Summary
Dit protocol wordt beschreven hoe voor te bereiden Drosophila larven op basis van GC-MS metabolomic analyse.
Abstract
Recente ontwikkelingen op het gebied van metabolomica hebben de fruitvlieg Drosophila melanogaster opgericht als een krachtige genetisch model voor het bestuderen van dierlijke metabolisme. Door het combineren van de enorme serie van Drosophila genetische hulpmiddelen met de mogelijkheid om grote zwaden van intermediaire metabolisme enquête, kan een aanpak metabolomica complexe interacties tussen voeding, genotype, levensgeschiedenis evenementen en milieu signalen onthullen. Bovendien, kunnen metabolomica studies ontdekken nieuwe enzymatische mechanismen en voorheen onbekende verbindingen tussen schijnbaar ongelijksoortige stofwisselingsroutes ontdekken. Teneinde meer wijdverbreide gebruik van deze technologie onder de Drosophila Gemeenschap, hier voorzien wij een gedetailleerd protocol waarin wordt beschreven hoe voor te bereiden Drosophila larvale monsters gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS)- op basis van metabolomic analyse. Onze protocol bevat beschrijvingen van larvale sample collectie, metaboliet extractie, chemische bewerking en GC-MS-analyse. Succesvolle afronding van dit protocol kunnen gebruikers voor het meten van de relatieve overvloed van kleine polar metabolieten, waaronder suikers, aminozuren en organische zuren die betrokken zijn in de glycolyse en de fietsen van het TCA.
Introduction
De fruitvlieg Drosophila melanogaster heeft ontpopt als een ideaal systeem voor het bestuderen van het moleculaire mechanisme dat tussenliggende metabolisme reguleren. Niet alleen zijn de meeste stofwisselingsroutes bewaard tussen Drosophila en de mens, maar ook belangrijke nutriënten sensoren en groeiregulatoren, zoals insuline, Tor en myc, zijn actief in de vliegen1,2. Dientengevolge, kan Drosophila worden gebruikt om te verkennen de metabole basis van ziekten bij de mens variërend van diabetes en obesitas tot neurodegeneratie en kanker. In dit verband biedt Drosophila larvale ontwikkeling het ideale kader om te bestuderen van een metabole programma genoemd aërobe glycolyse, of het Warburg effect. Net zoals veel tumoren aërobe glycolyse gebruiken biomassa genereren uit koolhydraten, dus activeren hiervoor Drosophila larven aërobe glycolyse ter bevordering van de ontwikkelingstoxiciteit groei3,4,5. Deze overeenkomsten tussen larvale en tumor metabolisme Drosophila vast te stellen als een belangrijke model om te begrijpen hoe aërobe glycolyse is gereglementeerde in vivo.
Ondanks het feit dat de vlieg heeft ontpopt als een populair model voor het bestuderen van de stofwisseling, vertrouwen meeste Drosophila studies op methoden die zijn ontworpen voor het meten van individuele metabolieten3, zoals trehalose, triglyceriden of ATP. Aangezien een specifiek protocol vereist is voor het meten van elk metaboliet, zijn assay gebaseerde studies arbeidsintensief, duur en bevooroordeeld naar deze verbindingen die kunnen worden gemeten met behulp van commerciële kits. Een oplossing voor deze beperkingen is gebleken uit het veld van metabolomica, waarmee een meer efficiënte en onpartijdige middel van het bestuderen van Drosophila metabolisme. In tegenstelling tot een kwantitatieve analyse gebaseerde studie, kan een analyse van één metabolomic tegelijk meten van honderden kleine molecuul metabolieten en bieden een grondig inzicht in een organisme van metabole status6,7. Deze techniek heeft het toepassingsgebied van Drosophila metabole studies aanzienlijk uitgebreid en vertegenwoordigt de toekomst van deze opkomende veld8.
Metabolomic onderzoeken worden hoofdzakelijk uitgevoerd met behulp van drie technologieën: (i) nucleaire magnetische resonantie (NMR), (ii) de vloeibare chromatografie-massaspectrometrie (LC-MS), en (iii) verlenging van het gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS)9. Elke benadering biedt verschillende voordelen en nadelen, en alle van deze technologieën zijn gebruikt om succesvol studeren Drosophila metabolisme. Aangezien het onderzoek uitgevoerd in ons lab is gericht op kleine, polar metabolieten, we gebruiken voornamelijk een op basis van GC-MS methode. GC-MS biedt de gebruiker met een aantal voordelen, waaronder hoge reproduceerbaarheid, de resolutie van de piek, de gevoeligheid, en de beschikbaarheid van een standaard elektron effect (EI) spectrale bibliotheek, die het mogelijk voor de snelle identificatie van maakt metabole ontdekt functies10,11. De bereiding van de monsters voor de GC-MS, echter, is enigszins complex en vereist een zorgvuldige aandacht voor detail. Monsters worden verzameld, gewassen, gewogen, en bevroren op een wijze die snel metabole reacties lest. Bovendien, het vliegen karkas is resistent tegen standaard homogenisering protocollen en vereist een kraal molen om optimale metaboliet extractie. Tot slot moeten monsters geanalyseerd door GC-MS chemische bewerking vóór detectie12ondergaan. Terwijl eerder gepubliceerde methoden elk van deze stappen3,13,14 beschrijven, is nog steeds een visuele protocol dat zou de beginnende gebruiker reproducibly het genereren van hoge kwaliteit gegevens nodig. Hier laten we zien hoe Drosophila larvale monsters om voor te bereiden op basis van GC-MS metabolomica analyse. Dit protocol kan de gebruiker reproducibly veel van de kleine polar metabolieten, waaruit de centrale koolstof metabolisme te meten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. de eicelpunctie
- Volwassen mannetjes en vrouwtjes van de Maagd van de gewenste genotypen verzamelen. Individueel leeftijd deze dieren in een flesje van voedsel met standaard Bloomington media voor 3-5 dagen.
- De juiste verparingen door 50 Maagd vrouwtjes en mannetjes 25 overbrengen naar een nieuwe voedsel-flacon opgericht.
Opmerking: Een minimum van zes onafhankelijke verparingen moet worden opgezet voor elk genotype. Slechts één monster wordt geïncasseerd via elke paring (dat wil zeggen, zes monsters verzameld uit zes onafhankelijke verparingen). -
Melasse ei leggen van caps voor te bereiden.
- Meng 115 mL van melasse en 29 g agar met 700 mL H2O in een erlenmeyer van 2 L.
- Kook de melasse agar mengsel op een hete plaat.
- Koel af tot 70 ° C.
- Voeg 25 mL zure mix (20 mL 85% fosforzuur en propionzuur 209 mL in 1 L H2O; Winkel in een bruine fles) en 10 mL 10% p-hydroxy-benzoëzuur acid methylester in 95% ethanol.
- Giet de melasse agar in zowel het deksel en het onderste gedeelte van een 35 x 10 mm2 weefselkweek schotel.
Opmerking: Voordat het gieten melasse agar platen, zorg ervoor dat de deksels en/of de basis van de plaat 35 x 10 mm2 snuggly in de mond van een Drosophila voorraad fles past (beschreven in stap 1.6). Afhankelijk van het merk van platen gebruikt, mogelijk de base niet bruikbaar zijn.
- Maken van verse gist plakken door het toevoegen van gedestilleerd water tot actieve droge gist (5 g gist/7 mL water) tot het mengsel wordt een pasta die gemakkelijk kan worden verspreid op een harde ondergrond (dat wil zeggen, de consistentie van pindakaas).
- Verspreiden van ongeveer 1,5 g gist plakken op het oppervlak van een GLB melasse ei leggen.
- Poke vier luchtgaten in de tegenover elkaar gelegen zijden van een plastic 6 oz. Drosophila voorraad fles met behulp van een naald 22 G.
- De nieuwe erop vliegen van de voedsel-flacon overboeken naar cultuur flessen.
Opmerking: Vliegen kunnen worden overgedragen door hetzij met behulp van CO2 , als een tijdelijke verdoving of door de top van de flacon in de mond van de fles en scherp te tikken op de bodem van de fles tegen een benchtop. - Plaats snel een melasse ei leggen van dop met gist plakken op het oppervlak in de mond van een voorraad fles van Drosophila . Laboratorium tape gebruiken om het leggen van eieren GLB in plaats veilig te stellen.
Opmerking: Als vliegen narcose voorafgaand aan de overdracht, de fles moet worden gelegd horizontaal op de benchtop totdat alle vliegen zijn hersteld. Eenmaal vliegen volledig mobiel zijn, plaatst u de fles in een broedmachine met de dop van de ei-leggen van de melasse aan de onderkant van de cultuur. - Vervang de melasse ei leggen van GLB ten minste eenmaal per dag gedurende de eerste twee dagen door het omkeren van de voorraad fles, onttrekken de bodem van de fles tegen de benchtop verwijderen van het oude ei GLB en onmiddellijk het plaatsen van een nieuwe ei cap in de monding van de fles. Gooi de oude ei leggen van dop.
Opmerking: Deze stap zorgt u ervoor dat vrouwtjes hun eieren niet houden en zorgt voor de collectie van gesynchroniseerde populaties. - Plaats een nieuwe ei leggen van cap in de voorraad fles na dag 3, vervangen na 2U, en gooi deze weg. Verwijder en vervang het tweede ei leggen van GLB na vier uur. Label onderin deze ei-leggen cap met de datum, tijd en genotype.
Opmerking: De eitjes verzameld tijdens dit 4 uur venster zal worden gebruikt voor analyse. Deze synchronisatie stap is cruciaal voor het analyseren van specifieke ontwikkelingsstadia. Eieren kunnen op deze manier worden verzameld voor meerdere dagen. - De ei-leggen caps invoegen met een 60 x 15 mm2 Petri plaat en zet in een incubator bij de gewenste temperatuur en vochtigheid.
- Inspecteer de doppen ei leggen elke dag voor problemen met honger, bevolkingsdichtheid of besmetting.
Opmerking: Larven moeten toegang hebben tot voldoende voedsel te zorgen voor continue ontwikkeling. Indien nodig, kan verse gist plakken worden verspreid op alle ei leggen van caps die zal worden gebruikt in het experiment. Bovendien, als de larvale bevolkingsdichtheid te hoog is, begint larven te dwalen uit de cultuur-plaat. Deze monsters moeten niet worden gebruikt voor metabolomic analyse, omdat de hoge bevolkingsdichtheid en de tussenliggende periodes van verhongering ervaren terwijl zwerven leiden inconsistente gegevens tot zal. Een dichtheid van ~ 80 – 100 midden tweede instar larven (L2) per plaat of 40 – 50 middelste derde instar larven (L3) per plaat wordt aanbevolen. Monsters die zichtbaar verontreinigd zijn met bacteriën of schimmels moeten worden weggegooid.
2. de larvale Sample collectie
- De larven van de leeftijd tot het gewenste werkgebied. Als het verzamelen van L3 larven, synchroniseren monsters op de L2-L3 molt. Opnieuw synchroniseren gebeurt vaak met behulp van een eerder beschreven methode die gebruikmaakt van de voorste spiracles als een ontwikkelingstoxiciteit mijlpaal15. U kunt ook kunnen midden-L3 larven worden gesynchroniseerd met behulp van een sgs3 verslaggever gene16.
Opmerking: In dit verband vinden wij medio-L2 larven (~ 60 h na het leggen van eieren) zijn bij uitstek geschikt voor de meeste analyses omdat larvale ontwikkeling in dit stadium nog relatief synchroon is, zorgvuldig verzamelde monsters hebben voldoende voedsel te ontwikkelen deze timepoint, en de aantal dieren per monster is beheersbaar (zie hieronder). Een extra synchronisatie stap is nodig voor L3 larven omdat de talrijke ecdysone pulsen die tijdens de ontwikkeling van de L3 optreden dramatische effecten op metabolisme hebben en artefacten in niet-gesynchroniseerde populaties genereert. - Gebruik een ontleden naald voorzichtig opheffen de gist pasta uit de agar. Plaats de gist op een nieuwe melasse agar cap.
Opmerking: De meeste larven eten op het raakvlak tussen de melasse agar en de gist plakken. - Gebruik een klein penseel voor het verzamelen van de larven van de nieuw blootgestelde oppervlak van de agar melasse. Plaats de larven in een centrifugebuis 1,5 mL op ijs.
Opmerking: De juiste steekproefomvang voor elke ontwikkelings fase zijn als volgt: 50 eerste instar larven (L1); 25 mid-L2 larven; 20 vroege L3 larven; 15 medio-L3 of laat L3 larven. - Wassen en bevriezen van monsters (stappen 2.3 via 2.8) in kleine batches (vier tot zes monsters) terwijl het verzamelen van een grote steekproef set. Monsters moeten worden bevroren, binnen 20 min van larven in de buizen te plaatsen.
Opmerking: We raden Eppendorf 1,5 mL Flex buizen omdat andere buizen met de overdracht van het monster bij stap 3 interfereren kunnen. Monsters moeten worden genomen in microfuge buizen. Verzamelen geen monsters in de buizen van de parel in stap 3.1 beschreven. Keramische kralen behouden de oplossing voor het wassen van NaCl, die resulteert in onjuiste massa metingen en introduceert verontreinigingen in het monster. - Voeg 1 mL ijskoud 0.9% NaCl in de buis, sluit het deksel, en verticaal spiegelen de buis te grondig te wassen van de larven.
- Plaats de buis terug op ijs voor ~ 30 s. Gedurende deze tijd, larven zal zinken naar de bodem van de buis, maar gist in suspensie blijft. Zodra alle larven hebben een losse pellet gevormd, verwijderen de NaCl-oplossing met behulp van een precisiepipet 1 mL.
- Herhaal stap 2.4 en 2.5 tweemaal, of totdat de laatste wasbeurt oplossing is duidelijk.
Opmerking: Extra wassen stappen kunnen nodig zijn als de verzamelde monster een bovenmatige hoeveelheid gist bevat. - Centrifugeer de monsters bij 2.000 × g gedurende 1 minuut bij 4 ° C.
- Verwijder alle resterende oplossing met behulp van een precisiepipet 200 µL.
- Onmiddellijk bevriezen het monster in vloeibare stikstof.
Opmerking: Het protocol kan worden onderbroken bij deze stap. Monsters kunnen worden opgeslagen voor maximaal 3 maanden bij-80 ° C.
3. overdracht van monsters naar kraal buizen
- Elke larvale monster moet worden overgebracht uit de 1,5 mL microfuge buis naar een 2 mL screwcap buizen met 1.4 mm keramische kralen. Ter voorbereiding van deze stap van de overdracht, kunt een markering voor ethanol-proof label van de kant van de kraal tube van een 2 mL screwcap (markeringen op het deksel zal worden vernietigd tijdens stap 4.4).
- Tarra de massa van de gelabelde kraal buis met behulp van een analytische balans staat voor het nauwkeurig meten van 0, 01 milligram.
- Als larvale monsters werden bewaard bij-80 ° C, plaatst u monster buizen in vloeibare stikstof voorafgaand aan de overdracht.
- Lange pincet gebruiken om het monsterbuisje 1,5 mL van de vloeibare stikstof dewar.
- Dragen nitril handschoenen, grijpen de bevroren buis, omkeren en scherp pond het deksel van de buis tegen de benchtop te verjagen van de bevroren pellet. Giet onmiddellijk de pellet in een vooraf getarreerde 2 mL screwcap kraal buis. Als de pellet mislukt te verjagen, vloeibare stikstof op de buis terugkomen en herhaalt.
Opmerking: Larvale pellets zal niet verjagen uit alle microfuge buizen. Als met behulp van een buis dan aanbevolen, bepalen als larvale pellets kunnen worden verdreven vóór het verzamelen van monsters voor analyse. - Meet snel de totale massa van de larvale pellet en kraal buis. Onmiddellijk plaats het monsterbuisje in vloeibare stikstof. De larvale pellet massa worden gebruikt voor het normaliseren van de gegevens van de metabolomic.
Opmerking: Het protocol kan worden onderbroken bij deze stap. Monsters kunnen worden opgeslagen voor maximaal 3 maanden bij-80 ° C.
4. monster extractie
- Plaats het monster buizen in een koeler-20 ° C-benchtop.
- Voeg 0.8 mL prechilled (-20 ° C) 90% methanol met 2 µg/mL succinic-d4 zuur in elke buis. Terug het monster naar de-20 ° C-benchtop koeler.
Opmerking: Het succinic-d4-zuur fungeert als een interne standaard. Gebruik alleen HPLC grade H2O en methanol. Aangezien methanol en andere organische oplosmiddelen zijn volatiel en moeilijk te nauwkeurig meten met behulp van lucht verplaatsing pipetten, raden we positieve-verplaatsing pipetten voor deze stap en alle volgende stappen. - Een negatieve controle instellen door toevoeging van 0,8 mL prechilled (-20 ° C) 90% methanol met 2 µg/mL succinic-d4 zuur in een lege kraal buis.
- Meng monsters voor 30 seconden op 6.45 m/s met behulp van een kraal molen homogenizer gelegen in een kamer van 4 ° C temperatuur controle.
Opmerking: Niet snel en volledig Meng de larvale pellet is een gemeenschappelijke bron van variabiliteit in metabolomica analyse. Alleen gebruik maken van homogeniseerders die vernietigen bevroren larvale weefsels binnen 30 kunnen s. - Terug de gehomogeniseerde monsters buizen naar de-20 ° C-benchtop koeler en hen in een vriezer van-20 ° C gedurende ten minste 1 uur uit te broeden.
- Centrifugeer de buizen met 20.000 × g of maximum snelheid gedurende 5 minuten bij 4 ° C om te verwijderen van de daaruit voortvloeiende neerslag.
- Breng 600 µL van de bovendrijvende substantie in een nieuwe 1,5 mL microcentrifuge buis. De neerslag niet storen. Als de overhaaste pellet wordt verdreven terwijl het supernatant pipetteren, alle supernatant terug te keren naar de buis en herhaalt u stap 4.6.
- Plaats de buizen van het monster in een vacuüm centrifuge. Zorg ervoor dat alle buizen open zijn voor het afdichten van de centrifuge. Drogen van de monsters bij kamertemperatuur totdat alle oplosmiddel wordt verwijderd (deze stap duurt meestal ~ 16 h om te voltooien).
Opmerking: Indien nodig, het protocol kan worden onderbroken bij deze stap. Gedroogde monster kan worden achtergelaten bij-80 ° C.
5. chemische bewerking
- Als de gedroogde monsters werden opgeslagen bij-80 ° C, plaats ongeopend monster buizen in een vacuüm centrifuge en drogen voor 30 min. Deze stap moet worden uitgevoerd vóór het openen van het monsterbuisje.
Opmerking: Deze stap verwijdert de condensatie die op de buitenkant van de microfuge buis verzamelt wanneer verwijderd uit de diepvries. Dit gedeelte van het protocol is uiterst gevoelig voor H2O en extra voorzorgsmaatregelen moet worden getroffen om alle reagentia zo droog mogelijk te houden. -
Bereid een oplossing van 40 mg/mL methoxylamine hydrochloride (MOX) in watervrij pyridine. Gebruik alleen watervrij pyridine. MOX en pyridine opslaan in een exsiccator en dagelijks de MOX-oplossing te bereiden.
Let op: MOX en pyridine zijn giftig. Bereid deze oplossing in de zuurkast.- Gebruik een warmte-pistool te drogen een spuit van 1 mL glas.
- Steek de naald van de spuit in de fles van watervrij pyridine. 1 mL van pyridine verwijderen en toevoegen aan een microfuge buis dat 40 mg MOX.
- Spoel de fles van watervrij pyridine met argon. Sluit de fles en terugkeren naar de exsiccator.
- Los de MOX in de pyridine door de buis in een thermische mixer bij 35 ° C gedurende 10 minuten bij 600 omwentelingen per minuut aan het broeden.
- Voeg 40 µL van 40 mg/mL MOX in watervrij pyridine oplossing aan het gedroogde monster.
- Vortex voor 10 s en kort centrifuge (10.000 x g gedurende 20 s).
- Incubeer bij 30 ° C gedurende 1 uur bij 600 omwentelingen per minuut in een thermische mixer.
- Centrifugeer bij 20.000 × g of maximumsnelheid voor 5 min om de kwestie van het deeltje.
- Pipetteer 25 µL van de bovendrijvende substantie in een flacon autosampler met een 250 µL gedeactiveerd inzetglas microvolume.
- Voeg 40 µL van N- methyl -N- trimethylsilyltrifluoracetamide (MSTFA) met 1% industrie.
Let op: De MSTFA is toxisch. Voer deze stap in de zuurkast.
Opmerking: Indien beschikbaar, deze stap kan worden uitgevoerd door een autosampler Gerstel. - Plaats een cap op de flacon autosampler en verzegelen met een krimptang gereedschap.
- Incubeer het monster bij 37 ° C gedurende 1 uur met schudden (250 rpm).
- Bereiden een fatty acid methyl ester (FAMES) standaardoplossing als eerder desceribed3. Voeg 3 µL van FAMES aan de autosampler flacon met behulp van een robot autosampler vóór injectie.
Opmerking: FAMEs worden gebruikt om de retentie timeshift kalibreren en controleren van de prestaties van het instrument. Als geen robotic autosampler beschikbaar is, kunnen FAMEs tijdens stap 5,8 worden toegevoegd.
6. GC-MS detectie
Opmerking: In de meeste gevallen zal de gebruiker deze stap uitvoeren met de hulp van een faciliteit voor de kern van massaspectrometrie. Dit protocol is ontworpen om te worden gebruikt met een 30 m, GC kolom met een voorkolom van 5 m.
- Randomize de volgorde van de steekproef.
-
Bereiden de GC-MS.
- Stel het debiet voor helium carrier gas aan 1 mL/min.
- De inlaattemperatuur ingesteld op 250 ° C.
- Programma GC te voeren de volgende temperatuurverloop tijdens:
- Aanvankelijke temperatuur tot 95 ° C met een greep van 1 min.
- Verhoog de temperatuur tot 110 ° C met de snelheid van 40 ° C/min met een greep van 2 min.
- Verhogen tot 250 ° C van 5° C/min. helling.
- Verhogen tot 330 ° C debiet van 25 ° C/min met een laatste greep van 4 min.
- Oplosmiddel vertraging ingesteld op 3,5 min.
Opmerking: De tijd kan worden gewijzigd volgens de GC-MS-systeem. Het doel van deze stap is om te voorkomen dat MSTFA en MOX beschadigen van de detector.
- Injecteren 1 µL van het derivatized monster in de GC-MS (split ratio van 10:1).
Opmerking: Injecteren 2 µL van monster als de intensiteit van de pieken te laag. De volgorde van de injectie van de monsters moet worden gerandomiseerde. - Functioneren van de massaspectrometer in volledige scanmodus via een massale bereik van 50 tot 500 m/z.
7. de gegevensanalyse
- Metabolomic gegevens met behulp van ofwel een gerichte of irrelevante aanpak te analyseren. Gerichte analyse is gericht op het meten van de overvloed aan een gedefinieerde set van metabolieten, zoals de lactaat metingen die wij hieronder beschrijven. Irrelevante analyse gebruikt daarentegen een onbevooroordeelde benadering te identificeren van een metabole functie die is aanzienlijk gewijzigd tussen twee sets van de steekproef.
Opmerking: Onze lab voornamelijk maakt gebruik van de gratis programma's MetAlign17 en19 18,MetaboAnalyst voor data-analyse. Aangezien een adequate beschrijving van zowel de kwaliteitscontrole, normalisatie en gegevensverwerking stappen buiten het bestek van dit manuscript, verwijzen we de gebruiker meer gedetailleerde protocollen die zijn gewijd aan gegevensverwerking20,21, 22. Bovendien, kan een stroomschema met een beschrijving van de stappen die nodig zijn voor deze analyse worden gevonden elders8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lactaat dehydrogenase (dLDH) mutanten, die geen dLDH activiteit4en genetisch-matched controles werden als medio-L2 larven verzameld en verwerkt volgens protocol hierboven beschreven. In vergelijking met de besturingselementen, vertonen mutant larven belangrijke veranderingen in lactaat en pyruvaat L-2-hydroxyglutarate4. Spectra werden verkregen met een Agilent GC6890-5973i MS-systeem. Een voorbeeld van de GC-MS-spectra genereren met ons protocol is afgebeeld in Figuur 1. Er zijn veel zichtbare kenmerken en een opmerkelijke piek voor trehalose, die normaal gesproken vertegenwoordigt de grootste piek in een larvale monster en is meestal oververzadigd (figuur 1AB). Het individuele spectrum van negatieve controlemonster wordt weergegeven in Figuur 1 c. Hoewel er nog steeds diverse zichtbaar toppen in de negatieve controlemonster, worden de intensiteit en het aantal pieken verlaagd in vergelijking met de experimentele monsters weergegeven in figuur 1A, B. Deze pieken voortvloeien voornamelijk uit kolom afloopgebied, de interne standaard (succinic-d4 zuur) FAMEs en contaminerende vetzuren. Mislukte monstervoorbereiding genereert een spectrum vergelijkbaar met degene die zijn weergegeven in Figuur 1 c.
Alle de spectra waren voorverwerkt met behulp van MetAlign17 en gegevens werden genormaliseerd met de interne standaard en pellet massa. De gegevens werden voorgelegd aan de MetaboAnalyst18,19 voor statistische analyse. Beginsel componenten analyse (PCA) toont duidelijk aan dat de twee groepen van elkaar scheiden en dat er geen uitschieter in ofwel groep (figuur 2A). Nadere analyse toont significante veranderingen in de metabolieten bekend worden beïnvloed door verlies van dLDH (figuur 2B)4.
Figuur 1 : Vertegenwoordiger GC-MS spectra van Drosophila larval extract. (A-B) Typische spectra van medio-L2 larvale uittreksels uit wild type (WT) en dLDH mutanten (KO). (C) een representatieve GC-MS spectrum gegenereerd op basis van een steekproef van de negatieve controle (NC). De meeste van de toppen van dit spectrum zijn van interne standaard, FAMEs en vetzuren. (D-F) In vergelijking met WT monsters, de KO monsters vertonen verhoogde niveaus van pyruvaat (D) en daalde niveaus van lactaat (E) en (F) 2-hydroxyglutarate (2-HG). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Statistische analyse toont de verschillende metabolische profielen tussen wild type (WT) en dLDH knock-out (KO) larven. (A) PCA scores plot. (B) metabolieten die ingrijpende veranderingen in de dLDH mutanten vertonen. Alle gegevenspunten worden uitgezet ten opzichte van het gemiddelde van de WT, die werd aangepast aan een willekeurige waarde van 100. Vóór de analyse, de gegevens op het interne succinic-d4-zuur was genormaliseerd standaard en larvale pellet massa. Gegevens worden weergegeven als één standaarddeviatie van de gemiddelde ±. p < 0.01 voor alle metabolieten met een tweezijdige t-test. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metabolomica biedt een ongeëvenaarde mogelijkheid om enquête de metabole reacties waaruit intermediaire metabolisme. De gevoeligheid van deze technologie, maakt gegevens echter gevoelig voor genetische achtergrond, developmental signalen, en een scala aan milieu benadrukt, met inbegrip van de temperatuur, de vochtigheid, de bevolkingsdichtheid en de beschikbaarheid van nutriënten. Dus, een hoge kwaliteit en reproduceerbare metabolomica analyse vereist dat de monsters worden genomen in sterk gecontroleerde omstandigheden. Terwijl diverse reviews dit punt3,8,23 benadrukken, voorzien hier wij een stapsgewijze methode voor het verzamelen van larven die is ontworpen om de reproduceerbaarheid.
De meest voorkomende bron van variabiliteit in de analyse van een metabolomica vloeit voort uit een storing doven, of stoppen, metabole reacties na het verzamelen van het monster. In dit verband metabolisme stopt bij ingevroren in vloeibare stikstof en metabolische enzymen zal worden vernietigd als het monster is gehomogeniseerd in methanol van-20 ° C. Ervan uitgaande dat de gebruiker bijzondere aandacht besteedt aan het houden van een monster bevroren voorafgaand aan methanol winning, is ons protocol ontworpen om ervoor te zorgen dat de gegevens van de metabolomica gegenereerd door deze procedure een nauwkeurige momentopname van larvale metabolisme vertegenwoordigen. Moet de gebruiker ervaring onaanvaardbaar hoge variabiliteit van de gegevens, moet de gebruiker het protocol op het gebied van inzameling en metaboliet extractie bestuderen met bijzondere aandacht besteed aan het waarborgen van (1) dat metabolisme is snel gehard (stappen 2.9-4.2) en (2) dat de monster is efficiënt gehomogeniseerd in 90% methanol (stap 4.4). In dit verband veel kraal molens bieden onvoldoende kracht om het homogeniseren van monsters binnen de opgegeven tijd en we moedigen de gebruiker om een instrument dat is in eerdere studies8 gebruiktte gebruiken.
Ons protocol benadrukt tevens de belangrijke stappen die de beginnende gebruiker vaststellen moet om de reproducibly monsters derivatize. Dit is essentieel voor de GC-MS omdat veel metabolieten hebben beperkte volatiliteit of slechte thermische stabiliteit. Bewerking verhoogt de volatiliteit en de thermische stabiliteit van vele metabolieten, waardoor het aantal verbindingen die reproducibly kan worden gemeten. Dientengevolge, zal de monsters die onvolledige bewerking hebben ondergaan niet-reproduceerbare pieken, hoogtes en vormen vertonen. Zoals we hier benadrukken, is een gemeenschappelijke bron van mislukte bewerking Gasbedwelming met behulp van het voorbeeld water, dat de chemische bewerking efficiëntie vermindert. Daarom moeten alle reagentia, waaronder MSTFA, MOX en pyridine, onder voorwaarden vochtvrije worden gehouden. De noodzaak om droge omstandigheden geldt ook voor de voorbereiding van monsters die zijn opgeslagen bij-80 ° C, die moet worden geplaatst in een vacuüm centrifuge voor 30 min. alvorens om ervoor te zorgen dat condensatie niet het monster betreden te openen. Wij wil ook benadrukken dat GC-MS een gevoelige technologie is, en dientengevolge, grotere monsters niet noodzakelijkerwijs betere gegevens genereren. Ons protocol biedt experimenteel getest steekproefgrootten en reproducibly meeste metabolieten in centrale koolstof metabolisme zullen meten. Sommige van deze metabolieten zijn zeer overvloedig en verhoogde steekproefgrootte zal leiden tot verzadiging in het spectrum signaal. In feite, het signaal voor trehalose is al verzadigd in onze analyse en een splitsingsverhouding van 100:1 GC-MS injectie moet worden gebruikt om te nauwkeurig meten dit samengestelde. Tot slot moet de gebruiker opmerking dat omdat we gebruik maken van een polaire extractieoplossing, ons protocol niet geschikt voor lipide extractie is. Ons protocol ook houdt geen rekening met vetzuren verontreinigende stoffen die aanwezig op de plastic buizen en tips, dat is zijn kunnen waarom sommige signalen vetzuur verschijnen in de steekproef van de negatieve controle (figuur 1B).
Tot slot, de hier gedetailleerde methoden biedt een krachtig hulpmiddel voor de studie van Drosophila metabolisme. Dit protocol, maar is niet specifiek voor Drosophila en met enkele wijzigingen kan worden gebruikt voor het uitvoeren van metabole studies in elke kleine ongewervelden. Ongeacht de soort, is deze eenvoudige methode voorziet van relatieve kwantificering van bijna alle aminozuren, tussenproducten in de glycolyse en de TCA-cyclus, evenals een aantal andere kleine polaire moleculen. In combinatie met de ongeëvenaarde genetische instrumenten waarover de Gemeenschap Drosophila , plaatst dit type metabolomic analyse de vlieg in de voorhoede van metabole onderzoek voor de nabije toekomst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dankzij de leden van de Indiana University Massa Spectroscopy faciliteit en de Universiteit van Utah metabolomica Core faciliteit voor hulp bij het optimaliseren van dit protocol. J.M.T. wordt ondersteund door de National Institute of General Medical Sciences van de National Institutes of Health onder Award nummer R35GM119557.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Unsulfured blackstrap molasses | Good Food, INC | ||
| Drosophila Agar Type II | Genesee Scientific | 66-103 | |
| Pyridine | EMD Millipore | PX2012-7 | |
| Methoxyamine hydrocholoride (MOX) | MP Biomedicals, LLC | 155405 | |
| MSTFA with 1% trimethylchlorosilane | Sigma | 69478 | |
| Fleischmann’s Active dry yeast | AB Mauri Food Inc | 2192 | |
| 6oz Drosophila stock bottle | Genesee Scientific | 32-130 | |
| Soft tissue homogenizing mix (2 mL tubes) | Omni International | SKU:19-627 | |
| Vial insert, 250 µL deactivated glass with polymer feet | Agilent | 5181-8872 | |
| Succinic acid-2,2,3,3-d4 | Sigma | 293075 | |
| SpeedVac | Thermo | SC210A | |
| o-Phosphoric acid | Fisher Scientific | A242-1 | |
| Propionic acid | Sigma | P5561 | |
| p-Hydroxy benzoic acid methyl ester | Genesee Scientific | 20-258 | |
| Bead Ruptor | Omni International | SKU:19-040E | |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000012 | |
| MultiTherm Shaker with a 24 X 12 mm block | Benchmark Scientific | H5000 | |
| Methanol | Sigma | 34860 | |
| 1.5 mL centrifuge tube | Eppendorf | 22364111 | |
| Falcon 35 X 10 mm tissue culture dish | Corning Incorporated | 353001 | |
| GC column | Phenomex | ZB-5MSi |
References
- Owusu-Ansah, E., Perrimon, N. Modeling metabolic homeostasis and nutrient sensing in Drosophila: implications for aging and metabolic diseases. Disease Models & Mechanisms. 7 (3), 343-350 (2014).
- Sieber, M. H., Spradling, A. C. The role of metabolic states in development and disease. Current Opinion in Genetics & Development. 45, 58-68 (2017).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods. 68 (1), 105-115 (2014).
- Li, H., et al. Drosophila larvae synthesize the putative oncometabolite L-2-hydroxyglutarate during normal developmental growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (6), 1353-1358 (2017).
- Tennessen, J. M., Baker, K. D., Lam, G., Evans, J., Thummel, C. S. The Drosophila Estrogen-Related Receptor Directs a Metabolic Switch that Supports Developmental Growth. Cell Metabolism. 13 (2), 139-148 (2011).
- Nicholson, J. K., Lindon, J. C., Holmes, E. Metabonomics': understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data. Xenobiotica. 29 (11), 1181-1189 (1999).
- Fiehn, O. Metabolomics - the link between genotypes and phenotypes. Plant Molecular Biology. 48 (1-2), 155-171 (2002).
- Cox, J. E., Thummel, C. S., Tennessen, J. M. Metabolomic Studies in Drosophila. Genetics. 206 (3), 1169-1185 (2017).
- Lenz, E. M., Wilson, I. D. Analytical strategies in metabonomics. Journal of Proteome Research. 6 (2), 443-458 (2007).
- Pasikanti, K. K., Ho, P. C., Chan, E. C. Y. Gas chromatography/mass spectrometry in metabolic profiling of biological fluids. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 871 (2), 202-211 (2008).
- Want, E. J., Nordstrom, A., Morita, H., Siuzdak, G. From exogenous to endogenous: The inevitable imprint of mass spectrometry in metabolomics. Journal of Proteome Research. 6 (2), 459-468 (2007).
- Garcia, A., Barbas, C. Metabolic Profiling: Methods and Protocols Vol. 708 Methods in Molecular Biology. Metz, T. O. , Humana Press Inc. Totowa, Nj. 191-204 (2011).
- Chan, E. C. Y., Pasikanti, K. K., Nicholson, J. K. Global urinary metabolic profiling procedures using gas chromatography-mass spectrometry. Nature Protocols. 6 (10), 1483-1499 (2011).
- Dunn, W. B., et al. Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Nature Protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).
- Ashburner, M. Drosophila: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 171-178 (1989).
- Biyasheva, A., Do, T. V., Lu, Y., Vaskova, M., Andres, A. J. Glue secretion in the Drosophila salivary gland: a model for steroid-regulated exocytosis. Developmental Biology. 231 (1), 234-251 (2001).
- Lommen, A. MetAlign: Interface-driven, versatile metabolomics tool for hyphenated full-scan mass spectrometry data preprocessing. Analytical Chemistry. 81 (8), 3079-3086 (2009).
- Xia, J., Wishart, D. S. Using MetaboAnalyst 3.0 for comprehensive metabolomics data analysis. Current Protocols in Bioinformatics. 55, (2016).
- Xia, J., Sinelnikov, I. V., Han, B., Wishart, D. S. MetaboAnalyst 3.0-making metabolomics more meaningful. Nucleic Acids Research. 43 (W1), W251-W257 (2015).
- Lommen, A. Data (pre-)processing of nominal and accurate mass LC-MS or GC-MS data using MetAlign. Methods in Molecular Biology. 860, 229-253 (2012).
- Xia, J., Wishart, D. S. Using MetaboAnalyst 3.0 for comprehensive metabolomics data analysis. Current Protocols in Bioinformatics. 55, (2016).
- Xia, J., Wishart, D. S. Web-based inference of biological patterns, functions and pathways from metabolomic data using MetaboAnalyst. Nature Protocols. 6 (6), 743-760 (2011).
- Li, H., Tennessen, J. M. Methods for studying the metabolic basis of Drosophila development. Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental Biology. 6 (5), (2017).
