Biochemistry

ניתוח של N- glycans של צנון sativus הזנים באמצעות PNGase H⁺

Published: June 25, 2018 doi: 10.3791/57979

Ya-Min Du¹, Shen-Li Zheng¹, Li Liu¹, Josef Voglmeir¹, Gabriel Yedid²

¹Glycomics and Glycan Bioengineering Research Center (GGBRC), College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, ²College of Life Science, Nanjing Agricultural University

Summary

אנו מתארים שיטה פשוטה ומהירה הכנה וניתוח של N- glycans מן הזנים השונים של צנון (צנון sativus).

Abstract

בשנים האחרונות moieties פחמימות של צמחים קיבלו תשומת לב רבה, כפי שהם מקור פוטנציאלי של תגובות חיסוניות cross-reactive, מעורר אלרגיה. בנוסף, פחמימות מבנים גם לשחק תפקיד קריטי בחילוף החומרים הצמח. כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה ומהירה להכנה של ניתוח N- glycans מן הזנים השונים של צנון (צנון sativus) שימוש ספציפיים - glycanase Nלשחרור של פחמימות הצמחי מבנים. כדי להשיג זאת, פוחת משקעים חומצת חומץ טריכלור גולמי של צנון homogenates היו מטופלים עם PNGase H⁺, הנקרא באמצעות 2-aminobenzamide כמו תגית פלורסנט. הדגימות - glycan Nשכותרתו לאחר מכן נותחו על ידי ביצועים אולטרה לייזר בסיוע מטריקס desorption יינון-שעת הטיסה (MALDI-TOF) ספקטרומטר מסה מבני נתונים היסטוריים והגליונות כרומטוגרפיה נוזלית (UPLC) הערכה כדי לכמת abundancies היחסית של המבנים נגזר צנון - glycan N. פרוטוקול זה יכול לשמש גם לניתוח של N- glycans ממינים צמח שונים אחרים, עשוי להיות שימושי עבור חקירה נוספת של הפונקציה ואפקטים של N- glycans על בריאות האדם.

Introduction

N- glycans בצמחים יש משכו תשומת לב מוגברת בשנים האחרונות, כמו מחקרים קודמים הדגישה N- glycans כמקור פוטנציאלי אימונולוגי cross-reactions זה עלול לעורר תגובות אלרגיות¹^,². זה כבר הוכיחה בעבר כי N- glycans על הצמח glycoproteins יכול להשפיע על פעילות קטליטית³^,⁴, thermostability,⁵^,מתקפל⁶ או לוקליזציה subcellular ו הפרשת⁷. על מנת לתאם את המבנים glycan עם הפונקציות המתאימות שלהם, N- glycans חייב קודם להשתחרר מן glycoproteins כימית או enzymatically. שיטת כימי קלאסית עבור שחרור N- והן O- glycans היא β-חיסול, שבו מדגם אלקליין הטיפול מלווה הפחתה borohydride להניב alditol⁸. עם זאת, הליך זה מונע תיוג עם fluorophore וגורמת דעיכה משמעותית של יחידות חד-סוכר מהקצה תוך צמצום של המבנה glycan. Deglycosylation הכימי מבוסס על טיפול אמוניה מימית/פחמתי הוא גם נפוץ בשיטה חלופית⁹. אף אחת מהשיטות האלה שחרור כימי השתנה חלבונים שלמים, מה שמאפשר ניתוח spectrometric המוני של glycan ללא תווית בריכות ללא ההפרעה של פפטיד שברי בטווח מסה זהה. אולם, חסרון אחד השיטות האלה הוא קצב מוגבר השפלה α1, 3-fucosylated N- glycans, מבנה פחמימות משותף נמצאו צמחים¹⁰. לחלופין, שיטות פרסום אנזימטי באמצעות פפטיד:N- glycanases (PNGases, EC 3.5.1.52) חלים גם נרחב. F PNGase רקומביננטי (מתוך Flavobacterium meningosepticum) הבחירה הנפוצה ביותר, מאפשרת השחרור של כל סוגי N- glycans, למעט המבנים הנושאת של הליבה α1,¹¹^,3 fucose¹². לכן, A PNGase (מבודד מזרעים שקדים) משמש בדרך כלל לניתוח של הצמח N- glycans¹³. עם זאת, deglycosylates אנזים זה רק proteolytically, נגזר glycopeptides, ואין אפשרות deglycosylate מקורי glycoproteins¹⁴. לפיכך, בדיקה רב שלבי מדגם נדרש לפני ניתוח נוסף, אשר גורם לאובדן נרחב של glycans, במיוחד אלה של שפע נמוכה¹⁵. המטרה הכוללת של השיטה היא להציג זרימת עבודה ממוטב עבור שחרור - glycan Nוזריחה תיוג באופן פשוט וחזק. הרציונל הבסיסי הוא כי PNGase H⁺, אשר נתגלה לאחרונה ב- Terriglobus ורודה , יכול להתבטא recombinantly ב e. coli, יכול hydrolyze N- glycans ישירות מתוך לגרדום חלבון בחומצי התנאים¹⁶. יתרון מפתח של שימוש PNGase H⁺על שיטות אלטרנטיביות היא כי תגובות תיוג פלורסנט יכולה להתבצע בצינור התגובה אותו מבלי לשנות את התגובה מאגרי¹⁷^,¹⁸. הכנה פשוטה תנאים ושחזור גבוה של oligosaccharides נמוך-שפע להפוך שיטה זו כלי רב ערך הניתוח של N- glycans. פרוטוקול זה מתאים לניתוח של N- glycans ממינים שונים של הצמח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. דוגמה אוסף

לרכוש את הזנים השונים של צנון טרי (צנון sativus ל').

2. בידוד של חלבון של צנון

Homogenize כ- 100 גרם של צנון טרי עם בלנדר מטבח למשך 10 דקות.
להעביר את slurry 50 מ ל צנטריפוגה ובשעות צנטריפוגה-× 14,000 g ב- 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות להסיר את החומר לא מסיסים.
להעביר את תגובת שיקוע בזהירות לתוך שפופרת צנטרפוגה 50 מ ל חדש ולהוסיף אמצעי שווה של 2 מ' חומצת חומץ טריכלור (TCA) פתרון.
הערה: הוספת TCA לזרז חלבונים מסיסים (glyco).
צנטריפוגה-× 14,000 g ב- 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ולהסיר את תגובת שיקוע החלבונים מגורען (glyco).
לשטוף את גלולה עם 20 מ של מים יונים, צנטריפוגה ב × 14,000 g ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות להסיר oligosaccharides מסיסים, סוכרים.
חזור על שלב 2.5. ארבע פעמים.
מחדש להשעות את כדורי ב 1 מ"ל של מים יונים, העברת שפופרת צנטרפוגה mL 1.5 טריים.

3. הכנת N- Glycans

µL 50 תערובת של חלבון פתרון משלב 2.7. (שווה ל- 5 גר' צנון טרי) עם מו 0.2 של recombinant H PNGase⁺, חומצה אצטית 10 מ מ.
דגירה תערובת התגובה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 12 שעות. לאחר הדגירה, צנטריפוגה-× 14,000 g עבור 5 דקות כדי להסיר את תוספת חלבון ואת האנזים.
להעביר את תגובת שיקוע שפופרת צנטרפוגה mL 1.5 טריים.

4. טיהור של N- Glycans

להכין את העמודה מיצוי מוצק-פאזי (SPE) להעשיר את N- glycans ולהסיר מלחי וזוהמה אחרים מן התערובת התגובה, להגדיל את מידת הבררנות של fluorogenic 2-aminobenzamide (2-AB) תיוג סוכן של N- glycan derivatization.
1. להוסיף 3 מ ל מים יונים לשטוף את העמודה.
2. להוסיף 3 מ"ל של 80% acetonitrile פתרון המכיל חומצה trifluoroacetic (TFA, 0.1% v/v) לפעיל SPE-העמודה.
3. להוסיף 3 מ"ל של מים יונים equilibrate SPE-העמודה.
להעביר את הדגימה מהשלב 3.3 אל העמודה וזורקים את הזרימה דרך.
להוסיף 1.5 מיליליטר מים יונים כדי לשטוף את העמודה ולמחוק את הזרימה דרך.
Elute N- glycans המשוחררים מן העמודה באמצעות 1.5 מ ל תמיסה מימית 20% acetonitrile, המכיל 0.1% TFA (v/v) לתוך שפופרת צנטרפוגה 2 מ"ל.
הסר הממס על ידי אידוי צנטריפוגלי בטמפרטורת החדר. להתנדף עד המדגם יהיה יבש לחלוטין.

5. קרינה פלואורסצנטית Derivatization של N- Glycans

להכין 1 מ"ל של פתרון 2-AB, בהיקף של 35 מ מ 2-AB ו- 0.1 M נתרן cyanoborohydride דימתיל סולפוקסיד/אצטית תמיסת חומצה (7:3, וי/v).
להוסיף 5 µL 2-AB לפתרון הדגימות מיובשים (שלב 4.5.) נגזר 6 צנוניות שונים. מערבולת כל דגימה עד לחלוטין התפרקה.
דגירה התערובת עבור 2 h ב- 65 מעלות צלזיוס.
ומצננים את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות, ולהוסיף 5 µL של מים יונים 40 µL של acetonitrile. Centrifuge הצינורות ב g x 14,000 למשך 3 דקות.
להעביר 48 µL מ תגובת שיקוע לתוך בקבוקון HPLC 300 µL שחזור גבוהה. אחסן את הדגימות - glycan Nderivatized ב-20 ° C עד לחודש אחד.

6. HILIC-UPLC בניית פרופיל של N- glycans

לנתח את הדגימות באמצעות מערכת UPLC רגיל מחובר של detectorset זריחה מקוון באורכי עירור/פליטה של 330 nm/420 nm, בהתאמה.
השתמש כרומטוגרפיה נוזלית של אינטראקציה הידרופובי (HILIC)-UPLC עמודה glycan בטמפרטורה עמודה של 60 מעלות צלזיוס לניתוח.
להכין ממס A על ידי דילול 50 מ של מניות פתרון (1 מ' אמוניום formate פתרון, pH 4.5) עם 950 מ"ל של כרומטוגרפיה נוזלית מסות (LCMS)-כיתה מים. הכן את הפתרון המניות כדלקמן:
1. 43 מ ל חומצה פורמית להוסיף 700 מ"ל של איכות המזון-כיתה ח₂O.
2. להתאים את ה-pH ל 4.5 תוספת dropwise של פתרון אמוניה מימית (25% w/w).
3. להעביר הממס צילינדר מדידה ולמלא עד 1000 מ"ל עם איכות המזון-כיתה ח₂O. החנות ב 4-6 מעלות צלזיוס עד 3 חודשים.
להשתמש acetonitrile איכות המזון-כיתה ב' הממס
הפרד N- glycans באמצעות • תנאי מעבר הצבע הבאים:
1. להתחיל על-ידי הוספת 95% ממס B לתוך א הממס להגדיר קצב הזרימה 0.5 mL/min מ-0 דקות 44.5.
2. מ 0 דקות ל- 6 דקות, לצמצם בהדרגה את הפרופורציה של הממס B עם % to78 מעבר צבע ליניארי.
3. מ- 6 דקות מינימום 44.5, לצמצם בהדרגה את הפרופורציה של הממס B עם מעבר צבע ליניארי 55.9%.
4. מ מין 44.5 46.5 מינימום, במהירות להקטין את חלקם של הממס B במילוי הדרגתי לינארית מ- 55.9% ל- 0% להחזיק ב- 0% למשך 2 דקות ו ליזום כביסה של העמודה. להפחית את קצב הזרימה כדי 0.25 mL/min של 44.5 ל- 55 דקות.
5. לשטוף את העמודה עוד יותר על ידי הגדלת B ממס עד 95% מן 48.5 דקות מינימום 50.5 והחזק ב 95% 4.5 דקות.
6. Equilibrate מחדש את העמודה לתנאי ההתחלה 95% ממס B ב- 0.5 mL/min מ- 50.5 מינימום 57.
מזריקים µL 45 המדגם לתוך המערכת UPLC.
Elute את N- glycans מאת UPLC עם השמירה פעמים בין 15 ל-40 דקות.
לאסוף את כל התצפיות UPLC שיא שבר באמצעות צינורות צנטריפוגה 2 מ"ל ויבש הדגימות אידוי צנטריפוגלי.
להזריק כ 1 pmol של 2-AB שכותרתו לתוספי סטנדרטי (2−20 גלוקוז יחידות) כדי לכייל את הצמח -N- glycan פרופיל, וכדי להקצות פעמים • תנאי שלהם ליחידות גלוקוז סטנדרטית.

7. MALDI-TOF MS ניתוח

להמיס דגימות מן µL 6.8 ב 5 שלב של איכות המזון-כיתה מים. לערבב 1 µL של הפתרון הדגימה, µL 1 6-עזה-2-thiothymine (ATT) פתרון (0.3% w/v ב- 70% v/v acetonitrile מימית), פיפטה התערובת על המוביל מדגם MALDI-TOF.
לנתח את הדגימות שימוש בכלי ספקטרומטר מסה MALDI-TOF במצב יון חיובי על ידי לחיצה על לחצן התחל .
נתח ספקטרום המונית באמצעות התוכנה הנלווית של ניתוח MALDI-תוף-MS.
לפרש הספקטרום באמצעות של קוד פתוח glycan פרשנות תוכנה¹⁹. הגדר את פרמטרי החיפוש עבור 2-AB תיוג, [M + Na]⁺, ולהגדיר את פרמטר דיוק 2.0 Da.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 1 מציג מבט סכמטי של פרוטוקול המתואר, כולל את הבידוד של חלבונים (glyco-) צנון, הכנת N- glycans, ניתוח UPLC, ניתוח MALDI-תוף-MS של רכיבים אלה. איור 2 מציג chromatograms נציג UPLC של N- glycans derivatized של הזנים צנון שנותחה. איור 3 מראה את התוצאות שהושג המבנים 2AB-derivatized N- glycan באמצעות MALDI-תוף-ספקטרומטריית. איור 4 מציגה את ההרכב כמותית של N- glycans מן כל לדבורי צנון.

איור 1 : סקירה סכמטי של שיטת הניתוח מתואר עבור N- glycans שוחררו צנון glycoproteins. השיטה כוללת הכנת (glyco-) חלבונים ו N- glycans, פרופיל UPLC וניתוח MALDI-תוף-MS. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2 : N -glycan פרופילים של 2-AB שכותרתו N - glycans. N- glycans הם בודדו אותנו מהמתרחש צנון אדום, פלפל ירוק, gegeol צנון, מלפפון, צנון דובדבנים, אבטיח צנון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3 : ניתוח spectrometric של המוני N - glycan דגימות מבודדת על ידי HILIC-UPLC. N- glycans ב spectrogram כל נאספים על ידי הפסגה אותו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 4 : הרכב כמותית של N - glycans מ לדבורי צנון לכל. הגדלים של עיגולים, crescents לייצג את השפע היחסי של התווית על-ידי 2AB N- glycans בין צנון glycoproteins. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול שהוצגו כאן מאפשר השוואת הפרופילים - glycan Nשל הזנים השונים של צנון. יתרון משמעותי של שיטה זו לעומת פרוטוקולים הקיימת היא כי אין שינויים מאגר בין המהדורה אנזימטי של N- glycans התגובה derivatization עם 2-AB נדרשים. השלב הקריטי ביותר של ההליך הטיהור של N- glycans באמצעות העמודה SPE, כמו כשל להסיר מלחים או זיהומים אחרים תערובת התגובה עלולה להשפיע לרעה על זריחה derivatization יעילות. השיטה כפי שהוצג כאן מתירה רק את ההערכה של abundances היחסית של שונות N -glycans; כימות מוחלטת ידרוש התוספת של תקן פנימי (כגון maltopentose) בשלב 2.1.

לחלופין, הסוכן derivatization המשמש כאן (2-AB) ניתן לשנות בקלות באמצעות 2-aminopyridine (2-AP) או סוכנים אחרים derivatization. ניתן להפריד גם שהושג N- glycan המעו ף מ שלב 5.3 לפי גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה (שניות), חזקה או חלשה אניון להחליף כרומטוגרפיה (סקסופון או שעווה), או בשיטות HPLC הפוכה-פאזי (אם כי ככל הנראה עם רזולוציה נחות). כדי להמשיך ולאמת את המבנים של N- glycans, טיפולים exoglycosidase סדרתית ניתן לאחר שלב 5.3 לאפיין את המבנה של N- glycans עם פרטים נוספים. לבסוף, ניתן לנתח דגימות מן שלב 6.8 נוספות על-ידי שימוש MALDI-תוף-MSⁿ-המבוסס על שיטות פיצול. יישומים עתידיים אפשריים של פרוטוקול שלנו כוללים חוקרת את ההשפעות בריאות ותפקוד של N- glycans צנון או מיני צמחים אחרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמך בחלקה על ידי קרן מדעי הטבע של סין (גרנט מספרים 31471703, A0201300537 ו- 31671854 כדי לומר שראשי, להעניק מספר 31470435 G.Y.), ואת תוכנית כשרונות זרים 100 (גרנט מספר JSB2014012 כדי לומר).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals:
Trichloroacetic acid	SCR, Shanghai	80132618
Acetic acid glacial	Huada, Guangzhou	64-19-7
Acetonitrile	General-reagent	G80988C
Trifluoroacetic acid	Energy chemical	W810031
2-aminobenzamide	Heowns, Tianjin	A41900
Sodium cyanoborohydride	J&K Scientific Ltd	314162
Dimethyl sulfoxide	Huada, Guangzhou	67-68-5
2AB-labeled dextran ladder, 200 pmol	Agilent Technologies	AT-5190-6998
6-Aza-2-thiothymine	Sigma	275514
Tools/Materials:
Kitchen blender	Bear, Guangzhou	LLJ-A10T1
Centrifuge	Techcomp	CT15RT
Centrifugal Evaporator	Hualida, Taicang	LNG-T120
SPE column	Supelco	Supelclean ENVI Carb SPE column
MALDI-TOF mass spectrometer	Bruker	Autoflex
HPLC Analysis:
High-recovery HPLC vial	Agilent Technologies	# 5188-2788
HPLC System	Shimadzu	Nexera
Fluorescence Detector for HPLC	Shimadzu	RF-20Axs
Column oven	Hengxin	CO-2000
HPLC Column	Waters	Acquity UPLC BEH glycan column	2.1 × 150 mm, 1.7 μm particle size
LCMS-grade Water	Merck Millipore	#WX00011
LCMS-grade Acetonitrile	Merck Millipore	# 100029
Formic acid	Aladdin	F112034
Ammonia solution	Aladdin	A112080