Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

En pipett-spets baserat metod för sådd celler till Droplet mikroflödessystem plattformar

Published: February 11, 2019 doi: 10.3791/57848
Automatic Translation
*1, *1, *2, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering and Institute for Complex Molecular Systems, Laboratory of Immunoengineering, Eindhoven University of Technology, 2Institute for Immunity, Transplantation, and Infection, Beckman Center, Stanford University
* These authors contributed equally

Summary

Denna artikel presenterar ett protokoll för sådd knappa population av celler med hjälp av pipett-tips till droplet mikroflödessystem enheter för att ge högre inkapsling effektivitet av celler i droppar.

Abstract

Bland olika mikroflödessystem plattform mönster används ofta för cellulära analys, ger droplet-mikrofluidik ett robust verktyg för att isolera och analysera celler på enskild cell nivå genom att eliminera påverkan av yttre faktorer på cellulära närmiljön. Inkapsling av celler i droppar styrs av Poisson-fördelningen som en funktion av antalet celler som är närvarande i varje droppe och det genomsnittliga antalet celler per volym av droplet. Primära celler, särskilt immunceller eller kliniska prover kan vara knappa och förlust mindre inkapsling av celler förblir utmanande. I detta papper presentera vi en ny metod som använder pipetten-tips till lastceller till droplet-baserade mikroflödessystem enheter utan betydande förlust av celler. Med olika celltyper visar vi effektiv cell inkapsling i droppar som nära motsvarar inkapsling effektivitet förutsägs av Poisson-fördelningen. Vår metod säkerställer förlust mindre lastning av celler till mikroflödessystem plattformar och kan enkelt anpassas för nedströms enda cell analys, t.ex., att avkoda cellulära interaktioner mellan olika celltyper.

Introduction

Under de senaste åren har användningen av mikrofluidik som en robust och mångsidig plattform för cellulära analys på enstaka cellnivå snabbt ökad1. Dessa plattformar ger hög genomströmning screening av enstaka celler och biologiska molekyler med hög precision och känslighet med mycket litet urval volym2,3,4. Bland olika typer av mikrofabricerade mönster möjliggör droplet-baserade plattformar hög genomströmning analys av enstaka celler genom att isolera dem i en vattenfas droplet omgiven av en icke blandbara fas som låter exakt och noggrann kontroll över mobilnätet närmiljön5,6. Droplet-baserade mikrofluidik ger flexibilitet att isolera enstaka eller flera-celler i, både, vattenhaltigt och hydrogel droppar och är värdefull i sondera komplexa cellulära beteende, till exempel protein sekretion eller cellulära interaktioner det7, 8 , 9. signalering och överhörning bland immunceller kan påverkas av interaktioner med andra celler i närmiljön10. Isolering av enstaka celler i droppar ger ett effektiv brusfri analyslaboratorium, fri från påverkan av yttre miljöfaktorer för mer effektiv och korrekt resultat11,12. Ändra design för en droplet-mikroflödessystem plattform med flera vikar tillåter inkapsling av flera celltyper att studera cellulära interaktioner via cell-ihopkoppling12,13.

Processen med inkapsling av celler i droppar är slumpmässiga och graden av inkapsling av celler statistiskt kan bestämmas med hjälp av formeln för Poissonfördelning14,15. Detta klassar av inkapsling kan uppskattas genom att beakta den genomsnittliga räntan på ankomsten av celler vid droplet korsningen och antar att ankomsten av varje cell är oberoende från ankomsten av andra celler16. Även om oberoende cell ankomst inte kan garanteras, i fall av glest distribuerade celler, förutsättningen oberoende kan övervägas och sannolikheten för ett droplet-program som innehåller en eller flera celler kan förutses som en funktion av antalet celler närvarande i varje droppe och det genomsnittliga antalet celler per droppe16,17. Eftersom denna uppskattning av cellulära inkapsling i droppar är beroende av antalet celler som är närvarande i varje droppe, kan man föreslå att öka koncentrationen av celler vid inloppet kommer att öka det genomsnittliga antalet celler som finns i varje droppe 16. därför, för att säkerställa enda cell inkapsling, cell koncentrationerna måste reduceras men detta ofta leder till ett stort antal tomma droppar18.

Förlust av celler under lastning av antingen fastsättning, sedimentering, eller klumpar i sprutan, slangar eller produktion enhet är en gemensam nackdel som är ansvarig för avsteget av faktiska inkapsling värden från den förutspådda inkapsling värde19 . Detta problem blir ytterligare överdriven när sådd sällsynta immunceller eller kliniska prover som de redan knappa i befolkningen och inkapsling av endast ett fåtal celler, mycket lägre än väntat, ger inte tillräckliga data för experimentell analys. Dess dendritiska celler (PDC) är en sällsynt delmängd av immunceller som utgör endast cirka 0,2 - 0,6 procent av den hela vita blod cell befolkningen20. Dessa celler utsöndrar enorma mängder typ I interferoner vid aktivering och därmed spela en kritisk roll i immunsvar21. När man studerar den cellulära beteenden av sådana sällsynta celler i droppar, är det absolut nödvändigt att förhindra cellförlust under cell sådd och inkapsling22. Det finns flera design relaterade utveckling som har sett inkapsling av enstaka celler i droppar med aktiva inkapsling metoder som utnyttjar olika fysiska krafter såsom akustiska eller elektriska krafter för generering av droppar som innehåller singel-celler23,24. Dessa metoder har dock sina egna begränsningar när det gäller droplet produktion16.

I denna studie har vi etablerat en robust och okomplicerad metod som kringgår bristerna i traditionella metoder för inläsning av enstaka eller flera celler till mikroflödessystem enheter. Vår metod, inspirerad av Rho et al., använder annorlunda medelstora pipettspetsar för sådd små volymer av sällsynta immunceller till droplet mikroflödessystem plattformar utan betydande prov förlust och gett resultat som är sammanhängande med teoretisk förutsägelser25. Denna metod kan vara enkelt och framgångsrikt anpassade för flera olika tillämpningar som involverar droplet-baserade mikrofluidik och tillämpas för en mängd olika celltyper eller ens mikropartiklar.

Protocol

1. 3-inlopp Polydimetylsiloxan (PDMS) enhet Fabrication

  1. Mäta 40 g PDMS base i en luftkonditionering mixer kopp och tillsätt 4 g PDMS härdare till bas reagenset i cupen, noggrant, med hjälp av en pipett.
  2. Placera koppen i innehavaren av luftkonditionering mixern och mäta den totala vikten av koppen med innehavaren. Värdet av centrifug balans vikt på luftkonditionering mixern med detta.
  3. Blanda bas och härdare i luftkonditionering blandaren vid 2.000 rpm 2 min följt av de skumbildning vid 2.000 rpm i 2 min.
  4. Förbereda en aluminium båt, med en diameter ungefär samma storlek som en 100 mm kisel wafer. Placera kisel rånet, fabricerade för repliken gjutningsprocessen, i aluminium båt och Lägg denna inställning i en petriskål (diameter = 120 mm, höjd = 20 mm).
    Obs: Petriskål storlek beror på storleken på kisel rånet.
  5. Ta bort koppen från innehavaren och häll pre härdade PDMS blandningen (innehållet i koppen), noggrant, på kisel rånet.
  6. Placera petriskål, som innehåller kisel rånet med pre härdade PDMS blandningen, i exsickator för ca 20 min att ta bort alla luftbubblor.
  7. Ta bort petriskål efter 20 min och kontrollera för eventuella kvarvarande luftbubblor som kan tas bort.
  8. Placera petriskål i ugn inställd på 65 ° C, i minst 3 tim.
  9. Ta bort petriskål från ugnen efter 3 h och dra försiktigt den härdade PDMS från silicon rånet.
  10. Skär PDMS enheter längs de skurna linjer, med hjälp av en kniv eller skalpell. Slå hål på inlopp och utlopp för varje enhet som använder en 1,2 mm hålslag. Ren varje PDMS enhet med scotch tejp för att ta bort någon damm eller resterande bitar av PDMS.
    1. Du kan också blåsa med kväve för att ta bort kvarvarande PDMS bitar.
  11. Förbereda objektglas genom att rengöra dem med tvål-vatten, följt av isopropanol och torr med kväve.
  12. Bond en ren PDMS-enhet med en ren glasskiva i en plasma asher att stänga flödeslinjer. Använd följande inställningar: Power: 50 W, tid: 45 s, blöda fördröjningstid: 2 s, processgas: Gas 1 (luft), Vent: båda ventilerna, begränsad vent tid: 60 s, Pump nedvarvningstid: 10 s, Vent håll tid: 0 s, Gas avstängning tid: 1 s, Turbo pumpning aktiverade : 0. Koppla bort alla andra gas rader.
    Obs: Inställningarna som används för plasma asher kan variera beroende på märket på plasma asher användas.
  13. Bereda silan-lösning genom att lägga till 50 µL av silan (1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorooctyltriethoxysilane) till 950 µL av fluorerade olja.
    Obs: Silan är giftiga. Vänligen verka under spiskåpa.
  14. Rita beredd silan lösningen i en spruta, som är ansluten till en Teflon-slang.
  15. Snuskpelle enheten genom att spola den beredda silan lösningen genom utloppet av enheten.
  16. Placera enheten i ugn inställd på 65 ° C under 30 min.
  17. Ta bort salinized enheten från ugnen och spola överskott silan ur enheten med fluorerade olja.
  18. Placera enheten tillbaka i ugn inställd på 65 ° C, i minst 1 h att slutföra limning.
    Obs: Protokollet kan pausas här.

2. förlust mindre Cell inkapsling

  1. Cellen skörd
    1. Återsuspendering Jurkat T-celler i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium vid koncentrationer av 1.0x106 celler/mL, 2.0x106 celler/mL, 4.0x106 celler/mL och 8.0x106 celler/mL; PDC: er i hematopoetiska serumfritt kultur media (t.ex. X-VIVO 15) vid koncentrationer av 1.3x106 celler/mL, 3.0x106 celler/mL och 13.0x106 celler/mL; A549 celler i Dulbeccos modifierade örnens Medium (DMEM) vid en koncentration på 1.0x106 celler/mL.
      Obs: Typ av celler och koncentration av celler kan variera beroende på experimentet. Märkning av celler kan också göras baserat på experimentet.
  2. Tip-lastning för vattenhaltiga droplet generation
    1. Förbereda fluorerade olja med 3% biokompatibla tensid blandning genom att tillsätta 3 mL tensid i 2 mL av fluorerade olja.
      Obs: Koncentrationen av det ytaktiva ämnet tillsätts fluorerade oljan avgör stabiliteten i emulsionen för olika inkubation perioder. Koncentrationen av tensiden varierar beroende på media som används för särskilda cell-typer.
    2. Dra olja fas blandningen i en spruta (1 mL). Avlägsna luftbubblor från sprutan och Anslut den till en Teflon slang av lämplig längd.
    3. Förbereda en prov spruta genom ritning biokompatibla mineralolja i en spruta. Ta bort luftbubblor och Anslut sprutan till en Teflon slang av lämplig längd.
    4. Punsch en PDMS plugg med en diameter på 5 mm från en lufttorkad PDMS-platta.
      Obs: Gravad PDMS plattan kan förberedas genom steg 1,1 till 1,9. Använd en vanlig silicon wafer istället för en fabricerade kisel wafer.
    5. Slå ett annat hål i mitten av kontakten med en 1 mm hålslag.
    6. Sätt i kontakten i ett 200 µL pipettspetsen, från större slutet, så att det passar tätt.
      Obs: Använd en 1000 µL pipettspetsen för större provvolymen och större celler. För 1000 µL pipettspetsen, kan pluggar med diameter mellan 5 och 7 mm användas. Med en propp av diameter 5 mm, en provvolymen av runt 400 µL kan vara aspirerade i pipettspetsen. Om en propp av större diameter är begagnade (7 mm), kan mer provvolymen vara aspirerade (runt 900 µL).
    7. Sätt in slangen, som är ansluten till sprutan, i PDMS kontakten, som har satts i pipettspetsen. Tryck sprutkolven långsamt för att fylla anslutna pipettspetsen med mineralolja. Tryck ut all kvarvarande luft från pipettspetsen.
    8. Lägre pipettspetsen, sprutan, i provlösningen och aspirera cirka 150 µL prov i spetsen.
    9. Upprepa steg 2.2.4 till 2.2.8 att förbereda en andra prov-spruta.
    10. Noggrant placera alla de tre sprutorna som är beredda på sprutpumpen.
    11. Sätt båda de pipettspetsar, som innehåller provet i de två inre vikar av PDMS chip. För in röret som innehåller olja fas blandningen i den yttersta öppningen.
    12. Värdet av flödesvärden på sprutpumpen enligt följande: kontinuerlig fas lösning: 600 µL/h, cellprover: 100 µL/h, varje. Ange och måtten på sprutan.
      Observera: Diameter inställningar varierar beroende på typ av spruta.
    13. Starta pumpen för att spola provlösningen genom inre kanaler av enheten och olja fas genom den yttersta kanalen av enheten.
    14. Anslut en slang av lämplig längd till utlopp att börja samla droppar när droplet bildandet är stabil. Insamlingen av varierar beroende på experimentet.
    15. Samla droppar i en lock slangen. Tillsätt 200 µL RPMI medium (utan serum) ovanpå insamlade droppar och inkubera provet.
      Obs: Inkubation av insamlade droppar varierar baserat på experimentet. Droppar är samlade i en lock slangen när flödet flödescytometri-baserad analys eller isolering utförs efter hämtning cellerna från droppar genom att bryta emulsionen. Det är möjligt att samla droppar i ett glas kammare om experimentet kräver i-droppen Mikroskopisk analys.
  3. Emulsion bryta och cell hämtning för flöde flödescytometrisk analys
    1. Förbereda 20% 1H, 1H, 2H, 2H-Perfluoro-1-oktanol (PFO) lösning (v/v) i fluorerade olja genom att tillsätta 2 mL PFO i 10 mL av fluorerade olja.
    2. Ta bort överflödig olja från botten av samling röret, som innehåller droppar, med hjälp av en spruta.
    3. Tillsätt 100 µL 20% PFO lösning att emulsionen att bryta emulsionen och frigöra de inkapslade cellerna i vattenfasen. Tryck och blanda kort. Gör inte vortex på denna punkt. Inkubera i 1-2 min.
      Obs: Mängden PFO lagt till beror på mängden droppar produceras. Fortsätta att lägga till ytterligare PFO tills olja lagret är helt upplöst. Tänk på att PFO är giftigt för cellerna och att alltför höga PFO koncentrationer eller för lång inkubation i PFO kan leda till ökad celldöd.
    4. Snurra lösningen strax vid den lägsta möjliga rcf för 30 s.
    5. Förbereda 100 mL kall Phosphate-Buffered saltlösning (PBS) lösning kompletteras med 2% fostrets kalv Serum (FCS) (2 mL av FCS i 98 mL PBS).
    6. Pipettera 550 µL av den vattenhaltiga fraktionen, omedelbart efter centrifugering och överföra den till en ny lock slangen innehåller 500 µL kallt PBS lösning kompletteras med 2% FCS, som bereddes i steg 2.3.5. Låt någon överbliven olja sjunka till botten av den nya lock slangen.
    7. Aspirera 950 µL av vattenfasen som innehåller celler från detta lock slangen, noggrant, utan aspirera eventuella resterande olja och överför lösningen till en ny lock slangen.
    8. Snurra ner cellerna i nya lås röret i 10 min.
    9. Slamma upp cellerna i 300 µL kallt PBS lösning kompletteras med 2% FCS, som bereddes i steg 2.3.5.
      Obs: Cellerna kan också åter upphävas i någon annan lämplig lösning såsom media beroende på experimentet. Färga celler, baserat på experimentet, för analys med flödescytometri.

3. cell ihopkoppling

  1. Cellen skörd och färgning
    1. Räkna Jurkat T celler, från kultur kolv, och snurra ner cellerna vid 1500 rpm i 5 min.
    2. Avlägsna supernatanten och slamma 1.0x106 celler i 1 mL PBS att få en koncentration av 1.0x106 celler/mL. PBS har lagt till det beror på celltalet.
    3. Upprepa steg 3.1.1 till 3.1.2 att förbereda ett andra prov med Jurkat T-celler med samma cell koncentration.
    4. Tvätta båda prov två gånger med 1 mL PBS med 1 500 rpm för 5 min.
    5. Återsuspendering ett cell prov med 1.25 µM carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) färgämne och andra cell provet med 1,25 µM långt rött färgämne eller 1,25 µM cell spridning färgämne i en cell koncentration av 1.0x106 celler/mL. Den totala färgning lösning är 1 mL för 1.0x106 celler.
      Obs: Celler kan märkas med olika färgämnen beroende på filter som är tillgängliga i flödescytometer eller i mikroskopet fluorescens.
    6. Inkubera i cellprover med färgämnen i 10 min vid 37 ° C.
    7. Stoppa färgning reaktionen genom att tillsätta 1 mL is kallt FCS efter 10 min.
    8. Tvätta av cell prov två gånger med 1 mL PBS med 1 500 rpm för 5 min.
    9. Återsuspendering cellprover i RPMI medier vid en koncentration på 10.0x106 celler/mL, för varje färg.
  2. Tip-lastning för produktion av agaros hydrogel droppar för cell parkoppling
    Obs: För cell ihopkoppling med agarosgelelektrofores hydrogel droppar, upprätthålla temperaturen i systemet mellan 27 ° C och 37 ° C under hela droplet generation och samling att förhindra gelbildande av hydrogels och garanterar cellulära livskraft9.
    1. Lös ultralåg gelbildande temperatur agaros genom att värma den upp till 75 ° C i PBS med en koncentration på 4% (w/v) och rör blandningen i 20 min.
    2. Blanda agar lösningen med märkta Jurkat T celler för att ge en agaros koncentration av 2% (w/v). Upprepa detta för andra provet med annorlunda märkta celler.
    3. Förbereda fluorerade olja med 2% tensid blandning genom att lägga till 20 mL av det ytaktiva ämnet 30 mL fluorerade olja (olja fas blandning).
    4. Följ stegen 2.2.2 - 2.2.14.
      Obs: På grund av trögflytande arten i låg smälttemperatur agaros och säkerställa stabil droplet produktion, värdet av flödesvärden på sprutpumpar enligt följande: olja fas blandning: 2 000 µL/h, cellprover: 200 µL/h. Ange och måtten på sprutan.
    5. Samla droppar i en lock slangen och inkubera droppar vid 4 ° C i 60 min.
  3. Emulsionen bryter och agaros pärla hämtning för FACS analys
    1. Efter inkubation av droppar för 60 min, ta bort överflödig olja från låsa röret, som innehåller droppar, med hjälp av en spruta.
    2. Tillsätt 200 µL av PFO ta bort olja interphasen från droppar.
      Obs: Mängden PFO tillsätts röret beror på mängden droppar produceras. Fortsätta att lägga till ytterligare PFO tills olja lagret är helt upplöst.
    3. Tvätta insamlade agaros pärlorna två gånger med 1 mL kall PBS ta bort oljan helt genom centrifugering vid 1500 rpm i 10 min.
    4. Analysera insamlade agaros pärlor med hjälp av flödescytometri.
      Obs: Det är också möjligt att observera pärlorna i fluorescens Mikroskop.

Representative Results

För våra experiment använde vi en 3-inlopp PDMS baserat mikroflödessystem enhet med höjden av 25 µm (figur 1). I den här konfigurationen av enheten använde vi den yttersta öppningen för spolning oljan med ytaktivt ämne och de två inre vikar för spolning aqueous faserna med cellsuspensioner eller media. Efter generation och samling inkuberas droppar i ett par timmar av chip innan efterföljande analys med flödescytometri. Under inkubationstiden, kan serum beståndsdelar i media interagera med tensiden och orsaka droppar till blir instabila och faller sönder. Det är därför viktigt att lägga till en optimerad koncentration av ytaktiva fluorerade oljan. Vi testade monodispersed droppar som innehåller hematopoetiska serumfritt kultur media kompletteras med 2% humant serum med olika koncentrationer av tensiden i fluorerade olja stabilitet. Det kan utläsas från figur 2 som dessa monodispersed droppar är mycket stabila i upp till 24 timmar vid minst 3% tensid läggs till fasen olja. Liknande resultat erhölls med RPMI media med och utan tillsats av 10% FCS (inga data anges). Därför är droplet stabilitet starkt beroende av optimal tensid koncentrationer när du arbetar med olika källor av kultur media och serum komponenter.

För att påvisa inkapsling effektiviteten av vår strategi seedade vi först cellerna använder slangen ansluten till sprutor, som är den mest konventionella metoden för sådd celler (figur 3A). Vi skördade Jurkat T-celler vid olika koncentrationer av 1.0x106 celler/mL, 2.0x106 celler/mL och 4.0x106 celler/mL och erhålls en inkapsling effektivitet som var lägre än förutsagda värden (figur 3B). 1.0x106 celler/ml var fraktionen av droppar som innehöll en enda cell 2,5 procent, vilket inte ökade ens på att använda högre cell koncentrationer. För att effektivisera de cell-lastning, vi ändrade vårt tidigare arbetssätt och monterade slangen på halva längden till en förhöjd stativ och laddad cellsuspensionen i den halvan som var kopplade till PDMS enheten (figur 4A). Använder denna metod, inkapslade vi Jurkat T-celler vid olika koncentrationer av 1.0x106 celler/mL, 2.0x106 celler/mL, och 4.0x106 celler/mL, och även sällsynta PDC vid olika koncentrationer av 1.0x106 celler/mL, 2.0x106 celler/mL, och 12.0x106 celler/mL. Vi förväntade förbättrade inkapsling priser genom att förhindra cell sedimentering med denna metod. Men vid alla de koncentrationer som testats, var experimentella resultat mycket lägre att de förutspådda Poisson värden ( figur 4Cochfigur 4B ).

Använda vår tips-loading-metoden som vi optimerat vår cell inkapsling priser för att få experimentella resultat sammanhängande med de statistiskt förväntade värdena (figur 5A). Vid olika koncentrationer av Jurkat T-celler matchas erhållna inkapsling effektivitet våra beräknade värden i alla koncentrationer (figur 5B). Anmärkningsvärt, även med vidhäftande celler som A549 tumörceller, som tenderar att klumpa, vi observerat en något förbättrad inkapsling effektivitet på en cellulär koncentration av 1.0x106 celler/mL (bild 5C). Vi bedömde också effekten av vårt system att kapsla in mindre tillgängliga och knappa PDC vid annan cell koncentrationer av 1.0x106 celler/mL, 3.0x106 celler/mL och 13.0x106 celler/mL (figur 5D). För att underlätta lastning av möjligen större volymer överstigande 200 µL, t.ex., när du arbetar med cellinjer eller rikligare primära immunceller, vi undersökte också cell inkapsling effektivitet med hjälp av 1000 µL tips (blå). Vi visade att dessa 1000 µL tips gav en liknande inkapsling effektivitet jämfört med 200 µL tips (gul) (figur 5E).

Beroende av chip design och forskning frågan till hands, vårt tips lastning teknik kan användas till lastceller genom antingen ett inlopp, för avsökning i cellulära heterogenitet, eller flera vikar i parallella för avkodning cellulära interaktioner. Vi jämförde lastningen av Jurkat T-celler (vid en koncentration på 10.0x106 celler/mL) från ett inlopp till två olika märkta populationer av Jurkat T-celler (vid en kombinerad koncentration 10,0 x106 celler/mL) från två vikar (figur 6 A och figur 6B). Under inkapsling genererades droppar med ultralåg gelbildande temperatur agaros och geléartad efter produktion till formuläret agaros hydrogel pärlor som tillåtna efterföljande nedströms analys via mikroskopi och flöde flödescytometri (figur 6 C och figur 6D). Mikroskopisk analys visade att cellen ihopkoppling uppnåddes på olika kombinationer som indikerar för hög genomströmning cell parning (figur 6C). Analys av samma population av hydrogel pärlor av flödescytometri visade dessutom att pärlor utan celler kunde skiljas från pärlor med celler baserat på det distinkta framåt (FSC, storlek) och sideward (SSC, granularitet) scatter mönster (figur 6 D). Gating på befolkningen i pärlor utan celler bekräftade brist cell inkapsling av avsaknaden av fluorescerande signaler. Dessutom avslöjade gating på bead befolkningen med celler förekomsten av flera delpopulationer vägledande för inkapsling av olikt märkta Jurkat T-celler. Våra resultat visar att effektiv cell ihopparning kan uppnås, baserat på både mikroskopiska flow flödescytometrisk analys och visade en något ökad inkapsling effektivitet jämfört med Poisson prognos (figur 6E).

Figure 1
Figur 1 . PDMS baserat droplet mikroflödessystem enhet med tre vikar och ett utlopp. Enheten består av tre vikar för kontinuerlig olja fas, cell kulturmassmedia och cellsuspension, respektive. Genererade droppar samlas vid utloppet. Proverna flöde laminarly flöde-fokus korsningen där de är inkapslade i droppar. På öppningarna, filterstrukturer håller stora partiklar som protein eller cell aggregat tillbaka. Diametern på luckorna i strukturen filter indikeras med blå linjer. Diametern på kanalerna vid produktion munstycket indikeras med röda linjer. Kanal höjden på hela chip var 25 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 . Droplet stabilitet under 24 timmar. Diagrammen visar området av droppar som innehåller hematopoetiska serumfritt kultur media + 2% humant serum över tiden för tre olika koncentrationer av tensiden A) 0,5% (B) 3% (C) 5%. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 . Slangar baserad cell lastning strategi. Jurkat-T-celler är laddade med olika koncentrationer till enheten med en spruta som ansluten till slangar. (A) bilden visar den experimentella setup (B) inkapsling cellhastighet som bestäms av ljusmikroskop. Prickar: experimentellt fastställas värden; Stängda linjer: Poisson-fördelningen. Felstapel representerar standardavvikelsen för medelvärdet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 . Inkapsling av olika celltyper vid olika koncentrationer med en vertikal tub lastning strategi. Jurkat T-celler och PDC (av olika koncentrationer) var inkapslat för att avgöra effektiviteten i cell inkapsling. A) bilden visar den experimentella setup för vertikala röret lastning strategi. B) diagrammet visar inkapsling effektiviteten i Jurkat T celler. C) diagrammet visar inkapsling effektiviteten av PDC. Prickar: experimentellt fastställas värden; Stängda linjer: Poisson-fördelningen. Felstapel representerar standardavvikelsen för medelvärdet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 . Tips lastning strategi att kapsla in olika celler typer. (A) Schematisk illustration av spetsen lastning teknik. B) diagrammet visar inkapsling effektiviteten av Jurkat celler. C) diagrammet visar inkapsling effektiviteten av A549 celler. D) diagrammet visar inkapsling effektiviteten av PDC. E) diagrammet visar inkapsling effektiviteten i Jurkat T celler med 200 µL pipettspetsar (gul) och 1000 µL pipettspetsar (blå). Prickar: experimentellt fastställas värden; Stängda linjer: Poisson-fördelningen. Felstapel representerar standardavvikelsen för medelvärdet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6 . Cell ihopkoppling i droppar. (A) Schematisk illustration av spetsen lastning strategi för parkoppling distinkta celler från 2 vikar i droppar. B) diagrammet visar inkapsling av Jurkat T celler med ett inlopp eller två vikar parallellt. Cellkoncentrationen för ett tips är 2.0x106 celler/mL och cellkoncentrationen för två tips båda 1.0x106 celler/mL. Prickar: experimentellt fastställas värden; Stängda linjer: Poisson-fördelningen. C) The fluorescens mikroskopiska överlägg av hydrogel pärlor och märkta Jurkat T-celler. D) Diagrammet visar flödet flödescytometrisk analys av kopplade celler i agaros hydrogel pärlor. Handlingen visar både framåt scatter och sidled scatter. E) jämförelse av cell nummer i agaros hydrogel pärlor som upptäcks av fluorescence mikroskopi och flöde flödescytometri. Barer: medelvärde; Morrhår: standardavvikelsen för medelvärdet, n ≥ 4. Felstapel representerar standardavvikelsen för medelvärdet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

I detta protokoll, har vi visat en effektiv och okomplicerad teknik att lasta och kapsla in celler i droppar för hög genomströmning, encelliga analys och utföra kontrollerade cell parkoppling för cellulära interaktionsstudier. Dessutom har vi jämfört flera konventionella metoder för att lastceller mikroflödessystem enheter och visade att vårt tips lastning strategi är en effektivare teknik i jämförelse med andra metoder.

Studera kliniska prover eller sällsynta celltyper knappa i flera av droplet-baserade mikrofluidik besitter några inneboende utmaningar. Som vi har också visat, tenderar celler att sediment i sprutor och ytan av slangen, därmed förhindra cellulära inkapsling för att uppfylla de förväntade värdena. För att undgå detta problem, använder vissa grupper omrörning barer i sprutorna. När du använder sällsynta och begränsad cellpopulationer, begränsas den totala cellvolym emellertid också, därmed, begränsa användningen av stora sprutor och omrörning barer. Dessutom vi ersatte också vanliga slangar med teflonbelagd slangar för att förhindra cell fastsättning men denna metod förbättrades inte resultaten och om slangen är för lång, problemet med cell fastsättning förvärrar (inga data anges). Alternativt, använde vi ett vertikalt rör lastning strategi där cellerna lastades i slangarna och inte i spruta för att förhindra förlust av celler i stor spruta volymer. Med denna teknik, kan celler med små provvolymen laddas, t.ex., PDC: er som är sällsynta och begränsad. Dessutom laddas provet från slangen till enheten vertikalt för att förhindra cell sedimentering. Slangen används för cell sådd har små dimensioner och kan jämföras med mikrokanaler. Flödet i slangen är trycket driven och följer en parabolisk velocity profil26. Detta innebär att den maximala flödeshastigheten är i mitten av slangen och lägsta hastighet är vid kanterna på de slangar27. När spolning en population av celler genom slangen, gör velocity lutningen att cellerna att skjutas mot kanterna där de bosätta eftersom hastigheten vid gränsen är nära noll. Den sedimentering eller avveckling av celler i slangen, därmed minskar inkapsling effektivitet som visas i de representativa resultat där experimentella data inte matchade med den förutspådda modellen.

En annan ofta anpassad lösning används av forskare, som arbetar med droplet-mikrofluidik, är att öka tätheten av cell kultur media genom tillsats av densitet matchande reagenser såsom Iodinaxol att förhindra cell sedimentering i sprutor19. Dock densitet matchande reagenser kan påverka cellulära beteende och negativt påverkar den cytokin sekretionen av celler (inga data anges)28.

Trots att flera små och stora ändringar i konventionella cell lastning tekniker visade små förbättringar i inkapsling effektivitetsvinster, matchar erhållna experimentella resultat fortfarande inte de teoretiska beräkningarna. Med spetsen lastning strategi kan vi dock den övervinna begränsningarna av föregående metoder och inkapsling effektivitet styrs av Poisson statistik. Denna teknik är inte bara fördelaktiga för lastning suspension celler men kan också tillämpas för lastning vidhäftande celler, såsom primära keratinocyter och A549 till mikroflödessystem chip. När du använder rikliga cellinjer, till exempel A549, K562, etc., kan större provvolymen användas. Därför, beroende på volymen av provet, olika storlek pipett-tips kan också användas och denna enkla teknik kan anpassas för både encelliga inkapsling och flera cell inkapsling.

Medan låg cell koncentration krävs för att säkerställa inkapsling av enstaka celler i droppar, önskas högre celler koncentrationer att öka det genomsnittliga antalet celler inkapslade i varje droppe för studier relaterade till cell ihopkoppling. I området i närheten finns det flera encelliga metoder som tidigare har beskrivits till par immunceller på mikroflödessystem chip eller biochips nanowells29,30,31. I droplet-mikrofluidik dikterar Poisson statistik att 1:1 cell parkoppling för två olika celltyper kan uppnås vid optimal cell koncentrationer. Baserat på Poisson prognos, finns det också en sannolikhet att droppar kan innehålla andra kombinationer. 1:1 cell ihopparning kan vara önskvärt att studera cellulära interaktioner på enstaka cellnivå och resulterar i ökad cellulär förståelse, har flera cell ihopkoppling också stora fördelar. Det gör för att förstå flera celler av en celltyp inflytande på den andra celltypen. Replikväxlning mellan olika immunceller hjälpa till att skapa ett effektivt immunsvar mot flera infektioner och patogener samt tillför robusthet i vårt immunförsvar32. Som sådan, kan cellulär kommunikation förhöras med hög precision i olika sammanhang, t.ex., 1:1, 2:1, 1:2, 2:2, 3:1, etc. Molekylstudier ger ökad förståelse på hur enkel eller par celler styra induktion av immunsvar. Detta är särskilt intressant att studera exempelvis egenskap av naturliga mördarceller eller cytotoxiska T-celler till seriellt döda deras respektive målceller.

Som diskuterats, för flera inkapsling av celler i droppar, önskas högre cell koncentrationer. Dock vid lastning celler från ett inlopp för cell inkapsling, högre koncentrationer av cell provet kan orsaka celler till samlade vid inloppet. Detta resulterar i lägre inkapsling priser och högre avvikelse från de teoretiska värdena. För att undgå detta problem, kan cellerna läsas från två separata vikar samt. Teoretiskt, skulle det vara möjligt att utveckla andra mikroflödessystem enheter med flera vikar att uppnå ännu högre nivåer av cell inkapsling där ett genomsnitt på x antal celler är befogad. I denna studie undersökte vi inkapsling effektiviteten av Jurkat T-celler när laddas från både ett inlopp och två vikar med samma totala koncentration och erhålls liknande inkapsling effektivitet. Denna ändring gör det möjligt för forskare att par olika celltyper på chip.

Även denna metod underlättar lastning celler till mikroflödessystem enheter utan betydande förlust av celler, finns det vissa försiktighetsåtgärder som måste hållas i åtanke. När fyller sprutor med mineralolja och aspirera cell provet i pipettspetsar, införlivandet av luftbubblor bör undvikas och hela systemet ska vara fritt från luft. Det är också viktigt att komma ihåg att mineralolja inte bör blanda med provet. Pipettspetsar, prover, som innehåller bör införas ordentligt i öppningarna av mikrofabricerade enheten, med yttersta försiktighet, för att förhindra läckage och ytterligare inkorporering av luftbubblor. För att sammanfatta, är tip-lastning en okomplicerad, och ändå robust teknik som möjliggör hög genomströmning analys av cellulära beteende genom cell inkapsling utan betydande förlust av celler på ett kostnadseffektivt sätt. När den används med optimala urvalet koncentrationer vid inloppet, detta tillvägagångssätt för lastning celler med pipett-tips är mycket flexibel och kan anpassas för olika celltyper, särskilt för sällsynta primära immunceller, att erhålla högre inkapsling effektivitet, nära förutsagda modellerna.

Disclosures

Vi har inget att redovisa.

Acknowledgments

Vi tackar vid Eindhoven University of Technology för generösa stöd.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1H,1H,2H,2H-Perfluoro-1-octanol  Sigma-Aldrich 171468-5G
1H,1H,2H,2H-Perfluorooctyltriethoxysilane Fluorochem/UK S13150 Silane (toxic)
Agarose (Ultra-low Gelling Temperature) Sigma-Aldrich  9012-36-6
BD Wegwerpspuiten met Luer-Lok-punten Fisher Scientific 10630694 Syringe
Biopsy Punch 1.2 mm Harris Uni-Core
Cell Proliferation Dye eFluro 670 eBioscience 65-0840-85
CellTrace CFSE Invitrogen C34554
CellTrace Far Red Cell Invitrogen C34564
Eppendorf Tubes Eppendrof Tubes Safe-Lok tubes 1 mL and 2 mL
Glass Slide Sigma Aldrich CLS294775X38-72EA Corning microscope slides, plain L × W 75 mm × 38 mm
Harvard Pumps Harvard Apparatus C-400750; C-400727 Syringe pumps
HFE-7500 3M Novec Engineered fluid Fluorochem/UK 51243 Flourinated oil
Kai Biopsy Punch 5 mm Amstel Medical 1980130
Luer stub Instechlabs/USA LS20S Luer stub, 20ga (pink) x 0.5in (12mm), non-sterile
Mineral oil (Light) Sigma Aldrich M8410-1L
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich P4417-50TAB Tablets
Pico-Surf 1 (5%in Novec 7500) Sphere Fluidics 020317-09 Surfactant
Plasma Asher Emitech K1050X  Plasma asher
RPMI 1640 Medium Gibco 11875093
Silicone Elastomer Base 184 Sylgard 9355218 PDMS base
Silicone Elastomer Curing Agent  Sylgard 9355218 Curing Agent 
Stainless steel catheter coupler Instechlab/USA SC20/15 20ga x 15mm, non-sterile
TFE Teflon Tubing Sigma-Aldrich 58696-U PTFE Tubing  L × O.D. × I.D. 50 ft × 1/16 in. × 0.031 in.
Thinky mixer ARE-250 EX-4025F Conditioning mixture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yin, H., Marshall, D. Microfluidics for single cell analysis. Current Opinion in Biotechnology. 23 (1), 110-119 (2012).
  2. Meyvantsson, I., Beebe, D. J. Cell Culture Models in Microfluidic Systems. Annual Review of Analytical Chemistry. 1, 423-429 (2008).
  3. Yi, C., Li, C. W., Ji, S., Yang, M. Microfluidics technology for manipulation and analysis of biological cells. Analytica Chimica Acta. 560, 1-23 (2006).
  4. Wang, H. Y., Bao, N., Lu, C. A microfluidic cell array with individually addressable culture chambers. Biosensors and Bioelectronics. 24, 613-617 (2008).
  5. Zhang, Y., et al. A programmable microenvironment for cellular studies via. microfluidics-generated double emulsions. Biomaterials. 34 (19), 4564-4572 (2013).
  6. Teh, S. -Y., Lin, R., Hung, L. -H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab on a chip. 8 (2), 198-220 (2008).
  7. Hu, H., et al. Efficient cell pairing in droplets using dual-color sorting. Lab Chip. 15 (20), 3989-3993 (2015).
  8. Brouzes, E., et al. Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (34), 14195-14200 (2009).
  9. Chokkalingam, V., et al. Probing cellular heterogeneity in cytokine-secreting immune cells using droplet-based microfluidics. Lab on a Chip. 13 (42), 4740 (2013).
  10. den Haan, J. M. M., Arens, R., van Zelm, M. C. The activation of the adaptive immune system: Cross-talk between antigen-presenting cells, T cells and B cells. Immunology Letters. 162 (2), 103-112 (2014).
  11. Shah, G. J., Ohta, A. T., Chiou, E. P. -Y., Wu, M. C., Kim, C. -J. EWOD-driven droplet microfluidic device integrated with optoelectronic tweezers as an automated platform for cellular isolation and analysis. Lab on a Chip. 9 (12), 1732 (2009).
  12. Griffiths, A. D., Tawfik, D. S. Miniaturising the laboratory in emulsion droplets. Trends in Biotechnology. 24 (9), 395-402 (2006).
  13. Lagus, T. P., Edd, J. F. High-throughput co-encapsulation of self-ordered cell trains: cell pair interactions in microdroplets. RSC Advances. 3, 43 (2013).
  14. Moon, S., Ceyhan, E., Gurkan, U. A., Demirci, U. Statistical modeling of single target cell encapsulation. PLoS ONE. 6 (7), (2011).
  15. Abate, A. R., Chen, C. -H., Agresti, J. J., Weitz, D. A. Beating Poisson encapsulation statistics using close-packed ordering. Lab on a Chip. 9 (18), 2628 (2009).
  16. Collins, D. J., Neild, A., deMello, A., Liu, A. -Q., Ai, Y. The Poisson distribution and beyond: methods for microfluidic droplet production and single cell encapsulation. Lab Chip. 15 (17), 3439-3459 (2015).
  17. Kemna, E. W. M., et al. High-yield cell ordering and deterministic cell-in-droplet encapsulation using Dean flow in a curved microchannel. Lab on a Chip. 12 (16), 2881 (2012).
  18. Köster, S., et al. Drop-based microfluidic devices for encapsulation of single cells. Lab on a Chip. 8 (7), 1110 (2008).
  19. Mazutis, L., et al. Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics. Nature Protocols. 8 (5), 870-891 (2013).
  20. Sun, P., et al. Functional characterization of ex vivo. blood myeloid and plasmacytoid dendritic cells after infection with dengue virus. Virology. 383 (2), 207-215 (2009).
  21. Tel, J., et al. The chemotherapeutic drug oxaliplatin differentially affects blood DC function dependent on environmental cues. Cancer Immunology, Immunotherapy. 61 (7), 1101-1111 (2012).
  22. Wimmers, F., et al. Single-cell analysis reveals that stochasticity and paracrine signaling control interferon-alpha production by plasmacytoid dendritic cells. Nature Communications. 9 (1), 3317 (2018).
  23. Gong, J., Kim, C. -J. All-electronic droplet generation on-chip with real-time feedback control for EWOD digital microfluidics. Lab on a Chip. 8 (6), 898 (2008).
  24. Demirci, U., Montesano, G. Single cell epitaxy by acoustic picolitre droplets. Lab on a Chip. 7 (9), 1139 (2007).
  25. Rho, H. S., Yang, Y., Veltkamp, H. -W., Gardeniers, H. Direct Delivery of Reagents from a Pipette Tip to a PDMS Microfluidic Device. Chips and Tips. , (2015).
  26. Paul, P. H., Garguilo, M. G., Rakestraw, D. J. Imaging of Pressure- And Electrokinetically Driven Flows through Open Capillaries. Analytical Chemistry. 70 (13), 2459-2467 (1998).
  27. Whitesides, G. M., Stroock, A. D. Flexible methods for microfluidics. Physics Today. 54, 42 (2001).
  28. Mita, A., et al. Anti-proinflammatory Effects of Iodixanol (OptiPrep)-Based Density Gradient Purification on Human Islet Preparations. Cell Transplant. 19 (12), 1537-1546 (2013).
  29. Dura, B., et al. Profiling lymphocyte interactions at the single-cell level by microfluidic cell pairing. Nature Communications. 6 (1), 1-13 (2015).
  30. Dura, B., et al. Longitudinal multiparameter assay of lymphocyte interactions from onset by microfluidic cell pairing and culture. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (26), 3599-3608 (2016).
  31. Yamanaka, Y. J., et al. Single-cell analysis of the dynamics and functional outcomes of interactions between human natural killer cells and target cells. Integrative Biology. 4 (10), 1175 (2012).
  32. Satija, R., Shalek, A. K. Heterogeneity in immune responses: From populations to single cells. Trends in Immunology. 35 (5), 219-229 (2014).

Tags

Ingenjörsvetenskap fråga 144 droppar mikrofluidik spets lastning Poisson-fördelningen Cell inkapsling Cell-ihopkoppling cellulära interaktioner
En pipett-spets baserat metod för sådd celler till Droplet mikroflödessystem plattformar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sinha, N., Subedi, N., Wimmers, F.,… More

Sinha, N., Subedi, N., Wimmers, F., Soennichsen, M., Tel, J. A Pipette-Tip Based Method for Seeding Cells to Droplet Microfluidic Platforms. J. Vis. Exp. (144), e57848, doi:10.3791/57848 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter