Высок объём идентификации генов регулирования последовательностей с использованием следующего поколения последовательности круговой хромосома конформации захвата (4C-seq)

Erin A. Brettmann; Inez Y. Oh; Cristina de Guzman Strong

doi:10.3791/58030

Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Высок объём идентификации генов регулирования последовательностей с использованием следующего поколения последовательности круговой хромосома конформации захвата (4C-seq)

10.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/58030

⸱

5 октября 2018 г.

Erin A. Brettmann¹ , Inez Y. Oh¹ , Cristina de Guzman Strong¹

¹Division of Dermatology, Center for Pharmacogenomics, Center for the Study of Itch, Department of Medicine, Washington University School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Выявление физических взаимодействий между генов и нормативных элементов сложной но способствовала хромосома конформации захвата методами. Эта модификация 4C-seq протокол смягчает ПЦР предвзятости, сведения к минимуму чрезмерного амплификации PCR шаблонов и максимально mappability чтений путем включения добавлением энзима ограничения дайджест шаг.

Аннотация

Выявление нормативных элементов для заданного целевого гена представляет значительную техническую проблему ввиду изменчивости размеров позиционирования и эффект нормативных элементов целевого гена. Некоторый прогресс был достигнут с bioinformatic прогноз существования и функции проксимальной эпигеномные изменения, связанные с активированной гена выражением, с использованием сайтов связывания фактор транскрипции сохраняется. Хроматин конформации захвата исследования революционизировали нашу способность обнаружить физические хроматина контактов между последовательностями и даже в пределах всего генома. Круговой хроматина конформации захвата в сочетании с следующего поколения последовательности (4C-seq), в частности, предназначен для обнаружить все возможные физические хроматина взаимодействия для заданной последовательности интерес (точки зрения), например целевого гена или регулирования усилитель. Нынешние стратегии 4C-seq непосредственно последовательности от в пределах точки зрения, но требуют многочисленные и разнообразные точки зрения одновременно упорядочивать избежать технических проблем единой базы вызова (томография) с виртуализации платформ следующего поколения. Этот объем экспериментов не может быть практичным для многих лабораторий. Здесь мы приводим модифицированный подход к Протоколу 4C-seq, который включает в себя дополнительные энзима ограничения дайджест и шаги на основе ПЦР амплификации, которые предназначены для содействия большей захват последовательности различных чтений и уменьшить потенциал для ПЦР смещения, соответственно. Наш модифицированный метод 4C поддаются стандартным молекулярной биологии лаборатории для оценки архитектуры хроматина.

Введение

В проекте Энциклопедия элементов ДНК (кодирования), всесторонне аннотированной функциональной активности для 80% генома человека¹^,²способствует выявление нормативных элементов для экспрессии генов. Определение участков в естественных условиях привязки фактор транскрипции, DNaseI Гиперчувствительность и эпигеномные гистона и изменения метилирования ДНК в типах отдельных клеток проложили путь для функционального анализа регулирования кандидата элементы для целевого выражения гена. Вооружившись этими выводами, мы сталкиваемся с проблемой определения функциональной взаимосвязи между регуляторных элементов....