Summary
Her presenterer vi en ny tilnærming for å identifisere plante virus med dobbel-strand DNA genomer. Vi bruker standard metoder å trekke ut DNA og RNA fra infiserte blader og gjennomføre neste generasjons sekvensering. Bioinformatic verktøy montere sekvenser i contigs, identifisere contigs som representerer virus genomer og tilordne genomer taksonomisk grupper.
Abstract
Denne metagenome brukes til å identifisere plante virus med sirkulær DNA genomer og sine transkripsjoner. Ofte anlegget DNA virus som forekommer i lav titers i deres vert eller ikke kan være mekanisk inokulert til en annen host er vanskelig å overføre for å oppnå en større titer av smittestoffer. Infiserte bladene er bakken i en mild buffer med optimal pH og ioniske komposisjon anbefalt for rensing av de fleste bacilliform Para retroviruses. Urea er brukt til å bryte opp inkludering organer som overlappes virions og oppløse cellulære komponenter. Differensial sentrifugering gir ytterligere skille virions fra anlegget forurensninger. Deretter fjerner proteinasen K behandling av capsids. Deretter er viral DNA konsentrert og brukes for neste generasjons sekvensering (NGS). NGS dataene brukes til å sette sammen contigs som sendes til NCBI-BLASTn til å identifisere et delsett av virus sekvenser i genererte datasettet. I en parallell rørledning er RNA isolert fra infiserte blader med en standard kolonne-baserte RNA utvinning metode. Ribosom nedbryting utføres deretter for å berike for en undergruppe av mRNA og virus transkripsjoner. Samlet sekvenser fra RNA sekvensering (RNA-seq) ble sendt til NCBI-BLASTn til å identifisere et delsett av virus sekvenser i dataset. I vår studie identifisert vi to relaterte full lengde badnavirus genomer i to datasett. Denne metoden foretrekkes til en annen felles tilnærming som trekker samlede befolkningen i små RNA sekvenser for å gjeninnføre plante virus genomisk sekvenser. Denne sistnevnte metagenomic rørledning gjenoppretter virus knyttet sekvenser som settes retro-transkribere elementer inn i anlegget genomet. Dette er koplet til biokjemiske eller molekylær analyser ytterligere skjelne aktivt smittestoffer. Fremgangsmåten dokumentert i denne studien gjenoppretter sekvenser representant replikere virus som sannsynligvis indikerer aktiv virusinfeksjon.
Introduction
Nye anlegget sykdommer kjøre forskere til å utvikle nye verktøy for å identifisere de riktige kausale agent (er). Første rapporter om nye eller gjentakende sykdommer er basert på vanlig forekommende symptomer som mosaikk og misdannelser av blad, vene clearing, sekretet, wilting, lesjoner, nekrose, eller andre symptomer. Standarden for rapporten om et nytt virus som kausale agent for en sykdom er å skille den fra andre skadelige patogener, overføres det i passende vert, og reprodusere sykdommen av vaksinere i friske planter av den opprinnelige vert arten. Begrensningen i denne tilnærmingen er at mange arter av plante virus avhenger av en insect eller andre vektorer for overføring til en passende vert eller tilbake til den opprinnelige vert arten. I dette tilfellet Søk etter passende vektoren kan bli forlenget, kan det være problemer å etablere laboratorium kolonier av vektoren og ytterligere innsats er nødvendig for å utarbeide en protokoll for eksperimentell overføring. Hvis betingelsene for vellykket laboratoriestudier overføring ikke kan oppnås, deretter faller arbeidet kort av standarden for rapporten om en ny virus sykdom. For virus som forekommer i deres naturlige vertskapet på svært lav titers, må forskere identifisere alternativ verter for overføringen for å opprettholde tilstrekkelig smittsomme aksjer for gjennomføring av forskning. For virus arter som infiserer bare noen planter kan dette også være et hinder for voksende lager kulturer1.
De siste årene ansette forskere oftere høy gjennomstrømming NGS og metagenomic tilnærminger for å avdekke virus sekvenser som finnes i miljøet som kan eksistere relatert til en kjent sykdom, men kan tilordnes taksonomisk arter og slekter 2 , 3 , 4. slik tilnærminger til oppdagelsen og kategorisering av genetisk materiale på et særskilt miljø å beskrive virus mangfold i naturen eller deres tilstedeværelse i en sikker økosystem, men ikke nødvendigvis bekrefte til et rammeverk for å definere kausale agenter for en tydelig sykdom.
Badnavirus slekten tilhører familien Caulimoviridae til pararetroviruses. Disse virusene er bacilliform i form med sirkulær dobbel strand DNA genomer ca 7 til 9 KB. Alle pararetroviruses replikere gjennom en RNA mellomliggende. Pararetroviruses som episomes og gjenskape uavhengig av anlegget chromosomal DNA5,6. Feltstudier av virus befolkningsgrupper viser at populasjonene viruset er genetisk komplekse. I tillegg informasjon oppnådd gjennom en rekke anlegget genomer av høy gjennomstrømning sekvensering har avdekket mange eksempler på badnavirus genomet fragmenter inn av illegitim integrering hendelser planten genomer. Disse endogene badnavirus sekvensene er ikke nødvendigvis knyttet til infeksjon,7,,8,,9,,10,,11. Deretter Bruk av NGS å identifisere nye badnaviruses som den kausale agenten for sykdom er komplisert ved det subpopulasjon mangfoldet av episomal genomer samt forekomsten av endogene sekvenser12,13.
Mens det er ikke en optimal rørledning for oppdagelsen av romanen pararetrovirus genomer, er det to felles tilnærminger til å identifisere disse virusene som kausale agenter for sykdom. En metode er å berike for små RNA sekvenser fra infiserte blader og deretter montere disse sekvensene å gjeninnføre de virus genome(s)14,15,16,17. En annen tilnærming er bølgende sirkel forsterkning (RCA) å forsterke sirkulær DNA virus genomer18. Suksessen til RCA avhenger av bladet og virus titer i valgte vev. RCA produktene er utsatt for begrensning fordøyelsen og klonet i plasmider for direkte sekvensering19,20,21.
Canna gule mottle virus (CaYMV) er en badnavirus og er beskrevet som den paranoid årsaken til gul mottle sykdom i canna, selv om bare en 565 bp fragment av genomet er tidligere isolert fra infiserte klaser Canna22. En moderne studie identifisert CaYMV i Alpinia purpurata (blomstrende ingefær; CaYMV-Ap)23. Målet med denne studien var å gjenopprette fullstendig badnavirus genomet sekvenser fra infiserte canna liljene. Vi beskriver en protokoll for å rense virus fra anlegget forurensninger, og deretter isolere virus-DNA fra dette preparatet, og forberede et DNA-bibliotek for bruk i NGS. Dette eliminerer behovet for mellomliggende molekylær forsterkning trinnene. Vi også isolere mRNA fra infiserte planter for RNA-seq. NGS, som inkluderer RNA-seq ble gjennomført med hver nukleinsyre forberedelse. Samlet contigs ble funnet å forholde seg til Badnavirus gruppe (biologi) i begge datasett ved hjelp av National Center for bioteknologi og informasjon (NCBI) grunnleggende lokale justering søkeverktøyet for nucleic syrer (BLASTn). Vi identifisert genomer to badnavirus arter24.
Protocol
1. generelle Virus rensing av differensial sentrifugering bruke standardmetoden av Covey et al. 25
- Først, kutt 80-100 g av bladene fra syke planter og grind i en waring blender på 4 ° C med 200 mL sliping buffer (0,5 M NaH2PO4, 0,5 M Na2HPO4 (pH 7.2). og 0,5% (w/v) Na2SO3). Bruk en laboratoriet frakk og hansker for alle trinnene i denne fremgangsmåten.
- Deretter overføre homogenate (300 mL) til en 1.0 liters kanne. Legge til 18 g urea og 25 mL 10% ikke-ionisert vaskemiddel (t-oktober-C6H4-(OCH2lm2)9OH) homogenate i en kjemisk hette.
Merk: For dette trinnet er det best å bruke vernebriller og en enkel puste maske for personlig verneutstyr. - Rør med en magnetisk rørestang kort i panseret og dekke kanne med folie. Deretter overføre folie dekket begeret til et kaldt og rør med en magnetisk rørestang overnatting på 4 ° C.
- Overføre homogenate å sentrifuge rotoren flasker (250 mL beholdere) og sentrifuger i en fast vinkel rotor 4000 x g i 10 min på 4 ° C. I kjemisk avtrekksvifte, gjenopprette nedbryting og filteret gjennom 4 lag av cheesecloth.
- Dele homogenate blant 38,5 mL polypropylen sentrifuge rør og sentrifuge for 2,5 t 40 000 x g på 4 ° C. Vanligvis kontrollere grønne pellets på bunnen av røret og hvite pellets langs lengden av røret. Hell av nedbryting og beholde begge pellets; Sett prøvene på is.
Merk: Den grønne pellet inneholder chloroplasts, stivelse og andre. - Arbeider i en kjemisk hette, bruk en gummi politimann for å skille pellets. Resuspend den hvite pellet i hver rotoren flaske i 1 mL av ddH2O i løpet av 1-2 h samtidig av suspensjon overnatting på 4 ° C at materialet til å fullstendig løse opp løsning. Sentrifuge suspensjon på 6000 x g og 4 ° C i 10 min å fjerne de gjenværende rester.
- Sentrifuge konsentrert suspensjon 136.000 x g for 2t 4 ° c til pellets virions. Resuspend pellets i 1 mL av buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 5 mM MgCl2).
Merk: Et valgfritt trinn er å behandle virions med DNAse jeg (10 µg/mL) for 10 min på 37 ° C å fjerne ikke-encapsidated DNA, dvs. forurensende chloroplast og Mitokondrielt DNA. Deretter deaktivere DNAse jeg ved å legge til EDTA 1 mM. - Avbryte virions med 40 µL av 2 µg/µL proteinasen K på 37 ° C i 15 min.
- Arbeider inne en kjemisk hette å gjenopprette virion DNA av organisk utvinning. Bruk ansiktsskjerm, hansker og en laboratoriet frakk under utvinning for beskyttelse mot potensielle akutte helsevirkninger. Legge 1 volumet av fenol-kloroform-isoamyl alkohol (49:50:1) til prøven og riste for hånd for 20 s. sentrifuge ved romtemperatur for 5 min på 16.000 x g. fjerne øvre vandige fasen og overføre til en ny tube. Gjenta uttrekkingen to eller flere ganger. Kast den organiske fasen ved å plassere den i en glass avfall flaske for riktig institusjonelle kjemiske avhending26.
- Konsentrere DNA ved hjelp av etanol nedbør. Bruke 0,3 M siste konsentrasjon av natrium acetate (pH 5.2) og 2,5 mengder 95% etanol. Plasser eksempler på 20 ° C for 30-60 minutter og sentrifuger 13.000 x g for 10-20 min til pellets DNA26.
- Arbeider på en laboratoriebenk, resuspend DNA pellet i 1 mL av 0,1 mM TE buffer (pH 8.0). Filer suspensjon gjennom en kommersiell gel filtrering kolonne (vanligvis brukt for polymerasekjedereaksjons (PCR) rydde opp) å eliminere salter og lav molekylvekt materiale som kan hemme NGS.
- Analysere prøvene av 1% agarose gel geleelektroforese bruker ethidium bromide flekker for å vise kvaliteten på forberedelsene. Vurdere kvaliteten på DNA ved hjelp av et nanodrop spektrofotometer.
Merk: Forholdet eksempel absorbans ved 260 λ og 280 λ mellom 1,85 og 2.0 vanligvis indikerer at forberedelsene er "ren" av urenheter og er ønsket kvalitet. - Analysere kvaliteten på DNA (bruker 5 pg 10 ng) bruker en chip basert kapillært geleelektroforese instrument.
Merk: Kvalitet viser ren topper, representerer DNA fragmenter distribuert av størrelsen langs en x-akse. Topp høyde angir overflod av fragmentet. Ruvende fjelltopper angir delvis degradert fragmenter eller kjemisk forurensning. Runde kurver representerer en smear av DNA som viser dårlig kvalitet
2. biblioteket forberedelse bruke DNA og krembasert klonal forsterkning (emPCR forsterkning)
Merk: Biblioteket er vanligvis utarbeidet av en NGS anlegg som utfører kundeorientert arbeid.
- Skråstille en løsning av DNA (> 200 ng) bruker en forstøveren som konverterer DNA fragmenter. Ligate kommersielle kortene etter den manuelle instruksjoner27.
- Utføre emPCR forsterkning av DNA-prøve i henhold til produsentens instruksjoner28,29,30. Gjenta wash trinn tre ganger, og etter hver vask, pellets perler i en minicentrifuge for 10 s. kast nedbryting etter hver vask.
Merk: Prosedyren begynner med utarbeidelse av fange perler ved vask i den kommersielle vaskebuffer følger med kit. emPCR er ofte brukt for malen forsterkning for NGS. - Varme denature DNA eller RNA 95 ° c i 2 minutter og 4 ° C til klar til bruk. Bruk 200 - millioner molekyler av DNA/til 5 millioner fange perler i et siste volum på 30 µL. Forbered et uekte utvalg sammen med DNA/RNA prøve og gjennomføre følgende med nukleinsyre prøven samt narr prøven.
- Utføre emulgering ved vortexing tube emulsjon olje for 10 s med maksimal hastighet, og hell hele innholdet (4 mL) i en plast rør rør som er kompatibel med en plattform homogenizer. Sett gripende røret på plattformen for å blande emulsjonen 2000 RPM for 5 min.
- Dispensere 100 µL dele emulsjon i 8-stripen cap rør eller en 96-brønns plate. Cap rør eller forsegle platen og utføre emPCR med produsentens anbefalte programmet28.
Merk: Når PCR er fullført, se brønnene for å se om emulsjonen er intakt og Fortsett. Kaste hele brønnen hvis emulsjonen er ødelagt. - Ha en labfrakk og innarbeide kjemiske hette å samle forsterket DNA perler (ADB). Vakuum sug opp emulsjonen fra brønnene og samle perlene i en 50 mL tube. Skyll brønnene to ganger med 100 µL av isopropanol og Sug opp skylling til samme 50 mL røret.
- Vortex de innsamlede emulsjoner og resuspend ADB med isopropanol til et siste volum på 35 mL. Pellets ADB 930 x g for 5 min. Fjern nedbryting og tilsett 10 mL styrke buffer. Vortex ADB og deretter vask ved å legge isopropanol til 40 mL siste volum sentrifuge og Forkast nedbryting etter hver vask og gjenta vask trinnet to ganger.
- Utfør en siste vask med etanol i stedet for isopropanol. Legge til styrke buffer 35 mL siste volum, vortex og pellets perlene 930 x g for 5 min. fjerne nedbryting men la 2 mL styrke buffer.
- Overføre suspensjon slik microcentrifuge og kort sentrifuge for å pellets ADB. Etter forkaster nedbryting, skyll ADB pellet to ganger med 1 mL styrke bufferen. Virvel og kaste nedbryting etter hver vask.
- For å forberede DNA biblioteket perle berikelse, legge til 1 mL 1 N NaOH perler. Vortex ADB og deretter Inkuber i 2 minutter ved romtemperatur. Virvel og kast nedbryting. Repeter dette vask en gang.
- Legg 1 mL av annealing buffer, deretter vortex ADB og ruge i 2 minutter ved romtemperatur. Kort sentrifuge og kast nedbryting. Gjenta dette trinnet med 100 µL annealing bufferen.
- For å anneal sekvensering primere for DNA, Legg 15 µL av Seq Primer og 15 µL av Seq Primer B i settet. Kort blanding av vortexing og plasser microcentrifuge røret i en varme blokk ved 65 ° C i 5 min. overføring til is i 2 minutter.
- Vask tre ganger med 1.0 mL annealing buffer. Vortex for 5 s og Forkast nedbryting hver gang.
- Før sekvensering, måle antall perler med en kommersiell perle teller. Det bør være minst 500.000 beriket perler.
Merk: Perle telleren er en spesiell enhet som måler perlene i en medfølgende microcentrifuge tube.
3. generelle mRNA isolasjon og dsDNA syntese starter med infisert Canna blader som tester av RT PCR for CaYMV bruker rapportert diagnostiske primere
- Bruk en laboratoriet frakk og latex hansker for personlig beskyttelse i alle etterfølgende trinnene. Arbeider på en laboratoriebenk, samle 12 prøver fra bladene og stupe prøvene i flytende nitrogen. Bruk en perle møllen for homogenisering. Bruk en kommersiell kit som inneholder en standard kolonne-basert metode for totale anlegget RNA isolasjon. Legge til guanidine-isothiocyanate lyseringsbuffer levert av settet til bakken utvalg og riste for 20 s.
- Legg etanol og bland godt, ifølge kit instruksjoner. Legge til hver homogenate en spinn kolonne som binder RNA til membranen. Vask tre ganger og elute RNA i en utvinning tube24.
- Kvantifisere RNA bruker et spektrofotometer for å måle forholdet mellom absorbans ved 260 λ og 280 λ. Bekreft RNA integritet med 1% agarose gel geleelektroforese med ethidium bromide.
Merk: En absorbansen forholdet mellom 1,85 og 2.0 indikerer at forberedelsene er av ønsket kvalitet. Behandle RNA med DNase jeg (10 µg/mL) for 10 min på 37 ° C. Bruke en kommersiell spin for å konsentrere RNA i RNase-gratis vann31. Bassenget RNA prøver før du fortsetter. - Bruk en rRNA fjerning kit for å fjerne anlegget ribosomal RNA. Aliquot magnetiske perler til microcentrifuge rør og vask to ganger vann med RNase uten. Vortex tube aliquot til resuspend, sett røret på en magnetisk stå og vente på væske å fjerne. Forkaste nedbryting og erstatte med magnetiske perle rørets løsningen. Vortex resuspend og legge til 1 µL av RNase hemmer.
Merk: Slik kits bruke oligo-dT bundet til magnetiske perler som hybridize til mRNA. Metoden bruker standard magnet perle separasjonsteknologi gjenopprette transkripsjoner24. - Kombiner 500 ng til 1,25 µg av RNase-fritt vann, og reaksjonen buffere levert av settet. Sett blandingen i 10 min på 50 ° C. Fjern fra varmen og tilsett vasket magnetiske perler i RNAse gratis vann. Vortex kort og sett ved romtemperatur for 5 min.
- Plasser på en magnetisk stå og vente for flytende fjerne. Overføre nedbryting slik frisk microcentrifuge. Angi på is.
- Bruk en løsning-baserte fange metode for anriking av exosomes og 200 ng av å forberede cDNA biblioteket.
Merk: Dobbel tråd cDNA biblioteket er vanligvis utarbeidet av en NGS anlegg som utfører kundeorientert arbeid. - Fragment av RNA bruker en kommersiell RNA fragmentering løsning (0.136 g ZnCl2 og 100 mM Tris-HCl pH 7.0). Legg 2 µL av løsning til 18 µL av RNA (200 ng totalt). Spin rør kort plasserer i microcentrifuge, prøvene på 70 ° C for 30 s og overføring til is. Stoppe reaksjonen bruker 2 µL av 0,5 M EDTA pH 8.0 og 28 µL av 10 mM Tris-HCl pH 7.5.
- Binde RNA til magnetiske perler ved å blande ved romtemperatur for 10 min. Bruk en magnetisk konsentrator å samle perler og forkaste nedbryting. Vask perlene tre ganger med 200 µL av 70% etanol. Forkast hver vask og deretter lufttørke pelleted perler ved romtemperatur for 3 min. Resuspend i 19 µL av 10 mM Tris-HCl pH 7.5.
- Anneal tilfeldig primere for fragmentert RNA ved oppvarming til 70 ° C i 10 min og deretter sett røret på is 2 min. forberede først strand og andre strand cDNA bruker en standard kommersielle cDNA syntese kit.
- Rense dobbel-strand cDNA bruker en magnetisk perle konsentrator. Vask med 800 µL av 70% etanol tre ganger. Forkast hver vask og lufttørke pellets ved romtemperatur for 3 min. Resuspend i 16 µL av 10 mM Tris-HCl pH 7.5. Bruke magnetiske perle presisjonstørking skille perlene fra dobbelttrådet cDNA, som nå er i løsningen. Fjerne cDNA av pipettering i en ny 200 µL PCR tube.
- Utføre fragment slutten reparasjon ved hjelp av Taq utvalg og en blanding av deoxyribonucleotides levert av en kommersiell biblioteket forberedelse kit. Kommersielle pakken inneholder pre utvannet kort legge til hver ende av dobbel-strand cDNA bruke kommersielle ligase ved 25 ° C for 10 min.
4. NGS av DNA biblioteket forberedt fra råolje Virus forberedelse og dsDNA bibliotek forberedt fra mRNA
- Bruke en standard høy gjennomstrømning pyrosequencing instrument og følg alle anbefalte produsentenes protokoller for å generere direkte readouts av DNA-sekvenser. Bruk kommersielle sekvensering reagenser, inkludert fluorescently merket nukleotider.
Merk: For detaljer se produsentens instruksjoner med apparatet. - Gjennomføre etter sekvensering analyse bruker genome montering programvare som automatisk samler leser å produsere det første settet med contigs med en gjennomsnittlig lengde på < 700 bp. bruke FastQC programvaren på iPlant/CyVerse nettsted som utfører kvalitetskontroll sjekker på rå sekvens data32. Velg sekvenser med Phred score ≥ 30 å rekonstruere lengre sekvenser fra mindre sekvens leser24 kartlegging og amplicon programvare.
Merk: For detaljer se produsentens instruksjoner. - Sende disse sammensatte contigs til NCBI-BLASTn analyse med MEGABLAST standard modul samt Viridplantae (TaxID: 33090) og virus (TaxID: 10239) som begrensende organismebiologi navn33. Samle subpopulasjon av contigs som viser høy likhet rapporterte Badnavirus genomer i en rapport.
- Kontroller at sammenføyde stillasene som representerer én eller flere kandidat full lengde virus genomer, riktig produsere i-ramme sekvenser som har samme organisasjon som standard badnavirus genomet. Dette inn kandidat full lengde virus genomet en plasmider tegning programvare. Bekreft de 15 første nukleotider består av en tRNAmøtte (TGGTATCAGAGCGAG) som er svært bevart blant badnaviruses. Finne potensielle polyadenylation signalet mot 3 slutten av genomet. Kommentere komplett genomet for å identifisere to små ORFs og en stor ORF koding en polyprotein. Bruk ExPASy portalen oversetter verktøy for å identifisere badnavirus ORF1, ORF2 og ORF3 oversettelse produkter34.
Merk: Denne vitenskapelige programvaren er gratis og vil generere sirkulær DNA, identifisere alle åpne lesing rammer, og gir en umiddelbar utgang for å kontrollere at sekvensen representerer full lengde sirkulær DNA genomet. - Bruk åpen kildekode flere sekvens sammenligningsverktøy, muskel- og CLUSTALW, for å sammenligne virus genomer fra DNA og RNA analyser35,36.
- Søk i NCBI nukleotid databasen å få full genomet sekvenser av 30 badnavirus arter og eksportere dem som et dokument i .fasta format. Laste opp sekvenser til en programvare som utfører evolusjonære genetisk analyse av sekvenser med virus genomet sekvenser ved NGS. Generere flere sekvens justeringer og maksimal sannsynlighet trær med muskel37.
5. kvalitetsvurdering av De Novo sekvensering av PCR forsterkning av Virus genomer fra infiserte planter
- Angi den nylig identifisert full lengde badnavirus genomet sekvenser (.fasta format) gratis nettbaserte Primer3 verktøy å utlede PCR primere38. Identifisere primer sett som vil produsere forskjøvet produkter av 1000-1500 bp langs hele lengden av virus genome(s). Sende sekvenser til et tjeneste som syntetisere og levere PCR primere.
Merk: Utdataene identifiserer akseptabel primer par med felles og akseptabel smeltingen temperaturer og presis primer steder langs introdusert sekvenser. - Arbeider på en laboratoriebenk og iført en labfrakk og hansker, isolere 5 µg DNA fra virus-infiserte og sunn bladene med en automatisert metode som involverer standard spinn cellulose partikler for å isolere DNA plante materiale39 . Fryse blad materiale (20-40 mg) i flytende nitrogen i et microcentrifuge rør og male med en perle mill. Kombinere prøven med lyseringsbuffer i et microcentrifuge rør og legge RNase A til hvert utvalg. Vortex prøven for 10-20 s og kort spinne prøve å fjerne faste partikler.
Merk: Spinn cellulose partikler har høy DNA-innbindingen behandlingskapasitet og isolere høy avkastning av ren DNA. Metodene standard kommersielle silica kolonnen DNA isolering ut ikke effektivt DNA fra en rekke plantearter. Følgelig finnes dusinvis av metoder som endringer av disse fremgangsmåtene for å forbedre effektiviteten for individuelle plantearter. Automatisert spinn cellulose partikkel metoden ble valgt fordi det gir mer og høyere kvalitet DNA fra mer enn 25 urteaktige største arter40. - Bruke kommersielle reagenskassetter for automatisert spinn DNA isolering. Legge til 300 µL nuclease gratis vann hver kommersielle reagens kassetten og overføre plante lysate til samme patron. Sett kassetten i kassettstativet, Plasser en stempelholderen brønnen nærmest til elueringsrør, og plassere elueringsbufferen i elueringsrør. Laste inn blekkpatronene inn i automatiserte nukleinsyre isolasjon maskin og kjøre anlegget DNA isolasjon protokoll41,42.
- Utføre PCR å utlede et sett av overlappende PCR-produkter. Bruke 5 µM av hver forover og bakover grunning med 35 sykluser av PCR forsterkning. Bruk følgende sykling: rødsprit 95 ° c for 60 s, annealing ved 50 ° C for 45 s og utvidelse ved 72 ° C i 1-2 min med filtypen endelige ved 72 ° C for 7-10 min. Bruk en prepackaged gel filtrering kolonne å eliminere salter og lav molekylvekt materiale som i trinn 1.231.
- Beregne 3:1 molar forholdet PCR produktet til vektor for å bestemme mengden av PCR produktet til ligate til 50 ng av lineær pGEM plasmider43. Bruk en kontroll inn DNA å avgjøre om ligations arbeide effektivt. Utføre ligation over natten ved hjelp av T4 DNA ligase (3 U/µL) på 4 ° C. Så transformering kommersielt forberedt JM109 kompetent Escherichia coli celler. Bruk kontrollere 100 pg av uncut plasmider DNA som en positiv for effektiv transformasjon. Plate 100 µL transformert celler på LB-agar plater med antibiotika og blå/hvit utvalg gjenopprette samskrevet plasmider26. Inkuber plater for 16-24 h på 37 ° C.
Merk: PGEM vektoren har en lacZ genet som koder β-galactosidase. Transformert bakterier dyrket på en plate blir som inneholder 100 µg/mL ampicillin, 0,5 mM IPTG, 80 µg/mL 5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galactopyranosidase (X-gal) blå på grunn av β-galactosidase aktivitet. PGEM plasmider er linearized på en måte som forstyrrer lacZ genet. Kolonier som inneholder PCR produktet skivene forstyrre lacZ genet og metabolismer ikke X-gal. Disse koloniene er hvite. Dermed kan kolonier med insert være differensiert fra de uten insert av fargen på kolonien (hvit versus blå)26. - Isolere DNA fra tre kolonier ved hjelp av en standard kolonne-baserte plasmider isolering kit39. Sekvens tre plasmider transformasjon produkt. Sammenligne hver DNA sekvens med de novo samlet virus genomer produsert av NGS. Bruk CLUSTALW til å justere sekvenser og å sikre at de er riktig sortert.
Representative Results
Denne modifisert virus rensing metoden gitt en berikelse av virus DNAs nyttig for å identifisere to virus arter av NGS og bioinformatikk. Etter homogenate var sentrifugeres 40.000 x g 2,5 h, var det grønne pellets på bunnen av røret og hvite pellets langs. Den grønne pellet var resuspended i en microcentrifuge tube og den hvite pellet ble resuspended i to microcentrifuge rør. PCR ble gjennomført med standard CaYMV PCR diagnostiske primere, og produkter ble oppdaget i det solubilized hvite pellet og ikke den grønne pellet (figur 1A). Et utvalg av råolje preparatet ble undersøkt av overføring elektronmikroskop og vi observerte bacilliform partikler måle 124-133 nm i lengde (figur 1B). Dette er innenfor spådd sperrende lengden på de fleste badnaviruses. DNA ble Hentet fra hvite og grønne pellets og resuspended separat. I figur 1Cvi lastet 5 µL av DNA Hentet fra grønne og hvite pellet utvalg (1.6 µg DNA for den grønne brøken) og 3.1 µg DNA for den hvite brøken til 0,8% agarose gel geleelektroforese og analysert DNA etter ethidium bromide flekker. Grønne brøken inneholdt lav molekylvekt DNA mens hvit brøken produsert to band av høyere molekylvekt DNA, samt den lavere Molekylvekten DNA (figur 1C). Gel presentert i figur 1C ble kjørt for 40 min 100 V og smear i lane 3 antyder at gel spenningen må senkes for å produsere klarere band. Disse data tyder på at den hvite pellet anriket for virions. DNA (0,6 µg/mL) konsentrasjonen utvunnet fra hvite prøven var lav, men tilstrekkelig for NGS, som krever minst 10 ng DNA å fortsette. Fragmentert DNAs ble brukt til å forberede et bibliotek NGS.
Parallelt, ble RNA Hentet fra infiserte canna planter (figur 1D) for høy gjennomstrømming RNA-seq. En standard arbeidsflyt ble gjennomført på biblioteket forberedelser, NGS, opprette contigs og identifisere viral genomet sekvenser (figur 1E). Output resultatene av DNA og RNA som starter materialer ble sammenlignet.
Vi får 188,626 rå DNA leser av NGS DNA isolert fra råolje virus forberedelse. Leser ble samlet til 13,269 contigs og BLASTn ble brukt til å søke NCBI datasettet av nukleotid sekvenser (bruker Viridplantae TaxID: 33090 og Virus TaxID: 10239 som de begrensende organismene) (figur 1E). NCBI-BLASTn resultatene viste at 93% av de novo samlet contigs var mobilnettet sekvenser, 22% var ukjent, og 0,3% var virus contigs (figur 2A). Fleste contigs kategorisert som mobilnettet sekvenser ble identifisert som mitokondrie eller chloroplast DNA. Innen datasettet av virus contigs 32% av virus contigs var knyttet til medlemmer av Caulimoviridae (som ikke var Badnavirus sekvenser) og 58% av disse var knyttet til Badnavirus. Virus contigs, 29% var svært lignende e < 1 x 10-30CaYMV isolere V17 ORF3 genet (EF189148.1), Sugarcane bacilliform virus isolere Batavia D, komplett genomet (FJ439817.1), og banan strek CA virus fullføre genomet ( KJ013511). I denne populasjonen var det lange contigs som lignet to full lengde genomer.
Høy gjennomstrømming RNA-seq produsert 153,488 renset personlige sekvens leser med en gjennomsnittlig lese lengden på < 500 bp. Contig montering redusert dette til 8,243 contigs. Dette ble sendt til NCBI-BLASTn (med Viridplantae TaxID: 33090 og Virus TaxID: 10239 som de begrensende organismene) og utganger plassert 76% av contigs i en kategori av anlegget mobilnettet sekvenser, 23% var ukjent, og 0,1% ble kategorisert som virus contigs ( Figur 2 B). nærmere undersøkelse av befolkningen i befolkningen 0,1% av virus contigs fastslått at 68% av disse var tilordnet Caulimoviridae (figur 2B). Tre store contigs innenfor denne befolkningen ble identifisert med høy likhet (e < 1 X 10-30) til CaYMV isolere V17 ORF3 genet (EF189148.1), Sugarcane bacilliform virus isolere Batavia D, komplett genomet (FJ439817.1) og banan strek CA virus komplett genomet (KJ013511). Undersøke de tre contigs, sammen vi manuelt to av disse til å lage et helaftens virus genomet.
Vi sammenlignet virus genomet lengde contigs produsert av DNA og RNA sekvensering som en gjensidig stillaset å bekrefte tilstedeværelse av to fulle virus genomer. En full lengde virus genomet av 6,966 bp het foreløpig Canna gule mottle assosiert virus 1 (CaYMAV-1) (Figur 3A). Andre genomet var 7,385 bp og en variant av CaYMV infiserer Alpinia purpurata (CaYMV-Ap01) (Figur 3A).
Endelig ble PCR primere som ble laget for å klone ~ 1000 bp fragment av hver virus, brukt til å oppdage ulikt både genomer i en befolkning på 227 canna planter representerer ni kommersielle varianter. I mange tilfeller ble personlige planter infisert med både virus. Vi gir et eksempel på RT PCR deteksjon av CaYMAV-1 og CaYMV-Ap01 på 12 planter. Tre av disse var positive bare for CaYMV-Ap01 og ni var positivt for begge virus (Figur 3B).
Figur 1 : Virus nukleinsyre forberedelser og NGS arbeidsflyten. (A) Agarose (1,0%) gel geleelektroforese av 565 bp PCR fragmenter av CaYMV genomer. To PCR produkter ble oppdaget i prøver forberedt fra den hvite pellet (baner 1, 2), men ikke i grønne pellet prøven (lane 3). Positiv kontroll (+) representerer et PCR produkt forsterket fra infiserte plante-DNA som ble isolert bruker en automatisert metode som involverer standard spinn cellulose partikler. Lane L inneholder DNA stigen brukes som standard for å måle størrelsen på lineær DNA band i eksempel baner. (B) eksempel på viruset partikkel sett av overføring elektronmikroskop i den hvite pellet av råolje fraksjoneres av infiserte canna blader. (C) Agarose (0,8%) gel geleelektroforese av DNA fra grønne (lane 1) og hvite (lane 2) pellets som testet positivt av PCR i panelet A. De røde og gule prikkene ved siden av kjørefelt 2 identifisere to molekylvekt DNA band som oppstår i hvit fraksjonen. (D) Agarose (1%) gel geleelektroforese av totalt av kolonne-baserte RNA rensing. Lane L inneholder DNA stigen brukes som standard for å måle størrelsen på lineær band i eksempel baner. Lane 1-6 inneholder RNA isolert fra infiserte canna blader som var samlet et enkelt utvalg for ribo-uttømming og RNA-seq. (E) skjematisk rør av nukleinsyre isolasjoner, bibliotek forberedelse, sekvensering, contig montering og virus genomet funn. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Krone diagrammer visualisere taksonomisk informasjonskategoriene contigs. (A) diagrammet på venstre viser overflod og taksonomisk distribusjon av contigs samlet fra råolje virus forberedelse. Høyre diagrammet viser andelen virus contigs tilknyttet Caulimoviridae familien, Badnavirus slekten og tre nært beslektede arter. (B) i panelet til venstre viser overflod av contigs fra RNA-seq basert på taksonomisk distribusjonen. Til høyre er grafen viser overflod av contigs i befolkningen i virus contigs tilknyttet Caulimoviridae familien, Badnavirus slekten og tre nært beslektede arter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . Karakterisering av CaYMAV-1 og CaYMV-Ap01 genomer. (A) diagrammatisk representasjon av Canna gule mottle knytte virus 1 (CaYMAV) og Canna gule mottle virus ligner genomet isolert fra Alpinia purpurata (CaYMV-Ap01). Nukleotid posisjoner 1-10 som starten av genomet og inneholder et tRNAmøtte anticodon område typisk for de fleste badnavirus genomer. Stopp og start stillingene for oversettelse av åpent lesing ramme (ORF) 1 og 2 er tilstøtende. Disse proteinene har ukjente funksjoner. ORF3 er en polyprotein inneholder sink finger (ZnF), protease (Pro), revers transkriptase (RT) og RNAse H domener. En 3 poly(A) signal sekvens er bevart for både virus genomer. (B) RT PCR analyse ble gjennomført med RNA isolert fra virusinfiserte blader og primere som oppdager CaYMAV og CaYMV-Ap01. I samme populasjon av 12, var tre infisert med CaYMV-Ap01, mens resten var infisert med både CaYMAV og CaYMV-Ap01. (+) angir positive kontroll og (-) angir negativ kontroll. Dette tallet er gjengitt/endret fra Wijayasekara et al. 24 med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
De siste årene har en rekke metoder arbeidet å studere plante virus biologisk mangfold i naturskjønne omgivelser inkluderer berikende for virus-lignende partikler (VLP) eller virus bestemt RNA eller DNA2,3,44, 45,46 . Disse metodene er etterfulgt av NGS og bioinformatic. Målet med denne studien var å finne den kausale agenten for en vanlig sykdom i en dyrket plante. Sykdommen ble rapportert å være et resultat av et ukjent virus som har ikke-innhyllet bacilliform partikler, og som bare en 565 bp fragment er klonet47. Denne informasjonen var tilstrekkelig for tidligere forskere hypotetisk tilordne viruset til slekten Badnavirus i familien Caulimoviridae. Mens tidligere rapporter hypotesen at canna mottle sykdom i canna liljene var resultatet av en enkelt badnavirus, ved hjelp av metagenomics tilnærming i denne studien vi funnet ut at sykdommen skyldes to foreløpig badnavirus arter24. Dermed styrke med en metagenome tilnærming til å oppdage den kausale agenten for en sykdom er at vi nå kan identifisere situasjoner der det kan være mer enn én anledning.
Vår tilnærming kombinere DNA og RNA sekvensering data er grundig og demonstrerer også at resultatene med to tilnærminger gitt konsekvent resultater og bekreftet tilstedeværelse av to i slekt viruser. Vi ansatt en endret fremgangsmåte for isolering av caulimoviruses laget en prøve som anriket for virus forbundet nucleic syrer og som ble beskyttet i virus kapsid. En tjenesten laboratory ble leid inn til å utføre DNA sekvensering. De novo sekvensering grunnleggende konseptet er at DNA polymerase inkorporerer fluorescerende merket nukleotider i en DNA mal strand under sekvensiell sykluser av DNA-syntese. Contigs samlet etterfulgt av NGS ble sendt til en bioinformatic arbeidsflyt produsere noen contigs som ble identifisert som virus contigs. Ytterligere bekreftelse av to virus genomer10,24,48,49,50 ble oppnådd gjennom bioinformatic analyse av RNA-seq data fra ribo-utarmet RNA forberedelser. En interessant resultatet var å lære at bestander av sekvenser utvinnes av DNA og RNA sekvensering gitt lignende distribusjoner av ikke-viral og viral nukleinsyrer. DNA og RNA sekvensering var < 0,5% av sekvenser av virus opprinnelse. I befolkningen av viruset sekvenser 78-82% tilhørte familien Caulimoviridae. Ved å sammenligne den sammensatte virus contigs fra DNA og RNA sekvensering, bekreftet vi at to sammensatte genomer skjedde i begge datasett.
En bekymring for å bruke bare DNA sekvensering for å identifisere nye virus genomer er at badnavirus genomet er en åpen sirkulær DNA. Vi mente at sekvenser overlappende avbrudd i genomet kunne presentere hindringer for genomet samlingen fra contigs. Innledende undersøkelser av DNA sekvensering resultatene viste to lignende virus genomer. Vi hypotesen at disse genomer enten representert genetisk mangfold av en art som ikke har blitt studert eller representert to arter co infisere samme plante24. Derfor aktivert kollektive bioinformatic analyse av datasett ved NGS DNA og RNA sekvensering, bekreftelse av tilstedeværelsen av to full lengde genomer.
Det er en annen rapport som utviklet en alternativ metode for å trekke ut VLP og nukleinsyrer fra anlegget homogenates for metagenomic studier, basert på prosedyrer for å gjenopprette DNA fra blomkål mosaikk virus (CaMV, en caulimovirus)3. Denne tilnærmingen identifisert romanen RNA og DNA virus sekvenser i ikke-dyrket planter. Trinnene avledet fra caulimovirus isolasjon fremgangsmåte som er brukt i denne studien for å oppdage den kausale agenten for en sykdom i landbruket er i motsetning til trinnene avledet for uttrekking VLP fra naturlig infiserte planter24. Suksessen til begge endret metodene antyder at rammeverket prosedyren for caulimovirus isolasjon kan være et verdifullt utgangspunkt for metagenomic studier av plante virus generelt.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forskningen ble finansiert av Oklahoma Center for fremme av vitenskap og teknologi brukt Research Program fase II AR 132-053-2; og av Oklahoma Department of Agriculture spesialitet avlinger forskning Grant Program. Vi takker Dr. HongJin Hwang og OSU bioinformatikk Core anlegget som ble støttet av tilskudd fra NSF (EOS-0132534) og NIH (2P20RR016478-04, 1P20RR16478-02 og 5P20RR15564-03).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich St. Louis MO | S5976 | Grinding buffer for virus purification |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S0751 | Grinding buffer for virus purification |
| Na2SO3 | Thermo-Fisher Waltham, MA | 28790 | Grinding buffer for virus purification |
| urea | Thermo-Fisher | PB169-212 | Homogenate extraction |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X-100 | Homogenate extraction |
| Cheesecloth | VWR Radnor, PA | 21910-107 | Filter homogenate |
| Tris | Thermo-Fisher | BP152-5 | Pellet resuspension& DNA resuspension buffers |
| MgCl2 | Spectrum, Gardena, CA | M1035 | Pellet resuspension buffer |
| EDTA | Spectrum | E1045 | Stops enzyme reactions |
| Proteinase K | Thermo-Fisher | 25530 | DNA resuspension buffer |
| phenol:chloroform:isoamylalcohol | Sigma-Aldrich | P2069 | Dissolve virion proteins |
| DNAse I | Promega | M6101 | Degrade cellular DNA from extracts |
| 95% ethanol | Sigma-Aldrich | 6B-100 | Virus DNA precipitation |
| Laboratory blender | VWR | 58984-030 | Grind leaf samples |
| Floor model ultracentrifuge &Ti70 rotor | Beckman Coulter, Irving TX | A94471 | Separation of cellular extracts |
| Floor model centrifuge and JA-14 rotor | Beckman Coulter | 369001 | Separation of cellular extracts |
| Magnetic stir plate | VWR | 75876-022 | Mixing urea into samples overnight |
| Rubber policeman | VWR | 470104-462 | Dissolve virus pellet |
| 2100 bioanalyzer Instrument | Agilent Genomics, Santa Clare, CA | G2939BA | Sensitive detection of DNA and RNA quality and quantity |
| 2100 Bioanalyzer RNA-Picochip | 5067-1513 | Microfluidics chip used to move, stain and measure RNA quality in a 2100 Bioanalyzer | |
| 2100 Bioanalyzer DNA-High Sensitive chip | 5067-4626 | Microfluidics chip used to move, stain and measure DNA quality in a 2100 Bioanalyzer | |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo-Fisher | ND-2000 | Analysis of DNA/RNA quality at intermediate steps of procedures |
| Plant total RNA isolation kit | Sigma-Aldrich | STRN50-1KT | Isolate RNA for RNA-seq |
| RNase-free water | VWR | 10128-514 | Resuspension of DNA and RNA for NGS |
| RNA concentrator spin column | Zymo Research, Irvine, CA | R1013 | Prepare RNA for RNA-seq |
| rRNA removal kit | Illumina, San Diego, CA | MRZPL116 | Prepare RNA for RNA-seq |
| DynaMag-2 Magnet | ThermoFisher | 12321D | Prepare RNA for RNA-seq |
| RNA enrichment system | Roche | 7277300001 | Prepare RNA for RNA-seq |
| Agarose | Thermo-Fisher | 16500100 | Gel analysis of DNA/RNA quality at intermediate steps of procedures |
| Ethidium bromide | Thermo-Fisher | 15585011 | Agarose gel staining |
| pGEM-T +JM109 competent cells | Promega, Madison, WI | A3610 | Clone genome fragments |
| pFU Taq polymerase | Promega | M7741 | PCR amplify virus genome |
| dNTPs | Promega | U1511 | PCR amplify virus genome |
| PCR oligonucleotides | IDT, Coralvill, IA | Custom order | PCR amplify virus genome |
| Miniprep DNA purification kit | Promega | A1330 | Plasmid DNA purification prior to sequencing |
| PCR clean-up kit | Promega | A9281 | Prepare PCR products for cloning |
| pDRAW32 software | ACAClone | Computer analysis of circular DNA and motifs | |
| MEGA6.0 software | MEGA | Molecular evolutionary genetics analysis | |
| Primer 3.0 | Simgene.com | ||
| Quant-iT™ RiboGreen™ RNA Assay Kit | Thermo-Fisher | R11490 | Fluorometric determination of RNA quantity |
| GS Junior™ pyrosequencing System | Roche | 5526337001 | Sequencing platform |
| GS Junior Titanium EmPCR Kit (Lib-A) | Roche | 5996520001 | Reagents for emulsion PCR |
| GS Jr EmPCR Bead Recovery Reagents | Roche | 5996490001 | Reagents for emulsion PCR |
| GS Junior EmPCR Reagents (Lib-A) | Roche | 5996538001 | Reagents for emulsion PCR |
| GS Jr EmPCR Oil & Breaking Kit | Roche | 5996511001 | Reagents for emulsion PCR |
| GS Jr Titanium Sequenicing kit* | Roche | 5996554001 | Includes sequencing reagents, enzymes, buffers, and packing beads |
| GS Jr. Titanium Picotiter Plate Kit | Roche | 5996619001 | Sequencing plate with associated reagents and gaskets |
| IKA Turrax mixer | 3646000 | Special mixer used with Turrax Tubes | |
| IKA Turrax Tube (specialized mixer) | 20003213 | Specialized mixing tubes with internal rotor for creating emulsions | |
| GS Nebulizers Kit | Roche | 5160570001 | Nucleic acid size fractionator for use during library preparations |
| GS Junior emPCR Bead Counter | Roche | 05 996 635 001 | Library bead counter |
| GS Junior Bead Deposition Device | Roche | 05 996 473 001 | Holder for Picotiter plate during centrifugation |
| Counterweight & Adaptor for the Bead Deposition Devices | Roche | 05 889 103 001 | Used to balance deposition device with picotiter plate centrifugation |
| GS Junior Software | Roche | 05 996 643 001 | Software suite for controlling the instrument, collecting and analyzing data |
| GS Junior Sequencer Control v. 3.0 | Roche | (Included in item 05 996 643 001 above) | |
| GS Run Processor v. 3.0 | Roche | (Included in item 05 996 643 001 above) | |
| GS De Novo Assembler v. 3.0 | Roche | (Included in item 05 996 643 001 above) | |
| GS Reference Mapper v. 3.0 | Roche | (Included in item 05 996 643 001 above) | |
| GS Amplicon Variant Analyzer v. 3.0 | Roche | (Included in item 05 996 643 001 above) |
References
- Dijkstra, J., Jager, C. P. Practical Plant Virology : Protocols and Exercises. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. 1 edn (1998).
- Roossinck, M. J. Plant virus metagenomics: biodiversity and ecology. Annu Rev Genet. 46, 359-369 (2012).
- Melcher, U., et al. Evidence for novel viruses by analysis of nucleic acids in virus-like particle fractions from Ambrosia psilostachya. J Virol Methods. 152 (1-2), 49-55 (2008).
- Stobbe, A. H., Schneider, W. L., Hoyt, P. R., Melcher, U. Screening metagenomic data for viruses using the e-probe diagnostic nucleic Acid assay. Phytopathology. 104 (10), 1125-1129 (2014).
- Borah, B. K., et al. Bacilliform DNA-containing plant viruses in the tropics: commonalities within a genetically diverse group. Mol Plant Pathol. 14 (8), 759-771 (2013).
- Bousalem, M., Douzery, E. J., Seal, S. E. Taxonomy, molecular phylogeny and evolution of plant reverse transcribing viruses (family Caulimoviridae) inferred from full-length genome and reverse transcriptase sequences. Arch Virol. 153 (6), 1085-1102 (2008).
- Geering, A. D., et al. Banana contains a diverse array of endogenous badnaviruses. J Gen Virol. 86, Pt 2 511-520 (2005).
- Kunii, M., et al. Reconstruction of putative DNA virus from endogenous rice tungro bacilliform virus-like sequences in the rice genome: implications for integration and evolution. BMC Genomics. 5, 80 (2004).
- Laney, A. G., Hassan, M., Tzanetakis, I. E. An integrated badnavirus is prevalent in Figure germplasm. Phytopathology. 102 (12), 1182-1189 (2012).
- Gambley, C. F., Geering, A. D., Steele, V., Thomas, J. E. Identification of viral and non-viral reverse transcribing elements in pineapple (Ananas comosus), including members of two new badnavirus species. Arch Virol. 153 (8), 1599-1604 (2008).
- Gayral, P., et al. A single Banana streak virus integration event in the banana genome as the origin of infectious endogenous pararetrovirus. J Virol. 82 (13), 6697-6710 (2008).
- Lyttle, D. J., Orlovich, D. A., Guy, P. L. Detection and analysis of endogenous badnaviruses in the New Zealand flora. AoB Plants. 2011, 008 (2011).
- Le Provost, G., Iskra-Caruana, M. L., Acina, I., Teycheney, P. Y. Improved detection of episomal Banana streak viruses by multiplex immunocapture PCR. J Virol Methods. 137 (1), 7-13 (2006).
- Singh, K., Talla, A., Qiu, W. Small RNA profiling of virus-infected grapevines: evidences for virus infection-associated and variety-specific miRNAs. Funct Integr Genomics. 12 (4), 659-669 (2012).
- Alfson, K. J., Beadles, M. W., Griffiths, A. A new approach to determining whole viral genomic sequences including termini using a single deep sequencing run. J Virol Methods. 208, 1-5 (2014).
- Kreuze, J. F., et al. Complete viral genome sequence and discovery of novel viruses by deep sequencing of small RNAs: a generic method for diagnosis, discovery and sequencing of viruses. Virology. 388 (1), 1-7 (2009).
- Zheng, Y., et al. VirusDetect: An automated pipeline for efficient virus discovery using deep sequencing of small RNAs. Virology. 500, 130-138 (2017).
- James, A. P., Geijskes, R. J., Dale, J. L., Harding, R. M. Molecular characterisation of six badnavirus species associated with leaf streak disease of banana in East Africa. Annals of Applied Biology. 158 (3), 346-353 (2011).
- Baranwal, V. K., Sharma, S. K., Khurana, D., Verma, R. Sequence analysis of shorter than genome length episomal Banana streak OL virus like sequences isolated from banana in India. Virus Genes. 48 (1), 120-127 (2014).
- Sukal, A., Kidanemariam, D., Dale, J., James, A., Harding, R. Characterization of badnaviruses infecting Dioscorea spp. in the Pacific reveals two putative novel species and the first report of dioscorea bacilliform RT virus 2. Virus Res. 238, 29-34 (2017).
- BÖmer, M., Turaki, A. A., Silva, G., Kumar, P. L., Seal, S. E. A sequence-independent strategy for amplification and characterisation of episomal badnavirus sequences reveals three previously uncharacterised yam badnaviruses. Viruses. 8 (7), (2016).
- Momol, M. T., Lockhart, B. E. L., Dankers, H., Adkins, S. Canna yellow mottle virus detected in Canna in Florida. Plant Health Progress. , August 2-4 (2004).
- Zhang, J., et al. Characterization of Canna yellow mottle virus in a new host, Alpinia purpurata, in Hawaii. Phytopathology. 107 (6), 791-799 (2017).
- Wijayasekara, D., et al. Molecular characterization of two badnavirus genomes associated with Canna yellow mottle disease. Virus Res. 243, 19-24 (2018).
- Covey, S. N., Noad, R. J., al-Kaff, N. S., Turner, D. S. Caulimovirus isolation and DNA extraction. Methods Mol Biol. 81, 53-63 (1998).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd edn. , Cold Spring Harbor Press. (1989).
- Radford, A. D., et al. Application of next-generation sequencing technologies in virology. J Gen Virol. 93, Pt 9 1853-1868 (2012).
- Kanagal-Shamanna, R. Emulsion PCR: Techniques and Applications. Methods Mol Biol. 1392, 33-42 (2016).
- Getts, D. R., et al. Targeted blockade in lethal West Nile virus encephalitis indicates a crucial role for very late antigen (VLA)-4-dependent recruitment of nitric oxide-producing macrophages. J Neuroinflammation. 9, 246 (2012).
- van Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. Library preparation methods for next-generation sequencing: tone down the bias. Exp Cell Res. 322 (1), 12-20 (2014).
- Gel filtration principles and methods. GE Healthcare. , (2010).
- Goff, S., et al. The iPlant Collaborative: Cyberinfrastructure for Plant Biology. Frontiers in Plant Science. 2, (2011).
- Lin, Z., et al. Next-generation sequencing and bioinformatic approaches to detect and analyze influenza virus in ferrets. J Infect Dev Ctries. 8 (4), 498-509 (2014).
- Artimo, P., et al. ExPASy: SIB bioinformatics resource portal. Nucleic Acids Res. 40, Web Server issue 597-603 (2012).
- Edgar, R. C. MUSCLE: a multiple sequence alignment method with reduced time and space complexity. BMC Bioinformatics. 5, 113 (2004).
- Hung, J. H., Weng, Z. Sequence Alignment and Homology Search with BLAST and ClustalW. Cold Spring Harb Protoc. 2016 (11), (2016).
- Sohpal, V. K., Dey, A., Singh, A. MEGA biocentric software for sequence and phylogenetic analysis: a review. Int J Bioinform Res Appl. 6 (3), 230-240 (2010).
- Untergasser, A., et al.
- Dhaliwa, A. DNA extraction and purification. Mater Methods. 3, 191 (2013).
- Moeller, J. R., Moehn, N. R., Waller, D. M., Givnish, T. J. Paramagnetic cellulose DNA isolation improves DNA yield and quality among diverse plant taxa. Appl. Plant Sci. 2 (10), (2014).
- Moeller, J. R., et al. Paramagnetic cellulose DNA isolation improves DNA yield and quality among diverse plant taxa. Appl. Plant Sci. 2 (10), (2014).
- Grooms, K. Review: Improved DNA Yield and Quality from Diverse Plant Taxa. , (2015).
- Nishimori, A., et al. In vitro and in vivo antivirus activity of an anti-programmed death-ligand 1 (PD-L1) rat-bovine chimeric antibody against bovine leukemia virus infection. PLoS One. 12 (4), 0174916 (2017).
- Rojas, M. R., Gilbertson, R. L. Plant Virus Evolution. Roossinck, M. J. 1, Springer-Verlag. 27-51 (2008).
- Roossinck, M. J. The big unknown: plant virus biodiversity. Curr Opin Virol. 1 (1), 63-67 (2011).
- Roossinck, M. J., Martin, D. P., Roumagnac, P. Plant Virus Metagenomics: Advances in Virus Discovery. Phytopathology. 105 (6), 716-727 (2015).
- Momol, M. T., Lockhart, B. E. L., Dankers, H., Adkins, S. Plant Health Progress. , Online (2004).
- Eni, A., Hughes, J. D., Asiedu, R., Rey, M. Sequence diversity among badnavirus isolates infecting yam (Dioscorea spp.). Archives of Virology. 153 (12), Ghana, Togo, Benin and Nigeria. 2263-2272 (2008).
- Harper, G., et al. The diversity of Banana streak virus isolates in Uganda. Arch Virol. 150 (12), 2407-2420 (2005).
- Muller, E., Sackey, S. Molecular variability analysis of five new complete cacao swollen shoot virus genomic sequences. Arch Virol. 150 (1), 53-66 (2005).
