein potenter Inhibitor der Atemwege Elektronentransport-Kette, um HCMs für 1 h bei einer Konzentration von 20 µM für die Positivkontrolle zu behandeln.
(4) Flow Cytometer Setup
- Starten Sie das Durchflusszytometer und sicherzustellen Sie, dass die Software mit ihm verbunden ist.
- Fluidics Neustart durchführen, starte den Stream und die Abreißkupplungen eingerichtet.
- Öffnen Sie zwei Dot-Plot-Fenster in der Flow-zytometrie-Software.
- Wählen Sie nach vorne verteilt Licht (FSC) auf der x-Achse und verstreut Streiflicht (SSC) auf der y-Achse in der erste Punkt des Grundstückes, die Eigenschaften der Zellen in Bezug auf ihre Größe und ihre Granularität bzw. zu vertreten.
- Wählen Sie den PE (575 ± 26 nm) Erkennung Kanal für die y-Achse und FITC (530 ± 30 nm) für die x-Achse mit einer logarithmischen Skala in dem zweiten Punkt Grundstück, die verwendet wird, um die Fluoreszenzintensität der JC-1 Farbstoff in den Zellen zu messen.
(5) flow Cytometry Messung und Analyse von Daten
- Klicken Sie auf Entfernen zu lassen, das Rohr stützen Sie Arm und positionieren Sie die leere (HCMs, die nicht gefärbt worden mit JC-1) Rohr auf es zu probieren. Klicken Sie auf Laden um das Rohr Unterstützung Arm in die Arbeitsposition zurück.
- Klicken Sie auf Datensatz , um Partikel von der Aussetzung in das leere Probenröhrchen zu sammeln und dann Tor der Zellpopulation (P1) zur weiteren Analyse in der erste Punkt des Grundstückes (Abbildung 3).
- Sammeln Sie HCMs in anderen Probenröhrchen und optimieren Sie die Messung durch Anpassen der Spannungen der Fluoreszenz-Kanäle, um sicherzustellen, dass die Zelle Punkt sich im Zentralbereich des zweiten Dot-Plot befindet.
- Zeigen Sie die Statistiken der einzelnen Probenröhrchen und berechnen Sie die MMPs jeder Probe dividiert das Verhältnis der rote Fluoreszenz-Intensität von der grünen Fluoreszenzintensität.
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Representative Results
Vor der Durchführung des JC-1-Tests um die Veränderungen der MMP zu bewerten, es empfiehlt Versuche durchgeführt werden, bestätigen die Bedingungen erfolgreich von den Forschern festgelegt. Dargestellt durch die Flow Cytometry Ergebnisse (Abbildung 2), verglichen mit der normalen Gruppe Hypoxie/flussbettfilters (H/R) deutlich induziert Apoptose von HCMs (Annexin V + /PI±), darauf hinweist, dass wir eine Zelle basierendes Modell i aufgebaut hatten / R (45,00 ± 2.13 % Vs. 11.50 ± 0,18 % im Bereich "normalen" p < 0,05). Tongxinluo, eine traditionelle chinesische Medizin mit kardioprotektive Wirkung, verhindert die Apoptose von HCMs in einem Zustand der H/R (24,50 ± 1,13 % vs. 45,00 ± 2.13 % in der Gruppe H/R, p < 0,05).
CCCP ist eine Protonophore, die Oxidative Phosphorylierung in den Mitochondrien hemmen können, durch Entkopplung der Proton-Gradient (Verlust von MMP) während der normalen Tätigkeit des Elektron-Träger in der Elektronentransport-Kette gegründet. Infolgedessen HCMs mit CCCP behandelt wurde als Positivkontrolle festgelegt. Wie in Abbildung 4dargestellt, war das rot/grün-Verhältnis in der CCCP-behandelten Gruppe fast gleich NULL. Einklang mit den Ergebnissen aus der Apoptose-Assay, die H/R-behandelten Gruppe angezeigt ein deutlich rot/grün-Verhältnis im Vergleich mit der normalen Gruppe (0,69 ± 0,07 vs. 5,64 ± 0,21 in der normalen Gruppe, p < 0,05) und Tongxinluo eine solchen Verhältnis umgekehrt ändern (2.92 ± 0,22 vs. 0,69 ± 0,07 in der Gruppe H/R, p< 0,05).
Abbildung 1: Einrichtung von Hypoxie/flussbettfilters (H/R)-Modell. A. Materialien benötigt, um die H/R-Modell zu etablieren; B. Bestätigung der hypoxischen Umwelt in das Glas. Die Farbe des anaeroben Indikator wechselt von hellblau in Inklusieve Umgebung nach blass Weiss in hypoxischen Zustand. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Validierung der Einrichtung von Hypoxie/flussbettfilters (H/R)-Modell von Durchflusszytometrie. Im Vergleich mit der normalen Gruppe, apoptotischen menschlichen kardialen Myozyten lag die signifikant höher in der Gruppe H/R, während Tongxinluo diese Änderung rückgängig gemacht (*p < 0,05 vs. normale; # p < 0,05 vs H/R; n = 3)11. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3. Anspritzung Zellpopulation (P1, rot) in der SSC versus FSC-Dot-Plot zur weiteren Analyse. Die Integrität der Zellenbevölkerung ist mit Side Scatter (SSC) und forward Scatter (FSC) beurteilt. Zellenrückstand (außerhalb der P1, schwarz), die leicht reduziert haben Streuung, sind ausgeschlossen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4. Bewertung der mitochondrialen Membranpotentials in menschlichen kardialen Myozyten. Im Vergleich mit der normalen Gruppe, die Gruppe H/R eine deutlich geringere rot/grün-Verhältnis angezeigt, während Tongxinluo dieser Trend umgekehrt (rot: Zellen mit keine Fluoreszenz; Blau, Zellen mit rote Fluoreszenz; Lila, Zellen mit grün fluoreszieren. Negative Kontrolle, Blank und keine Flecken; Positivkontrolle, Zellen mit CCCP behandelt; p < 0,05 vs. Normal; #p < 0,05 vs H/R; n = 3)11. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Hier präsentieren wir eine Protokoll, die JC-1 Farbstoff verwendet, um die MMP der Zellen beurteilen nach der Belichtung H/R. erkannt durch JC-1-Assay, der MMP der Zellen ist unabhängig von Faktoren wie mitochondriale Größe, Form und Dichte, die Einkomponenten-Fluoreszenz beeinflussen können 14-Signale. Infolgedessen sind die Ergebnisse der JC-1-Assay relativ zuverlässig. Außerdem ist es bequem und zeitsparend, JC-1-Assay durchzuführen. Dieser Test hat eine niedrige Anforderung für Materialien und Reagenzien, und in der Regel dauert es weniger als 1,5 h zu tun, die Färbung von Zelle Ablösung MMP-Messung.
Ein paar wichtige Schritte können nicht überbewertet werden, wenn den JC-1-Test durchführen, wenn Forscher wollen sichere und zufriedenstellende Ergebnisse zu erzielen. Zu aller erst sollten die Zellen geladen mit JC-1 in eiskalten Färbung Puffer gespeichert werden, bis sie durch das Durchflusszytometer gesammelt werden. Temperatur hat einen erheblichen Einfluss auf die Stabilität der MMP und der Wert einer Probe variiert stark nach einer kurzen Zeit bei Raumtemperatur. Darüber hinaus Vorversuchen werden empfohlen, bestimmen die pretreating Zeit und Konzentration der CCCP, um sicherzustellen, dass die Rot/Grün-der Positivkontrolle Verhältnis ~ 0. Es ist bemerkenswert, dass Carbonyl Cyanid 4-(trifluoromethoxy) Phenylhydrazone (FCCP), die auch beseitigen MMP und Oxidative Phosphorylierung zu hemmen kann, ist eine Alternative zu CCCP und kann auch verwendet werden, Einrichten der Positivkontrolle10.
Die JC-1-Assay hat eine große Einschränkung, dass andere Fluorochromes mit JC-1 kombiniert werden können, für seine Fluoreszenz Emission umfasst die grün, gelb und Teil der roten Wellenlängen des Spektrums. Darüber hinaus muss JC-1-Assay mit kombiniert werden eine oder mehrere Methoden, wie die Verwendung von Calcein-Acetoxymethylester15,16 oder sogar genetische Manipulation17,18, um festzustellen, ob die Eröffnung des mPTP entfallen die Abnahme der MMP. Und zwar deshalb, weil die Öffnung der anderen mitochondrialen Poren wie der ATP-sensitiven K+ Kanäle19,20 kann auch auf die Depolarisation der Mitochondrien führen.
Die JC-1-Assay eignet sich am besten zu gröberen "Ja/Nein", dass Bewertungen mit dem Ziel der Beurteilung, ob die Mitochondrien weitgehend sind (z. B. im Zusammenhang mit der Apoptose Experimente)8polarisiert. Es wurde auch angewendet um MMP in einer Vielzahl von Zelltypen als Kardiomyozyten, einschließlich Neuronen21, Hepatozyten22, Nierenzellen23 und sogar isolierte Mitochondrien24zu messen. Zusammenfassend lässt sich sagen beschreiben wir eine schnelle, einfache und empfindliche Methode zum Nachweis von MMP in HCMs nach H/R.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse aus der nationalen Schlüssel Forschung und Entwicklung-Programm von China (Nr. 2017YFC1700503), die nationale Basic Research Program (973-Programm) von China (No.2012CB518602), der National Natural Science Foundation of China (Nr. 81370223 und Nr. 81573957), und die Doktoranden Innovative Research Foundation of Peking Union Medical College (2016-1002-01-02).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1 | Beyodtime, China | C2006 | In the kit there are JC-1 stock solution (200×), stock staining buffer (5×) and CCCP(10mM) |
| Tongxinluo ultrafine powder | Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co., China | 071201 | |
| Annexin V-FITC/PI Kit | Becton-Dickinson, USA | 556547 | |
| DMEM | Life Technologies, Grand Island Biological Company, USA | 11966-025 | |
| Human cardiac myocyte | Promocell, Germany | C-12810 | |
| Myocyte Growth Medium (SupplementMix) |
Promocell, Germany | C-39275 | |
| Myocyte Growth Medium (Ready-to-use) | Promocell, Germany | C-22070 | used with Myocyte Growth Medium SupplementMix |
| GENbox | BioMérieux, Marcy l’Etoile, France | 96127 | 2.5L |
| Catalyst (AnaeroPack) | MITSUBISHI GAS CHEMICAL COMPANY, INC. , Japan | C-1 | |
| Anaerobic indicator | BioMérieux, Marcy l’Etoile, France | 96118 | |
| Flow cytometer | Becton-Dickinson, USA | FACSAria 2 | |
| BD FACSDiva Software | Becton-Dickinson, USA | Version8.0.1 | |
| Sample tube | Corning science, USA | 352054 | 12*75mm |
| PBS | Hyclone, USA | SH30256.01 |
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