Summary
Aquí se describe un protocolo de co-inmunoprecipitación para estudiar interacciones de proteínas entre las proteínas nucleares endógenas bajo condiciones hipóxicas. Este método es conveniente para la demostración de las interacciones entre los factores de transcripción reguladores Co transcripcionales a hipoxia.
Abstract
Niveles bajos de oxígeno (hipoxia) accionar una variedad de respuestas adaptativas con el factor inducible por hipoxia 1 (HIF-1) complejo actuando como regulador maestro. HIF-1 se compone de una subunidad α regulados por oxígeno de heterodiméricos (HIF-1α) y expresa constitutivamente la subunidad β (HIF-1β) también conocido como aril hidrocarburo del receptor nuclear translocador (ARNT), regulación de genes implicados en diversos procesos como angiogénesis , eritropoyesis y glucólisis. La identificación de proteínas interactuantes de HIF-1 es clave para la comprensión de la vía de señalización de la hipoxia. Además de la regulación de la estabilidad de HIF-1α, hipoxia desencadena también la translocación nuclear de los muchos factores de transcripción, incluyendo HIF-1α y ARNT. En particular, la mayoría de los métodos actuales utilizados para el estudio de tales interacciones proteína-proteína (IBP) se basa en sistemas donde los niveles de proteínas se incrementan artificialmente a través de la sobreexpresión de la proteína. Sobreexpresión de la proteína a menudo conduce a resultados no fisiológicos derivados de artefactos temporales y espaciales. Aquí describimos una co-inmunoprecipitación modificada protocolo después del tratamiento de la hipoxia con proteínas nucleares endógenas y como una prueba de concepto, para mostrar la interacción entre HIF-1α y ARNT. En el presente Protocolo, las células hipóxicas se cosecharon bajo condiciones hipóxicas y tampón de lavado de Dulbecco Phosphate-Buffered salina (DPBS) también fue previamente equilibrado a condiciones hipóxicas antes de su uso para mitigar la degradación de la proteína o complejo de la proteína disociación en reoxygenation. Además, las fracciones nucleares se extrajeron posteriormente para concentrar y estabilizar proteínas nucleares endógenas y evitar resultados falsos a menudo vistos en la sobreexpresión de la proteína. Este protocolo puede utilizarse para demostrar interacciones endógenas y nativas entre los factores de transcripción reguladores transcripcionales Co bajo condiciones hipóxicas.
Introduction
La hipoxia ocurre cuando falta oxígeno se suministra a las células y tejidos del cuerpo. Juega un papel fundamental en diversos procesos fisiológicos y patológicos como la diferenciación de la célula de vástago, inflamación y cáncer1,2. Factores inducible por la hipoxia (HIFs) funcionan como heterodímeros, compuesto por una subunidad α regulados por el oxígeno y una subunidad β constitutivamente expresada también conocido como ARNT3. Hasta la fecha se han identificado tres isoformas de las subunidades de HIF-α (HIF-1α, 2α HIF y HIF-3α) y tres subunidades β HIF (HIF/ARNT-1β, ARNT2 y ARNT3). HIF-1α y ARNT se expresan ubicuamente, mientras que HIF-2α, 3α HIF, ARNT2 y ARNT3 tienen más restringido de patrones de expresión4. El complejo de la proteína HIF-1 es el regulador clave de la respuesta de la hipoxia. Bajo condiciones de hipoxia, HIF-1α se convierte estabilizado, transloca al núcleo y dimerizes con ARNT5. Posteriormente, este complejo se une a nucleótidos específicos conocidos como elementos sensibles de la hipoxia (HREs) y regula la expresión de genes diana implicados en diversos procesos como angiogénesis, eritropoyesis y glucólisis6. Además de esta respuesta "canónica", la vía de señalización de hipoxia también es conocida por interferencia con la respuesta celular múltiples vías como la muesca y Nuclear Factor kappa B (NF-κB) de señalización7,8,9.
La identificación de proteínas interactuantes novela HIF-1 es importante para una mejor comprensión de la vía de señalización de la hipoxia. A diferencia de ARNT, que es insensible a los niveles de oxígeno y constitutivamente expresada, los niveles de la proteína HIF-1α están estrictamente regulados por los niveles de oxígeno celular. En normoxia (21% de oxígeno), HIF-1α proteínas son rápidamente degradadas10,11. La vida media corta de HIF-1α en normoxia presenta desafíos técnicos específicos para la detección de la proteína de extractos celulares, así como para la identificación de proteínas HIF-1α-que obran recíprocamente. Además, varios factores de transcripción, incluyendo aquellos del complejo HIF-1 se translocan a núcleo bajo condiciones hipóxicas12,13,14. La mayoría de los métodos actuales utilizados para estudios PPI se realiza utilizando no-fisiológico sobreexpresión de las proteínas. Dicha sobreexpresión de la proteína se ha divulgado para causar defectos celulares diferentes a través de múltiples mecanismos incluyendo sobrecarga de recursos, desequilibrio estequiométrica, interacciones promiscuas y vía modulación15,16. En cuanto a estudios PPI, sobreexpresión de la proteína puede llevar a falsos negativos positivos o incluso falsa, resultados, dependiendo de las propiedades de la proteína y las funciones de las proteínas sobreexpresadas. Por lo tanto, los métodos actuales para estudios de IBP debe ser modificado con el fin de revelar el IBP fisiológicamente relevantes bajo condiciones hipóxicas. Previamente hemos demostrado la interacción de HIF-1 y el factor de transcripción familia Ets GA-proteína de unión (GABP) en las células P19 hipóxicas, que contribuye a la respuesta del promotor Hes1 a hipoxia17. Aquí, describimos un protocolo de co-inmunoprecipitación estudio IBP entre proteínas endógenas nucleares bajo condiciones hipóxicas. La interacción de HIF-1α y ARNT se muestra como una prueba de concepto. Este protocolo es adecuado para demostrar las interacciones entre los factores de transcripción reguladores transcripcionales Co bajo condiciones hipóxicas, incluyendo pero no limitado a la identificación de proteínas interactuantes de HIF-1.
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Protocol
Esta sección del Protocolo, que utiliza el riñón embrionario humano 293A celular (HEK293A), s sigue las directrices del Comité de ética de investigación en la Universidad Tecnológica de Nanyang, Singapur.
1. inducción de hipoxia en las células HEK293A
- Preparar cuatro platos de 10 cm y la semilla 3 – 5 x 10 células de6 HEK293A por plato en 10 mL Dulbecco modificado suplementado Eagle (DMEM, glucosa de 4.5 g/L) con 10% suero bovino fetal (FBS), 2 mM L-glutamina, piruvato de sodio 110 mg/L, 100 U/mL de penicilina y 100 mg / estreptomicina de mL. Las células a 37 ° C, 5% CO2 incubadora de la cultura.
Nota: Celular siembra debe realizarse en un gabinete de la seguridad biológica (BSC). Las superficies de todos los materiales a ser colocados en el BSC se deben limpiar con etanol al 70%. - 24 h después de la siembra, cuando las células han alcanzado 80-90% de confluencia, poner dos platos en el subchamber de la hipoxia en la guantera de la incubadora (véase Tabla de materiales) con 1% O2 y 5% CO2 a 37 ° C y mantener los otros dos platos en normoxia (21% O 2, 5% CO2 a 37 ° C) para h. 4 Utilice un conjunto de células hipóxicas y normoxic para evaluar el tratamiento de la hipoxia por western blot y utilizar el otro conjunto de células para los experimentos de co-inmunoprecipitación.
Nota: Los niveles de oxígeno se pueden establecer a 0 – 5% y la duración del tratamiento de la hipoxia puede variar dependiendo del tipo de célula y objetivo de estudio.
2. toda célula y extracción Nuclear
Nota: Ver tabla 1 para obtener información sobre los tampones utilizados en el presente Protocolo.
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Cosechar las células de control de normoxia.
- Quitar los medios de cultivo por aspiración y lavar las células con 10 mL DPBS (PH 7.0 – 7.2) usando una pipeta de 10 mL.
Nota: Evite tocar la monocapa de células con la pipeta. Durante el lavado, pipetee suavemente la DPBS abajo la pared de la placa de cultivo celular para evitar la pérdida de la célula. - Pipetear 5 mL DPBS helada en la placa y raspe las células de la superficie de la placa en PBS helado con un raspador celular.
- La suspensión de células de transferencia en tubos cónicos de 15 mL y conservar en hielo.
- Quitar los medios de cultivo por aspiración y lavar las células con 10 mL DPBS (PH 7.0 – 7.2) usando una pipeta de 10 mL.
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Cosecha de las células cultivadas bajo condiciones hipóxicas.
- Equilibre la DPBS a condiciones hipóxicas colocando una destapado 100 mL experimento botella reactiva de cristal llenada de DPBS en la subchamber de la hipoxia (1% O2 y 5% CO2 a 37 ° C) durante 24 h de antelación.
- Aproximadamente 1 h antes de la cosecha de las células tratada la hipoxia, coloque una caja de hielo con hielo en la cámara de procesamiento de la guantera, que ha sido equilibrada al 1% O2 y 5% CO2. Transferir al frasco que contiene la DPBS hipóxico previamente equilibrado de la subchamber de la hipoxia a la cámara de procesamiento y coloque en hielo.
- 4 h después del tratamiento de la hipoxia, transferir las células de la subchamber de la hipoxia a la cámara de procesamiento que ha sido previamente equilibrada al 1% O2 y 5% CO2.
- Quitar los medios de cultivo por aspiración y enjuague las células una vez con 10 mL pipeta heladas previamente equilibrados DPBS hipóxicos con 10 mL.
- Añadir 5 mL DPBS heladas previamente equilibradas con 5 mL pipeta y desalojar a las células por raspado con una espátula de la célula.
- Inclinación de la placa de cultivo celular y recoger las células separadas con una pipeta de 10 mL. Transferir la suspensión de células en DPBS en tubos cónicos de 15 mL y conservar en hielo.
- Abrir la puerta entre las cámaras de procesamiento y memoria intermedia de la guantera, los cuales han sido previamente equilibrados 1% O2 y 5% CO2. Transferir los tubos cónicos de 15 mL en hielo que contiene células de hipoxia tratada de la cámara de procesamiento a la cámara de amortiguamiento. Abra la puerta de la cámara de amortiguamiento y eliminar completamente las células de la guantera.
- Tanto las células normoxic de 2.1 y las células hipóxicas de 2.2 de pellets por centrifugación a 1.000 x g durante 5 min a 4 ° C.
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Preparar la célula entera extractos.
- Resuspender el pellet celular en 500 μl de tampón de lisis de ensayo (RIPA) helada radio inmunoprecipitación que contiene 50 mM pH Trisaminomethane clorhidrato (Tris-HCl) 8.0, 150 mM cloruro de sodio (NaCl), 1% tipo de tergitol NP-40 (NP-40), desoxicolato de sodio 0,5%, y 0.1% sodio dodecil sulfato (SDS), complementado con 1 x inhibidor de la proteasa cóctel (véase Tabla de materiales) transfiriendo los pellets de células arriba y abajo varias veces.
- Transfiera los lysates de la célula a nuevos tubos de microcentrífuga de 1,5 mL y mantener en hielo durante 30 minutos con Vortex ocasional.
- Centrifugue los lysates de la célula a 13.000 x g por 10 min a 4 ° C.
- Recoger el sobrenadante, alícuota 50 μl del sobrenadante en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL y guardar a-80 ° C.
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Preparar los extractos nucleares usando una extracción nuclear kit (véase tabla de materiales).
- Suavemente, Resuspender el pellet celular en 500 μl de tampón de lisis NL complementado con 1 x inhibidor de la proteasa cóctel y 0.1 M de Ditiotreitol (DTT) transfiriendo los pellets de células arriba y abajo varias veces.
- Añadir 25 μl de una solución de detergente NP a la suspensión de la célula y vortex durante 10 s a velocidad máxima.
- Centrifugar a 10.000 x g por 5 min a 4 ° C.
- Recoger el sobrenadante (extractos citoplasmáticos), alícuota de 50 μl del sobrenadante en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL y almacenar a-80 ° C.
- Resuspender el precipitado que contiene los núcleos de célula en 500 μl de tampón de lisis NL complementado con 1 x inhibidor de la proteasa cóctel y 0,1 M TDT con un vórtex durante 5 s a velocidad máxima.
- Centrifugar a 10.000 x g durante 5 min a 4 ° C y guardar el pellet nuclear.
- Resuspender el pellet nuclear en 50 μl de tampón de extracción NX1 complementado con 1 x inhibidor de la proteasa cóctel transfiriendo el diábolo hacia arriba y abajo varias veces.
- Incubar durante 30 min en hielo, mezcla en Vortex por 10 seg cada 5 min a velocidad máxima.
- Centrifugar a 12.000 x g durante 10 min a 4 ° C.
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Desalar los extractos nucleares.
- Recoger el sobrenadante del paso 2.5.9 y transferencia en los dispositivos de diálisis mini con un volumen máximo de 100 μl por unidad.
- Los dispositivos de diálisis mini del casquillo y colocarlos en un dispositivo de flotación.
- Coloque el dispositivo de la flotación en un vaso de precipitados que contenga 500 mL de buffer de diálisis previamente enfriada (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 20% glicerol, 100 mM de cloruro potásico (KCl), 0,2 mM dihidratada del ácido (EDTA), 0,2 mM phenylmethylsulfonyl fluoruro (PMSF) y 0,5 mM DTT) e incubar durante 30 min a 4 ° C con agitación suave.
PRECAUCIÓN: PMSF es peligroso. Evitar el contacto directo con la piel o inhalación. - Recolectar las muestras de la esquina de los dispositivos de diálisis mini y transfiera a nuevos tubos de microcentrífuga de 1,5 mL.
- Centrifugar a 12.000 x g durante 10 min a 4 ° C, alícuota 25 μl de cada sobrenadante en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y guardar a-80 ° C.
3. evaluación del tratamiento de la hipoxia por la detección de la expresión de la proteína y la localización subcelular de HIF-1α
- Determinar la concentración de proteína de la célula entera o extractos nuclear citoplasmática usando el ensayo de microplacas bicinchoninic ácido (BCA) proteína análisis kit según el las instrucciones18 fabricante.
- Diluir los lysates de la célula en tampón x Laemmli 1 que contiene 5% 2-Mercaptoetanol y hierve a 95 ° C durante 5 minutos.
PRECAUCIÓN: No toque la superficie del bloque de calefacción, ya que puede provocar quemaduras. -
Separar las proteínas por electroforesis en gel de poliacrilamida sodio dodecil sulfato (SDS-PAGE).
- De carga iguales cantidades de proteína (25 μg) en cada pocillo de un geles de SDS-PAGE prefabricado gradiente (4 – 20%), junto con 3 μl del marcador de peso molecular.
- Correr el gel tampón que contiene 2,5 mM Tris, glicina de 19,2 mM, 0.01% SDS, PH8.3 durante 30 min a 200 V de corriente.
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Transferencia de las proteínas desde el gel a la membrana de nitrocelulosa.
- Montar el sándwich de transferencia (papel de filtro de membrana de papel de filtro gel) con el gel en el lado del ánodo y la membrana del lado del cátodo del cassette.
- Coloque el cartucho en el tanque de la transferencia con el tampón de transferencia que contiene 2,5 mM trisaminomethane (Tris), glicina 19,2 mM y 20% de metanol.
PRECAUCIÓN: El metanol es inflamable y debe guardarse en el almacenamiento de líquidos inflamable gabinete. - Llevar a cabo la transferencia por 1 h a 100 V en la cámara fría.
- Bloquear el blot en 10 mL de tampón de bloqueo que contiene 50 mM de Tris-Cl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0,1 leche descremada de Tween 20 y 5% durante 1 h a temperatura ambiente en un agitador.
- Incubar el blot con anticuerpos anti-HIF-1α (dilución 1/500) en el mismo tampón de bloqueo durante la noche a 4 ° C.
- Lave la mancha 3 veces durante 5 min cada vez con 50 mL de TBS-T.
- Incubar el blot con peroxidasa de rábano (HRP)-anticuerpo secundario conjugado (dilución al 1/1.000) en leche 10 mL de TBS-T que contiene 5% sin grasa durante 1 h a temperatura ambiente.
- Lave la mancha 3 veces durante 5 min cada vez con 50 mL de TBS-T.
- Mezcla 500 μl cada una de mayor chemilumescent (ECL) Reactivo A y B en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y agitar brevemente.
- El sustrato de la ECL se aplican a la mancha e incubar durante 1 min a temperatura ambiente.
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Captura las señales quimioluminiscencia utilizando un dispositivo de carga acoplada (CCD) sistema de imagen basado en cámaras.
- Escurrir exceso sustrato ECL tocando el borde de la membrana con un papel y colocar la membrana en un protector de hoja.
- Coloque la membrana sobre la bandeja de muestra de la CCD sistema de imagen basado en cámaras.
- Inicie el software de procesamiento de imagen (véase Tabla de materiales) y capturar las imágenes con las siguientes opciones: archivo → nuevo protocolo → canal → configuración de protocolo → Gel la proyección de imagen (aplicación: Chemi; Proyección de imagen de área: Gel listo Bio-Rad; Exposición de imágenes: El software optimizará automáticamente el tiempo de exposición para las bandas intensas) protocolo de funcionamiento →
Nota: El tiempo de exposición puede ser ajustado manualmente para lograr las imágenes óptimas.
4. inmunoprecipitación y la detección de las proteínas Immunoprecipitated
- Lavar 50 μl de bolas de proteína A/g sepharose en 500 μl de tampón TBS en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL y los granos de pellets por centrifugación a 3.000 x g durante 2 min a 4 ° C.
- Deseche el sobrenadante y resuspender los granos en 100 μl de tampón TBS.
- Añadir 2 μl de anticuerpo monoclonal anti-ARNT de ratón (1,4 mg/mL) o el ratón de la inmunoglobulina G (IgG) (1,4 mg/mL) que fue preparado por reconstitución ratón 0,7 mg IgG en 500 μl de tampón TBS.
- Coloque los tubos de microcentrífuga de 1,5 mL con los granos en un tubo de los rotadores e incubar por 2 h a 10 rpm en la cámara fría.
Nota: Manejar los tubos suavemente y mantenga la suspensión que contiene los granos en la parte inferior del tubo. - Los granos de pellets por centrifugación a 3.000 x g durante 2 min a 4 ° C y descartar el sobrenadante.
- Diluir 200 μg de la proteína nuclear lisada obtenida en paso 2.6.5 en 800 μl del buffer IP consistente en 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 180 mM NaCl, 20% glicerol, inhibidor de la proteasa de 0.2% NP-40 y 1 x cóctel. Incubar el lisado con los granos de acoplamiento de anticuerpos obtenidos en el paso 4.5 durante la noche a 4 ° C.
- Los granos de pellets por centrifugación a 3.000 x g durante 2 min a 4 ° C, desechar el sobrenadante y lavar los granos 3 veces con 1 mL cucharadas helado que contiene 0.2% NP-40.
- Hervir los granos en 50 μl Laemmli Solución tampón de muestra a 95 ° C durante 5 minutos.
- Centrifugue los granos a 10.000 x g por 5 min a 4 ° C, recoger el sobrenadante y desechar los granos.
Nota: El sobrenadante puede almacenarse a 4 ° C a corto plazo o a-20 ° C a largo plazo. - Detectar la presencia de HIF-1α de los complejos de proteína immunoprecipitated por western blot como se describió anteriormente en el paso 3.3 adelante.
Nota: La cuantificación de proteína no es necesaria para este paso. Carga de volumen completo (50 μL) del sobrenadante de cada muestra en cada pocillo de una geles gradiente (4 – 20%) de SDS-PAGE prefabricado
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Representative Results
Para evaluar la respuesta celular a la hipoxia, la expresión se examinaron los niveles y la localización subcelular de los componentes de tratamiento complejo de hipoxia siguiente de HIF-1. HEK293A las células fueron cultivadas bajo condiciones hipóxicas durante 4 h o guardado en normoxia como controles. Niveles de la proteína HIF-1α y ARNT se examinaron en células completas o extractos nuclear citoplasmática por western blot. Como los niveles de HIF-1α esperados, total eran upregulated por hipoxia, mientras que niveles de ARNT en Lisados celulares total no fueron significativamente alteradas (figura 1A). Además, la hipoxia inducida por acumulación nuclear de HIF-1α y ARNT en HEK293A las células (figura 1B), que es consistente con informes anteriores, aunque no se detectó expresión citoplásmica de ARNT en algunas de la líneas de celular probado19.
A continuación, hemos demostrado la interacción de HIF-1α y ARNT después del tratamiento de la hipoxia. Se prepararon extractos nucleares de células HEK293A expuestas a normoxic o condiciones hipóxicas para experimentos de 4 h. Co-inmunoprecipitación se realizaron utilizando extractos nucleares de células HEK293A. Como se muestra en la figura 2, HIF-1α fue co-immunoprecipitated con ARNT de los extractos nucleares de células HEK293A hipóxicos.
Tomados en conjunto, el protocolo descrito puede ser utilizado con éxito para inducir una respuesta hipóxica en células y determinar mayor unión a proteínas fisiológicas del endógeno expresado complejos de HIF-1α/ARNT dentro del núcleo.
Figura 1: Regulación de la expresión de la proteína y localización subcelular de los componentes por hipoxia HIF-1. (A) el análisis de Immunoblot de la total expresión de HIF-1α o ARNT en células HEK293A. Las células fueron expuestas a la hipoxia durante 4 h (H) o guardadas en normoxia (N). Las proteínas de los extractos celulares fueron separadas por SDS-PAGE y analizadas por immunoblotting con anti-HIF-1α, anti-ARNT y los anticuerpos anti-gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH). Se utilizó GAPDH como control de carga. (B) el análisis de Immunoblot de expresión de HIF-1α y ARNT en fracciones subcelulares de las células HEK293A. HEK293A las células fueron cultivadas bajo condiciones hipóxicas durante 4 h (H) o guardado en normoxia (N). 25 μg de proteína de extractos nucleares o citoplasmáticos se analizaron por inmunotransferencia utilizando anti-HIF-1α, anti-ARNT, el yin y yang 1 (YY1) y anticuerpos anti-GAPDH. YY1 y GAPDH fueron utilizados como controles para las fracciones citoplasmáticas y nucleares, de la carga respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: HIF-1α interactúa con ARNT bajo condiciones hipóxicas. HEK293A células fueron expuestas a la hipoxia durante 4 h o guardadas en normoxia como controles. Se prepararon extractos nucleares de células HEK293A y immunoprecipitations se realizaron utilizando un anticuerpo anti-ARNT. (Entradas) los extractos nucleares y immunoprecipitated proteínas fueron analizadas por immunoblotting usando anticuerpos anti-HIF-1α, anti-ARNT y anti-YY1. YY1 fue utilizado como un control de carga para las entradas, mientras que IgG fue utilizado como control negativo para los experimentos de co-inmunoprecipitación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Solución | Componentes | Comentarios |
| Buffer de diálisis | 20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 20% glicerol, 100 mM KCl, 0.2 mM EDTA, 0.2 mM PMSF y 0,5 mM DTT | Añadir PMSF y TDT inmediatamente antes del uso. |
| Buffer de ejecución | 2,5 mM Tris-HCl (PH 8,3), 19,2 mM glicina y 0.01% SDS | Mezclar 100 mL 10 x tampón Tris/glicina/SDS con 900 mL ddH2O. |
| Tampón de transferencia | 2,5 mM Tris-HCl (PH 8,3), 19,2 mM glicina y 20% de metanol | Mezclar 100 mL 10 x tampón Tris/glicina con 200 mL de metanol y 700 mL ddH2O. |
| Tampón TBS | 50 mM de Tris-Cl (pH 7.6) y 150 mM NaCl | Mezclar 100 mL 10 x TBS tampón con 900 mL ddH2O. |
| Tampón TBS-T | 50 mM de Tris-Cl (pH 7.6), 150 mM NaCl y 0,1% Tween 20 | Mezcla 100 mL 10 x TBS solución tampón con 900 mL ddH2O y 1 mL de Tween 20. |
| Solución amortiguadora de bloqueo | 50 mM de Tris-Cl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0,1% de Tween 20 y 5% de leche descremada | Disolver 5 g de secante-Grade Blocker en tampón TBS-T de 100 mL. |
| Buffer IP | 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 180 mM NaCl, 20% glicerol, inhibidor de la proteasa de 0.2% NP-40 y 1 x coctel | Añadir el cóctel de inhibidor de la proteasa inmediatamente antes del uso. |
Tabla 1: Preparación de solución.
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Discussion
El complejo de HIF-1 es un regulador principal de la homeostasis del oxígeno celular y regula una gran cantidad de genes implicados en diferentes respuestas de adaptación celulares a la hipoxia. Identificación de nuevas proteínas interactuantes de HIF-1 es importante para la comprensión del transduction de la señal hipóxica. Experimentos de co-inmunoprecipitación se utilizan comúnmente para los estudios de IBP para delinear vías de transducción de señal celular. Sin embargo, la sobreexpresión de la proteína sigue siendo ampliamente utilizada y esto puede conducir a los artefactos experimentales. Además, HIF-1α es una proteína altamente inestable y se convierte rápidamente degradado durante re-oxigenación11. Además, la hipoxia provoca translocación nuclear de los componentes de HIF-1 en líneas celulares de mamíferos más. Por lo tanto, protocolos de co-inmunoprecipitación convencional tienen que ser optimizado para la identificación de fisiológicamente relevantes proteínas interactuantes de HIF-1 después del tratamiento de la hipoxia. Aquí, describimos un protocolo de co-inmunoprecipitación modificado que se utiliza para demostrar la interacción entre HIF-1α y ARNT en hipoxia.
Para evitar la degradación de HIF-1α durante la oxigenación, se cosecharon las células hipóxicas dentro de la cámara de procesamiento de la guantera de la incubadora que previamente fue equilibrada en condiciones hipóxicas. El tampón de lavado DPBS también fue equilibrado en condiciones hipóxicas antes de su uso. Si no se dispone de ninguna estación de trabajo de hipoxia para el proceso, las células hipóxicas se pueden lavar con DPBS hipóxico previamente equilibrado y cosechadas después de eso rápidamente en hielo. Considerando que la hipoxia puede provocar la translocación nuclear de HIF-1 componentes y esa sobreexpresión de la proteína puede inducir resultados artefactuales, proteínas nucleares endógenas fueron utilizadas en el presente Protocolo. La utilización de extractos nucleares en el protocolo de co-inmunoprecipitación también ha sido reportado por otros20. Representa una ventaja técnica para el estudio de las interacciones entre las proteínas nucleares, ya que minimiza la posibilidad de que las proteínas nucleares de ser diluido a cabo por las proteínas celulares. Además, la utilización de extractos nucleares puede ser útil para la reducción de las interacciones no específicas, especialmente de proteínas citoplásmicas irrelevantes muy abundantes y para la mejora de la estabilidad de la proteína nuclear reduciendo al mínimo la exposición a proteasas presentes en el citoplasma. El uso de extractos nucleares endógenos en lugar de extractos celulares todo para la co-inmunoprecipitación demuestra una mejora técnica importante, como solo podemos detectar la interacción entre HIF-1α y GABPα usando los extractos nucleares endógenos pero no con toda los extractos de célula de17.
En el protocolo descrito, varias condiciones pueden optimizarse aún más para mejorar los resultados. Nos inducida por hipoxia en células HEK293A por tratamiento con 1% de oxígeno durante 4 horas. Sin embargo los niveles de oxígeno y la duración del tratamiento de la hipoxia pueden variar para diferentes tipos de células y ajustados de acuerdo a los objetivos del estudio. Por ejemplo, HIF-1α y HIF-2α pueden ser diferencialmente regulada por hipoxia en una manera específica de tipo celular, indicando sus diferentes roles en diferentes contextos biológicos. Se ha demostrado que en las células del neuroblastoma, HIF-1α es más activo durante cortos períodos de hipoxia intensa (1% O2), mientras que HIF-2α es también activo bajo hipoxia leve (5% O2) y se convierte en más activo siguiente tratamiento de la hipoxia crónica (48-72 h de exposición hipóxica)21. 0 – 5% de O2 niveles se utilizan para tratamientos de hipoxia en vitro , donde 1 – 5% O2, 0.1 – 1% O2 y 0-0.1% de O2 con frecuencia se definen como leve hipoxia, hipoxia y anoxia, respectivamente22. Concentración de sal es otro parámetro que requiere optimización, sobre todo porque juega un papel fundamental para las interacciones iónicas en los IBP23. En este estudio se utilizaron extractos nucleares con las proteínas nucleares generalmente extraídas por medio de un tampón que contiene altas concentraciones de sal. Por lo tanto, los extractos nucleares tenga que ser desalado antes de los experimentos de co-inmunoprecipitación. Aquí, hemos desalado los extractos nucleares utilizando un buffer de diálisis conteniendo 100 mM KCl y mezclado los extractos dializados con el tampón IP que contiene 180 mM NaCl proporcionalmente para lograr una concentración final de sal cerca de 150 mM, que es similar a la fisiológica condiciones de protones intracelulares. La concentración final de sal puede ser modificada dependiendo de las propiedades de los protones de interés. En este protocolo, se utilizó GAPDH como control de carga para extractos de células enteras y las fracciones citoplasmáticas. No observamos inducida por hipoxia regulatorios efectos significativos sobre la expresión de la GAPDH en células HEK293A. Sin embargo, GAPDH se ha demostrado previamente ser upregulated por hipoxia en ciertos tipos de la célula del24. Con esto en mente, uno puede necesitar utilizar los controles de la carga alternativa adecuada cuando sea necesario25. Por separado, se observó un importante nivel de fondo derivados de los granos o anticuerpos utilizados en el protocolo actual de la señal. Para reducir el fondo, se puede prolongar los pasos de lavado (10 – 15 min) o realizar lavados más de 3 (5-10 veces). Alternativamente, también puede incrementarse la fuerza iónica del tampón de lavado por valorar la concentración de 150 a 500 mM durante el lavado. Los lisados pueden también ser preaprobados por incubación con granos de sepharose A/G de proteína por 1 h a 4 ° C con rotación.
Este protocolo se limita a los extractos nucleares y como tal puede no ser adecuado para el estudio de los IBP en otros compartimentos celulares como las mitocondrias y el retículo endoplásmico. Similar a otros protocolos de co-inmunoprecipitación convencional, este método no puede utilizarse para el estudio de los IBP en tiempo real o a determinar si el IBP directa o indirecta.
En Resumen, le ofrecemos un protocolo modificado de co-inmunoprecipitación para la identificación de nuevas proteínas interactuantes fisiológicamente relevantes de HIF-1. Este protocolo también es adecuado para el estudio de las interacciones entre los factores de transcripción reguladores transcripcionales Co bajo condiciones hipóxicas. Aunque este protocolo está diseñado específicamente para los experimentos de co-inmunoprecipitación en condiciones de hipoxia, una parte del protocolo descrito para las células control de normoxia puede utilizarse para estudiar los protones nucleares bajo condiciones de normoxia.
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Disclosures
Los autores no declaran conflictos de interés.
Acknowledgments
Agradecemos a Prof. Asoc. pecado Tiong Ong para el uso de la plataforma de la hipoxia. Este trabajo fue apoyado por el siguiente: Singapur Ministerio de educación, Ministerio de educación 1T1-02/04 y MOE2015-T2-2-087 (a Y.A.), Lee Kong Chian Facultad de medicina, concesión de la puesta en marcha de la Universidad Tecnológica de Nanyang M4230003 (a P.O.B.), el Consejo de investigación sueco, la Fundación familiar de Erling Persson, la Fundación de Novo Nordisk, la Fundación af Fundación de Quito, la Asociación Sueca de la Diabetes, la compañía de seguros de Scandia, la investigación de la Diabetes y Wellness Foundation, Fundación de litera von Kantzow, el Programa de investigación estratégica en Diabetes en el Instituto Karolinska, la ERC ERC-2013-AdG 338936-Betalmage y el Knut y Alice Wallenberg Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| 1.0 M Tris-HCl Buffer, pH 7.4 | 1st BASE | 1415 | |
| Protein A/G Sepharose beads | Abcam | ab193262 | |
| Natural Mouse IgG protein | Abcam | ab198772 | |
| EDTA | Bio-Rad | 1610729 | |
| 2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610737 | |
| 2-Mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710 | |
| Nitrocellulose Membrane | Bio-Rad | 1620112 | |
| Blotting-Grade Blocker | Bio-Rad | 1706404 | Non-fat dry milk for western blotting applications |
| 10x Tris Buffered Saline (TBS) | Bio-Rad | 1706435 | |
| 10% Tween 20 | Bio-Rad | 1610781 | |
| 10x Tris/Glycine/SDS | Bio-Rad | 1610732 | |
| 10x Tris/Glycine Buffer | Bio-Rad | 1610771 | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-Rad | 1610374 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7074 | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7076 | |
| SignalFire ECL Reagent | Cell Signaling | 6883 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-030-CV | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Merck Millipore | 52332 | |
| ARNT/HIF-1 beta Antibody | Novus Biologicals | NB100-124 | Concentration: 1.4 mg/mL |
| HIF-1 alpha Antibody | Novus Biologicals | NB100-479 | Concentration: 1.0 mg/mL |
| YY1 Antibody | Novus Biologicals | NBP1-46218 | Concentration: 0.2 mg/mL |
| Qproteome Nuclear Protein Kit | Qiagen | 37582 | Lysis buffer NL and Extraction Buffer NX1 are provied in the kit |
| GAPDH Antibody | Santa Cruz | sc-47724 | Concentration: 0.2 mg/mL |
| Glycerol (≥99%) | Sigma | G5516 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| RIPA buffer | Sigma | R0278 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | 71376 | |
| NP-40 | Sigma | 127087-87-0 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, 4.5 g/L glucose) | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher Scientific | R0861 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | |
| HEK293A cell line | Thermo Fisher Scientific | R70507 | |
| Methanol | Thermo Fisher Scientific | 67-56-1 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pierce Protease Inhibitor Tablets | Thermo Fisher Scientific | 88660 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| QSP gel loading tip | Thermo Fisher Scientific | QSP#010-R204-Q-PK | 1-200 uL |
| Equipment/Instrument | |||
| Thick Blot Filter Paper, Precut, 7.5 x 10 cm | Bio-Rad | 1703932 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, with Mini Trans-Blot Module and PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1658034 | |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | Bio-Rad | 4561083 | |
| ChemiDoc XRS+ System | Bio-Rad | 1708265 | |
| I-Glove | BioSpherix | I-Glove | |
| Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader | BioTek | BTS1LFTA | |
| Costar 5mL Stripette Serological Pipets | Corning | 4487 | |
| Costar 10mL Stripette Serological Pipets | Corning | 4488 | |
| Costar 25mL Stripette Serological Pipets | Corning | 4251 | |
| Corning 96-Well Clear Bottom Black Polystyrene Microplates | Corning | 3631 | |
| 15mL High Clarity PP conical Centrifuge Tubes | Corning | 352095 | |
| Small Cell Scraper | Corning | 3010 | |
| Gilson Pipetman L 4-pipettes kit | Gilson | F167370 | P2, P20, P200, P1000 and accessories |
| 1.5mL Polypropylene Microcentrifuge Tubes | Greiner Bio-One | 616201 | |
| PIPETBOY acu 2 Pipettor | INTEGRA Biosciences | 155 000 | |
| Justrite Flammable Liquid Storage Cabinets | Justrite Manufacturing Co. | 896000 | |
| Vortex mixer | Labnet | S0200 | |
| CO2 incubator | NuAire | NU-5820 | |
| Orbital shakers | Stuart | SSL1 | |
| Tube rotator SB3 | Stuart | SB3 | |
| MicroCL 21R Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002470 | |
| Sorvall ST 16 Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004240 | |
| Tissue Culture Dishes (100 mm) | Thermo Fisher Scientific | 150350 | |
| Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device | Thermo Fisher Scientific | 69580 | 10K MWCO, 0.1 mL |
| Float Buoys for 0.1mL Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Devices | Thermo Fisher Scientific | 69588 | |
| LSE Digital Dry Bath Heaters | Thermo Fisher Scientific | 1168H25 | |
| Thermo Scientific 1300 Series A2 Class II, Type A2 Bio Safety Cabinets | Thermo Fisher Scientific | 13-261-308 | |
| Software | |||
| Image Lab Software | Bio-Rad | 1709691 |
References
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