Summary
Ce protocole décrit comment préparer des larves de drosophile pour analyse métabolomique basée sur GC-MS.
Abstract
Les progrès récents dans le domaine de la métabolomique ont établi la drosophile Drosophila melanogaster comme un puissant modèle génétique pour étudier le métabolisme des animaux. En combinant la vaste gamme d’outils génétiques drosophile avec la possibilité d’arpenter les grandes étendues du métabolisme intermédiaire, une approche métabolomique peut révéler des interactions complexes entre diet, génotype, événements démographiques et des signaux environnementaux. En outre, les études métabolomiques peuvent découvrir de nouveaux mécanismes enzymatiques et découvrir jusque-là inconnues des connexions entre les voies métaboliques apparemment disparates. Afin de faciliter une utilisation plus répandue de cette technologie auprès de la communauté de drosophile , ici, nous fournissons un protocole détaillé qui décrit comment préparer des échantillons de larves de drosophile pour chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse (GC-MS)- base d’analyse de la métabolomique. Notre protocole inclut des descriptions de prélèvement d’échantillons de larves, d’extraction de métabolite, dérivatisation chimique et analyse par CPG-SM. La réussite de ce protocole permettra aux utilisateurs de mesurer l’abondance relative des petits métabolites polaires, y compris les acides aminés, sucres et acides organiques impliqués dans la glycolyse et les cycles TCA.
Introduction
La drosophile Drosophila melanogaster est apparu comme un système idéal pour étudier les mécanismes moléculaires qui régulent le métabolisme intermédiaire. Non seulement la plupart des voies métaboliques conservées entre la drosophile et les humains, mais capteurs en éléments nutritifs principaux et régulateurs de croissance, comme l’insuline, Tor et myc, sont également actifs dans la mouche1,2. En conséquence, drosophile peut servir à explorer la base métabolique de maladies allant du diabète et l’obésité neurodégénérescence et du cancer. À cet égard, le développement larvaire de Drosophila offre le cadre idéal étudier un programme métabolique appelé glycolyse aérobie, ou l’effet Warburg. A l’instar de plusieurs tumeurs utilisent glycolyse aérobie pour générer la biomasse provenant des glucides, donc pour faire Drosophila larves activent la glycolyse aérobie afin de promouvoir la croissance du développement3,4,5. Ces similitudes entre les larves et le métabolisme de tumeur établir la drosophile comme modèle clé pour comprendre comment aérobie glycolyse est réglementé en vivo.
Malgré le fait que la mouche s’est imposé comme un modèle populaire pour étudier le métabolisme, la plupart des études de drosophile s’appuient sur des méthodes qui sont conçus pour mesurer différents métabolites3, tels que le tréhalose, triglycérides ou ATP. Puisqu’un protocole spécifique est requise pour mesurer chaque métabolite, études sur le dosage sont fastidieux, coûteux et préjugé en faveur de ces composés qui peuvent être mesurés à l’aide de trousses commerciales. Une solution à ces limitations a émergé dans le domaine de la métabolomique, qui fournit un moyen plus efficace et impartial d’étudier le métabolisme de la drosophile . Contrairement à une étude axée sur l’analyse, une analyse unique métabolomique peut simultanément mesure des centaines de métabolites de petites molécules et fournit une compréhension globale de l’organisme un état métabolique6,7. Cette technique a considérablement élargi la portée des études métaboliques de drosophile et représente l’avenir de ce nouveau champ8.
Métabolomique sont principalement menées à l’aide de trois technologies : (i) résonance magnétique nucléaire (RMN), (ii) liquide chromatographie spectrométrie de masse (LC-MS) et (iii) chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse (GC-MS)9. Chaque approche propose des inconvénients et des avantages distincts, et toutes ces technologies ont été utilisées pour étudier avec succès le métabolisme de drosophile . Étant donné que les recherches effectuées dans notre laboratoire se concentre sur les métabolites petits, polaires, nous utilisons principalement une méthode basée sur le GC-MS. GC-MS fournit à l’utilisateur avec un certain nombre d’avantages, notamment une grande reproductibilité, résolution maximale, la sensibilité, et de la disponibilité d’une bibliothèque spectrale standard electron impact (IE), qui permet l’identification rapide des découvertes métabolique caractéristiques10,11. La préparation des échantillons pour GC-MS, cependant, est quelque peu complexe et nécessite une attention minutieuse aux détails. Échantillons doivent être recueillies, lavés, pesés et congelés d’une manière qui apaise rapidement les réactions métaboliques. En outre, la carcasse mouche résiste aux protocoles standard de l’homogénéisation et nécessite un moulin à billes afin d’assurer l’extraction optimale de métabolite. Enfin, les échantillons analysés par GC-MS doivent subir dérivatisation chimique avant la détection12. Alors que les méthodes publiées antérieurement décrivent toutes ces étapes de13,3,14, un protocole visuel qui permettrait à l’utilisateur novice de façon reproductible générer des données de haute qualité est encore nécessaire. Nous démontrons comment préparer des échantillons de larves de drosophile pour analyse métabolomique basée sur GC-MS. Ce protocole permet à l’utilisateur de façon reproductible mesurer beaucoup des petits métabolites polaires qui composent le métabolisme carboné central.
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Protocol
1. collecte des œufs
- Recueillir des adultes mâles et femelles vierges des génotypes désirées. L’âge individuellement ces animaux dans un flacon de nourriture avec des supports de Bloomington standard pour 3 à 5 jours.
- Mettre en place les accouplements appropriés en transférant 50 femelles vierges et 25 hommes un nouveau flacon de nourriture.
NOTE : Un minimum de six accouplements indépendants devrait être mis en place pour chaque génotype. On recueillera seulement un échantillon de chaque croisement (c.-à-d. six échantillons prélevés sur six des accouplements indépendants). -
Préparer les casquettes de Ponte de mélasse.
- Mélangez 115 mL de mélasse et 29 g de gélose avec 700 mL H2O dans un flacon de 2 L.
- Faire bouillir la mélasse mélange agar sur une plaque chauffante.
- Laisser refroidir à 70 ° C.
- Ajouter 25 mL d’acide mix (20 mL d’acide phosphorique à 85 % et l’acide propionique 209 mL dans 1 L de H2O ; Entreposer dans une bouteille brune) et 10 mL d’ester méthylique de l’acide p-hydroxy-benzoïque 10 % dans l’éthanol à 95 %.
- Verser l’agar de mélasse en partie le couvercle et le fond d’un plat de vitroplants de2 35 x 10 mm.
Remarque : Avant de verser de mélasse plaques d’agar, n’oubliez pas que les couvercles et/ou de la base de la plaque de2 35 x 10 mm ExacTen dans la bouche d’une solution concentrée de drosophile (décrite dans l’étape 1.6). Selon la marque de plaques utilisées, la base ne peut pas être utilisable.
- Faire le pâte en ajoutant de l’eau distillée de levure fraîche active levure sèche (5 g levure/7 mL d’eau) jusqu'à ce que le mélange devient une pâte qui peut se propager facilement sur une surface solide (c.-à-d., la consistance du beurre d’arachide).
- Étaler environ 1,5 g de pâte de levure sur la surface d’une calotte de Ponte de mélasse.
- Introduisez les quatre trous d’air dans les côtés opposés d’un plastique 6 oz Drosophila solution concentrée à l’aide d’une aiguille de 22 G.
- Transférer les mouches accouplées nouvellement dans le flacon de nourriture dans les flacons de culture.
Remarque : Les mouches peuvent être transférés en soit à l’aide de CO2 comme anesthésique temporaire ou en tenant le haut du flacon dans la bouche de la bouteille et en tapant fortement le fond de la bouteille contre un sur table. - Placer rapidement une casquette de Ponte de mélasse avec la pâte de levure sur la surface dans la bouche d’une solution concentrée de drosophile . Bande de laboratoire permet de fixer le capuchon de ponte en place.
Remarque : Si les mouches ont été anesthésié avant le transfert, la bouteille devrait figurer horizontalement sur la table jusqu'à ce que toutes les mouches sont rétablis. Une fois que les mouches sont entièrement mobiles, placer le flacon dans un incubateur avec le capuchon de Ponte de mélasse au bas de la culture. - Replacer le capuchon de Ponte de mélasse au moins une fois par jour pour les deux premiers jours en inversant la solution concentrée, touchant le fond de la bouteille contre la paillasse, enlevant l’ancienne PAC oeuf et plaçant immédiatement un nouveau capuchon de l’oeuf dans la bouche de la bouteille. Jeter le vieux chapeau de ponte.
Remarque : Cette étape garantit que les femmes ne tiennent pas leurs oeufs et autorise collection des populations synchronisées. - Placer un nouveau capuchon de ponte dans la solution concentrée après day 3, remplacer après 2 h et le jeter. Enlever et reboucher la deuxième Ponte après quatre heures. L’étiquette au bas de cette casquette de ponte avec la date, l’heure et le génotype.
Remarque : Les œufs récoltés au cours de cette fenêtre 4 h servira pour l’analyse. Cette étape de synchronisation est critique pour analyser des stades de développement spécifiques. Œufs peuvent être collectées de cette manière pendant plusieurs jours. - Insérer les bouchons de ponte en un Pétri de 60 x 15 mm2 et les placer dans un incubateur à la température et l’humidité.
- Inspecter les capuchons des pontes tous les jours pour des problèmes avec la famine, de la densité de population ou de contamination.
Remarque : Les larves doivent avoir accès à une nourriture suffisante pour assurer un développement continu. Si nécessaire, la pâte de levure fraîche peut se propager sur tous les bouchons de ponte qui seront utilisés dans l’expérience. En outre, si la densité de la population larvaire est trop élevée, les larves commencera à se promener hors de la plaque de culture. Ces échantillons ne doivent pas être utilisés pour l’analyse de la métabolomique, parce que la forte densité de population et les épisodes intermédiaires de famine expérimentés tout en errant seront traduira par des données incohérentes. Une densité d’environ 80 à 100 moyen deuxième stade larvaire (L2) par plaque ou 40 – 50 milieu troisième stade larvaire (L3) par plaque est recommandé. Les échantillons qui sont visiblement contaminés par des bactéries ou des champignons doivent être jetés.
2. prélèvement de l’échantillon larvaire
- Âge des larves jusqu’au stade désiré. Si collecte les larves L3, resynchroniser les échantillons à la mue de L2 – L3. Resynchronisation est couramment réalisée en utilisant une méthode décrite précédemment qui utilise les stigmates antérieures comme une étape importante du développement de15. Alternativement, mi-L3 larves peuvent être synchronisées à l’aide d’un de gène de journaliste sgs3 16.
Remarque : À cet égard, nous trouvons mi-L2 larves (~ 60 h après la ponte) sont parfaitement adaptés pour la plupart des analyses parce qu’à ce stade, le développement larvaire est encore relativement synchrone, échantillons soigneusement recueillis ont une nourriture suffisante pour développer à ce validant, ainsi que la nombre d’animaux par exemple est gérable (voir ci-dessous). Une étape de synchronisation supplémentaire est nécessaire pour les larves L3 car les impulsions de l’ecdysone nombreux qui se produisent au cours du développement de L3 ont des effets dramatiques sur le métabolisme et généreront des artefacts dans les populations non synchronisées. - Utiliser une aiguille dissection pour soulever doucement la pâte de levure au large de la gélose. Placer la levure sur un nouveau capuchon de gélose de mélasse.
Remarque : La plupart des larves mangeront à l’interface entre l’agar de mélasse et de la pâte à levure. - Utilisez un petit pinceau pour recueillir les larves de la surface nouvellement exposée de l’agar de mélasse. Placez les larves dans un tube à centrifuger 1,5 mL sur la glace.
Remarque : Les tailles d’échantillon appropriée pour chaque stade de développement sont les suivants : 50 premier stade larvaire (L1) ; 25 mi-L2 larves ; larves L3 début 20 ; 15-L3 de milieu ou fin larves L3. - Laver et congeler les échantillons (étapes 2,3 à 2,8) par petits lots (quatre à six échantillons) tout en rassemblant un ensemble de grands échantillons. Les échantillons doivent être congelés à 20 min de placer des larves dans les tubes.
Remarque : Nous vous recommandons d’utiliser Eppendorf 1,5 mL Tubes Flex car les autres tubes risquent d’interférer avec le transfert de l’échantillon à l’étape 3. Échantillons doivent être prélevés dans des microtubes. Ne pas prélever des échantillons dans les tubes de perle décrits à l’étape 3.1. Perles en céramique conservent la solution de lavage de NaCl, qui se traduit par des mesures de masse inexactes et introduit des contaminants dans l’échantillon. - Ajouter 1 mL de glacee 0,9 % NaCl dans le tube, fermer le couvercle et verticalement flip le tube à fond pour laver les larves.
- Placer le tube de retour sur la glace pour ~ 30 s. Pendant ce temps, les larves vont couler au fond du tube, mais levure restera en suspension. Une fois que toutes les larves ont formé une boulette de lâche, enlever la solution de NaCl à l’aide d’une pipette de 1 mL.
- Répétez les étape 2.4 et 2.5 deux fois, ou jusqu'à ce que la solution de lavage final est clair.
Remarque : Pas de lavage supplémentaire peuvent être nécessaires si l’échantillon contient une quantité excessive de la levure. - Centrifuger les échantillons à 2 000 × g pendant 1 min à 4 ° C.
- Enlever toute la solution résiduelle à l’aide d’une pipette de 200 µL.
- Congeler immédiatement l’échantillon dans l’azote liquide.
Remarque : Le protocole peut être suspendu à cette étape. Échantillons peuvent être conservés jusqu'à 3 mois à-80 ° C.
3. transférer les échantillons aux perles Tubes
- Chaque échantillon de larve doit être transférée dans le tube de microtubes de 1,5 mL à un bouchage des tubes 2 mL contenant les billes en céramique de 1,4 mm. En préparation de cette étape de transfert, utilisez un marqueur de l’éthanol à l’épreuve pour marquer le côté d’un tube de perles de bouchage de 2 mL (marquage sur le couvercle sera détruit au cours de l’étape 4.4).
- Tarer la masse du tube perle étiquetés à l’aide d’une balance analytique permettant de mesurer avec précision 0,01 mg.
- Si les échantillons de larves ont été conservés à-80 ° C, placer les tubes échantillon en avant de l’azote liquide pour transférer.
- Pince longue permet de retirer le tube d’échantillon de 1,5 mL de l’azote liquide dewar.
- Porter des gants de nitrile, prenez la gelée tube, inverser, puis enfoncez fortement le couvercle du tube contre la paillasse pour déloger le culot congelé. Versez immédiatement le culot dans un tube de perles de bouchage préalablement taré 2 mL. Si la pastille ne parvient pas à déloger, retournez le tube à l’azote liquide et répétez.
NOTE : Boulettes de larves ne seront pas déloger de toutes les microtubes. Si vous utilisez un tube autre que celle recommandée, déterminer si granulés larvaires peuvent se détacher avant le prélèvement d’échantillons pour analyse. - Rapidement mesurer la masse totale du tube granule et perle larvaire. Placer immédiatement le tube échantillon dans l’azote liquide. Le culot de larve masse sera utilisé pour normaliser les données de la métabolomique.
Remarque : Le protocole peut être suspendu à cette étape. Échantillons peuvent être conservés jusqu'à 3 mois à-80 ° C.
4. Extraction de l’échantillon
- Placer les tubes à échantillon dans un banc de-20 ° C plus froide.
- Ajouter 0,8 mL de méthanol à 90 % prérefroidies (-20 ° C) contenant 2 µg/mL d’acide succinique-d4 dans chaque tube. Retourner l’échantillon à la paillasse de-20 ° C plus frais.
Remarque : L’acide succinique-d4 sert comme étalon interne. Utilisez uniquement la HPLC grade H2O et le méthanol. Étant donné que le méthanol et autres solvants organiques sont instables et difficiles à mesurer avec précision à l’aide de pipettes de déplacement d’air, nous recommandons d’utiliser des pipettes à déplacement positif pour cette étape et toutes les étapes suivantes. - Mettre en place un contrôle négatif en ajoutant 0,8 mL de méthanol à 90 % prérefroidies (-20 ° C) contenant 2 µg/mL d’acide succinique-d4 dans un tube à vide perle.
- Homogénéiser les échantillons pendant 30 secondes à 6,45 m/s en utilisant un homogénéisateur de moulin de perle située dans une salle de contrôle de température de 4 ° C.
NOTE : Échec d’homogénéiser les rapidement et complètement le culot larvaire est une source commune de variabilité dans l’analyse de la métabolomique. Utilisez uniquement les homogénéisateurs qui sont capables de détruire congelés tissus larvaires dans les 30 s. - Retourner les tubes échantillons homogénéisés à-20 ° C applications refroidisseur et les incuber dans un congélateur à-20 ° C pendant au moins 1 h.
- Centrifuger les tubes à 20 000 × g ou maximum vitesse pendant 5 min à 4 ° C pour éliminer le précipité obtenu.
- Transférer 600 µL du liquide surnageant dans un nouveau tube de microtubes de 1,5 mL. Ne pas déranger le précipité. Si la pastille précipitée devient délogée lors de pipetage le surnageant, renvoyer tous les surnageant au tube et répétez l’étape 4.6.
- Placer les tubes échantillon dans une centrifugeuse sous vide. N’oubliez pas que tous les tubes sont ouverts avant de sceller la centrifugeuse. Sécher les échantillons à la température ambiante jusqu'à l’élimination de tous les solvants (cette étape prend habituellement environ 16 h pour terminer).
Remarque : Si nécessaire, le protocole peut être suspendu à cette étape. Échantillon séché peut être conservé à-80 ° C.
5. chimique dérivatisation
- Si les échantillons séchés ont été conservés à-80 ° C, placer les tubes échantillon non ouverte dans une centrifugeuse vide et sécher pendant 30 min. Cette étape doit être exécutée avant l’ouverture du tube à essais.
Remarque : Cette étape supprime la condensation qui recueille à l’extérieur du tube microtubes lorsque retirés du congélateur. Cette partie du protocole est extrêmement sensible aux H2O et précautions supplémentaires doivent être adoptées pour garder tous les réactifs aussi sèches que possible. -
Préparer une solution de chlorhydrate de methoxylamine 40 mg/mL (MOX) dans la pyridine anhydre. N’utilisez que la pyridine anhydre. Stocker les MOX et la pyridine dans un dessicateur et préparez la solution de MOX de tous les jours.
ATTENTION : MOX et la pyridine sont toxiques. Préparer cette solution sous la hotte.- Utiliser un pistolet à air chaud pour sécher une seringue de verre de 1 mL.
- Insérer l’aiguille de la seringue dans le flacon de pyridine anhydre. Prélever 1 mL de pyridine et ajouter à un tube à centrifuger contenant 40 mg de MOX.
- Vider la bouteille de pyridine anhydre avec argon. Sceller la bouteille et retourner dans le dessiccateur.
- Dissoudre le MOX dans la pyridine en incubant le tube dans un mélangeur thermique à 35 ° C pendant 10 min à 600 tr/min.
- Ajouter 40 µL de MOX de 40 mg/mL dans une solution de pyridine anhydre à l’échantillon séché.
- Vortexer pendant 10 s et centrifuger brièvement (10 000 x g pendant 20 s).
- Incuber à 30 ° C pendant 1 h à 600 tr/min dans un mélangeur thermique.
- Centrifuger à vitesse maximale pendant 5 min retirer les particules de matière ou de 20 000 × g .
- Transférer 25 µL de liquide surnageant dans un flacon pour échantillonneur automatique avec un insert de microvolume verre 250 µL désactivé.
- Ajouter 40 µL de N- méthyl -N- trimethylsilyltrifluoracetamide (MSTFA) contenant 1 % TMCS.
ATTENTION : MSTFA est toxique. Effectuez cette étape sous la hotte.
Remarque : S’il est disponible, cette étape peut être complétée par un échantillonneur automatique Gerstel. - Placer un bouchon sur l’auto-échantillonneur et sceller à l’aide d’un outil de sertisseur.
- Incuber les échantillons à 37 ° C pendant 1 heure avec agitation (250 tr/min).
- Préparer une solution d’acide gras méthyl ester standard (FAMES) comme précédemment desceribed3. Ajouter 3 µL de FAMES dans le flacon pour échantillonneur automatique à l’aide d’un échantillonneur robotique immédiatement avant l’injection.
Remarque : Les FAMEs sont utilisés pour calibrer le décalage de temps de rétention et de vérifier les performances de l’instrument. Si aucun échantillonneur automatique robotique n’est disponible, les FAMEs peuvent être ajoutés au cours de l’étape 5.8.
6. GC-MS détection
Remarque : Dans la plupart des cas, l’utilisateur effectuera cette étape avec l’assistance d’un laboratoire central de la spectroscopie de masse. Ce protocole est conçu pour être utilisé avec un 30 m, colonne GC avec une colonne de garde de 5 m.
- Randomiser l’ordre de l’échantillon.
-
Préparer la GC-MS.
- Régler la vitesse d’écoulement de gaz hélium porteur à 1 mL/min.
- Régler la température d’entrée à 250 ° C.
- Programme de la GC à exécuter le gradient de température suivant :
- Température initiale à 95 ° C, avec une cale de 1 min.
- Augmenter la température à 110 ° C à raison de 40 ° C/min avec une cale de 2 min.
- Augmenter à 250 ° C en rampe de 5° C/min.
- Augmenter à 330 ° C à raison de 25 ° C/min avec un maintien finale de 4 min.
- La valeur délai solvant 3,5 min.
Remarque : La durée peut être modifiée selon le système de la GC-MS. Cette étape vise à empêcher MSTFA et MOX d’endommager le détecteur.
- Injecter 1 µL de l’échantillon de dérivés dans la GC-MS (split ratio de 10:1).
NOTE : Injecter 2 µL de l’échantillon, si l’intensité des pics est trop faible. L’ordre d’injection des échantillons devrait être randomisé. - Exploiter le spectromètre de masse en mode balayage complet sur une gamme de masses de 50 à 500 m/z.
7. analyse de données
- Analyser les données de métabolomique en utilisant soit une approche ciblée ou non ciblée. Analyse ciblée est axée sur la mesure de l’abondance d’un ensemble défini de métabolites, comme les mesures de lactate que nous décrivons ci-dessous. En revanche, l’analyse non ciblée utilise une approche impartiale afin d’identifier toute caractéristique métabolique qui est significativement changée entre deux ensembles d’échantillons.
NOTE : Notre laboratoire utilise principalement les programmes gratuits MetAlign17 MetaboAnalyst18,19 pour l’analyse des données. Comme une description adéquate de la contrôle de la qualité, normalisation et étapes de traitement des données sont au-delà de la portée de ce manuscrit, nous renvoyons l’utilisateur à des protocoles plus détaillés qui sont consacrées au traitement des données20,21, 22. En outre, un diagramme qui décrit les étapes requises pour cette analyse se trouvent ailleurs8.
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Representative Results
Lactate déshydrogénase (dLDH) des mutants qui n’ont pas d’activité dLDH4et témoins du même génétiquement ont été recueillis sous forme de larves de milieu-L2 et traitées selon le protocole décrit ci-dessus. Par rapport aux témoins, mutants larves présentent des changements significatifs en lactate et pyruvate L-2-hydroxyglutarate4. Les spectres ont été acquises avec un système d’Agilent GC6890-5973i MS. Un exemple des spectres GC-MS générer avec notre protocole est illustré à la Figure 1. Il y a beaucoup de fonctionnalités visibles et un pic notable pour le tréhalose, qui représente le plus grand sommet dans un échantillon de larve normalement et qui est habituellement saturé (Figure 1 aB). Le spectre individuel d’échantillon témoin négatif est illustré à la Figure 1. Bien qu’il y a encore plusieurs pics visibles dans l’échantillon de contrôle négatif, l’intensité et le nombre de pics sont réduits en comparaison avec les échantillons expérimentaux illustrés à la Figure 1 a, B. Ces pics résultent principalement de purge de la colonne, l’étalon interne (acide succinique-d4), FAMEs et contaminants acides gras. Préparation de l’échantillon défaillant génère un spectre similaire à celui illustré à la Figure 1.
Tous les spectres ont été prétraitées à l’aide de la MetAlign17 et les données ont été normalisées avec l’étalon interne et pellet massive. Par la suite, les données ont été présentées à MetaboAnalyst18,19 pour l’analyse statistique. Analyse en composantes principales (PCA) montre clairement que les deux groupes se séparent les uns des autres et qu’il n’y a aucune valeur aberrante dans deux groupes (Figure 2 a). Une analyse plus approfondie montre des changements significatifs dans les métabolites connus pour être affecté par la perte de dLDH (Figure 2 b)4.
Figure 1 : Spectres représentant GC-MS de Drosophila extrait larvaire. (A-B) Spectre typique de milieu-L2 extraits larvaires de type sauvage (WT) et dLDH mutants (KO). (C) un éventail représentatif GC-MS généré à partir d’un échantillon de contrôle négatif (NC). La plupart des sommets dans cette partie du spectre sont de l’étalon interne, des acides gras et des FAMEs. (D-F) En comparaison avec des échantillons WT, l’exposition d’échantillons KO des niveaux élevés de pyruvate (D) et abaissé les taux de lactate (E) et (F) 2-hydroxyglutarate (2-HG). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : L’analyse statistique montre les différents profils métaboliques entre le type sauvage (WT) et dLDH larves knockout (KO). (A) parcelle de scores PCA. (B) les métabolites qui présentent des changements significatifs chez les mutants dLDH . Tous les points de données sont tracés par rapport à la moyenne du contrôle WT, ce qui a été ajusté à une valeur arbitraire de 100. Avant l’analyse, les données a été normalisées à l’acide succinique-d4 interne standard et larves pellet masse. Données présentées sous forme de moyenne ± écart. p < 0,01 pour tous les métabolites à l’aide d’un à deux t-test. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Métabolomique fournit une occasion sans pareille d’arpenter les réactions métaboliques qui composent le métabolisme intermédiaire. La sensibilité de cette technologie, toutefois, restitue des données sensibles au bagage génétique, les indices du développement et une variété de contraintes environnementales, y compris la température, l’humidité, la densité de population et la disponibilité des nutriments. Par conséquent, une haute qualité et reproductibles métabolomique analyse exige que les échantillons soient recueillies dans des conditions très contrôlées. Alors que plusieurs clients mettent l’accent sur ce point3,8,23, nous fournissons ici une méthode étape par étape pour rassembler des larves qui vise à garantir la reproductibilité.
La source la plus courante de la variabilité dans une analyse métabolomique découle d’un échec à étancher, ou arrêter, les réactions métaboliques après que l’échantillon. À cet égard, le métabolisme s’arrête sur le point de congélation dans l’azote liquide et enzymes métaboliques seront détruites quand l’échantillon est homogénéisé dans le méthanol de-20 ° C. En supposant que l’utilisateur accorde une attention particulière pour garder un échantillon congelé avant extraction au méthanol, notre protocole est conçu pour s’assurer que les données de métabolomique générées par cette procédure représentent un instantané précis du métabolisme larvaire. Si l’utilisateur rencontrez des niveaux inacceptables de la variabilité des données, l’utilisateur devrait réexaminer le protocole d’extraction collection et métabolite avec une attention particulière portée à s’assurer (1) que le métabolisme est rapidement trempés (étapes 2,9 – 4.2) et (2) que la échantillon est efficacement homogénéisé dans 90 % de méthanol (4.4 étape). À cet égard, plusieurs usines de perle fournissent une force insuffisante pour homogénéiser les échantillons dans le délai imparti et nous encourageons l’utilisateur à utiliser un instrument qui a été utilisé dans les précédentes études8.
Notre protocole met également en évidence les principales étapes que l’utilisateur novice doit noter afin de façon reproductible derivatize échantillons. Ceci est essentiel pour la GC-MS, parce que de nombreux métabolites ont limité la volatilité ou la faible stabilité thermique. Dérivatisation augmente la volatilité et la stabilité thermique de nombreux métabolites, ce qui augmente le nombre de composés qui peuvent être mesurés de façon reproductible. Ainsi, les échantillons qui ont subi une dérivation incomplète exposera les formes et hauteurs des pics non reproductibles. Comme nous le soulignons ici, une source commune de dérivatisation défaillante est l’exposition de l’échantillon d’eau, ce qui diminue l’efficacité de dérivatisation chimique. Par conséquent, tous les réactifs, notamment MSTFA, MOX et pyridine, doivent être conservés dans des conditions exemptes d’humidité. La nécessité de maintenir des conditions de sécheresse s’étend également à la préparation des échantillons qui sont conservés à-80 ° C, ce qui doit être placé dans une centrifugeuse vide pendant 30 min avant de l’ouvrir pour faire en sorte que la condensation n’entre pas dans l’échantillon. Nous tenons également à souligner que le GC-MS est une technologie sensible, et ainsi, plus grands échantillons ne génèrent pas nécessairement les meilleures données. Notre protocole fournit des tailles d’échantillon testé expérimentalement et mesurera reproductible la plupart des métabolites dans le métabolisme du carbone central. Certains de ces métabolites sont très abondants et taille de l’échantillon accrue mènera à saturation dans le spectre du signal. En effet, le signal pour le tréhalose est déjà saturé dans notre analyse et un rapport de 100 : 1 split pour CG-SM injection doit être utilisée avec précision pour mesurer ce composé. Enfin, les utilisateurs devraient noter que parce que nous utilisons une solution d’extraction polaire, notre protocole n’est pas approprié pour l’extraction de lipides. Notre protocole ne tient pas compte des contaminants acides gras pouvant être présentes sur les tubes en plastique et les conseils, c’est pourquoi certains signaux de l’acide gras apparaître dans l’échantillon de contrôle négatif (Figure 1 b).
Enfin, les méthodes détaillées ici fournit un outil puissant pour l’étude du métabolisme de drosophile . Ce protocole, cependant, n’est pas spécifique à la drosophile et peut être utilisé avec peu de modifications pour la réalisation d’études métaboliques dans n’importe quel petit invertébré. Quelle que soit l’espèce, cette méthode simple permet la quantification relative de presque tous les acides aminés, intermédiaires de la glycolyse et le cycle de Krebs, ainsi que plusieurs autres petites molécules polaires. Lorsqu’il est combiné avec les outils de génétiques incomparables dont dispose la communauté de drosophile , ce type d’analyse métabolomique met la volée à l’avant-garde des recherches métaboliques dans un avenir prévisible.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Merci aux membres de la Indiana University Mass Spectroscopy Facility et l’Université de l’Utah métabolomique Core Facility d’assistance dans l’optimisation de ce protocole. J.M.T. est pris en charge par le National Institute of General Medical Sciences, de la National Institutes of Health, sous attribution numéro R35GM119557.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Unsulfured blackstrap molasses | Good Food, INC | ||
| Drosophila Agar Type II | Genesee Scientific | 66-103 | |
| Pyridine | EMD Millipore | PX2012-7 | |
| Methoxyamine hydrocholoride (MOX) | MP Biomedicals, LLC | 155405 | |
| MSTFA with 1% trimethylchlorosilane | Sigma | 69478 | |
| Fleischmann’s Active dry yeast | AB Mauri Food Inc | 2192 | |
| 6oz Drosophila stock bottle | Genesee Scientific | 32-130 | |
| Soft tissue homogenizing mix (2 mL tubes) | Omni International | SKU:19-627 | |
| Vial insert, 250 µL deactivated glass with polymer feet | Agilent | 5181-8872 | |
| Succinic acid-2,2,3,3-d4 | Sigma | 293075 | |
| SpeedVac | Thermo | SC210A | |
| o-Phosphoric acid | Fisher Scientific | A242-1 | |
| Propionic acid | Sigma | P5561 | |
| p-Hydroxy benzoic acid methyl ester | Genesee Scientific | 20-258 | |
| Bead Ruptor | Omni International | SKU:19-040E | |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000012 | |
| MultiTherm Shaker with a 24 X 12 mm block | Benchmark Scientific | H5000 | |
| Methanol | Sigma | 34860 | |
| 1.5 mL centrifuge tube | Eppendorf | 22364111 | |
| Falcon 35 X 10 mm tissue culture dish | Corning Incorporated | 353001 | |
| GC column | Phenomex | ZB-5MSi |
References
- Owusu-Ansah, E., Perrimon, N. Modeling metabolic homeostasis and nutrient sensing in Drosophila: implications for aging and metabolic diseases. Disease Models & Mechanisms. 7 (3), 343-350 (2014).
- Sieber, M. H., Spradling, A. C. The role of metabolic states in development and disease. Current Opinion in Genetics & Development. 45, 58-68 (2017).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods. 68 (1), 105-115 (2014).
- Li, H., et al. Drosophila larvae synthesize the putative oncometabolite L-2-hydroxyglutarate during normal developmental growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (6), 1353-1358 (2017).
- Tennessen, J. M., Baker, K. D., Lam, G., Evans, J., Thummel, C. S. The Drosophila Estrogen-Related Receptor Directs a Metabolic Switch that Supports Developmental Growth. Cell Metabolism. 13 (2), 139-148 (2011).
- Nicholson, J. K., Lindon, J. C., Holmes, E. Metabonomics': understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data. Xenobiotica. 29 (11), 1181-1189 (1999).
- Fiehn, O. Metabolomics - the link between genotypes and phenotypes. Plant Molecular Biology. 48 (1-2), 155-171 (2002).
- Cox, J. E., Thummel, C. S., Tennessen, J. M. Metabolomic Studies in Drosophila. Genetics. 206 (3), 1169-1185 (2017).
- Lenz, E. M., Wilson, I. D. Analytical strategies in metabonomics. Journal of Proteome Research. 6 (2), 443-458 (2007).
- Pasikanti, K. K., Ho, P. C., Chan, E. C. Y. Gas chromatography/mass spectrometry in metabolic profiling of biological fluids. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 871 (2), 202-211 (2008).
- Want, E. J., Nordstrom, A., Morita, H., Siuzdak, G. From exogenous to endogenous: The inevitable imprint of mass spectrometry in metabolomics. Journal of Proteome Research. 6 (2), 459-468 (2007).
- Garcia, A., Barbas, C. Metabolic Profiling: Methods and Protocols Vol. 708 Methods in Molecular Biology. Metz, T. O. , Humana Press Inc. Totowa, Nj. 191-204 (2011).
- Chan, E. C. Y., Pasikanti, K. K., Nicholson, J. K. Global urinary metabolic profiling procedures using gas chromatography-mass spectrometry. Nature Protocols. 6 (10), 1483-1499 (2011).
- Dunn, W. B., et al. Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Nature Protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).
- Ashburner, M. Drosophila: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 171-178 (1989).
- Biyasheva, A., Do, T. V., Lu, Y., Vaskova, M., Andres, A. J. Glue secretion in the Drosophila salivary gland: a model for steroid-regulated exocytosis. Developmental Biology. 231 (1), 234-251 (2001).
- Lommen, A. MetAlign: Interface-driven, versatile metabolomics tool for hyphenated full-scan mass spectrometry data preprocessing. Analytical Chemistry. 81 (8), 3079-3086 (2009).
- Xia, J., Wishart, D. S. Using MetaboAnalyst 3.0 for comprehensive metabolomics data analysis. Current Protocols in Bioinformatics. 55, (2016).
- Xia, J., Sinelnikov, I. V., Han, B., Wishart, D. S. MetaboAnalyst 3.0-making metabolomics more meaningful. Nucleic Acids Research. 43 (W1), W251-W257 (2015).
- Lommen, A. Data (pre-)processing of nominal and accurate mass LC-MS or GC-MS data using MetAlign. Methods in Molecular Biology. 860, 229-253 (2012).
- Xia, J., Wishart, D. S. Using MetaboAnalyst 3.0 for comprehensive metabolomics data analysis. Current Protocols in Bioinformatics. 55, (2016).
- Xia, J., Wishart, D. S. Web-based inference of biological patterns, functions and pathways from metabolomic data using MetaboAnalyst. Nature Protocols. 6 (6), 743-760 (2011).
- Li, H., Tennessen, J. M. Methods for studying the metabolic basis of Drosophila development. Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental Biology. 6 (5), (2017).
