Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

טיפ פיפטה המבוסס על שיטה עבור תאים זריעה על פלטפורמות Microfluidic רביב

Published: February 11, 2019 doi: 10.3791/57848
Automatic Translation
*1, *1, *2, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering and Institute for Complex Molecular Systems, Laboratory of Immunoengineering, Eindhoven University of Technology, 2Institute for Immunity, Transplantation, and Infection, Beckman Center, Stanford University
* These authors contributed equally

Summary

מאמר זה מציג עבור זריעה נדיר אוכלוסיית תאים באמצעות פיפטה-טיפים droplet microfluidic התקנים על מנת לספק יעילות גבוהה יותר כימוס של תאים בטיפות פרוטוקול.

Abstract

בין העיצובים פלטפורמה microfluidic שונים בשימוש תכוף לניתוח הסלולר, רביב-מיקרופלואידיקה מספק כלי חזקים בידוד וניתוח תאים ברמת תא בודד על-ידי ביטול השפעת גורמים חיצוניים על הטלפון הסלולרי microenvironment. כימוס של תאים בטיפות מוכתב על ידי התפלגות פואסון כפונקציה של מספר התאים המצויים לכל droplet ואת המספר הממוצע של תאים לכל אמצעי אחסון של droplet. ראשי תאים, במיוחד תאים חיסוניים, או דגימות הקליני יכול להיות נדיר, אובדן-פחות ומגעים תאים נותר מאתגר. בנייר זה, אנו מציגים מתודולוגיה חדשה המשתמשת פיפטה-טיפים כדי לטעון לתאים התקנים מבוסס-droplet microfluidic ללא אובדן משמעותי של תאים. עם סוגי תאים שונים, נדגים היעילה תא אנקפסולציה בתוך טיפות שמתאים מקרוב היעילות כימוס שמנבאת את התפלגות פואסון. השיטה שלנו מבטיח הפסד-פחות הטעינה של תאים microfluidic פלטפורמות וניתן בקלות להתאים לניתוח במורד הזרם תא בודד, למשל, כדי לפענח אינטראקציות סלולרי בין סוגי תאים שונים.

Introduction

בשנים האחרונות השימוש מיקרופלואידיקה כפלטפורמה חזקים ופסיביות לניתוח הסלולר ברמת תא בודד יש במהירות מוגברת1. פלטפורמות אלה מספקים ההקרנה תפוקה גבוהה של תאים בודדים ומולקולות ביולוגיות ברמת דיוק גבוהה ורגישות באמצעות מדגם קטן מאוד נפח2,3,4. בין סוגים שונים של עיצובים microfluidic, פלטפורמות מבוססות-droplet לאפשר ניתוח תפוקה גבוהה של תאים בודדים על-ידי בידוד אותם ב- droplet פאזה מימית מוקף שלב immiscible המאפשר שליטה מדויקת על הטלפון הסלולרי 5,microenvironment6. מיקרופלואידיקה מבוסס-droplet מעניק את הגמישות לבודד יחיד או מרובות-תאים בשני, מימית, טיפות הידרוג הוא ערך שם בודק את התנהגות הסלולר מורכבים, כגון חלבון הפרשת או סלולרי אינטראקציות7, 8 , 9. האיתות, צולבות לדבר בין תאים חיסוניים יכול להיות מושפע על ידי אינטראקציות עם שאר התאים microenvironment10. בידוד של תאים בודדים בטיפות מספק יעיל ללא רעש האנליטית, חופשי מהשפעת גורמים סביבתיים חיצוניים יותר יעיל ומדויק תוצאות11,12. שינוי העיצוב של פלטפורמה רביב-microfluidic עם אינלטס מרובים מאפשר כימוס של סוגי תאים מרובים ללמוד אינטראקציות סלולרי באמצעות תיאום תא12,13.

התהליך של כימוס של תאים בטיפות אקראי, הקצב של כימוס של תאים יכול מבחינה סטטיסטית להיקבע באמצעות הנוסחה עבור התפלגות פואסון ה-14,15. קצב זה הסגירות להיות מוערך על ידי בהתחשב הקצב הממוצע על ההגעה של תאים בצומת droplet, בהנחה כי הגעתו של כל תא הוא עצמאי הגעתו של השני תאים16. אף כי לא ניתן להבטיח את ההגעה תא עצמאית, במקרים של תאים בדלילות מבוזרת, ההשערה של אי-תלות יכול להיחשב, ההסתברות של droplet המכיל תאים אחד או יותר ניתן לחזות כפונקציה של מספר התאים נוכח כל droplet ואת המספר הממוצע של תאים לכל droplet16,17. מאז זה הערכה של כימוס הסלולר בטיפות תלויה מספר התאים המצויים לכל droplet, אחד יכול להציע כי הגדלת ריכוז התאים-הים יגדיל את המספר הממוצע של תאים המצויים לכל droplet 16. לכן, כדי להבטיח כימוס תא בודד, הריכוזים התא צריך להיות מופחת אבל זה בדרך כלל מוביל למספר רב של טיפות ריקה18.

אובדן של תאים במהלך טעינת קובץ מצורף, משקעי סחף, ו/או clumping במזרק, אבובים, או התקן ההפקה היא חיסרון משותף אחראי על הסטייה של כימוס בפועל ערכים ערכים כימוס החזוי19 . בעיה זו מקבל מוגזמות עוד יותר כאשר זריעה תאים חיסוניים נדיר או דגימות קלינית וגם הם כבר נדיר באוכלוסיה העטיפה של רק כמה תאים, נמוך בהרבה ממה שציפיתי, אינה מספקת מספיק נתונים לשם ניתוח ניסיוני. Plasmacytoid תאים דנדריטים (שיתפקדו) הם סוג נדיר של תאים חיסוניים שמהווה רק כ 0.2 - 0.6 אחוזים של הלבן כולו דם תא האוכלוסייה20. תאים אלו מפרישים כמויות אדירות של מסוג האינטרפרונים בעת ההפעלה, ובכך לשחק תפקיד קריטי תגובות חיסוניות21. כאשר הלומדים את ההתנהגות הסלולר של תאים כאלה נדירים של טיפות, זה הכרחי כדי למנוע איבוד תאים במהלך תא זריעה וכימוס22. יש עיצוב מספר התפתחויות הקשורות הבטיחו את ומגעים תאים בודדים בטיפות בשיטות כימוס פעיל לנצל כוחות פיזיים שונים כגון כוחות אקוסטית או חשמלית לדור של טיפות המכיל חד-תאים23,24. עם זאת, שיטות אלה יש המגבלות שלהם במונחים של ייצור droplet16.

במחקר זה, הקמנו שיטה חזקה וישירה העוקפות את החסרונות של שיטות מסורתיות עבור טעינת בודד או מספר תאים למכשירים microfluidic. השיטה שלנו, בהשראת רו. et al., מנצל טיפים פיפטה בגודל שונה זריעה כרכים קטנים של תאים חיסוניים נדירים כדי droplet פלטפורמות microfluidic ללא הפסד משמעותי הדגימה, הניב תוצאות שאינן קוהרנטי עם תיאורטי תחזיות25. מתודולוגיה זו ניתן להגיע בקלות הותאם עבור מספר יישומים מעורבים מיקרופלואידיקה מבוסס-droplet בהצלחה, מיושם עבור מגוון רחב של סוגי תאים או אפילו microparticles.

Protocol

1. 3-כניסת ייצור המכשיר Polydimethylsiloxane (PDMS)

  1. למדוד 40 גר' PDMS בסיס במיקסר מיזוג גביע ולהוסיף 4 g של סוכן ריפוי PDMS הכימית הבסיס בגביע, בזהירות, שימוש של טפי.
  2. למקם את הגביע בעל של מיקסר מיזוג ולמדוד את המשקל הכולל של הגביע עם בעל. להגדיר את הערך של המשקל איזון צנטריפוגה על המיקסר מיזוג בהתאם.
  3. לערבב את הבסיס, אשפרה הסוכן במיקסר מיזוג ב-2000 סל ד למשך 2 דקות ולאחריו מבטל את קצף 2,000 סל ד למשך 2 דקות.
  4. להכין את הסירה אלומיניום, עם קוטר בערך באותה המידה כמו זה של רקיק סיליקון 100 מ מ. למקם את לחם הקודש של סיליקון, מפוברק עבור העותק המשוכפל שהמודעות התהליך, סירה אלומיניום ו להכניס תוכנית התקנה זו צלחת פטרי (בקוטר 120 מ מ, גובה = = 20 מ מ).
    הערה: גודל הפטרי תלויה בגודל הנגדי של סיליקון.
  5. להסיר את הגביע ממחזיק ויוצקים את התערובת PDMS נרפא מראש (תוכן של הגביע), בזהירות, על פרוסת סיליקון סיליקון.
  6. מניחים על צלחת פטרי, המכיל את פרוסות סיליקון עם התערובת PDMS מראש נרפא, ב desiccator למשך כ 20 דקות כדי להסיר את כל הבועות אוויר.
  7. הסר הפטרי לאחר 20 דקות ולבדוק כל בועות האוויר הנותרים ניתן להסירו.
  8. מניחים על צלחת פטרי בתנור, שוכן בגובה 65 מעלות צלזיוס, במשך לפחות 3 שעות.
  9. הסר הפטרי מהתנור אחרי 3 שעות, קלף בזהירות את PDMS ריפא מ כשהפחד סיליקון.
  10. התקנים PDMS לחתוך לאורך הקווים לחתוך, בעזרת סכין או אזמל. מנקבים חורים אינלטס, עודפים של כל התקן באמצעות כבטלן 1.2 מ מ. נקה כל התקן PDMS עם נייר דבק שקוף כדי להסיר את כל פיסות אבק או ממסר של PDMS.
    1. באופן אופציונלי, מכה עם חנקן להסיר חתיכות PDMS שיורית.
  11. להכין שקופיות זכוכית על-ידי ניקוי אותם עם סבון-מים, ולאחר מכן על-ידי אלכוהול איזופרופיל ויבש עם חנקן.
  12. בונד מכשיר PDMS נקי עם מגלשת זכוכית נקי ב פלזמה אשר כדי לסגור את קווי הזרימה. השתמש בהגדרות הבאות: כוח: 50 W, זמן: 45 s, זמן ההשהיה בליד: 2 s, תהליך גז: גז 1 (אוויר), בפיזור: שני השסתומים, מוגבלים וונט זמן: 60 s, משאבת סחרור את הזמן: 10 s, האוורור זמן: 0 s, זמן הכיבוי גז: 1 s, טורבו שאיבה מאופשר : 0. נתק את כל שאר קווי גז.
    הערה: ההגדרות המשמשות פלזמה שאשר יכול להשתנות על פי המותג של הפלזמה אשר משמש.
  13. היכונו הפתרון silane על-ידי הוספת 50 µL של silane (1H 1H, 2H, 2H-Perfluorooctyltriethoxysilane) µL 950 של fluorinated שמן.
    הערה: Silane הוא רעיל. בבקשה לפעול תחת fume המנוע.
  14. לצייר את הפתרון silane מוכן בתוך מזרק, אשר מחובר עם שרוולי טפלון מתכווצים.
  15. Salinize את המכשיר על ידי שטיפה הפתרון silane מוכן דרך השקע של המכשיר.
  16. מניחים את המכשיר בתוך תנור, שוכן בגובה 65 מעלות צלזיוס, למשך 30 דקות.
  17. להסיר את ההתקן salinized מהתנור ומורידים silane עודף שליפת בשמן fluorinated.
  18. מניחים את המכשיר בחזרה בתוך תנור, שוכן בגובה 65 מעלות צלזיוס, במשך לפחות שעה להשלים את תהליך האיחוי.
    הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן.

2. אובדן-פחות תא כימוס

  1. קציר תאים
    1. להשעות מחדש תאי Jurkat T במדיום המכון ממוריאל פארק רוזוול (RPMI) בריכוזים של 1.0x106 תאים למ"ל, 2.0x106 תאים למ"ל, 4.0x106 תאים למ"ל ו 8.0x106 תאים למ"ל; שיתפקדו בתקשורת hematopoietic ללא סרום תרבות (למשל, 15 X-VIVO) בריכוזים של 1.3x106 תאים למ"ל, 3.0x106 תאים למ"ל ו 13.0x106 תאים למ"ל; A549 תאים בינוני (DMEM ששינה הנשר של Dulbecco)-ריכוז של 1.0x106 תאים/מ ל....
      הערה: סוג התאים ואת ריכוז של תאים יכולים להשתנות לפי הניסוי. Labelling של תאים יכולים להיעשות גם בהתבסס על הניסוי.
  2. טיפ-טעינה לדור droplet מימית
    1. להכין שמן fluorinated עם תערובת חומרים פעילי שטח מסתיימים 3% על-ידי הוספת 3 מ"ל של חומרים פעילי שטח 2 מ של שמן fluorinated.
      הערה: הריכוז של חומרים פעילי שטח להוסיף את השמן fluorinated קובע את היציבות של האמולסיה לתקופות שונות הדגירה. ריכוז חומרים פעילי שטח משתנה בהתאם המדיה המשמש עבור סוגי תאים ספציפיים.
    2. לצייר את התערובת שלב שמן בתוך מזרק (1 מ"ל). להסיר בועות אוויר במזרק וחבר אותו שרוולי טפלון מתכווצים באורך המתאים.
    3. להכין מזרק לדוגמה על ידי ציור שמן מינרלי מסתיימים במזרק. להסיר בועות אוויר וחבר את המזרק שרוולי טפלון מתכווצים באורך המתאים.
    4. פונץ ' פקק PDMS בקוטר של 5 מ מ לוח PDMS נרפא.
      הערה: לוח PDMS נרפא ניתן להכין באמצעות צעדים 1.1 ל 1.9. השתמש רקיק סיליקון רגיל במקום רקיק סיליקון מפוברק.
    5. אגרוף עוד חור במרכז התקע עם כבטלן 1 מ מ.
    6. הכנס את התקע בעצה 200 µL פיפטה, מהקצה גדול יותר, כך שיתאים בחוזקה.
      הערה: השתמש טיפ פיפטה µL 1,000 עבור תאים גדול יותר ונפח מדגם גדול יותר. על הטיפ 1,000 µL פיפטה, פקקים של קוטר הנע בין 5 מ מ ו- 7 מ מ יכול לשמש. עם תקע של קוטר 5 מ"מ, נפח דגימה של בסביבות 400 µL יכול להיות aspirated בקצה פיפטה. אם פקק של קוטר גדול יותר בשימוש (7 מ מ), יכול להיות aspirated עוד נפח דגימה (סביב 900 µL).
    7. הכנס את הצנרור, אשר מחובר אל המזרק, מייקל PDMS, אשר הוכנס בקצה פיפטה. לחצו הבוכנה מזרק לאט כדי למלא את הטיפ פיפטה מחוברים עם שמן מינרלי. לדחוף החוצה כל האוויר שיורית מהקצה פיפטה.
    8. להוריד את הטיפ פיפטה, מחובר המזרק, הפתרון לדוגמה, האחות µL כ-150 מדגם בקצה.
    9. חזור על שלבים 2.2.4 כדי 2.2.8 להכין מזרק הדגימה השנייה.
    10. בזהירות המקום כל שלושה מזרקים מוכנים על המשאבה מזרק.
    11. להוסיף שתי העצות פיפטה, המכיל את הדגימה, בעוד שני פתחי הכניסה הפנימית של שבב PDMS. הכנס את הצינור המכיל את התערובת שלב שמן ב לים החיצוני.
    12. להגדיר את הערך של התעריפים זרימה על המשאבה מזרק כדלקמן: פתרון שלב רציף: דגימות תאים µL/ה', 600: 100 µL/ה', כל. הזן ולהגדיר את הממדים של המזרק.
      הערה: הקוטר ההגדרות ישתנו בהתאם לסוג של מזרק.
    13. הפעל את המשאבה ריקון מדגם פתרון דרך הערוצים הפנימי של שלב התקן ושמן דרך ערוץ החיצוני של המכשיר.
    14. חברו של צינורות באורך המתאים לשקע לאסוף את טיפות בעת היווצרות droplet יציב. הזמן של אוסף משתנה בהתאם הניסוי.
    15. לאסוף טיפות בשפופרת נעל. להוסיף 200 µL בינוני RPMI (ללא סרום) על גבי טיפות שנאספו, דגירה המדגם.
      הערה: דגירה תקופת טיפות שנאספו משתנה בהתבסס על הניסוי. טיפות נאספים בשפופרת lock כאשר ניתוח מבוססת cytometry זרימה או בידוד מבוצע לאחר אחזור התאים טיפות על ידי שבירת האמולסיה. זה אפשרי לאסוף את טיפות בתוך תא זכוכית אם הניסוי דורש ניתוח מיקרוסקופי ב- droplet.
  3. אמולסיה שבירת ותא ואחזור מידע ניתוח cytometric תזרים
    1. להכין 20% 1H. 1H, 2H. 2H-Perfluoro-1-octanol (PFO) פתרון (v/v) בשמן fluorinated על-ידי הוספת 2 מ של PFO 10 מ"ל שמן flourinated.
    2. להסיר עודפי שומן מהחלק התחתון של הרכבת התחתית אוסף, המכיל את טיפות, באמצעות מזרק.
    3. להוסיף 100 µL של 20% PFO פתרון האמולסיה כדי לשבור האמולסיה ולשחרר את התאים שעברו אנקפסולציה לשלב מימית. הקש על ומערבבים בקצרה. לא מערבולת בשלב זה. תקופת דגירה של 1-2 דקות.
      הערה: הסכום של PFO הוסיף תלוי כמות טיפות המיוצר. המשיכו להוסיף PFO נוספים עד לשכבת הנפט היא התפרקה לחלוטין. זכור כי PFO רעיל לתאים, כי ריכוז PFO גבוה מדי או יותר מדי זמן דגירה של PFO עלול להוביל גדל מוות של תאים.
    4. לסובב את פתרון תוך זמן קצר rcf אפשרי הנמוך ב-30 s.
    5. להכין פתרון Phosphate-Buffered מלוחים (PBS) קר 100 מ ל בתוספת 2% עוברית עגל סרום (FCS) (2 מ"ל של FCS ב 98 מ של PBS).
    6. פיפטה µL 550 של השבר מימית, מיד לאחר צנטריפוגה, להעביר אותו צינור מנעול חדש המכיל 500 µL של פתרון PBS קר בתוספת 2% FCS, מוכן בשלב 2.3.5. תן לכל מזוט לשקוע לתחתית הצינור מנעול חדש.
    7. האחות µL 950 השלב מימית המכיל תאים מן הרכבת התחתית המנעול, בקפידה, ללא כ רפה בעברית כל מזוט ולהעביר את הפתרון צינור נעל.
    8. ספין למטה התאים בצינור מנעול חדש במשך 10 דקות.
    9. מחדש להשעות את התאים ב- 300 µL של פתרון PBS קר בתוספת 2% FCS, מוכן בשלב 2.3.5.
      הערה: התאים יכול להיות גם מחדש מושעים בתוך כל פתרון מתאים אחר כגון מדיה בהתאם הניסוי מכתים את התאים, בהתבסס על הניסוי, עבור ניתוח שימוש cytometry זרימה.

3. תא זיווג

  1. קציר תאים ולא מכתים
    1. לספור תאים Jurkat T, מן התרבות מבחנה, ספין למטה התאים ב- 1,500 סל ד במשך 5 דקות.
    2. הסר את תגובת שיקוע ולאחר מחדש להשעות 1.0x106 תאים 1 מ"ל PBS להגיע לריכוז של 1.0x106 תאים/מ ל.... הכמות של PBS הוסיף תלוי ספירת.
    3. חזור על שלבים 3.1.1 ל 3.1.2 להכין מדגם השני של תאי-Jurkat T עם ריכוז תא זהה.
    4. לשטוף שתי דגימות פעמיים עם 1 מ"ל של PBS ב- 1,500 סל ד במשך 5 דקות.
    5. מחדש להשעות דוגמא אחת תא עם צבע אסתר (CFSE) succinimidyl carboxyfluorescein מיקרומטר 1.25, המדגם תא אחרים עם צבע אדום רחוק מיקרומטר 1.25 או 1.25 מיקרומטר תא התפשטות צבע-ריכוז תא של 1.0x106 תאים/מ ל.... צביעת פתרון. סה כ 1 מ"ל עבור 1.0x106 תאים.
      הערה: תאים ניתן יהיה מתויג עם צבעים שונים בהתאם המסננים הזמינים cytometer את הזרימה או בכל המיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית
    6. דגירה דגימות תאים עם צבעי 10 דקות ב 37 º C.
    7. לעצור את התגובה צביעת על-ידי הוספת 1 מ"ל של FCS קר קרח לאחר 10 דקות.
    8. לשטוף את הדגימות תא פעמיים עם 1 מ"ל של PBS ב- 1,500 סל ד במשך 5 דקות.
    9. מחדש להשעות את הדגימות תא RPMI בתקשורת-ריכוז של 10.0x106 תאים למ"ל, לכל צבע.
  2. טיפ-טעינה לייצור agarose טיפות הידרוג כפילת תא
    הערה: עבור תא זיווג באמצעות טיפות הידרוג agarose, לשמור על הטמפרטורה של המערכת בין 27 ° C ל- 37 מעלות צלזיוס לאורך droplet דור ואוסף התהליך כדי למנוע ג'לי של hydrogels וכדי להצדיק את הכדאיות הסלולר9.
    1. להמיס agarose טמפרטורה ג'לי נמוך במיוחד על ידי חימום זה עד 75 ° C ב- PBS ב ריכוז של 4% (w/v) ומערבבים את התערובת למשך 20 דקות.
    2. מערבבים הפתרון agarose עם שכותרתה Jurkat T תאים להניב תשואה של ריכוז agarose של 2% (w/v). חזור על הפעולה עבור המדגם אחרים עם תאים עם תוויות ברורות בצורה שונה.
    3. להכין שמן fluorinated עם תערובת חומרים פעילי שטח 2% על-ידי הוספת 20 מ של חומרים פעילי שטח 30 מ של שמן fluorinated (תערובת שלב שמן).
    4. בצע את השלבים 2.2.2 - 2.2.14.
      הערה: בגלל הטבע צמיגה של agarose ההיתוך נמוכה, כדי להבטיח ייצור droplet יציב, הגדר את הערך של שיעור זרימת על משאבות מזרק כדלקמן: שמן שלב תערובת: דגימות תאים µL/ה', 2,000: 200 µL/ה' הזן ולהגדיר את הממדים של המזרק.
    5. לאסוף את טיפות בשפופרת המנעול, דגירה את טיפות ב 4 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות.
  3. אמולסיה שבירת ואחזור חרוז agarose לניתוח FACS
    1. לאחר דגירה של טיפות למשך 60 דקות, להסיר עודפי שומן מהצינור המנעול, המכיל את טיפות, באמצעות מזרק.
    2. להוסיף 200 µL של PFO כדי להסיר את לאטמוספרה שמן טיפות.
      הערה: הסכום של PFO הוסיף את הצינור תלוי כמות טיפות המיוצר. המשיכו להוסיף PFO נוספים עד לשכבת הנפט היא התפרקה לחלוטין.
    3. לשטוף את החרוזים agarose שנאספו פעמיים עם 1 מ"ל של PBS קר להסיר שמן לחלוטין על ידי צנטריפוגה-1,500 סל"ד למשך 10 דקות.
    4. לנתח חרוזים agarose שנאספו באמצעות cytometry זרימה.
      הערה: זה גם ניתן לצפות את החרוזים תחת מיקרוסקופ זריחה.

Representative Results

לניסויים שלנו, השתמשנו מכשיר מבוסס microfluidic PDMS 3-כניסה עם הגובה של 25 מיקרון (איור 1). בהגדרת התקן הזה, השתמשנו לים החיצוני עבור שטיפה השמן עם חומרים פעילי שטח, את שני פתחי הכניסה הפנימית שטיפה שלבי מימית עם המתלים התא או מדיה. לאחר דור, אוסף, טיפות מודגרת למשך כמה שעות את השבב לפני ניתוח במורד הזרם באמצעות flow cytometry. במהלך תקופת דגירה, סרום רכיבים נוכח בתקשורת יכול לקיים אינטראקציה עם חומרים פעילי שטח ולגרום טיפות כדי לאי-יציבות והתפוררות גירנית. לכן חשוב להוסיף על ריכוז חומרים פעילי שטח ממוטבות הנפט fluorinated. בדקנו את היציבות של טיפות monodispersed המכיל hematopoietic ללא סרום תרבות המדיה בתוספת 2% בנסיוב אדם עם ריכוזים שונים של חומרים פעילי שטח בשמן fluorinated. שניתן להסיק מן איור 2 שהם אלה טיפות monodispersed מאוד יציבה עד 24 שעות כאשר לפחות 3% חומרים פעילי שטח מתווסף לשלב שמן. תוצאות דומות התקבלו עם מדיה RPMI עם או בלי התוספת של 10% FCS (נתונים לא מוצג). לכן, יציבות droplet תלויה מאוד ריכוזי חומרים פעילי שטח אופטימליים בעת עבודה עם מקורות שונים של תרבות התקשורת ורכיבים סרום.

כדי להדגים את היעילות כימוס של הגישה שלנו אנחנו קודם נזרע את התאים באמצעות צינורות מחוברים מזרקים, וזו הגישה המקובלת ביותר עבור זריעת תאי (איור 3א). אנחנו לקצור תאי Jurkat T בריכוזים שונים של 1.0x106 תאים למ"ל, 2.0x106 תאים למ"ל ו 4.0x106 תאים למ"ל וקיבלתי יעילות כימוס זה היה נמוך יותר מאשר הערכים החזויים (איור 3ב). 1.0x106 תאים למ"ל, השבר של טיפות שהכיל תא בודד היה 2.5%, אשר לא להגביר אפילו על באמצעות ריכוז גבוה של התא. כדי להגביר את היעילות תא העמסה, ששינה את הגישה הקודמת שלנו, רכוב לאורך צינור-חצי אורך חצובה גבוהות ואנו טעון התליה תא במחצית אשר צורף למכשיר PDMS (איור 4א). באמצעות גישה זו, אנחנו אנקפסולציה תאי Jurkat T בריכוזים שונים של 1.0x106 תאים למ"ל, תאים6 2.0x10/mL, ו 4.0x106 תאים למ"ל, וגם שיתפקדו נדיר בריכוזים שונים של תאים6 1.0x10/mL. 2.0x106 תאים למ"ל, 12.0x106 תאים/מ ל.... ציפינו המחירים כימוס משופרת על ידי מניעת תא נוקז באמצעות שיטה זו. אולם כל בריכוזים שנבדקו, תוצאות הניסוי היו נמוכים בהרבה פואסון החזוי ערכים (איור 4B ו- איור 4C).

באמצעות הגישה העמסה עצה שלנו אנחנו ממוטב שלנו המחירים כימוס תא כדי להשיג תוצאות ניסויית קוהרנטי עם הערכים החזויים סטטיסטית (איור 5א). עבור ריכוזים שונים של תאי Jurkat T, התאימה היעילות כימוס שהושג שלנו ערכים מחושבים בריכוזים כל (איור 5B). למרבה הפלא, אפילו עם תאים חסיד כמו תאים סרטניים A549, אשר נוטים מזיעות, הבחנו של יעילות כימוס מעט משופר-ריכוז הסלולר של תאים6 1.0x10/mL (איור 5C). אנחנו גם העריכו את היעילות של המערכת שלנו כדי לכמס שיתפקדו נדיר וזמינה פחות בריכוזים שונים תא 1.0x106 תאים למ"ל, 3.0x106 תאים למ"ל ו 13.0x106 תאים/mL (איור 5D). כדי להקל על הטעינה של אחסון גדולים יותר ואולי העולה על 200 µL, למשל, בעת עבודה עם שורות תאים או שופע יותר תאים חיסוניים העיקרי, גם חקרנו את היעילות כימוס תא באמצעות טיפים µL 1000 (כחול). להדגים כי הטיפים µL 1,000 נתן יעילות עיטוף דומה בהשוואה העצות µL 200 (צהוב) (איור 5E).

תלוי בשבב, עיצוב ומחקר השאלה שעל הפרק, עצה שלנו טעינה טכניקה יכול לשמש כדי לטעון תאים דרך כניסת אחד, דורשים בדיקה לתוך הטרוגניות הסלולר, או אינלטס מרובות במקביל, פענוח באינטראקציה תאית. השווינו את טעינת התאים Jurkat T (על ריכוז של 10.0x106 תאים למ"ל) של כניסה אחת עד שתי האוכלוסיות שכותרתה באופן שונה של תאי Jurkat T (בריכוז משולב של 10.0 x106 תאים למ"ל) של שני פתחי הכניסה (איור 6 A ואיור 6B). במהלך כימוס, טיפות נוצרו באמצעות agarose טמפרטורה ג'לי נמוך במיוחד של הג'לי לאחר ייצור טופס agarose הידרוג חרוזים שמותר חשפה במורד הזרם דרך מיקרוסקופ וזרימה cytometry (איור 6 C ואיור 6D). ניתוח מיקרוסקופי גילה כי התא זיווג הושג ב צירופים שונים המעידים על תפוקה גבוהה תא זיווג (איור 6C). יתר על כן, ניתוח של אותה אוכלוסיה של הידרוג חרוזים מאת cytometry זרימה גילה החרוזים ללא תאים יכול ניתן להפריד בין חרוזים עם תאים המבוסס על העבר לנמענים נפרדים (FSC, גודל), sideward (האס, צפיפות) תבנית פיזור (איור 6 D). Gating על האוכלוסייה של חרוזים ללא תאים אישר חוסר תא כימוס בהעדרה של אותות פלואורסצנט. בנוסף, gating על האוכלוסייה חרוז עם תאים חשף קיומה של מצביע תת אוכלוסיות מרובות לצורך כימוס תאי Jurkat T שכותרתו באופן שונה. התוצאות שלנו להפגין כי היעילה תא זיווג יכולה להיות מושגת, בהתבסס על שניהם מיקרוסקופיים לזרום cytometric ניתוח ואת הראה יעילות של כימוס מעט מוגבר לעומת התחזית פואסון (איור 6E).

Figure 1
איור 1 . PDMS מבוסס droplet microfluidic מכשיר עם 3 אינלטס ולשקע אחד. המכשיר מורכב שלושה פתחי הכניסה לשלב שמן רציפה, תא תרבות המדיה של התא ההשעיה, בהתאמה. טיפות שנוצר נאספים משקע החשמל. הדגימות זורמים laminarly לצומת מיקוד זרימה איפה הם נמצאים במארז טיפות. -פתחי הכניסה, מסנן מבנים להחזיק חלקיקים גדולים כמו חלבון או אגרגטים תא בחזרה. הקוטר של הפערים במבנה סינון מצוינים באמצעות קווים כחולים. הקוטר של הערוצים-הצינור ייצור מצוינים באמצעות קווים אדומים. גובה ערוץ על השבב כולו היה 25 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 . Droplet יציבות מעל 24 שעות. הגרפים מראים את האזור של טיפות המכילות מדיה תרבות ללא סרום hematopoietic + 2% בנסיוב אדם, לאורך זמן עבור שלושה ריכוזים שונים של חומרים פעילי שטח א) 0.5% B) 3% C) 5%. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 . אבובים מבוסס תא גישת הטעינה. Jurkat-T תאים נטענים בריכוזים שונים להתקן באמצעות מזרק מחובר לצנרת. א) האיור מציג את הגדרת הניסוי B) קצב עיטוף תא כפי שנקבע על ידי מיקרוסקופ אור. נקודות: השפעול נקבעים ערכים; סגור קווים: התפלגות פואסון. קו שגיאה מייצג שגיאה סטנדרטית של ממוצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 . כימוס של סוגי תאים שונים בריכוזים שונים באמצעות צינור אנכי גישת הטעינה. תאי Jurkat T, שיתפקדו (של ריכוזים שונים) היו אנקפסולציה כדי לקבוע את היעילות של תאים אנקפסולציה. A) האיור מציג את הגדרת הניסוי עבור צינור אנכי גישת הטעינה. B) הגרף מראה היעילות כימוס של Jurkat T תאים. C) הגרף מראה את היעילות כימוס של בקר קבוצת מחשבים ראשי. נקודות: השפעול נקבעים ערכים; סגור קווים: התפלגות פואסון. קו שגיאה מייצג שגיאה סטנדרטית של ממוצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5 . עצה גישת הטעינה כדי לתמצת סוגי תאים שונים. A) איור סכמטי של קצה טעינה טכניקה. B) הגרף מראה את היעילות כימוס של תאים Jurkat. C) הגרף מראה את היעילות כימוס של תאים A549. D) הגרף מראה את היעילות כימוס של בקר קבוצת מחשבים ראשי. E) הגרף מראה היעילות כימוס של Jurkat T תאים באמצעות טיפים פיפטה µL 200 (צהוב) ו- 1,000 µL פיפטה טיפים (כחול). נקודות: השפעול נקבעים ערכים; סגור קווים: התפלגות פואסון. קו שגיאה מייצג שגיאה סטנדרטית של ממוצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6 . תא זיווג של טיפות. A) איור סכמטי של הקצה בטעינה כפילת תאים נפרדים מן 2 פתחי הכניסה בטיפות. B) הגרף מראה ומגעים Jurkat T תאים באמצעות כניסת אחד או שני פתחי הכניסה במקביל. ריכוז תא לקבלת עצה אחת 2.0x106 תאים למ"ל, ריכוז התא לשניים טיפים בשני 1.0x106 תאים למ"ל. נקודות: השפעול נקבעים ערכים; סגור קווים: התפלגות פואסון. C) זריחה כיסויי מיקרוסקופיים של הידרוג חרוזים ותאי Jurkat T עם תוויות ברורות. D) הגרף מציג ניתוח cytometric זרימה של תאים לזווג agarose הידרוג חרוזים. העלילה ממחישה גם פיזור קדימה וגם פיזור sideward. E) השוואה של מספרי הטלפון הנייד ב- agarose הידרוג חרוזים כפי שזוהה על-ידי קרינה פלואורסצנטית cytometry מיקרוסקופ וזרימה. ברים: כלומר ערך; . שפם: שגיאת תקן של רעות, n ≥ 4. קו שגיאה מייצג שגיאה סטנדרטית של ממוצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

ב פרוטוקול זה, הראו טכניקה פשוטה ויעילה אל לטעון, לתמצת בתאים טיפות לניתוח תפוקה גבוהה, תא בודד, כדי לבצע התא מבוקרת זיווג ללימודי אינטראקציה הסלולר. יתר על כן, אנו יש לעומת מספר גישות קונבנציונליות כדי לטעון את התאים microfluidic התקנים, הראה כי עצה שלנו גישת הטעינה היא טכניקה יעילה יותר לעומת שיטות אחרות.

דגימות קליניות לומד או סוגי תאים נדיר נדיר במספר מאת מיקרופלואידיקה מבוסס-droplet בעלי כמה אתגרים הטבועה. כמו גם הראו, התאים נוטים משקעים מזרקים, השטח של הצנרת, ובכך, מניעת כימוס הסלולר לציית הערכים החזויים. כדי להתחמק מהבעיה, כמה קבוצות להשתמש ברים מלהיב תארגן את הדברים. עם זאת, בעת שימוש נדיר ומוגבל תא אוכלוסיות, נפח התאים הכולל הוא גם מוגבל, ובכך, הגבלת השימוש של מזרקים גדולים זע ברים. יתר על כן, גם החלפנו לצנרת וללחצנים שבשימוש עם אבובים כדי למנוע התא מצורף מצופה טפלון אך שיטה זו לא שיפר את התוצאות, אם לאורך צינור ארוך מדי, הבעיה של התא מצורף המחמירה (נתונים לא מוצג). לחלופין, השתמשנו צינור אנכי גישת הטעינה שבו התאים היו טעונים הצנרת ולא את המזרק כדי למנוע האובדן של תאים מזרק גדול כרכים. בעזרת טכניקה זו, תאים עם מדגם קטן נפח ניתן לטעון, למשל, שיתפקדו שהינם נדירים ומוגבל. כמו כן, הדוגמה של הצנרת טעון למכשיר אנכית כדי למנוע שקיעת תא הצנרת המשמשים תא זריעה יש מידות קטנות, ניתן להשוות microchannels. הזרם ב לאורך צינור לחץ מונע ונוהליו פרופיל מהירות פרבולית26. זה מרמז כי מהירות זרימת המקסימום היא במרכז של הצנרת, מהירות מינימלית ויש בקצוות של אבובים27. שטיפה אוכלוסיה של תאים דרך הצנרת, מעבר הצבע מהירות גורמת התאים להיות דחף לכיוון הקצוות איפה הם להתיישב כי המהירות על הגבול היא קרובה לאפס. משקעי סחף או התיישבות בתאים הצנרת, ובכך, מפחית את היעילות כימוס כמוצג בתוצאות נציג שבו לא תאמה נתוני הניסוי עם המודל החזוי.

עוד פתרון מותאם בדרך כלל בשימוש על ידי מדענים, עבודה עם מיקרופלואידיקה רביב, הוא להגביר את הצפיפות של התקשורת התרבות התא על ידי תוספת של צפיפות התאמת ריאגנטים כגון Iodinaxol כדי למנוע שקיעת תא מזרקים19. עם זאת, צפיפות התאמת ריאגנטים יכולים להשפיע על התנהגות הסלולר, לרעה משפיע על הפרשת ציטוקינים על ידי תאים (נתונים לא מוצג)28.

אף-על-פי מספר שינויים קטנים וגדולים בתא קונבנציונאלי טעינת טכניקות הראו שיפורים קלים כימוס היעילות, תוצאות הניסוי שהושג עדיין לא תאמה החישובים התיאורטיים. עם זאת, כשהרטיב את גישת הטעינה שיכולנו את ולהתגבר על המגבלות של שיטות קודמות ויעילות כימוס נשלטת על ידי פואסון נתונים סטטיסטיים. טכניקה זו היא לא רק יתרון עבור טעינת ההשעיה תאים אבל גם יכול להיות מיושם עבור טעינת תאים חסיד, כגון keratinocytes הראשי A549 microfluidic שבבי. בעת שימוש שורות תאים שופע, לדוגמה A549, K562, וכו, נפח דגימה גדול יכול לשמש. לכן, בהתאם לנפח של המדגם, פיפטה בגדלים שונים-טיפים יכול לשמש גם, טכניקה פשוטה זו ניתן להתאים כימוס תא בודד וגם כימוס תאים מרובים.

בזמן הריכוז נמוך תא נדרש כדי להבטיח את ומגעים תאים בודדים בטיפות, ריכוז גבוה של תאים הם הרצוי כדי להגדיל את המספר הממוצע של תאים במארז לכל droplet על מחקרים בנושא התא זיווג. ישנן מספר שיטות תא בודד בעבר שתוארו לתאי מערכת החיסון זוג על שבבי microfluidic או microfabricated nanowells29,30,31. ב- droplet מיקרופלואידיקה, סטטיסטיקה פואסון מכתיב תא 1:1 זה זיווג של שני סוגי תאים שונים יכולה להיות מושגת בריכוזים אופטימליים תא. על סמך התחזית פואסון, יש גם הסתברות כי טיפות עשוי להכיל שילובים אחרים. אמנם זיווג של 1:1 התא יכול להיות רצוי ללמוד אינטראקציות סלולרי ברמה תא בודד, תוצאות בהבנה הסלולר מוגברת, זיווג תאים מרובים יש גם יתרונות חשובים. זה מאפשר להבין את ההשפעה של תאים מרובים מסוג תא אחד על הסוג תא אחר. הצלב דיבורים בין תאים חיסוניים שונים לעזור כדי ליצור תגובה חיסונית יעילה נגד דלקות, פתוגנים מספר ומוסיף גם החוסן שלנו המערכת החיסונית32. ככזה, תקשורת סלולרית יכולה להיחקר עם דיוק גבוהה בהקשרים שונים, למשל, 1:1, 2:1, 1:2, 2:2, 3:1, וכו '. מניב הבנה גוברת על איך יחיד או זוגות של תאים לשלוט על אינדוקציה של תגובות חיסוניות. . זה מעניין במיוחד ללמוד לדוגמה הקיבולת של תאים רוצח טבעי או T ציטוטוקסיים להרוג תאי מטרה בהתאמה שלהם באופן סדרתי.

כפי שפורט, לצורך כימוס מרובים של תאים בטיפות, ריכוז גבוה של התא הרצוי. עם זאת, בעת טעינת תאים מפני כניסת אחד עבור תא כימוס, ריכוז גבוה של דגימות התאים יכול לגרום תאים להפעיל עליה פונקציית צבירה-מפרצון. התוצאה נמוכים כימוס וסטיות גבוה מהערכים תיאורטי. להתחמק בעיה זו, ניתן לטעון את התאים מכל שני אינלטס נפרד גם כן. באופן תיאורטי, זה יהיה אפשרי לפתח מכשירים אחרים microfluidic עם אינלטס מרובים כדי להשיג ברמה גבוהה יותר של כימוס התא שבו נדרש ממוצע על x מספר תאים. במחקר זה חקרנו את היעילות כימוס של תאי Jurkat T כאשר נטען כניסת אחד והן שני פתחי הכניסה באמצעות ריכוז מוחלט באותו והשיג יעילות עיטוף דומה. שינוי זה מאפשר לחוקרים לסוגי תאים שונים זוג השבב.

בעוד ששיטה זו מסייעת טעינת תאים microfluidic התקנים ללא אובדן משמעותי של תאים, ישנם מספר כללי זהירות שצריך לזכור. בעת מילוי של המזרקים עם שמן מינרלי וכ רפה בעברית המדגם תא בטיפים פיפטה, יש להימנע התאגדות של בועות אוויר, המערכת כולה צריכה להיות נטולת אוויר. חשוב גם לזכור כי שמן מינרלי אינו צריך לערבב עם הדוגמה. טיפים פיפטה, המכיל דוגמאות, צריך להיות מוכנס בחוזקה, פתחי הכניסה של המכשיר microfluidic, עם זהירות מירבית, כדי למנוע דליפה נוספת התאגדות של בועות אוויר. לסיכום, עצה העמסה היא טכניקה פשוטה, עדיין חזקה המאפשרת לניתוח תפוקה גבוהה של התנהגות הסלולר דרך כימוס תא ללא אובדן משמעותי של תאים באופן יעיל. בעת שימוש עם ריכוזים מדגם אופטימלי-הים, גישה זו של טעינת תאים עם פיפטה-טיפים מאוד גמיש, ניתן להתאים לסוגי תאים שונים, במיוחד עבור תאים חיסוניים העיקרי נדיר, כדי להשיג יעילות גבוהה יותר כימוס, קרוב מודלים החזוי.

Disclosures

אין לנו לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים האוניברסיטה הטכנולוגית של איינדהובן לתמיכה נדיבה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1H,1H,2H,2H-Perfluoro-1-octanol  Sigma-Aldrich 171468-5G
1H,1H,2H,2H-Perfluorooctyltriethoxysilane Fluorochem/UK S13150 Silane (toxic)
Agarose (Ultra-low Gelling Temperature) Sigma-Aldrich  9012-36-6
BD Wegwerpspuiten met Luer-Lok-punten Fisher Scientific 10630694 Syringe
Biopsy Punch 1.2 mm Harris Uni-Core
Cell Proliferation Dye eFluro 670 eBioscience 65-0840-85
CellTrace CFSE Invitrogen C34554
CellTrace Far Red Cell Invitrogen C34564
Eppendorf Tubes Eppendrof Tubes Safe-Lok tubes 1 mL and 2 mL
Glass Slide Sigma Aldrich CLS294775X38-72EA Corning microscope slides, plain L × W 75 mm × 38 mm
Harvard Pumps Harvard Apparatus C-400750; C-400727 Syringe pumps
HFE-7500 3M Novec Engineered fluid Fluorochem/UK 51243 Flourinated oil
Kai Biopsy Punch 5 mm Amstel Medical 1980130
Luer stub Instechlabs/USA LS20S Luer stub, 20ga (pink) x 0.5in (12mm), non-sterile
Mineral oil (Light) Sigma Aldrich M8410-1L
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich P4417-50TAB Tablets
Pico-Surf 1 (5%in Novec 7500) Sphere Fluidics 020317-09 Surfactant
Plasma Asher Emitech K1050X  Plasma asher
RPMI 1640 Medium Gibco 11875093
Silicone Elastomer Base 184 Sylgard 9355218 PDMS base
Silicone Elastomer Curing Agent  Sylgard 9355218 Curing Agent 
Stainless steel catheter coupler Instechlab/USA SC20/15 20ga x 15mm, non-sterile
TFE Teflon Tubing Sigma-Aldrich 58696-U PTFE Tubing  L × O.D. × I.D. 50 ft × 1/16 in. × 0.031 in.
Thinky mixer ARE-250 EX-4025F Conditioning mixture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yin, H., Marshall, D. Microfluidics for single cell analysis. Current Opinion in Biotechnology. 23 (1), 110-119 (2012).
  2. Meyvantsson, I., Beebe, D. J. Cell Culture Models in Microfluidic Systems. Annual Review of Analytical Chemistry. 1, 423-429 (2008).
  3. Yi, C., Li, C. W., Ji, S., Yang, M. Microfluidics technology for manipulation and analysis of biological cells. Analytica Chimica Acta. 560, 1-23 (2006).
  4. Wang, H. Y., Bao, N., Lu, C. A microfluidic cell array with individually addressable culture chambers. Biosensors and Bioelectronics. 24, 613-617 (2008).
  5. Zhang, Y., et al. A programmable microenvironment for cellular studies via. microfluidics-generated double emulsions. Biomaterials. 34 (19), 4564-4572 (2013).
  6. Teh, S. -Y., Lin, R., Hung, L. -H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab on a chip. 8 (2), 198-220 (2008).
  7. Hu, H., et al. Efficient cell pairing in droplets using dual-color sorting. Lab Chip. 15 (20), 3989-3993 (2015).
  8. Brouzes, E., et al. Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (34), 14195-14200 (2009).
  9. Chokkalingam, V., et al. Probing cellular heterogeneity in cytokine-secreting immune cells using droplet-based microfluidics. Lab on a Chip. 13 (42), 4740 (2013).
  10. den Haan, J. M. M., Arens, R., van Zelm, M. C. The activation of the adaptive immune system: Cross-talk between antigen-presenting cells, T cells and B cells. Immunology Letters. 162 (2), 103-112 (2014).
  11. Shah, G. J., Ohta, A. T., Chiou, E. P. -Y., Wu, M. C., Kim, C. -J. EWOD-driven droplet microfluidic device integrated with optoelectronic tweezers as an automated platform for cellular isolation and analysis. Lab on a Chip. 9 (12), 1732 (2009).
  12. Griffiths, A. D., Tawfik, D. S. Miniaturising the laboratory in emulsion droplets. Trends in Biotechnology. 24 (9), 395-402 (2006).
  13. Lagus, T. P., Edd, J. F. High-throughput co-encapsulation of self-ordered cell trains: cell pair interactions in microdroplets. RSC Advances. 3, 43 (2013).
  14. Moon, S., Ceyhan, E., Gurkan, U. A., Demirci, U. Statistical modeling of single target cell encapsulation. PLoS ONE. 6 (7), (2011).
  15. Abate, A. R., Chen, C. -H., Agresti, J. J., Weitz, D. A. Beating Poisson encapsulation statistics using close-packed ordering. Lab on a Chip. 9 (18), 2628 (2009).
  16. Collins, D. J., Neild, A., deMello, A., Liu, A. -Q., Ai, Y. The Poisson distribution and beyond: methods for microfluidic droplet production and single cell encapsulation. Lab Chip. 15 (17), 3439-3459 (2015).
  17. Kemna, E. W. M., et al. High-yield cell ordering and deterministic cell-in-droplet encapsulation using Dean flow in a curved microchannel. Lab on a Chip. 12 (16), 2881 (2012).
  18. Köster, S., et al. Drop-based microfluidic devices for encapsulation of single cells. Lab on a Chip. 8 (7), 1110 (2008).
  19. Mazutis, L., et al. Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics. Nature Protocols. 8 (5), 870-891 (2013).
  20. Sun, P., et al. Functional characterization of ex vivo. blood myeloid and plasmacytoid dendritic cells after infection with dengue virus. Virology. 383 (2), 207-215 (2009).
  21. Tel, J., et al. The chemotherapeutic drug oxaliplatin differentially affects blood DC function dependent on environmental cues. Cancer Immunology, Immunotherapy. 61 (7), 1101-1111 (2012).
  22. Wimmers, F., et al. Single-cell analysis reveals that stochasticity and paracrine signaling control interferon-alpha production by plasmacytoid dendritic cells. Nature Communications. 9 (1), 3317 (2018).
  23. Gong, J., Kim, C. -J. All-electronic droplet generation on-chip with real-time feedback control for EWOD digital microfluidics. Lab on a Chip. 8 (6), 898 (2008).
  24. Demirci, U., Montesano, G. Single cell epitaxy by acoustic picolitre droplets. Lab on a Chip. 7 (9), 1139 (2007).
  25. Rho, H. S., Yang, Y., Veltkamp, H. -W., Gardeniers, H. Direct Delivery of Reagents from a Pipette Tip to a PDMS Microfluidic Device. Chips and Tips. , (2015).
  26. Paul, P. H., Garguilo, M. G., Rakestraw, D. J. Imaging of Pressure- And Electrokinetically Driven Flows through Open Capillaries. Analytical Chemistry. 70 (13), 2459-2467 (1998).
  27. Whitesides, G. M., Stroock, A. D. Flexible methods for microfluidics. Physics Today. 54, 42 (2001).
  28. Mita, A., et al. Anti-proinflammatory Effects of Iodixanol (OptiPrep)-Based Density Gradient Purification on Human Islet Preparations. Cell Transplant. 19 (12), 1537-1546 (2013).
  29. Dura, B., et al. Profiling lymphocyte interactions at the single-cell level by microfluidic cell pairing. Nature Communications. 6 (1), 1-13 (2015).
  30. Dura, B., et al. Longitudinal multiparameter assay of lymphocyte interactions from onset by microfluidic cell pairing and culture. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (26), 3599-3608 (2016).
  31. Yamanaka, Y. J., et al. Single-cell analysis of the dynamics and functional outcomes of interactions between human natural killer cells and target cells. Integrative Biology. 4 (10), 1175 (2012).
  32. Satija, R., Shalek, A. K. Heterogeneity in immune responses: From populations to single cells. Trends in Immunology. 35 (5), 219-229 (2014).

Tags

הנדסה גיליון 144 טיפות מיקרופלואידיקה עצה טעינה התפלגות פואסון תא כימוס אינטראקציות בשיוך תא סלולר
טיפ פיפטה המבוסס על שיטה עבור תאים זריעה על פלטפורמות Microfluidic רביב
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sinha, N., Subedi, N., Wimmers, F.,… More

Sinha, N., Subedi, N., Wimmers, F., Soennichsen, M., Tel, J. A Pipette-Tip Based Method for Seeding Cells to Droplet Microfluidic Platforms. J. Vis. Exp. (144), e57848, doi:10.3791/57848 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter