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Immunology and Infection

नए वायरस जीनोम की खोज करने के लिए संक्रमित पत्तियों से आरएनए के विश्लेषण के साथ एक क्रूड विरिअन निष्कर्षण में डीएनए के विश्लेषण का मेल

Published: July 27, 2018 doi: 10.3791/57855
Automatic Translation
1, 2, 3, 4
1Texas A&M Agrilife Center at Dallas, 2Noble Research Center, Oklahoma State University, 3Department of Biology, College of Engineering and Natural Sciences, The University of Tulsa, 4Bioinformatics and Genomics Core Facility, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Oklahoma State University

Summary

यहां हम डबल-किनारा डीएनए जीनोम के साथ संयंत्र वायरस की पहचान करने के लिए एक नया दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं । हम संक्रमित पत्तियों से डीएनए और शाही सेना निकालने और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण बाहर ले जाने के लिए मानक तरीकों का उपयोग करें । Bioinformatic उपकरण contigs में दृश्यों को इकट्ठा, contigs वायरस जीनोम का प्रतिनिधित्व करने और वर्गीकरण समूहों के जीनोम आवंटित की पहचान ।

Abstract

इस metagenome दृष्टिकोण परिपत्र डीएनए जीनोम और उनके टेप के साथ संयंत्र वायरस की पहचान करने के लिए प्रयोग किया जाता है । अक्सर संयंत्र डीएनए वायरस है कि उनके मेजबान में कम titers में होते है या यांत्रिक नहीं किया जा सकता है एक और मेजबान के लिए inoculated को संक्रामक सामग्री का एक बड़ा titer हासिल प्रचार मुश्किल है । संक्रमित पत्तियों इष्टतम पीएच और ईओण संरचना सबसे bacilliform पैरा retroviruses शुद्ध करने के लिए सिफारिश के साथ एक हल्के बफर में जमीन कर रहे हैं । यूरिया को शामिल करने निकायों कि जाल virions तोड़ने और सेलुलर घटकों को भंग करने के लिए प्रयोग किया जाता है । विभेदक केंद्रापसारक संयंत्र संदूषणों से virions के आगे जुदाई प्रदान करता है । इसके बाद proteinase K treatment capsids को हटा देता है । तो वायरल डीएनए केंद्रित है और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (NGS) के लिए इस्तेमाल किया । NGS डेटा जो जनरेट किए गए dataset में वायरस अनुक्रम का एक सबसेट की पहचान करने के लिए NCBI-BLASTn करने के लिए सबमिट किया गया contigs को एकत्रित करने के लिए उपयोग किए जाते हैं । एक समानांतर पाइपलाइन में, आरएनए एक मानक स्तंभ-आधारित आरएनए निष्कर्षण विधि का उपयोग कर संक्रमित पत्तियों से पृथक है । तो ribosome कमी बाहर किया जाता है mRNA और वायरस टेप के एक सबसेट के लिए समृद्ध । इस डेटासेट में वायरस दृश्यों का एक सबसेट की पहचान करने के लिए NCBI-BLASTn करने के लिए प्रस्तुत किया गया था आरएनए अनुक्रमण (आरएनए-seq) से व्युत्पंन अनुक्रम इकट्ठा । हमारे अध्ययन में, हम दो डेटासेट में दो संबंधित पूर्ण लंबाई badnavirus जीनोम की पहचान की । इस विधि एक और आम दृष्टिकोण है जो छोटे आरएनए अनुक्रम की कुल जनसंख्या अर्क संयंत्र वायरस जीनोमिक दृश्यों का पुनर्गठन करने के लिए पसंद किया जाता है । यह उत्तरार्द्ध metagenomic पाइपलाइन वायरस से संबंधित दृश्यों कि रेट्रो टाइपिंग तत्वों संयंत्र जीनोम में डाला जाता है ठीक हो । यह जैव रासायनिक या आणविक परख करने के लिए युग्मित करने के लिए आगे सक्रिय रूप से संक्रामक एजेंटों विचार है । इस अध्ययन में प्रलेखित दृष्टिकोण, ठीक हो जाता है कि संभावना सक्रिय वायरस संक्रमण का संकेत वायरस नकल के अनुक्रम प्रतिनिधि ।

Introduction

उभरते संयंत्र रोग शोधकर्ताओं ड्राइव करने के लिए नए उपकरण विकसित करने के लिए सही कारण एजेंट (ओं) की पहचान । नई या आवर्ती वायरस रोगों की प्रारंभिक रिपोर्ट ऐसी मोज़ेक और पत्ती, नस समाशोधन, बौना, मुरझाना, घावों, परिगलन, या अन्य लक्षणों की विकृतियों के रूप में आमतौर पर होने वाले लक्षणों के आधार पर कर रहे हैं । एक रोग के लिए कारण एजेंट के रूप में एक नए वायरस की रिपोर्टिंग के लिए मानक यह अंय दूषित रोगजनकों से अलग है, यह उपयुक्त मेजबान में प्रचार, और मूल मेजबान प्रजातियों के स्वस्थ पौधों में inoculating द्वारा रोग पुनरुत्पादन । इस दृष्टिकोण में सीमा है कि संयंत्र वायरस के कई पीढ़ी एक उपयुक्त मेजबान या मूल मेजबान प्रजातियों को वापस करने के लिए संचरण के लिए एक कीट या अंय वैक्टर पर निर्भर करते हैं । इस मामले में, उपयुक्त वेक्टर के लिए खोज लंबे समय तक हो सकता है, वहां के लिए सदिश की प्रयोगशाला कालोनियों स्थापित करने के लिए कठिनाइयों हो सकता है, और आगे के प्रयासों के लिए प्रयोगात्मक संचरण के लिए एक प्रोटोकॉल ईजाद करना आवश्यक हैं । यदि सफल प्रयोगशाला संचरण अध्ययन के लिए शर्तों को प्राप्त नहीं किया जा सकता है, तो काम एक नए वायरस रोग की रिपोर्टिंग के लिए मानक से कम हो जाता है । वायरस है कि बहुत कम titers में उनके प्राकृतिक मेजबान में पाए जाते हैं, शोधकर्ताओं के लिए प्रचार के लिए पर्याप्त संक्रामक शेयरों को बनाए रखने के लिए शोध के लिए वैकल्पिक मेजबान की पहचान करनी चाहिए । वायरस प्रजातियों के लिए है कि केवल कुछ पौधों को संक्रमित यह भी शेयर संस्कृतियों1बढ़ के लिए एक बाधा हो सकती है ।

हाल के वर्षों में, वैज्ञानिकों को अधिक बार काम कर रहे है उच्च प्रवाह NGS और metagenomic के दृष्टिकोण को उजागर वायरस अनुक्रम है कि पर्यावरण में मौजूद हैं, जो एक ज्ञात रोग के लिए असंबंधित मौजूद हो सकता है, लेकिन वर्गीकरण प्रजातियों और पीढ़ी को सौंपा जा सकता है 2 , 3 , 4. एक अलग वातावरण में खोज और आनुवंशिक सामग्री के वर्गीकरण के लिए इस तरह के दृष्टिकोण एक निश्चित पारिस्थितिकी तंत्र में प्रकृति या उनकी उपस्थिति में वायरस विविधता का वर्णन करने के लिए एक तरीका है, लेकिन जरूरी परिभाषित करने के लिए एक रूपरेखा के लिए पुष्टि नहीं है प्रदान एक स्पष्ट रोग के लिए कारण एजेंटों ।

Badnavirus जीनस pararetroviruses के परिवार Caulimoviridae के अंतर्गत आता है । ये वायरस लगभग 7 से 9 केबी के परिपत्र डबल कतरा डीएनए जीनोम के साथ आकार में bacilliform हैं । सभी pararetroviruses एक आरएनए मध्यवर्ती के माध्यम से दोहराने । Pararetroviruses episomes के रूप में मौजूद है और संयंत्र गुणसूत्र डीएनए के स्वतंत्र दोहराने5,6। वायरस आबादी के क्षेत्र अध्ययनों से संकेत मिलता है कि इन वायरस आबादी आनुवंशिक रूप से जटिल हैं । इसके अलावा, उच्च प्रवाह अनुक्रमण द्वारा संयंत्र जीनोम की एक सीमा के पार प्राप्त जानकारी badnavirus जीनोम संयंत्र जीनोम में नाजायज एकीकरण की घटनाओं द्वारा डाला टुकड़े के कई उदाहरण खुला है । ये अंतर्जात badnavirus जुगाड़7,8,9,10,11संक्रमण के साथ जरूरी नहीं जुड़े हैं । बाद में, NGS का उपयोग करने के लिए रोग के कारण एजेंट के रूप में नए badnaviruses की पहचान episomal जीनोम के उपजनसंख्या विविधता से जटिल है और साथ ही अंतर्जात अनुक्रम12,13की घटना ।

जबकि वहां उपंयास pararetrovirus जीनोम की खोज के लिए एक इष्टतम पाइपलाइन नहीं है, वहां दो आम दृष्टिकोण रोग के लिए कारण एजेंटों के रूप में इन वायरस की पहचान कर रहे हैं । एक विधि को संक्रमित पत्तियों से छोटे आरएनए दृश्यों के लिए समृद्ध और फिर वायरस जीनोम (ओं) को फिर से गठित करने के लिए इन दृश्यों को इकट्ठा करने के लिए है14,15,16,17. एक अंय दृष्टिकोण रोलिंग सर्कल प्रवर्धन (आरसीए) को परिपत्र डीएनए वायरस जीनोम18बढ़ाना है । आरसीए की सफलता पत्ती की उंर और चयनित ऊतक में वायरस titer पर निर्भर करता है । आरसीए उत्पादों के लिए पाचन प्रतिबंध के अधीन है और प्रत्यक्ष अनुक्रमण के लिए plasmids में क्लोन19,20,21।

भंग येलो क्लोरोटिक वायरस (CaYMV) एक badnavirus है और भंग में पीली क्लोरोटिक रोग के etiological कारण के रूप में वर्णित है, हालांकि केवल जीनोम का ५६५ बीपी टुकड़ा पहले से संक्रमित cannas22से अलग किया गया है । एक समकालीन अध्ययन Alpinia purpurata में CaYMV की पहचान (फूल अदरक; CaYMV-एपी)23. इस अध्ययन का लक्ष्य संक्रमित भंग लिली से पूरा badnavirus जीनोम दृश्यों को ठीक करने के लिए किया गया था । हम संयंत्र संदूषणों से वायरस शुद्ध करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है, और फिर इस तैयारी से वायरल डीएनए अलग है, और NGS में उपयोग के लिए एक डीएनए पुस्तकालय तैयार करते हैं । यह दृष्टिकोण मध्यवर्ती आणविक प्रवर्धन कदमों की आवश्यकता को समाप्त करता है. हम भी आरएनए-seq. NGS, जो आरएनए-seq शामिल प्रत्येक न्यूक्लिक एसिड तैयारी का उपयोग किया गया था के लिए संक्रमित पौधों से mRNA को अलग । इकट्ठे contigs दोनों डेटासेट जैव प्रौद्योगिकी और सूचना (NCBI) न्यूक्लिक एसिड (BLASTn) के लिए बुनियादी स्थानीय संरेखण खोज उपकरण के लिए राष्ट्रीय केंद्र का उपयोग करने में Badnavirus taxon से संबंधित पाए गए । हम दो badnavirus प्रजातियों के जीनोम की पहचान24।

Protocol

1. Covey एट अल द्वारा मानक विधि का उपयोग अंतर केंद्रापसारक द्वारा सामांय वायरस शुद्धि । 25

  1. सबसे पहले, रोगग्रस्त पौधों से पत्तियों का 80-100 ग्राम काटा और 4 ° c २०० मिलीलीटर पीस बफर का उपयोग कर एक waring ब्लेंडर में पीसने (०.५ M णः2पीओ4, ०.५ Mना 2HPO4 (pH ७.२). and ०.५% (w/v) ना2सू3). इस प्रक्रिया के सभी चरणों के लिए एक प्रयोगशाला कोट और दस्ताने पहनें ।
  2. इसके बाद homogenate (३०० एमएल) को १.० एल यूरिन ट्रांसफर करें । यूरिया के 18 ग्राम और 10% गैर ईओण डिटर्जेंट (t-Oct-C6H4-(OCH2CH2)9ओह) एक रासायनिक हुड के अंदर homogenate के लिए 25 मिलीलीटर जोड़ें ।
    नोट: इस कदम के लिए यह सबसे अच्छा है सुरक्षा चश्मे और व्यक्तिगत सुरक्षा के लिए एक सरल श्वास मुखौटा पहनते हैं ।
  3. हुड में एक चुंबकीय सरगर्मी संक्षेप के साथ हिलाओ और पंनी के साथ चोंच कवर । फिर एक ठंडे कमरे में पन्नी कवर चोंच हस्तांतरण और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर एक चुंबकीय सरगर्मी के साथ हलचल ।
  4. रोटर बोतलों (२५० मिलीलीटर कंटेनरों) को homogenate हस्तांतरण और ४,००० x g पर एक निश्चित कोण रोटर में 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस में केंद्रापसारक । एक रासायनिक धुएं हुड में, supernatant और जाली के 4 परतों के माध्यम से फिल्टर ठीक हो ।
  5. ३८.५ मिलीलीटर के बीच homogenate के बीच विभाजित करें ट्यूबों और 4 डिग्री सेल्सियस पर ४०,००० x g पर २.५ घंटे के लिए केंद्रापसारक । आमतौर पर, ट्यूब और ट्यूब की लंबाई के साथ एक सफेद गोली के तल पर एक हरे रंग की गोली की उपस्थिति के लिए जांच करें । supernatant बंद डालो और दोनों छर्रों को बनाए रखने; बर्फ पर नमूने प्लेस ।
    नोट: ग्रीन गोली chloroplasts, स्टार्च, और अंय organelles शामिल हैं ।
  6. एक रासायनिक हुड में कार्य करना, छर्रों अलग करने के लिए एक रबर पुलिसकर्मी का उपयोग करें । 1-2 एच के पाठ्यक्रम पर ddH2ओ के 1 मिलीलीटर में प्रत्येक रोटर बोतल में सफेद गोली resuspend जबकि 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात निलंबन को बनाए रखने के लिए सामग्री पूरी तरह से समाधान में भंग करने की अनुमति । ६,००० x g पर और 4 ° c पर निलंबन केंद्रापसारक 10 मिनट के लिए शेष मलबे को दूर करने के लिए ।
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 ज के लिए १३६,००० x g पर केंद्रित सस्पेंशन virions गोली के लिए । (५० mm Tris-HCl, पीएच ७.५, 5 मिमी MgCl2) बफर के 1 मिलीलीटर में छर्रों resuspend ।
    नोट: एक वैकल्पिक कदम के लिए DNAse मैं (10 µ जी/एमएल) के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए गैर encapsidated डीएनए, यानी, दूषित chloroplast और mitochondrial डीएनए को दूर करने के लिए virions का इलाज है । फिर, DNAse मैं 1 मिमी EDTA जोड़कर निष्क्रिय ।
  8. बाधित virions के साथ ४० µ l के 2 µ g/µ l proteinase K के लिए ३७ ° c पर 15 min.
  9. कार्बनिक निष्कर्षण द्वारा विरिअन डीएनए ठीक करने के लिए एक रासायनिक हुड के अंदर काम करते हैं । एक चेहरा ढाल, दस्ताने, और संभावित तीव्र स्वास्थ्य प्रभाव के खिलाफ संरक्षण के लिए निष्कर्षण के दौरान एक प्रयोगशाला कोट पहनते हैं । phenol के 1 मात्रा जोड़ें-क्लोरोफॉर्म-isoamyl शराब (49:50:1) के लिए नमूना और हाथ से हिला 20 एस के लिए कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए १६,००० x g. ऊपरी जलीय चरण निकालें और एक नई ट्यूब के लिए स्थानांतरण । इस निष्कर्षण को दो या अधिक बार दोहराएं । यह उचित संस्थागत रासायनिक निपटान के लिए26एक गिलास अपशिष्ट बोतल में रखकर कार्बनिक चरण के निपटान ।
  10. इथेनॉल वर्षण का उपयोग डीएनए ध्यान केंद्रित । सोडियम एसीटेट के ०.३ मीटर अंतिम एकाग्रता (पीएच ५.२) और ९५% इथेनॉल के २.५ संस्करणों का उपयोग करें । 30-60 मिनट के लिए-20 ° c के नमूने प्लेस और १३,००० x g पर 10-20 मिनट के लिए डीएनए गोली26के लिए केंद्रापसारक ।
  11. एक प्रयोगशाला पीठ में कार्य करना, ०.१ mM ते बफर (पीएच ८.०) के 1 मिलीलीटर में डीएनए गोली फिर से स्थगित । Filer एक वाणिज्यिक जेल छानने का काम कॉलम के माध्यम से निलंबन (आम तौर पर पोलीमरेज़ चेन प्रतिक्रिया (पीसीआर) को साफ करने के लिए इस्तेमाल किया) लवण और कम आणविक भार सामग्री है कि NGS बाधा हो सकता है खत्म करने के लिए ।
  12. तैयारियों की गुणवत्ता को देखने के लिए ethidium ब्रोमाइड धुंधला का उपयोग करते हुए 1% agarose जेल ट्रो द्वारा नमूनों का विश्लेषण करें । एक nanodrop spectrophotometer का उपयोग कर डीएनए की गुणवत्ता का आकलन करें ।
    नोट: २६० λ पर नमूना अवशोषक का अनुपात और १.८५ और २.० के बीच २८० λ आम तौर पर यह इंगित करता है कि तैयारी "अशुद्धियों की साफ" है और वांछित गुणवत्ता की है ।
  13. डीएनए की गुणवत्ता का विश्लेषण (10 एनजी करने के लिए 5 स्नातकोत्तर का उपयोग करें) एक चिप आधारित केशिका ट्रो साधन का उपयोग कर ।
    नोट: गुणवत्ता उत्पादन स्वच्छ चोटियों से पता चलता है, डीएनए एक एक्स-अक्ष के साथ आकार द्वारा वितरित टुकड़े का प्रतिनिधित्व । पीक ऊंचाई अंश की बहुतायत को इंगित करता है । दांतेदार चोटियों आंशिक रूप से अपमानित टुकड़े या रासायनिक दूषित होने से संकेत मिलता है । दौर घटता डीएनए का एक धब्बा का प्रतिनिधित्व गरीब गुणवत्ता का संकेत

2. पुस्तकालय डीएनए और पायस आधारित क्लोनिंग प्रवर्धन (emPCR प्रवर्धन) का उपयोग कर तैयारी

नोट: पुस्तकालय आम तौर पर एक NGS सुविधा है जो ग्राहक उंमुख काम बाहर किया जाता द्वारा तैयार है ।

  1. कतरनी डीएनए का समाधान (> २०० एनजी) एक छिटकानेवाला जो टुकड़ों को डीएनए धर्मांतरित का उपयोग कर । Ligate वाणिज्यिक एडेप्टर के अनुसार मैनुअल के निर्देश27.
  2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार डीएनए नमूने के emPCR प्रवर्धन बाहर ले28,29,30। तीन बार धो चरण दोहराएँ, और प्रत्येक धोने के बाद, 10 एस के लिए एक minicentrifuge में मोतियों की गोली. प्रत्येक धोने के बाद supernatant त्यागें ।
    नोट: प्रक्रिया के साथ शुरू होता है पर कब्जा मोतियों की तैयारी वाणिज्यिक धोने के लिए किट के साथ प्रदान की बफर में धुलाई । emPCR सामांयतः NGS के लिए प्रवर्धन टेंपलेट के लिए प्रयोग किया जाता है ।
  3. गर्मी डीएनए या आरएनए 2 मिनट के लिए ९५ डिग्री सेल्सियस पर और फिर 4 ° c उपयोग करने के लिए तैयार जब तक स्वभाव । डीएनए/आरएनए के २००,०००,००० अणुओं का उपयोग करें 30 µ एल के अंतिम खंड में ५,०००,००० कैद मोतियों के लिए डीएनए/आरएनए नमूना के साथ एक नकली नमूना तैयार करने और न्यूक्लिक एसिड नमूने के साथ ही नकली नमूना के साथ निम्नलिखित कदम उठाने.
  4. अधिकतम गति से 10 एस के लिए पायस तेल की ट्यूब भंवर द्वारा emulsification प्रदर्शन, तो एक प्लास्टिक सरगर्मी ट्यूब कि एक मंच homogenizer के साथ संगत है में पूरी सामग्री (4 मिलीलीटर) डालना । 5 मिनट के लिए २,००० rpm पर पायस मिश्रण करने के लिए मंच पर सरगर्मी ट्यूब प्लेस ।
  5. 8 पट्टी टोपी ट्यूबों में या एक ९६ अच्छी तरह से थाली में पायस के १०० µ एल aliquots वितरण । ट्यूब कैप या प्लेट सील और emPCR बाहर ले निर्माता की सिफारिश की कार्यक्रम28का उपयोग कर ।
    नोट: पीसीआर पूरी होने के बाद अगर पायस बरकरार है और फिर आगे बढ़ना है तो देखने के लिए कुओं की जांच करें । यदि इमल्शन टूट जाए तो संपूर्ण रूप से उसे छोड़ दें ।
  6. एक प्रयोगशाला कोट पहनें और एक रासायनिक डाकू में काम करने के लिए प्रवर्धित डीएनए मोती (एडीबी) इकट्ठा । वैक्यूम महाप्राण कुओं से पायस और एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में मोती इकट्ठा । isopropanol के १०० µ एल के साथ दो बार कुओं कुल्ला और महाप्राण एक ही ५० मिलीलीटर ट्यूब कुल्ला ।
  7. एकत्र इमल्शन भंवर और ३५ मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा के लिए isopropanol के साथ एडीबी resuspend । 5 मिनट के लिए ९३० x g पर एडीबी गोली supernatant निकालें और बढ़ाने बफर के 10 मिलीलीटर जोड़ें । भंवर एडीबी और फिर ४० मिलीलीटर अंतिम मात्रा केंद्रापसारक के लिए isopropanol जोड़कर धो और प्रत्येक धोने के बाद supernatant त्याग और धो कदम दो बार दोहराएं ।
  8. isopropanol के स्थान पर इथेनॉल का उपयोग कर एक अंतिम धोने बाहर ले । ३५ मिलीलीटर अंतिम मात्रा, भंवर के लिए बढ़ाने बफर जोड़ें, और 5 मिनट के लिए ९३० x g पर मोती गोली । supernatant को हटाने पर बफर बढ़ाने के 2 मिलीलीटर छोड़ दें ।
  9. एक microcentrifuge ट्यूब को निलंबन स्थानांतरण और संक्षेप में एडीबी गोली करने के लिए केंद्रापसारक । supernatant खारिज करने के बाद, एक बार बढ़ाने बफर के 1 मिलीलीटर के साथ एडीबी गोली कुल्ला । केंद्रापसारक और प्रत्येक धोने के बाद supernatant त्यागें ।
  10. डीएनए पुस्तकालय मनका संवर्धन के लिए तैयार करने के लिए, 1 N के 1 मिलीलीटर मोतियों को NaOH जोड़ें । भंवर एडीबी और फिर कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए गर्मी । केंद्रापसारक और supernatant त्यागें । इस वॉश स्टेप को एक बार दोहराएं ।
  11. एनीलिंग बफर के 1 मिलीलीटर जोड़ें, तो एडीबी भंवर और कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए मशीन । संक्षेप में supernatant और त्यागें । एनीलिंग बफ़र के १०० µ l का उपयोग कर फिर से इस चरण को दोहराएँ ।
  12. डीएनए को ऐनी अनुक्रमण प्राइमर करने के लिए, Seq प्राइमर ए के 15 µ एल जोड़ने और Seq प्राइमर बी के 15 µ एल किट में प्रदान की । संक्षेप में भंवर से मिश्रण है और एक गर्मी ब्लॉक में microcentrifuge ट्यूब ६५ ° c पर 5 मिनट के लिए बर्फ को हस्तांतरण के लिए 2 मिनट के लिए जगह है ।
  13. एनीलिंग बफर के १.० मिलीलीटर के साथ तीन बार धो लें । 5 एस के लिए भंवर और supernatant हर बार त्यागें ।
  14. sequencing से पहले, एक वाणिज्यिक मनका काउंटर का उपयोग कर मोतियों की संख्या को मापने । वहां कम से ५००,००० समृद्ध मोती होना चाहिए ।
    नोट: मनका काउंटर एक विशेष उपकरण है कि एक आपूर्ति की microcentrifuge ट्यूब में मोतियों के उपाय है ।

3. सामान्य mRNA अलगाव और संक्रमित भंग पत्तियों के साथ शुरू dsDNA संश्लेषण है कि आरटी द्वारा परीक्षण-CaYMV के लिए पीसीआर का उपयोग रिपोर्ट नैदानिक प्राइमरों

  1. सभी बाद के चरणों में व्यक्तिगत सुरक्षा के लिए एक प्रयोगशाला कोट और लेटेक्स दस्ताने पहनें । एक प्रयोगशाला बेंच में कार्य करना, पत्तियों से 12 नमूने इकट्ठा करने और तरल नाइट्रोजन में नमूने डुबकी । homogenization के लिए एक मनका मिल का प्रयोग करें । कुल पौध आरएनए अलगाव के लिए एक मानक स्तंभ-आधारित विधि प्रदान करता है एक वाणिज्यिक किट का उपयोग करें । किट द्वारा जमीन के नमूने के लिए प्रदान की guanidine-isothiocyanate lysis बफर जोड़ें और 20 एस के लिए शेक ।
  2. इथेनॉल जोड़ें और अच्छी तरह से मिश्रण, किट निर्देश के अनुसार । प्रत्येक homogenate को एक स्पिन कॉलम में जोड़ें जो आरएनए को झिल्ली में बांधता है । तीन बार धोने और एक वसूली ट्यूब24में आरएनए elute ।
  3. २६० λ और २८० λ पर अवशोषक के अनुपात को मापने के लिए एक spectrophotometer का उपयोग कर आरएनए को बढ़ाता है । 1% agarose जेल का उपयोग कर आरएनए अखंडता सत्यापित करें ट्रो ethidium के साथ सना हुआ ।
    नोट: १.८५ और २.० के बीच एक अवशोषक अनुपात यह इंगित करता है कि तैयारी वांछित गुणवत्ता की है । ३७ डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए DNase मैं (10 µ जी/एमएल) के साथ आरएनए का इलाज । RNase-मुक्त पानी31में आरएनए ध्यान केंद्रित करने के लिए एक वाणिज्यिक स्पिन कॉलम का प्रयोग करें । आगे बढ़ने से पहले पूल आरएनए नमूने ।
  4. संयंत्र राइबोसोमल आरएनए को हटाने के लिए एक rRNA हटाने किट का उपयोग करें । Aliquot चुंबकीय मोती microcentrifuge ट्यूब करने के लिए और RNase मुक्त पानी के साथ दो बार धोने । भंवर ट्यूब aliquot resuspend करने के लिए, एक चुंबकीय स्टैंड पर ट्यूब जगह और स्पष्ट करने के लिए तरल के लिए प्रतीक्षा करें । supernatant त्यागें और चुंबकीय मनका resuspension समाधान के साथ बदलें । भंवर resuspend और RNase अवरोध करनेवाला के 1 µ एल जोड़ने के लिए ।
    नोट: इस तरह के किट चुंबकीय मोतियों से बंधे oligo-डीटी का उपयोग करते हैं जो mRNA को संकरण है । विधि मानक चुंबक मनका जुदाई प्रौद्योगिकी का उपयोग करता है टेप24पुनर्प्राप्त ।
  5. ५००-आरएनए के १.२५ µ जी के लिए एनजी का मिश्रण, RNase-नि: शुल्क पानी, और प्रतिक्रिया बफ़र्स किट द्वारा प्रदान की गई. ५० डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए मिश्रण प्लेस । गर्मी से निकालें और RNAse मुक्त पानी में धोया चुंबकीय मोती जोड़ें । भंवर संक्षेप में और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेट ।
  6. एक चुंबकीय स्टैंड पर प्लेस और तरल स्पष्ट करने के लिए प्रतीक्षा करें । supernatant को एक फ्रेश microcentrifuge ट्यूब पर ट्रांसफर करें । बर्फ पर सेट करें ।
  7. सीडीएनए पुस्तकालय तैयार करने के लिए exosomes और आरएनए के २०० एनजी के संवर्धन के लिए एक समाधान आधारित कब्जा विधि का उपयोग करें ।
    नोट: डबल किनारा सीडीएनए पुस्तकालय आमतौर पर एक NGS सुविधा है जो ग्राहक उंमुख काम बाहर किया जाता द्वारा तैयार है ।
  8. एक वाणिज्यिक आरएनए विखंडन समाधान (०.१३६ g ZnCl2 और १०० mM Tris-HCl pH ७.०) का उपयोग कर आरएनए को खंडित करें । 18 µ के लिए समाधान के 2 µ एल जोड़ें आरएनए के एल (२०० एनजी कुल) । स्पिन ट्यूबों संक्षेप में microcentrifuge के लिए, ७० डिग्री सेल्सियस पर नमूने 30 एस के लिए जगह है, और बर्फ को हस्तांतरण । ०.५ मीटर EDTA ph ८.० और 28 µ l के 10 mM Tris-HCl ph ७.५ के 2 µ l का प्रयोग करते हुए रिएक्शन रोकें ।
  9. 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मिश्रण से चुंबकीय मोतियों को बांधना आरएनए. मोतियों को इकट्ठा करने और supernatant को त्यागने के लिए चुंबकीय संकेन्द्रक का प्रयोग करें । ७०% इथेनॉल के २०० µ एल के साथ तीन बार मोतियों को धो लें । प्रत्येक धोने त्यागें और फिर हवा 3 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर छर्रों मोती सूखी । 10 मिमी Tris-एचसीएल पीएच ७.५ के 19 µ एल में पुनर्स्थगित ।
  10. 10 मिनट के लिए ७० ° c करने के लिए हीटिंग द्वारा खंडित आरएनए को ऐनी यादृच्छिक प्राइमरों और फिर 2 मिनट के लिए बर्फ पर ट्यूब जगह है । एक मानक वाणिज्यिक सीडीएनए संश्लेषण किट का उपयोग कर पहला कतरा और दूसरा किनारा सीडीएनए तैयार करें ।
  11. एक चुंबकीय मनका ध्यानी का उपयोग कर डबल-किनारा सीडीएनए शुद्ध । ७०% इथेनॉल के ८०० µ एल के साथ धो तीन बार । प्रत्येक धो और हवा 3 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सूखी छर्रों को त्यागें 10 मिमी Tris-एचसीएल पीएच ७.५ के 16 µ एल में पुनर्स्थगित । जो समाधान में अब है डबल असहाय सीडीएनए, से मोतियों को अलग करने के लिए चुंबकीय मनका ध्यानी का प्रयोग करें । एक नया २०० µ एल पीसीआर ट्यूब में pipetting द्वारा सीडीएनए निकालें ।
  12. Taq पोलीमरेज़ और एक वाणिज्यिक पुस्तकालय तैयारी किट द्वारा प्रदान की deoxyribonucleotides का मिश्रण का उपयोग कर टुकड़ा अंत मरंमत बाहर ले । वाणिज्यिक किट पूर्व पतला एडेप्टर प्रदान करता है डबल-किनारा सीडीएनए के प्रत्येक अंत में जोड़ने के लिए 25 ° c पर 10 मिनट के लिए वाणिज्यिक ligase का उपयोग कर ।

4. क्रूड वायरस तैयार करने और dsDNA लाइब्रेरी से तैयार किए गए डीएनए लाइब्रेरी की NGS mRNA

  1. एक मानक उच्च प्रवाह pyrosequencing साधन का उपयोग करें और डीएनए दृश्यों के प्रत्यक्ष readouts उत्पन्न करने के लिए सभी अनुशंसित निर्माताओं ' प्रोटोकॉल का पालन करें । फ्लोरोसेंट लेबल न्यूक्लियोटाइड सहित वाणिज्यिक अनुक्रमण रिएजेंट का उपयोग करें ।
    नोट: विवरण के लिए उपकरण के साथ प्रदान की निर्माता के निर्देशों का संदर्भ लें ।
  2. जीनोम असेंबली सॉफ्टवेयर है जो स्वचालित रूप से इकट्ठे का उपयोग कर के बाद अनुक्रमण विश्लेषण बाहर ले contigs का एक औसत लंबाई के साथ पहले सेट का उत्पादन करने के लिए पढ़ता < ७०० bp. iPlant/CyVerse वेबसाइट जो गुणवत्ता नियंत्रण प्रदर्शन पर FastQC सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें अपुष्ट अनुक्रम डेटा३२पर जाँच करता है । Phred स्कोर के साथ अनुक्रम का चयन करें 30 ≥ छोटे अनुक्रम से अब दृश्यों का पुनर्निर्माण करने के लिए जारी रखने के लिए24 पढ़ता मानचित्रण और amplicon सॉफ्टवेयर का उपयोग कर.
    नोट: विवरण के लिए निर्माता के निर्देश देखें ।
  3. इन इकट्ठे contigs NCBI-BLASTn विश्लेषण MEGABLAST डिफ़ॉल्ट मॉड्यूल के रूप में अच्छी तरह के रूप में Viridplantae (टैक्सी: ३३०९०) और वायरस (टैक्सी: १०२३९) सीमित जीव नाम३३के रूप में उपयोग करने के लिए सबमिट करें । contigs की उपआबादी है कि उच्च समानता दिखाने के लिए एक रिपोर्ट में Badnavirus जीनोम की सूचना इकट्ठा ।
  4. सत्यापित करें कि शामिल पाड़ों कि एक या एक से अधिक उंमीदवार पूर्ण लंबाई वायरस जीनोम का प्रतिनिधित्व करते हैं, सही ढंग से उत्पादन में फ्रेम दृश्यों कि मानक badnavirus जीनोम के रूप में एक ही संगठन है । ऐसा करने के लिए, एक प्लाज्मिड ड्राइंग सॉफ्टवेयर में उंमीदवार पूर्ण लंबाई वायरस जीनोम इनपुट । तो पहले 15 न्यूक्लियोटाइड की पुष्टि एक tRNAमिले (TGGTATCAGAGCGAG) जो अत्यधिक badnaviruses के बीच संरक्षित है के होते हैं । जीनोम के 3 ' अंत के पास संभावित polyadenylation संकेत का पता लगाएं । दो छोटे ORFs और एक बड़े ओआरएफ एक polyprotein एंकोडिंग की उपस्थिति की पहचान करने के लिए पूरा जीनोम व्याख्या । फिर badnavirus ORF1, ORF2, और ORF3 अनुवाद उत्पादों३४की पहचान करने के लिए ExPASy पोर्टल अनुवाद उपकरण का उपयोग करें ।
    नोट: इस वैज्ञानिक सॉफ्टवेयर मुक्त है और परिपत्र डीएनए उत्पन्न होगा, सभी खुले पढ़ने के फ्रेम की पहचान, और अनुक्रम पूरी लंबाई परिपत्र डीएनए जीनोम का प्रतिनिधित्व करता है कि यह सत्यापित करने के लिए एक तत्काल उत्पादन उपलब्ध कराता है.
  5. डीएनए और आरएनए विश्लेषण३५,३६से प्राप्त वायरस जीनोम की तुलना करने के लिए खुला स्रोत एकाधिक अनुक्रम तुलना उपकरण, मांसपेशी और CLUSTALW, का प्रयोग करें ।
  6. 30 badnavirus प्रजातियों के पूर्ण जीनोम दृश्यों को प्राप्त करने और उन्हें. फसता प्रारूप में एक दस्तावेज़ के रूप में निर्यात करने के लिए NCBI न्यूक्लियोटाइड डेटाबेस खोजें । एक सॉफ्टवेयर है कि वायरस जीनोम NGS द्वारा प्राप्त दृश्यों के साथ अनुक्रम के विकासवादी आनुवंशिक विश्लेषण आयोजित करने के लिए अनुक्रम अपलोड करें । एकाधिक अनुक्रम संरेखण और मांसपेशी३७का उपयोग कर अधिकतम संभावना पेड़ उत्पन्न करते हैं ।

5. संक्रमित पौधों से वायरस जीनोम की पीसीआर प्रवर्धन द्वारा डी नोवो अनुक्रमण की गुणवत्ता का आकलन

  1. नए इनपुट की पहचान की पूरी लंबाई badnavirus जीनोम अनुक्रम (. फसता प्रारूप) नि: शुल्क ऑनलाइन Primer3 उपकरण में पीसीआर प्राइमरों३८पाने के लिए । पहचान प्राइमर सेट है कि वायरस जीनोम (एस) की पूरी लंबाई के साथ 1000-1500 बीपी के चौंका देने वाला उत्पादों का उत्पादन होगा । एक सेवा की सुविधा है कि संश्लेषित और पीसीआर प्राइमरों उद्धार होगा करने के लिए अनुक्रम भेजें ।
    नोट: आउटपुट पेश दृश्यों के साथ आम और स्वीकार्य पिघलने तापमान और सटीक प्राइमर स्थानों के साथ स्वीकार्य प्राइमरी जोड़े को दिखाता है ।
  2. एक प्रयोगशाला बेंच में काम कर रहे है और एक प्रयोगशाला कोट और दस्ताने पहने हुए, वायरस संक्रमित और स्वस्थ नियंत्रण से डीएनए के 5 µ जी अलग एक स्वचालित तरीका है कि मानक paramagnetic फाइबर के लिए संयंत्र सामग्री३९ से डीएनए अलग कणों शामिल है का उपयोग कर पत्तियों । एक microcentrifuge ट्यूब में तरल नाइट्रोजन में पत्ता सामग्री फ्रीज (20-40 मिलीग्राम) और एक मनका मिल का उपयोग कर पीसने । नमूना lysis बफर के साथ एक microcentrifuge ट्यूब में जोड़ सकते हैं और प्रत्येक नमूने के लिए RNase. भंवर 10-20 एस के लिए नमूने और संक्षेप में ठोस कणों को हटाने के लिए नमूना स्पिन ।
    नोट: Paramagnetic फाइबर कणों उच्च डीएनए बाध्यकारी क्षमता है और शुद्ध डीएनए की उच्च पैदावार को अलग । डीएनए अलगाव के लिए मानक वाणिज्यिक सिलिका स्तंभ तरीकों कुशलतापूर्वक संयंत्र प्रजातियों की एक विस्तृत विविधता से डीएनए निकालने नहीं है । नतीजतन, तरीकों के दर्जनों मौजूद है कि इन प्रक्रियाओं के संशोधनों के लिए व्यक्तिगत संयंत्र प्रजातियों के लिए दक्षता में सुधार कर रहे हैं । स्वचालित paramagnetic फाइबर कण विधि चुना गया था क्योंकि यह अधिक से अधिक और उच्च गुणवत्ता डीएनए पैदावार से अधिक 25 घास जाने फाइलोजेनी प्रजातियों४०।
  3. स्वचालित paramagnetic डीएनए अलगाव के लिए वाणिज्यिक रिएजेंट कारतूस का प्रयोग करें । प्रत्येक वाणिज्यिक एजेंट कारतूस और एक ही कारतूस के लिए lysate हस्तांतरण संयंत्र के लिए nuclease मुफ्त पानी की ३०० µ एल जोड़ें । कारतूस रैक में कारतूस प्लेस, रेफरेंस ट्यूब के लिए अच्छी तरह से निकटतम में एक गोताख़ोर जगह है, और रेफरेंस ट्यूब में जगह रेफरेंस बफर । स्वचालित न्यूक्लिक एसिड अलगाव मशीन में कारतूस लोड और संयंत्र डीएनए अलगाव प्रोटोकॉल४१,४२चलाते हैं ।
  4. ओवरलैपिंग पीसीआर उत्पादों का एक सेट प्राप्त करने के लिए पीसीआर बाहर ले । पीसीआर प्रवर्धन के ३५ चक्र के साथ प्रत्येक आगे और रिवर्स प्राइमर के 5 µ मीटर का उपयोग करें । निम्नलिखित साइकलिंग शर्तों का उपयोग करें: ६० s के लिए ९५ ° c पर विकार, ४५ s के लिए ५० ° c पर एनीलिंग, ७२ ° c के लिए 1-2 डिग्री सेल्सियस पर ७२ डिग्री सेल्सियस पर एक अंतिम विस्तार के लिए एक पूर्व पैकेज्ड जेल निस्पंदन कॉलम का प्रयोग करें के रूप में लवण और कम आणविक भार सामग्री को खत्म चरण १.२31में ।
  5. पीसीआर उत्पाद के 3:1 दाढ़ अनुपात की गणना करने के लिए ligate के लिए पीसीआर उत्पाद की राशि का निर्धारण करने के लिए ५० रैखिक pGEM प्लाज्मिड४३के एनजी. यह निर्धारित करने के लिए कि क्या ligations कार्य कुशलता से नियंत्रण संमिलित करें डीएनए का उपयोग । 4 डिग्री सेल्सियस पर टी-6 डीएनए ligase (3 U/µ l) का उपयोग कर रात भर बंधाव प्रदर्शन । फिर व्यावसायिक रूप से तैयार JM109 सक्षम ई कोलाई कोशिकाओं को बदलने । नियंत्रण १०० बिना खतना प्लाज्मिड डीएनए के स्नातकोत्तर कुशल परिवर्तन के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण का उपयोग करें । प्लेट १०० पौंड पर रूपांतरित कोशिकाओं के µ एल-आगर एंटीबायोटिक और नीले/सफेद चयन के साथ प्लेटों ligated plasmids26को ठीक करने के लिए । ३७ डिग्री सेल्सियस पर 16-24 घंटे के लिए मशीन प्लेट ।
    नोट: pGEM वेक्टर एक lacZ जीन जो β-galactosidase सांकेतिक शब्दों में है । रूपांतरित बैक्टीरिया एक प्लेट पर उगाए जाते हैं जिसमें १०० µ g/ml एम्पीसिलीन, ०.५ mM IPTG, ८० µ g/एमएल 5-ब्रोमो-4-क्लोरोफ्लूरोकार्बन-3-indoyl-β-D-galactopyranosidase (X-gal) β-galactosidase गतिविधि के कारण नीला हो जाएगा । pGEM प्लाज्मिड एक तरह से है कि lacZ जीन बाधित में रैखिक है । जिन कॉलोनियों में पीसीआर उत्पाद सम्मिलित हैं, lacZ जीन को बाधित करते हैं और एक्स-gal metabolize नहीं करते हैं । ये कालोनियां सफेद हैं । इस प्रकार एक डालने के साथ कालोनियों कॉलोनी के रंग से एक डालने के बिना उन लोगों से अलग किया जा सकता है (सफेद बनाम नीला)26।
  6. एक मानक स्तंभ-आधारित प्लाज्मिड आइसोलेशन किट३९का उपयोग कर तीन कालोनियों से डीएनए को अलग । परिवर्तन उत्पाद के अनुक्रम तीन plasmids । NGS द्वारा उत्पादित वायरस जीनोम इकट्ठे डी नोवो के साथ प्रत्येक डीएनए अनुक्रम की तुलना करें । अनुक्रम को संरेखित करने के लिए CLUSTALW का उपयोग करें और सुनिश्चित करें कि वे उचित रूप से आदेश दिए गए हैं ।

Representative Results

इस संशोधित वायरस शुद्धि विधि NGS और bioinformatics द्वारा दो वायरस प्रजातियों की पहचान के लिए उपयोगी वायरस DNAs के एक संवर्धन प्रदान की है । के बाद homogenate २.५ एच के लिए ४०,००० x जी में केंद्रापसारक था, वहां ट्यूब और लंबाई के साथ एक सफेद गोली के नीचे एक हरे रंग की गोली थी । हरी गोली एक microcentrifuge ट्यूब में resuspend और सफेद गोली दो microcentrifuge ट्यूबों में resuspend किया गया था । पीसीआर मानक CaYMV पीसीआर नैदानिक प्राइमरों का उपयोग कर बाहर किया गया था, और उत्पादों solubilized सफेद गोली में पता चला रहे थे और नहीं हरी गोली (चित्रा 1ए) । कच्चे तेल की तैयारी का एक नमूना संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा जांच की थी और हम bacilliform लंबाई में 124-133 एनएम को मापने कणों (चित्रा 1बी) मनाया । यह सबसे badnaviruses की भविष्यवाणी मोडल लंबाई के भीतर है । डीएनए सफेद और हरे रंग की गोली से निकाला गया था और अलग से resuspend । चित्रा 1सीमें, हम हरे और सफेद गोली के नमूने से निकाले डीएनए के 5 µ एल भरी हुई (१.६ हरी अंश के लिए डीएनए के µ जी और सफेद अंश के लिए डीएनए के ३.१ µ जी) को ०.८% agarose जेल ट्रो और डीएनए का विश्लेषण निम्नलिखित ethidium ब्रोमाइड धुंधला. हरी अंश कम आणविक वजन डीएनए जबकि सफेद अंश उच्च आणविक वजन डीएनए के दो बैंड का उत्पादन किया, साथ ही कम आणविक वजन डीएनए (चित्रा 1सी) निहित । जेल चित्रा 1सी में प्रस्तुत १०० पर ४० मिनट के लिए चला गया था और 3 लेन में धब्बा पता चलता है कि जेल वोल्टेज स्पष्ट बैंड का उत्पादन कम किया जाना चाहिए । इन आंकड़ों का सुझाव है कि सफेद गोली virions के लिए समृद्ध था । डीएनए (०.६ µ g/एमएल) सफेद नमूने से निकाली एकाग्रता कम था, लेकिन NGS के लिए पर्याप्त है, जो डीएनए के 10 एनजी की एक ंयूनतम की आवश्यकता को आगे बढ़ना है । NGS के लिए एक पुस्तकालय तैयार करने के लिए खंडित DNAs का उपयोग किया गया ।

समानांतर में, आरएनए संक्रमित भंग पौधों (चित्रा 1डी) से उच्च प्रवाह आरएनए-seq के लिए निकाला गया था । एक मानक कार्यप्रवाह पुस्तकालय तैयार करने के लिए किया गया था, NGS, contigs बनाने, और वायरल जीनोम दृश्यों की पहचान (चित्रा 1ई). प्रारंभिक सामग्री के रूप में डीएनए और आरएनए का उपयोग करने से उत्पादन परिणामों की तुलना में थे ।

हम प्राप्त १८८,६२६ कच्चे डीएनए NGS द्वारा पढ़ता है डीएनए का उपयोग कर क्रूड वायरस तैयारी से अलग । पढ़ता १३,२६९ contigs में इकट्ठे हुए थे और BLASTn न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम के NCBI dataset खोज करने के लिए उपयोग किया गया था (का उपयोग कर Viridplantae टैक्सी: ३३०९० और वायरस टैक्सी: १०२३९ सीमित जीवों के रूप में) (चित्रा 1ई). NCBI-BLASTn परिणाम से पता चला कि डी नोवो के ९३% इकट्ठे contigs सेलुलर अनुक्रम थे, 22% अज्ञात थे, और ०.३% वायरस contigs (चित्रा 2ए) थे । सेलुलर अनुक्रम के रूप में वर्गीकृत contigs के बहुमत mitochondrial या chloroplast डीएनए के रूप में पहचाने जाते थे । वायरस contigs के डेटासेट के भीतर, वायरस contigs के ३२% Caulimoviridae के सदस्यों से संबंधित थे (जो Badnavirus अनुक्रम नहीं थे) और इनमें से ५८% Badnavirus से संबंधित थे । वायरस contigs की, 29% अत्यधिक समान थे (e < 1 x 10-30) को CaYMV अलग V17 ORF3 जीन (ef 189148.1), गन्ना bacilliform वायरस अलग Batavia डी, पूरा जीनोम (fj 439817.1), और केले की लकीर सीए वायरस पूरा जीनोम ( KJ013511) । इस आबादी के भीतर, वहां लंबे समय contigs कि दो पूरी लंबाई जीनोम के समान थे ।

उच्च प्रवाह आरएनए-seq उत्पादित १५३,४८८ जरुर व्यक्तिगत अनुक्रम की एक औसत पढ़ें लंबाई के साथ पढ़ता है < ५०० bp. Contig असेंबली कम यह करने के लिए ८,२४३ contigs. ये NCBI को प्रस्तुत किया गया-BLASTn (Viridplantae का उपयोग कर: ३३०९० और टैक्सी: सीमित जीवों के रूप में १०२३९) और outputs के ७६% contigs के एक वर्ग में रखा संयंत्र सेलुलर अनुक्रम, 23% अज्ञात थे, और ०.१% वायरस contigs के रूप में वर्गीकृत किया गया ( चित्रा 2 ख). वायरस contigs की ०.१% जनसंख्या की जनसंख्या के करीब परीक्षा निर्धारित किया गया है कि इनमें से ६८% Caulimoviridae को सौंपा गया (चित्रा 2बी) । इस जनसंख्या के भीतर तीन बड़े contigs को उच्च समानता के साथ पहचाना गया था (e < 1 X 10-30) को CaYMV अलग V17 ORF3 जीन (ef 189148.1), गन्ना bacilliform वायरस अलग Batavia डी, पूरा जीनोम (fj 439817.1) और केले की लकीर सीए वायरस पूरा जीनोम (KJ013511) । तीन contigs की जांच, हम मैंयुअल रूप से इन में से दो में शामिल एक पूर्ण लंबाई वायरस जीनोम का उत्पादन ।

हम वायरस जीनोम लंबाई डीएनए और आरएनए एक आपसी मचान के रूप में अनुक्रमण द्वारा उत्पादित contigs दो पूर्ण लंबाई वायरस जीनोम की उपस्थिति की पुष्टि की तुलना में । ६,९६६ बीपी की एक पूर्ण लंबाई वाले वायरस जीनोम को अंतरिम रूप से भंग येलो क्लोरोटिक एसोसिएटेड वायरस 1 (CaYMAV-1) (चित्रा 3ए) नाम दिया गया था । दूसरा जीनोम ७,३८५ बीपी और CaYMV संक्रमित Alpinia purpurata (CaYMV-Ap01) (चित्रा 3ए) का एक संस्करण था ।

अंत में, पीसीआर प्राइमरों जो एक वायरस के ~ १,००० बीपी टुकड़ा क्लोन करने के लिए डिजाइन किए थे, को अंतर २२७ भंग नौ वाणिज्यिक किस्मों का प्रतिनिधित्व संयंत्रों की आबादी में दोनों जीनोम का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया । कई उदाहरणों में व्यक्तिगत पौधों दोनों वायरस से संक्रमित थे । हम 12 संयंत्रों में CaYMAV-1 और CaYMV-Ap01 के आरटी-पीसीआर का पता लगाने का एक उदाहरण प्रदान करते हैं । इनमें से तीन CaYMV के लिए ही सकारात्मक थे-Ap01 और नौ दोनों वायरस (चित्रा 3बी) के लिए सकारात्मक थे ।

Figure 1
चित्रा 1 : विषाणु न्यूक्लिक अम्ल तैयारी और NGS कार्यप्रवाह. (A) Agarose (१.०%) CaYMV जीनोम के ५६५ बीपी पीसीआर अंशों की जेल ट्रो । सफेद गोली (गलियाँ 1, 2) से तैयार नमूनों में दो पीसीआर उत्पादों का पता लगाया गया था लेकिन हरी गोली का नमूना (लेन 3) में नहीं । सकारात्मक नियंत्रण (+) एक पीसीआर संक्रमित संयंत्र डीएनए है कि एक स्वचालित मानक paramagnetic फाइबर कणों को शामिल विधि का उपयोग अलग था से परिवर्धित उत्पाद का प्रतिनिधित्व करता है । लेन एल डीएनए नमूना गलियों में रैखिक डीएनए बैंड के आकार को मापने के लिए एक मानक के रूप में इस्तेमाल किया सीढ़ी शामिल हैं । (ख) सफेद गोली में संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा देखा वायरस कण का उदाहरण संक्रमित भंग पत्तियों के कच्चे अंश से बरामद किया । (ग) Agarose (०.८%) जेल ट्रो के डीएनए से बरामद हरी (लेन 1) और सफेद (लेन 2) छर्रों है कि एक पैनल में पीसीआर द्वारा सकारात्मक परीक्षण किया 2 लेन के बगल में लाल और पीले डॉट्स दो उच्च आणविक वजन डीएनए बैंड है कि सफेद अंश में होते हैं की पहचान. (घ) Agarose (१%) जेल ट्रो कुल आरएनए के कॉलम आधारित आरएनए शुद्धि द्वारा बरामद. लेन एल डीएनए सीढ़ी नमूना गलियों में रैखिक बैंड के आकार को मापने के लिए एक मानक के रूप में इस्तेमाल किया शामिल हैं । लेन 1-6 आरएनए संक्रमित भंग पत्तियों जो राइबो-घट और आरएनए-seq के लिए एक एकल नमूना के लिए परित थे से पृथक होते हैं । (ङ) न्यूक्लिक अम्ल अलगावों की योजनाबद्ध पाइपलाइन, पुस्तकालय की तैयारी, अनुक्रमण, contig विधानसभा, और वायरस जीनोम खोज. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : क्रोना contigs के वर्गीकरण श्रेणियों visualizing चार्ट । (क) बाईं तरफ चार्ट क्रूड वायरस तैयारी से इकट्ठे contigs की बहुतायत और वर्गीकरण वितरण से पता चलता है । सही चार्ट Caulimoviridae परिवार, Badnavirus जीनस, और तीन बारीकी से संबंधित प्रजातियों के साथ जुड़े वायरस contigs के अनुपात को दर्शाया गया है । (ख) बाईं ओर पैनल आरएनए से व्युत्पंन contigs की बहुतायत से पता चलता है-seq अपने वर्गीकरण वितरण के आधार पर । सही पर Caulimoviridae परिवार, Badnavirus जीनस, और तीन बारीकी से संबंधित प्रजातियों के साथ जुड़े वायरस contigs की आबादी के भीतर contigs की बहुतायत चित्रण ग्राफ है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 . CaYMAV-1 और CaYMV-Ap01 जीनोम के लक्षण वर्णन । (क) भंग येलो क्लोरोटिक एसोसिएट वायरस १ (CaYMAV) और भंग येलो क्लोरोटिक वायरस का Diagrammatic निरूपण Alpinia purpurata (CaYMV-Ap01) से पृथक जीनोम के समान है. न्यूक्लियोटाइड पदों 1-10 जीनोम के शुरू के रूप में पहचान की है और एक tRNAमुलाकात anticodon सबसे badnavirus जीनोम के ठेठ साइट । खुले पढ़ने के फ्रेम के अनुवाद के लिए बंद करो और शुरू पदों (ओआरएफ) 1 और 2 आसंन हैं । इन प्रोटीन अज्ञात कार्य किया है । ORF3 एक polyprotein युक्त जस्ता फिंगर (ZnF), टीज़र (Pro), रिवर्स transcriptase (RT), और RNAse H डोमेन है । एक 3 ' पाली (एक) संकेत अनुक्रम दोनों वायरस जीनोम के लिए संरक्षित है । (ख) RT-पीसीआर विश्लेषण CaYMAV और CaYMV-Ap01 का पता लगाने कि वायरस संक्रमित पत्तियों और प्राइमरों से पृथक आरएनए का उपयोग बाहर किया गया था. 12 संयंत्रों की ही आबादी में, तीन CaYMV-Ap01 से संक्रमित थे, जबकि शेष दोनों CaYMAV और CaYMV-Ap01 से संक्रमित थे । (+) धनात्मक नियंत्रण को इंगित करता है और (-) ऋणात्मक नियंत्रण को इंगित करता है. यह आंकड़ा reproduced/Wijayasekara एट अल से संशोधित है । 24 अनुमति के साथ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

हाल के वर्षों में तरीकों की एक किस्म के लिए प्राकृतिक वातावरण जो वायरस की तरह कण (VLP) या वायरस विशिष्ट आरएनए या डीएनए2,3,४४के लिए समृद्ध शामिल है में संयंत्र वायरस जैव विविधता का अध्ययन करने के लिए नियोजित किया गया है, ४५,४६ . इन विधियों NGS और bioinformatic विश्लेषण के बाद कर रहे हैं । इस अध्ययन का लक्ष्य एक खेती संयंत्र में एक आम बीमारी के कारण एजेंट मिल गया था । बीमारी एक अज्ञात वायरस है कि गैर है bacilliform कणों से घिरा हुआ है, और जिसके लिए केवल एक ५६५ बीपी टुकड़ा४७क्लोन किया गया है के परिणाम होने की सूचना दी थी । यह जानकारी पूर्व शोधकर्ताओं के लिए पर्याप्त था काल्पनिक रूप से परिवार Caulimoviridaeके भीतर जीनस Badnavirus को वायरस आवंटित । जबकि पूर्व रिपोर्टों की परिकल्पना है कि भंग लिली में भंग क्लोरोटिक रोग एक badnavirus का परिणाम था, metagenomics इस अध्ययन में उल्लिखित दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, हम निर्धारित किया है कि बीमारी दो अस्थाई badnavirus प्रजातियों के कारण था24। इस प्रकार, एक metagenome दृष्टिकोण का उपयोग करने के लिए एक रोग के कारण एजेंट की खोज की ताकत यह है कि हम अब स्थितियों जहां एक से अधिक कारण हो सकता है की पहचान कर सकते हैं ।

डीएनए और आरएनए अनुक्रमण डेटा के संयोजन हमारे दृष्टिकोण पूरी तरह से है और यह भी दर्शाता है कि दो तरीकों का उपयोग कर परिणामों अनुरूप परिणाम झुकेंगे और दो संबंधित वायरस की उपस्थिति की पुष्टि की । हम caulimoviruses के अलगाव के लिए एक संशोधित प्रक्रिया कार्यरत है और एक नमूना है कि वायरस जुड़े न्यूक्लिक एसिड के लिए समृद्ध किया गया था और कि वायरस कैप्सिड के भीतर सुरक्षित थे उत्पादित । एक सेवा प्रयोगशाला को डीएनए sequencing बाहर ले जाने के लिए अनुबंधित किया गया था । डी नोवो अनुक्रमण के लिए आवश्यक अवधारणा है कि डीएनए पोलीमरेज़ फ्लोरोसेंट डीएनए संश्लेषण के क्रमिक चक्र के दौरान एक डीएनए में न्यूक्लियोटाइड लेबल में शामिल है । contigs NGS द्वारा पीछा इकट्ठे एक bioinformatic कुछ contigs है कि वायरस contigs के रूप में पहचान की गई उत्पादन कार्यप्रवाह में प्रस्तुत किया गया । इसके अलावा दो वायरस जीनोम की पुष्टि10,24,४८,४९,५० आरएनए के bioinformatic विश्लेषण के माध्यम से प्राप्त किया गया था-seq राइबो-घट आरएनए तैयार करने से प्राप्त डेटा. एक दिलचस्प परिणाम जानने के लिए कि डीएनए और आरएनए अनुक्रमण द्वारा बरामद अनुक्रम की आबादी गैर वायरल और वायरल न्यूक्लिक एसिड के समान वितरण प्रदान की गई थी । डीएनए और आरएनए अनुक्रमण के लिए, अनुक्रम का < ०.५% वायरस मूल के थे । वायरस अनुक्रम 78-82% की आबादी के भीतर परिवार Caulimoviridaeके थे । डीएनए और आरएनए अनुक्रमण से इकट्ठे वायरस contigs की तुलना करके, हम दो इकट्ठे जीनोम दोनों डेटासेट में हुई कि पुष्टि की ।

केवल डीएनए अनुक्रमण का उपयोग करने के लिए नए वायरस जीनोम की पहचान का एक चिंता यह है कि badnavirus जीनोम एक खुला परिपत्र डीएनए है । हम surmised कि दृश्यों जीनोम में अतिव्यापी विच्छेदों contigs से जीनोम विधानसभा के लिए बाधाएं मौजूद हो सकता है । डीएनए अनुक्रमण परिणाम के प्रारंभिक परीक्षा के दो समान वायरस जीनोम से पता चला । हम कल्पना की है कि इन जीनोम या तो एक प्रजाति है कि अध्ययन नहीं किया गया है, या दो प्रजातियों के सह एक ही संयंत्र24संक्रमण का प्रतिनिधित्व आनुवंशिक विविधता का प्रतिनिधित्व । इसलिए, NGS डीएनए और आरएनए sequencing द्वारा प्राप्त डेटासेट के सामूहिक bioinformatic विश्लेषण, दो पूर्ण लंबाई जीनोम की उपस्थिति की पुष्टि सक्षम होना चाहिए ।

वहां एक और रिपोर्ट जो metagenomic अध्ययन के लिए संयंत्र homogenates से VLP और न्यूक्लिक एसिड निकालने के लिए एक वैकल्पिक विधि विकसित की है, प्रक्रियाओं के आधार पर फूलगोभी मोज़ेक वायरस से डीएनए ठीक (CaMV; ए caulimovirus)3। यह दृष्टिकोण गैर खेती पौधों में उपंयास आरएनए और डीएनए वायरस अनुक्रम की पहचान की । इस अध्ययन में प्रयुक्त caulimovirus अलगाव प्रक्रिया से व्युत्पंन कदम खेती पौधों की बीमारी के कारण एजेंट की खोज करने के लिए प्राकृतिक रूप से संक्रमित पौधों से24VLP निकालने के लिए व्युत्पंन कदम के विपरीत हैं । दोनों संशोधित तरीकों की सफलता से पता चलता है कि caulimovirus अलगाव के लिए फ्रेमवर्क प्रक्रिया सामांय में संयंत्र वायरस के metagenomic अध्ययन के लिए एक मूल्यवान प्रारंभिक बिंदु हो सकता है ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

अनुसंधान विज्ञान और प्रौद्योगिकी की उंनति के लिए ओकलाहोमा सेंटर द्वारा वित्त पोषित अनुसंधान कार्यक्रम चरण द्वितीय AR 132-053-2 लागू किया गया; और कृषि विशेषता फसलों अनुसंधान अनुदान कार्यक्रम के ओकलाहोमा विभाग द्वारा । हम Dr. HongJin ह्वांग और OSU Bioinformatics कोर सुविधा है जो NSF (EOS-०१३२५३४) और NIH (2P20RR016478-04, 1P20RR16478-02 और 5P20RR15564-03) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NaH2PO4 Sigma-Aldrich St. Louis MO S5976 Grinding buffer for virus purification
Na2HPO4 Sigma-Aldrich  S0751 Grinding buffer for virus purification
Na2SO3 Thermo-Fisher Waltham, MA 28790 Grinding buffer for virus purification
urea Thermo-Fisher PB169-212 Homogenate extraction 
Triton X-100 Sigma-Aldrich  X-100 Homogenate extraction 
Cheesecloth VWR Radnor, PA 21910-107 Filter homogenate 
Tris  Thermo-Fisher BP152-5 Pellet resuspension& DNA resuspension buffers 
MgCl2 Spectrum, Gardena, CA M1035 Pellet resuspension buffer
EDTA Spectrum E1045 Stops enzyme reactions
Proteinase K Thermo-Fisher 25530 DNA resuspension buffer
phenol:chloroform:isoamylalcohol  Sigma-Aldrich P2069 Dissolve virion proteins
DNAse I Promega M6101 Degrade cellular DNA from extracts
95% ethanol Sigma-Aldrich 6B-100 Virus DNA precipitation
Laboratory blender VWR 58984-030 Grind leaf samples
Floor model ultracentrifuge  &Ti70 rotor Beckman Coulter, Irving TX  A94471 Separation of cellular extracts
Floor model centrifuge and JA-14 rotor Beckman Coulter  369001 Separation of cellular extracts
Magnetic stir plate VWR 75876-022 Mixing urea into samples overnight
Rubber policeman VWR 470104-462 Dissolve virus pellet
 2100 bioanalyzer Instrument Agilent Genomics, Santa Clare, CA G2939BA Sensitive detection of DNA and RNA quality and quantity
2100 Bioanalyzer RNA-Picochip 5067-1513 Microfluidics chip used to move, stain and measure RNA quality in a 2100 Bioanalyzer
2100 Bioanalyzer DNA-High Sensitive chip 5067-4626 Microfluidics chip used to move, stain and measure DNA quality in a 2100 Bioanalyzer
Nanodrop spectrophotometer Thermo-Fisher ND-2000 Analysis of DNA/RNA quality at intermediate steps of procedures
Plant total RNA isolation kit Sigma-Aldrich STRN50-1KT Isolate RNA for RNA-seq
RNase-free water  VWR 10128-514 Resuspension of DNA and RNA for NGS
RNA concentrator spin column Zymo Research, Irvine, CA R1013 Prepare RNA for RNA-seq
rRNA removal kit Illumina, San Diego, CA MRZPL116 Prepare RNA for RNA-seq
DynaMag-2 Magnet ThermoFisher 12321D Prepare RNA for RNA-seq
 RNA  enrichment system Roche 7277300001 Prepare RNA for RNA-seq
Agarose  Thermo-Fisher 16500100 Gel analysis of DNA/RNA quality at intermediate steps of procedures
Ethidium bromide Thermo-Fisher 15585011 Agarose gel staining
pGEM-T +JM109 competent cells Promega, Madison, WI A3610 Clone genome fragments
pFU Taq polymerase Promega M7741 PCR amplify virus genome
dNTPs Promega U1511 PCR amplify virus genome
PCR oligonucleotides IDT, Coralvill, IA Custom order PCR amplify virus genome
Miniprep DNA purification kit Promega A1330 Plasmid DNA purification prior to sequencing
PCR clean-up kit Promega A9281 Prepare PCR products for cloning
pDRAW32 software ACAClone Computer analysis of circular DNA and motifs
MEGA6.0 software MEGA Molecular evolutionary genetics analysis
Primer 3.0 Simgene.com
Quant-iT™ RiboGreen™ RNA Assay Kit Thermo-Fisher R11490 Fluorometric determination of RNA quantity
GS Junior™ pyrosequencing System Roche 5526337001 Sequencing platform
GS Junior Titanium EmPCR Kit (Lib-A) Roche 5996520001 Reagents for emulsion PCR
GS Jr EmPCR Bead Recovery Reagents Roche 5996490001 Reagents for emulsion PCR
GS Junior EmPCR Reagents (Lib-A) Roche 5996538001 Reagents for emulsion PCR
GS Jr EmPCR Oil & Breaking Kit Roche 5996511001 Reagents for emulsion PCR
GS Jr Titanium Sequenicing kit* Roche 5996554001 Includes sequencing reagents, enzymes, buffers, and packing beads
GS Jr. Titanium Picotiter Plate Kit Roche 5996619001 Sequencing plate with associated reagents and gaskets
IKA Turrax mixer 3646000 Special mixer used with Turrax Tubes
IKA Turrax Tube (specialized mixer) 20003213 Specialized mixing tubes with internal rotor for creating emulsions
GS Nebulizers Kit Roche 5160570001 Nucleic acid size fractionator for use during library preparations
GS Junior emPCR Bead Counter Roche 05 996 635 001 Library bead counter
GS Junior Bead Deposition Device Roche 05 996 473 001 Holder for Picotiter plate during centrifugation
Counterweight & Adaptor for the Bead Deposition Devices Roche 05 889 103 001 Used to balance deposition device with picotiter plate centrifugation
GS Junior Software Roche 05 996 643 001 Software suite for controlling the instrument, collecting and analyzing data
GS Junior Sequencer Control v. 3.0 Roche (Included in item 05 996 643 001 above)
GS Run Processor v. 3.0 Roche (Included in item 05 996 643 001 above)
GS De Novo Assembler v. 3.0 Roche (Included in item 05 996 643 001 above)
GS Reference Mapper v. 3.0 Roche (Included in item 05 996 643 001 above)
GS Amplicon Variant Analyzer v. 3.0 Roche (Included in item 05 996 643 001 above)

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Verchot, J., Thapa, A., Wijayasekara, D., Hoyt, P. R. Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes. J. Vis. Exp. (137), e57855, doi:10.3791/57855 (2018).

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