Summary
記載プロトコルは、可溶性タンパク質と糖質 (非構造) 植物組織の内容を測定するための明確かつ親しみやすい方法論を提供します。これらの 2 つの植物栄養素を定量化することで、植物生理学、栄養生態学、植物-植食者の相互作用、食物網の生態学の分野に大きな影響を与えます。
Abstract
基本的なデータは、リソースとして草食動物に植物の品質を推測する使用されます。ただし、生体分子の炭素の普及、含窒素植物防御物質、窒素あるいは植物たんぱくすべての種特異的な相関の変化の存在は、これらの推論の精度を制限します。さらに、植物に焦点を当てた研究や草食動物生理学レベルを使用して効果が得られない精度の一般化相関関係を必要とします。紹介した方法は、研究者の植物水溶性タンパク質と消化しやすい炭水化物、動物の生理学的なパフォーマンスに密接に最も 2 つの植物栄養素を直接測定するための明確かつ迅速なプロトコルを提供しています。プロトコルを組み合わせて正確かつ再現性のある結果を提供するために最適化された植物固有の消化手順も特徴と比色試金。組織がこれらの試金がの変化を検出する感度であることを示す別のスイート コーンの分析植物の複数の空間スケールにわたって水溶性タンパク質と糖質コンテンツ。これら地域、植物の種や品種、成長している間で工場間違いがありますと同様に工場内の組織型の違いと同じ組織内でも位置的な違い。プラント生物学の植物生理学的過程とミネラル肥料を接続するための新しい機会を提供する可能性がありますも元素データの水溶性タンパク質と糖質コンテンツを組み合わせてします。これらの分析は、水溶性タンパク質と栄養生態学、植物-植食者の相互作用、食物網動態は, 生理・生態研究を強化する順番を研究に必要な糖質データ生成にも役立ちます。
Introduction
植物バイオマスは、事実上すべての陸生食物網の基礎を形作る。植物はその根系による土壌からの栄養の要素を取得し、生体分子を合成する、葉面組織に日光を利用します。特に、炭素と窒素は炭水化物、タンパク質 (アミノ酸で構成) の作成に使用し、植物バイオマス (それに注意してください「栄養素」という用語は、多くの場合、土壌など、N、生理を植えることを構築に必要な脂質P、K、S、ただし、このホワイト ペーパーではこの用語はタンパク質、炭水化物、脂質などの生体分子)。草食動物は、植物材料を消費する植物組織に含まれる栄養素、それらの構成要素に分解し、消費者の生理学的なプロセスを使用しています。この方法では、植物栄養素はより高い順序の生態学的相互作用と食物網動態にとって重要な意味と共に消費者の生理学に強い影響を持ってください。
動物王国の間で可溶性タンパク質と消化しやすい炭水化物が生存、複製、およびパフォーマンスの1に最も密接に関係する栄養素です。さらに、動物の大半は積極的にその生理的要求1,2を満たすためにこれらの 2 つの栄養素の摂取量を調節します。これは特に当てはまります植物組織の糖およびアミノ酸の濃度を検出する草食昆虫の摂食行動を指示します。その結果、植物の水溶性タンパク質と可消化炭水化物の含有量は植物・昆虫間の相互作用の進化で強力な役割を果たしています。
植物性水溶性タンパク質と消化性炭水化物含有量のデータは比較的稀である (しかし、6、7,8,9,10,11を参照してください)、間の優位性があります。データ (炭素・窒素・ リン) 植物要素のコンテンツで使用できます。これ主要素が植物無機栄養3,4、5の主要な役割を果たすためにです。要素の測定、相関関係は、水溶性タンパク質と消化性の炭水化物の量を推定する使用されているが正確な計算は、入手が困難。例えば、炭素はすべて有機化合物で普遍的に存在するため、植物に消化炭水化物含有量の指標としてカーボンを使用するは不可能です。元素の窒素と、植物の水溶性タンパク質含有の強力な関係が存在して窒素-タンパク質換算係数の一般化がしばしば用いられます。しかし、窒素-タンパク質の変換が高い種特異的な12,13,14,15、汎用的な変換の使用を可能性が高いことを強力な証拠があります。不正確です。このため、窒素-タンパク質換算係数はしばしば、草食動物の栄養学的研究に必要な限度において、特に、精度を欠いています。また、植物のアレロパシーの N 含有物質、アルカロイドなど、草食動物に有毒であることが多いグルコシノ レートの存在は、これらの変換を混同することができます。
ここでは、我々 は可溶性タンパク質の消化しやすい炭水化物植物組織の濃度を測定するため 2 つの化学的アッセイを提供しています。これらの試金は別々 に表示されますが、彼ら使用する同時に同じ植物のサンプルを分析する植物栄養素のより包括的な分析を達成するためにはお勧め。両方は吸光度による定量化続く抽出ステップから成ると同様の手法を採用しています。植物サンプル準備も容易にタンデムで両方の解析を実行する両方のプロトコルの同じです。これらのアッセイの有用性は彼らがそれ以上の年齢に依存して目新しさからなくならない (ブラッドフォード、ジョーンズ、デュボア) 確立された比色試金16,17,18, しかし、ここではっきりと容易に続く開催あいまいな植物固有の抽出技術17,19やすくこれらのアッセイの適用工場関連分野のものにするためにこれらのメソッドを組み合わせたプロトコル。
両方の試金のため、植物栄養素は凍結、lyophilizing、植物材料を研削加工によって物理的に抽出最初。さらに水溶性蛋白質の試金は、化学的抽出が17,19ボルテックス冷暖房 NaOH 溶液のサンプルのいくつかのラウンドを行われます。Coomassie ブリリアント ブルー G-250 を利用したよく知られているブラッドフォードの試金は、水溶性タンパク質と 3,000-5,000 ダルトン16,17間ポリペプチドを定量化する使用されます。この試金はよくマイクロ プレートあたり 1 20 μ g 総蛋白間の検出範囲または < 25 μ G/ml ですがないメジャー遊離アミノ酸。糖質分析の抽出工程はスミスらの希薄酸法に基づいてください。20糖、澱粉、フラクトサン- がない炭水化物の分離が可能します。フェノール-硫酸酸性の定量化は、Duboisらから取得されます。18すべてモノ、オリゴ - と多糖類 (と同様メチル誘導体) を測定します。この試金は特定の糖を定量化することができるが、ここで私たちの総可消化炭水化物の含有量を示すインジケーターとして使用 (スミスらを参照してください。20のためのより詳細な分析)。一緒に、これらの試金は強く植物生態生理学と草食動物のパフォーマンス、地上食物網の基地でリソースの品質に重要なデータを提供する関連付けられている 2 つの栄養素を測定します。これらのプロトコルを提示草食動物栄養生態学、植物生理学、植物-植食者の相互作用のより完全な理解を得るために植物栄養素データセットの生成を促進します。
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Protocol
1. 植物の収集と処理
- 収集および処理植物のサンプル
- 植物のサンプルを収集した後浸漬によるフラッシュ凍結試料は鉗子で液体窒素に植物素材、-80 ° C で保存植物のサンプルが収集された場合は、急速凍結、迅速に、できるだけ早く-80 ° C の冷凍庫にドライアイスと転送を使用してサンプルをクールに大きすぎます。植物材料の栄養素のコンテンツは、コレクション後できるだけ早く植物のサンプルを凍結する上で重要な植物から組織が別れた後に変更できます。
注意:液体窒素は、皮膚に接触すると重度の凍傷を引き起こす可能性が。認定された容器に液体窒素を輸送し低温手袋、目グーグル、顔面シールド、エプロン、白衣など、その処理中に適切な PPE を着用してください。 - 凍結乾燥機を使用して水が削除されている間に、組織が代謝活性を確認する植物材料を凍結乾燥します。すべての水が削除されていることを確認するサンプルの質量までドライを安定させます。
- 一度サンプルは乾燥、グラインダーまたはミルを使用して粉に挽きます。分析まで、サンプルを乾燥キャビネットに格納します。
- 植物のサンプルを収集した後浸漬によるフラッシュ凍結試料は鉗子で液体窒素に植物素材、-80 ° C で保存植物のサンプルが収集された場合は、急速凍結、迅速に、できるだけ早く-80 ° C の冷凍庫にドライアイスと転送を使用してサンプルをクールに大きすぎます。植物材料の栄養素のコンテンツは、コレクション後できるだけ早く植物のサンプルを凍結する上で重要な植物から組織が別れた後に変更できます。
2. 水溶性蛋白質の試金
- サンプル準備
- 各組織は、約 20 mg のレプリケート サンプル重量を量り 1.5 mL ポリスチレン マイクロ遠心チューブ用とラベル チューブに。これらのサンプルは未知試料とその後。この情報は、各未知サンプルの % 可溶性タンパク質を計算する必要があります、各サンプルの正確な質量を記録できます。サンプル ソリューションの損失の結果後の加熱段階非ロックの蓋が開くことができますロック蓋とマイクロ遠心チューブ用を使用します。
- 可溶化し、未知サンプルの蛋白質を分離
- マイクロ pipettor を使用して、各チューブに 0.1 M NaOH の 500 μ L を追加します。蓋をしめて、30 分間の超音波。お湯を予熱浴室の 90 ° C
注意:水酸化ナトリウムは強力な基盤を皮膚に接触すると火傷を引き起こすことができます。0.1 M NaOH を表します低濃度が、皮膚の炎症を避けるために保護手袋を着用します。 - 15 分間湯浴でラックにチューブを置きます。
- 10 分間 15,000 × g でチューブを遠心します。各サンプルの新しいピペット チップを使用して、新しいラベル付き遠心チューブに上清液をピペットします。10 分のペレットと 15,000 × g で遠心分離をもう一度を含む管に 0.1 M NaOH の 300 μ L を追加します。もう一度、上澄み液を収集し、同じサンプルから他の培養上清液とそれを組み合わせます。これは終了点、可能性と必要な場合も夜通しサンプルすることができます 4 ° C で保存します。
- マイクロ pipettor を使用して、各チューブに 0.1 M NaOH の 500 μ L を追加します。蓋をしめて、30 分間の超音波。お湯を予熱浴室の 90 ° C
- 植物タンパク質を沈殿させる
- 各試料溶液にリトマス試験紙を浸すことによって 5.8 M 塩酸確認 〜 7 の pH の 11 μ L を追加することによって上澄み液の pH を中和します。
注意:塩酸は皮膚 (皮膚アプリケーションまたは吸入) に接触すると火傷を引き起こす可能性が強い腐食性の酸です。HCl を処理しながら皮膚の炎症を防ぐために手袋を着用してください。 - 各管に 100% トリクロロ酢酸 (TCA) の 90 μ L を追加し、氷の上管 30 分間インキュベートします。蛋白質の沈殿物は不透明クリアからソリューションになります。これが 30 分後に発生しない場合は、チューブを 1 時間冷蔵します。これは終了点、可能性と必要な場合も夜通しサンプルすることができます 4 ° C で保存します。
注意:トリクロロ酸は腐食性です。肌との接触や吸入を防ぎますを処理するときは手袋を着用ください。 - 4 ° C で 10 分間 13,000 × g で遠心分離機サンプル(同じチップはサンプル全体で使用可能) の細かいガラス マイクロ ピペット チップに接続されている真空ラインを使用して吸引によって TCA 上澄みを慎重に取り外します。重い吸引をせずにピペット チップおよびペレット間の適切な距離を保つことにより蛋白ペレットを邪魔しないでください。
- -20 ° C アセトンの 100 μ L を迅速にペレットを洗浄します。この手順以降のブラッドフォードの試金; を妨げることができますペレットから任意の残りの TCA を削除しますしかし、アセトンは、場合は、長時間の接触のまま 5 秒以内、このペレットから迅速に抽出されたアセトンを追加する必要がありますので、蛋白ペレットを溶解する開始されます。
- ヒューム フードや冷蔵庫のチューブを配置することによって蒸発するアセトンを許可します。その後、各管に 1 mL の 0.1 M 水酸化ナトリウムを追加することによって蛋白質ペレットを溶解します。お湯で暖房のいくつかのラウンドを必要があります完全にペレットを溶解風呂、ボルテックス、sonicating。
注: チューブを長く座る発煙のフードか冷蔵庫、乾燥のペレットを取得、再可溶化することより困難。30 分間、ペレットを乾燥することを推奨し、アセトンの存在を確認するまで 10-15 分ごとをオフにアセトンが蒸発 (アセトン煙の検出がない)。
- 各試料溶液にリトマス試験紙を浸すことによって 5.8 M 塩酸確認 〜 7 の pH の 11 μ L を追加することによって上澄み液の pH を中和します。
- 標準溶液を混ぜて、未知試料溶液を希釈し、ブラッドフォードの試金を使用して未知のサンプルの総蛋白含量を定量化します。
- ウシ免疫グロブリン G (IgG)表 1 (凍結乾燥または igg 抗体原液は各濃度を達成するために脱イオン水と混合することができます) に記載されている濃度によると標準溶液を準備します。4 ° C でストア基準96 ウェル プレートのウェル プレートの A1 の位置から帳票である IgG の各標準液の 160 μ L を追加 (0 μ g/μ L a1、A2、A3 の位置、B1, B2, B3 の 0.0125 μ g/μ L の位置、等)。
- 950 μ L の蒸留水を 0.1 M NaOH の 50 μ L を追加することによって希釈した NaOH 水溶液を準備します。空白のネガティブ コントロールとして 3 通 (G1、G2、G3 の位置) ウェル プレートに 60 μ L のこのソリューションを追加します。
- 各試料溶液 50 μ L を新しい 1.5 mL 遠心チューブに蒸留水 950 μ L に追加することによって未知のサンプルの希釈液を準備します。H1 の位置から 3 通のウェル プレートに各希釈サンプルの 60 μ L を追加します。96 ウェル プレート 6 基準、1 のダミーと 3 通読んだとき 25 未知試料の分析できるようにします。分析各ウェル プレートは、独自の IgG の標準および空白のサンプルを含める必要があります。
- すべて空白と未知のサンプルのウェルに 100 μ L の蒸留水を追加します。それぞれはよくの 160 μ L (8 チャンネル)、マルチ チャンネル ピペットを使用して合計を含める必要があります今 Coomassie ブリリアント ブルー G-250 タンパク質の 40 μ L を染めるウェル プレートの最初の列でもすべてを追加します。数回の急落によってサンプルと染料を混ぜます。汚染を避けるためにピペット チップを交換、その他のすべての列を繰り返します。
注意:Coomassie ブリリアント ブルー G-250 は刺激し、目、皮膚との接触または肺を避ける必要があります。皮膚との接触を防ぐために手袋を着用してください。皮膚との接触が発生すると、この製品が染色されます。 - 針を使用して、彼らはマイクロ プレート分光光度計読書を妨げる可能性がある、井戸に存在する任意の気泡をポップします。井戸の汚染を避けるために針をクリーンアップします。室温で 5 分間インキュベート マイクロ プレートをしましょう。
- 595 各ウェルの吸光度値を記録、マイクロ プレート分光光度計を使用して nm。
- 3 つの空白の井戸の平均吸光度を記録し、各標準および未知のサンプルの測定値からこの値を減算します。各標準および未知のサンプルの平均吸光度を記録します。
注: 標準曲線を用いた各未知サンプルで現在の蛋白質の量を計算するが最も簡単各標準各標準の中に存在するタンパク質のマイクログラムの平均吸光度を縮するが、蛋白濃度 (μ をプロット 1 つg/μ L) であれば各標準の。次の計算はただし、マイクログラム、ない濃度 (μ g/μ L) に基づいて標準曲線を参照してください。 - それぞれの規格はよく (表 1) に存在するタンパク質の総量に対して各標準の平均吸光度をプロットします。これらのデータを線形回帰直線の調整し、も平均吸光度 (図 1 a) に基づいて各未知サンプルの蛋白質 (μ g) の量を計算する式を使用します。
注: この行の相関係数 (r値) は、0.99 近く日常的に 0.98 より大きくなければなりません。標準の回帰は、各プレートに固有になります、したがって各プレートで不明なサンプル井戸を個別に分析する必要があります。 - 蛋白質の平均額は各未知のサンプルも、一度、各元のサンプル中のタンパク質 (μ g) の合計金額を計算する次の式を使用します。
Mp = (((Wp60) x 1000)/50) * 1000
Mp = 元のサンプルの蛋白質の μ g
Wp = 未知の試料中のタンパク質の μ g をよく- 次の方程式を使用して、各サンプルの蛋白質の割合を判断します。
Pp = ((Mp/1000)/Mi) * 100
Pp % 蛋白質のサンプルを =
M は私最初の固まり (mg) のサンプルを =
注: 場合によっては、サンプルは上部の吸光度しきい値を上回る可能性があります。もしそうなら、ステップ 2.4.3 で希釈試料溶液がさらに必要があります。
その他の希釈は、後の計算での考慮をする必要があります。いくつかのマイクロ プレート リーダーのブランドは、自動的に標準曲線データに基づいて各未知試料の平均蛋白質の集中を計算するコンピューター ソフトウェアも提供します。
- 次の方程式を使用して、各サンプルの蛋白質の割合を判断します。
3. 糖質アッセイ
- サンプル準備
- 各組織は、約 20 mg のレプリケート サンプル重量を量り、ゴム並んでスクリュー キャップ (100 mm) 15 mL チューブをガラスに。これらのサンプルは未知試料とその後。チューブ防水マーカーや蓋にテープをラベルにラベルを付けるし、この情報は、各未知サンプルの % の炭水化物を計算する必要があります、各サンプルの正確な質量を記録します。
- 各未知サンプルから消化しやすい炭水化物を抽出します。
- 4各チューブ、スクリュー キャップにチューブしっかりと 0.1 M H2の 1 つの mL を追加します。1 時間沸騰水浴で配置します。
注意:硫酸は非常に腐食性です。だから H2を処理するときに、手袋、目グーグルとエプロンを着用ください4と発煙のフードでこの手順を実行します。 - ぬるま湯のお風呂でチューブを冷やします。マイクロ遠心チューブ用 (ガラス管のいくつかの植物の材料が残っている場合は関係はない) を 1.5 mL のラベルにチューブ内に注ぐ。
- 10 分間 15,000 × g でチューブを遠心します。新しいラベル付き 1.5 mL 遠心チューブに上清液マイクロ pipettor と場所を削除します。チューブは、この時点で一晩冷やすことができます。分析を継続し、ステップ 3.3.2 を参照します。
- 4各チューブ、スクリュー キャップにチューブしっかりと 0.1 M H2の 1 つの mL を追加します。1 時間沸騰水浴で配置します。
- 標準溶液を混合し、未知サンプルの総可消化炭水化物含量を定量化します。
- グルコース濃度の標準溶液は、表 2に示す D(+) を準備します。各標準溶液の 400 μ L で 6 ガラスの試験管を準備します。
- 独自の試験管に各未知サンプルの 15 μ L をピペット、385 μ L の蒸留水を各試験管に 400 μ L の総ボリュームのそれぞれに追加します。発煙のフード各標準および未知のサンプル テスト チューブに 5% のフェノールの 400 μ L を追加し、迅速にピペット 2 mL 濃縮 H2など4各チューブに。先端のピペットで試験管内容に触れる行う、(リピータ ピペットがこれに最も適した) ソリューションに追加するだけ。
- させない 10 分間インキュベートし、慎重に渦の内容をミックスするチューブ。さらに 30 分を孵化させなさい。
注意:フェノール、硫酸腐食性刺激。含む適切な PPE を使用して化学の発煙のフード吸入、目、皮膚への暴露から保護するためにこの手順を実行する必要があります: シールドまたは眼ゴーグル、ゴム手袋、ラボのエプロンとブーツに直面します。混合フェノール硫酸も発熱反応の結果、熱くなってきている管になります。 - 3 ポリスチレン 1.5 mL セミミクロ キュベット (サンプルあたり 3 技術的なレプリケートします) のそれぞれに各管からのサンプルの 800 μ L をピペットします。490 に分光光度計を設定 nm。基準または、未知サンプルを読む前に、断続的にサンプルの測定値の中で、蒸留水を含む空白のキュベットを調整します。分光光度計をそれぞれキュベットを実行し、吸光度を記録します。技術全体の平均は、未知のサンプルごとにレプリケートします。
注: 場合によっては、サンプルは上部の吸光度しきい値を上回る可能性があります。もしそうなら、3.2.3 の段階でサンプルを希釈する必要があります。後の計算での希釈を考慮も必要があります。 - 各標準の平均吸光度を計算します。
注: 標準曲線を用いた各未知サンプルで現在総可消化炭水化物の量を計算する各標準各標準に存在 D (+) グルコースのマイクログラムの平均吸光度を逆行する最も簡単ながまた望ましい場合は、各規格の D (+) グルコース濃度 (μ g/μ L) をプロットします。次の計算はただし、マイクログラム、ない濃度 (μ g/μ L) に基づいて標準曲線を参照してください。 - 各標準溶液中の D (+) ブドウ糖 (μ g) の合計量に対する平均吸光度をプロットすることによって標準的なカーブを計算します。これらのデータを線形回帰直線の調整し、各未知サンプルの炭水化物 (μ g) の合計額を計算する次の数式を使用します。
Mc = (((x – を b)/m)/(15)) * 1000
Mc = サンプル中の炭水化物の μ g
X = 未知試料の平均吸光度
b = y 切片 (標準回帰直線)
m = 勾配 (標準回帰直線)
この行の相関係数は 0.99 0.98 よりと日常的に大きいはずです。各サンプルの炭水化物の割合を判断するのに次の式を使用して。
Pc = ((Mc/1000)/(Mi)) * 100
Pc = % の炭水化物
M は私最初の固まり (mg) のサンプルを =
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Representative Results
これらのメソッドの有効性を示す、可溶性タンパクおよび 4 つの別のフィールドと草食昆虫の明確な潜在的な栄養資源としてとうもろこし組織の可消化炭水化物の含有量を分析しました。トウモロコシの耳 (ミネソタ州、ノースカロライナ州、テキサス州) は、アメリカ合衆国で 3 つの農業地域から収集した包括的なスイート コーン (すなわち、遺伝子型) の 5 種類と 1 つ、outgroup として各種分野のトウモロコシ。表 3は、これらのトウモロコシのサンプルのビルドとが収集された概要を示します。満期では、収集されたすべての品種はなかった発達の違いにより品種、彼らすべて植栽後同じ日に収集します。我々 は、殻 (変更された葉は、cob を囲む)、すぐに区切って区別された組織に耳を処理され、メソッドで示されたすべての組織として-80 ° C で保存する前に耳からシルク (殻とカーネルの光沢のある繊維)。各組織は、凍結乾燥させていた。一度乾燥、我々 はベースとコブの (基本) 上位三分の一 (tip) と下部 3 分の 1 からカーネルの削りで耳の先端からカーネルを分離しました。次に、すべての組織された微粉末に粉砕します。我々 は、殻、シルク、ヒント カーネルおよび可溶性タンパク質と糖質上記の方法での手順に従ってコンテンツの基本カーネル組織サンプルを分析します。利用可能な組織の量に制約を与え、可溶性タンパク質の消化性炭水化物含有量 217 工場サンプルの合計を分析しました。
可溶性タンパク質
合計では、分光光度計を 9 サンプル プレートを走った私たちと全体としては、標準的な曲線は 0.985 1.00 の間の値と高い相関係数 (r)。図 1は、プレート全体を見ました変動性を示す最高の (A) と (B) r値の小さい方の標準的な曲線を示しています。初期サンプル質量 (表 4) を使用してすべてのサンプル % 可溶性タンパク質を計算し、可溶性タンパク質含量の組織の種類、品種、地域間の統計的な差異のデータを分析します。データの正規性の仮定必要なときに合わせてランク変換されました。
我々 は地域 (ウェルチ ANOVA; 間可溶性タンパク質含量に有意差を観察F(2, 133.5) = 4.303、 P = 0.015)、結果、各地域のデータは別々 に行ったその後。可溶性タンパク質含量 (二元; に多様性と組織型との間の重要な相互作用を示したミネソタ サンプルF(3, 64) 16.51、 P = < 0.001)。ほとんどの組織は、スイート コーン品種がほぼ 7 倍量は分野のトウモロコシ品種に比べて含まれているベースのカーネルを除いて同様の可溶性タンパク質の両方の種類のコンテンツを持っていた。(シンジェンタ/NK-3122A-EZ) 分野のトウモロコシ品種の殻やシルクが似通っており、すべての組織の可溶性タンパク質含量が最低。耳の先端からカーネルが可溶性タンパク質含量と中間耳のベースからカーネルであった (図 2 a)。(プロビデンス二色) のスイート コーン品種すべての組織の方が、殻と最低の可溶性タンパク質のコンテンツ、および ~2.5 回カーネルのヒント (図 2 b) 以上に含まれているベースのカーネルを含むシルク、区別可能であった。
また、多様性と組織型 (双方向分散分析; 間の重要な相互作用を示したノースカロライナ サンプルF(3, 77) 3.33、 P = 0.024 <)。ほとんどの組織は、非Bt品種 (甘い G90 ハイブリッド) の高いコンテンツを表わしたヒント カーネル以外の品種間でコンテンツ同様水溶性タンパク質を示した。Bt (Seedway Bt 1576) 様々 な殻は続いてシルクとヒント カーネルでは、同様のコンテンツを持っていた最低の可溶性蛋白質の含量, 組織でした。基本カーネルは可溶性タンパク質含量を持っていたが、ヒント カーネル (図 2 c) で統計的に有意差は認められなかった。非Bt品種 (甘い G90 ハイブリッド)、すべての組織はヒントと統計学的に類似していた基本カーネルを除いて区別可能であった。殻があった最低の可溶性タンパク質含量、続いてシルクと先端とベースのカーネル (図 2 d) の最高のコンテンツを持っていた。
品種 (二元; 間可溶性タンパク質含量に有意差を示したテキサスのサンプルF(1, 76) = 12.91、 P = 0.001) と組織 (双方向分散分析;F(3, 76) 21.90、 P = < 0.001)、ない有意な相互作用 (二元; が、F(3, 76) 0.436 Pを = = 0.728)。全体的にみて、バイカラー品種 (Sh2 SS2742 NAT III) 示したシルバー クイーンの様々 なより低い平均可溶性蛋白質内容 (値 F1 (su))。両品種間で殻は蛋白質含量が最低、シルク、続いてと、ヒントし、カーネルでは、どちらが同様に含有量が高い (図 2 e~ f) をベースします。
消化しやすい炭水化物
すべてのサンプルを一度に解析していたため我々 はのみ 1 つの標準的なカーブを走った。図 1 cは、相関係数は 0.998 で高いことを示しています。すべてのサンプル (表 5) % 消化炭水化物の含有量を計算し、可消化炭水化物量の組織の種類、品種、地域間の統計的な差異のデータを分析します。データ ランク-変形した正規性の仮定を満たすために必要な場合。
地域 (ANOVA; の間に有意差はありませんでした。F(2, 216) = 1.47、 P = 0.231)、しかし、我々 は再び別々 に各地域からのデータを分析したタンパク質解析との連続性のために。ミネソタ サンプル品種 (二元; 間可消化炭水化物含量に有意差を認めなかったF(1, 64) = 0.00014、 P = 0.990) または組織型 (双方向分散分析;F(3, 64) = P 0.818 = 0.489)。品種と組織 (双方向分散分析の有意な相互作用はまたありませんでした。F(3, 64) = 2.26、 P = 0.092)。図 2a-bは、すべての組織が 36.5% (± 0.53) の平均のコンテンツを展示示しています。
ノース ・ カロライナ州サンプル消化性炭水化物含有量 (二元; 組織型の有意な効果を示したF(3, 77) = 3.99、 P = 0.011)、バラエティ (二元; 効果はありませんが、F(1, 77) = 1.06、 P = 0.307) または相互作用 (双方向分散分析;F(3, 77) = 0.465、 P = 0.708)。図 2 c-d絹が最も低い消化性炭水化物のコンテンツを持っていたことを示していますベース カーネルとカーネルでは、殻に続いて、ヒントします。すべての組織シルクと基本カーネルを除いて統計的に類似していた。
バラエティ (双方向分散分析の有意な効果を示したテキサスのサンプルF(1, 76) 0.834、 P = = 0.364) または組織型 (双方向分散分析;F(3, 76) = 1.03, P = 0.385)、有意な相互作用 (二元; 表示でしたが、F(3, 76) = 3.34、 P = 0.024)。この効果はバイカラー品種 (Sh2 SS2742 NAT III) 基本カーネルは有意に高い消化性炭水化物を持っていたので主よりもシルバー クイーンさまざまなコンテンツ (値 F1 (su))。図 2e-fがなかったことに消化炭水化物量の統計的な差異組織タイプ シルバー クイーンの様々 なを示しています (値 F1 (su))、シルク、バイカラー品種 (基本カーネル組織間に有意差はなかった国道 2 号線 SS2742 NAT III)。
図 1。栄養素の試金のための標準的なカーブ。(A)最高の相関係数 (最高曲線) とプレートを示す水溶性蛋白質の試金の標準の曲線。(B)最も低い相関係数 (最悪曲線) とプレートを示す水溶性蛋白質の試金の標準的な曲線。(C)糖質の試金のための標準曲線。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2。組織の種類ごとに % 可溶性タンパクおよび % 消化性炭水化物含有量を意味します。(A) MN - Btシンジェンタ/NK-3122A-EZ (フィールド トウモロコシ)、 (B) MN-非Btプロビデンス二色、 (C) NC-Seedway Bt 1576、 (D) NC-非Bt甘い G90 ハイブリッド、Sh2 テキサス州-SS2742 F1 NAT III (E) バイカラー、 (F)テキサス州-シルバー クイーン値 F1 (su)。正方形は平均値を表示しながら、円は、生データを表示します。緑 (殻)、赤 (シルク)、黄色 (ヒント カーネル)、紫 (基本カーネル)。各正方形に起源を接続する点線ライン表示各組織の P:C 比率 (比は点線の傾き)。文字は、組織全体で大幅に異なる値を表す別の文字と蛋白質の相違を側面に沿って上部と炭水化物の違いのホックを投稿結果を表示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| IgG 濃度 (ug/uL) | タンパク質標準サンプル (ug) |
| 0.0000 | 0 |
| 0.0125 | 2 |
| 0.0250 | 4 |
| 0.0375 | 6 |
| 0.0500 | 8 |
| 0.1000 | 16 |
表 1.可溶性蛋白質の試金の標準曲線計算します。各標準タンパク質の量は、各標準濃度、各井戸 (160 μ L) 標準溶液の量を乗算して計算されます。
| D (+) グルコース濃度 (ug/uL) | 標準試料 (ug) D (+) グルコース |
| 0.0000 | 0 |
| 0.0375 | 15 |
| 0.0750 | 30 |
| 0.1125 ° | 45 |
| 0.1500 | 60 |
| 0.1875 | 75 |
表 2。糖質の試金のための標準曲線計算します。各標準のブドウ糖の量は、各標準濃度、各テスト チューブ (400 μ L) の標準溶液の量を乗算して計算されます。
| 地域 | さまざまな | 場所 | N |
| ミネソタ州 | Bt シンジェンタ/NK-3122A-EZ (分野のトウモロコシ) | ローズ マウント, ミネソタ (44.7070、-93.1073) | 10 |
| 非-Bt プロビデンス二色 | ローズ マウント, ミネソタ (44.7070、-93.1073) | 10 | |
| ノース ・ カロライナ州 | 非 Bt 甘い G90 ハイブリッド | ロッキー マウント, NC (35.8918、-77.6780) | 10 |
| Seedway Bt 1576 | エデン、ノースカロライナ (36.1758、-76.7057) | 10 | |
| テキサス州 | 国道 2 号線 SS2742 F1 NAT III 二色 | ラボック, テキサス州 (33.6935、-101.8249) | 10 |
| シルバー クイーン値 F1 (su) | ラボック, テキサス州 (33.6935、-101.8249) | 10 |
表 3。トウモロコシ サンプリング場所と品種の概要。10 耳が収集された各地域と様々 な組み合わせの 4 つの組織を分析した: 殻やシルク、ヒント カーネル ベースのカーネル。
| 地域 | さまざまな | % 可溶性タンパク質 | |||
| 殻 | シルク | ヒント カーネル | 基本カーネル | ||
| ミネソタ州 | Bt シンジェンタ/NK-3122A-EZ (分野のトウモロコシ) | 3.29 ± 0.38 | 4.57 ± 1.27 | 14.74 ± 1.54 | 7.07 ± 0.84 |
| 非-Bt プロビデンス二色 | 3.35 ± 0.58 | 6.71 ± 0.70 | 17.87 ± 3.85 | 48.41 ± 2.85 | |
| ノース ・ カロライナ州 | 非 Bt 甘い G90 ハイブリッド | 2.90 ± 0.60 | 6.97 ± 0.63 | 12.95 ± 0.86 | 12.23 ± 0.83 |
| Seedway Bt 1576 | 5.48 ± 0.73 | 9.08 ± 0.62 | 10.75 ± 0.93 | 12.76 ± 1.16 | |
| テキサス州 | 国道 2 号線 SS2742 F1 NAT III 二色 | 7.74 ± 1.03 | 12.15 ± 0.63 | 14.79 ± 0.69 | 14.88 ± 0.48 |
| シルバー クイーン値 F1 (su) | 6.06 ± 1.05 | 8.17 ± 0.79 | 12.95 ± 1.19 | 12.32 ± 1.23 | |
表 4。各地域・品種および組織型の蛋白値の平均。意味する率が、乾燥質量) ± 1 のとおり SE。
| 地域 | さまざまな | % の消化しやすい炭水化物 | |||
| 殻 | シルク | ヒント カーネル | 基本カーネル | ||
| ミネソタ州 | Bt シンジェンタ/NK-3122A-EZ (分野のトウモロコシ) | 37.55 ± 0.88 | 32.31 ± 1.38 | 36.79 ± 1.60 | 38.66 ± 1.57 |
| 非-Bt プロビデンス二色 | 37.30 ± 0.82 | 37.31 ± 2.30 | 35.80 ± 1.77 | 34.83 ± 1.37 | |
| ノース ・ カロライナ州 | 非 Bt 甘い G90 ハイブリッド | 35.79 ± 0.81 | 35.28 ± 1.17 | 36.13 ± 0.91 | 39.47 ± 1.18 |
| Seedway Bt 1576 | 35.75 ± 0.58 | 34.91 ± 0.76 | 35.73 ± 1.35 | 37.29 ± 1.13 | |
| テキサス州 | 国道 2 号線 SS2742 F1 NAT III 二色 | 35.55 ± 0.87 | 33.40 ± 1.10 | 34.85 ± 1.01 | 39.14 ± 1.22 |
| シルバー クイーン値 F1 (su) | 34.63 ± 1.13 | 33.42 ± 2.33 | 35.16 ± 1.16 | 33.93 ± 1.03 | |
表 5。各地域・品種および組織型の炭水化物の値を意味します。意味する率が、乾燥質量) ± 1 のとおり SE。
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Discussion
、効果的な植物固有の抽出のプロトコルと定評の比色定量法を組み合わせて紹介アッセイは植物性水溶性タンパク質と消化性炭水化物の含有量を測定するための合理的かつ正確なメソッドを提供します。私たちの結果は、トウモロコシを使用して模範は、これらのプロトコルを使用して、異なる生物学的関連空間スケールで正確な測定を取得する方法を示しています。たとえば、地理的な地域、品種 (または遺伝子型)、組織の種類とも空間的分離組織の植物性水溶性タンパク質と消化性炭水化物含有量の違いを検出することができました。両方のアッセイを行うことができます一般的な実験装置および試薬、基礎実習スキルだけを必要とするを使用して、サンプル (50-75) 短い期間内の比較的大きい数を分析することができます。
比較的簡単に行う、いくつかの手順は、他の人よりも重要、正しく行われていない場合は、結果の精度を制限できます。たとえば、サンプリングの段階で植物材料が適切に処理されることが不可欠です。切り裂かれた植物組織は致命的な温度にさらされてまで代謝活性のままになり、この時代の植物に栄養素のコンテンツを変更できます。その結果、工場間の長い期間をサンプリングし、(液体 N ・冷凍保管のいずれか) を凍結可能性が高く植物栄養素のコンテンツのサンプルのサンプリング時に存在していたコンテンツを表さない場合があります。
蛋白質のプロトコルの手順の 2.3.3-2.3.5 は、沈殿したタンパク質対処手順として成功した結果のため特に重要です。蛋白質含有量の過小評価になるため遠心チューブから培養上清中の TCA を掃除するとき蛋白ペレットのいずれかを失うことを避けるために注意する必要があります。非常に迅速にそのようにアセトンで蛋白ペレットを洗浄するときにも重要です。アセトンは、数秒以上の連絡先のままの場合、ペレットを低下できます。アセトンと 5 秒未満にペレット間の接触を制限することをお勧めします。最後に、ペレットを乾燥するときのみアセトンを蒸発させるために十分な時間を許可するように注意することが重要です。ペレットが長すぎるため乾燥する場合、NaOH で再懸濁しますを非常に困難になります。30 分間、ペレットを乾燥し、チューブ内の液体を視覚的に観察することによって、または慎重にアセトン煙のにおいを検出することによりをアセトンの存在をチェックお勧めします。アセトンが蒸発するまで 10-15 分毎、ペレットをチェックを続けます。
鮮やかなブルーの Coomassie G-250 染料を使用して定量化手順のみ 5 μ g タンパク質/mL、高色素蛋白質複雑な安定性、および限られた干渉の標準偏差との高感度を可能にするブラッドフォード 197616に記載されている、非蛋白質化合物。この試金は検出範囲 1-20 μ g マイクロ プレートもあたり総蛋白の間 (低濃度測定)、最大 25 μ g/ミリリットルです。ただし、最高の水準を超える濃度を希釈し、(プロトコルは、このような希薄と再解析が必要な場合にソリューションの過剰を生成する) 最も正確な結果を再分析する必要があります。塩基性アミノ酸、アルギニンなど芳香族アミノ酸残基に優先的にバインドする染料のためのバイアスがあります。しかし、ブラッドフォードの試金のまま混合試料中総蛋白質定量法の最も正確で使いやすいです。
糖質アッセイは、(セルロース) などはほとんど草食動物によって消化性炭水化物を排除しながら植物の糖を定量化するため、費用対効果、速くて簡単な方法です。炭水化物の試金で最も問題のある手順は、3.2.1 の手順と 3.3.2-3.3.4 です。ここでは、チューブの直立物を保つため、沸騰、水の導入はサンプルを希釈し、定量の正確さに影響を与えるときも、screwcaps を強化するが重要です。また、ケアはフェノールを操作するときに撮影する必要があります、両方とも腐食性の高い硫酸酸を集中しました。私たちは 490 の nm は、六炭糖の最大吸光度がないその他の糖類、ペントースなどと 480 nm20,21最大吸光度を持つウロン酸でサンプルの吸光度を記録を提唱するに注意してください。植物のサンプル、490 の砂糖の混合物の nm は全体的な炭水化物コンテンツ22,23,24、定量化するため適切な波長を提供しますが、糖の種類の詳細な分析は、20を参照してください。 21。必要がありますその益子らを注意23は、フェノール-硫酸酸性糖分析のための合理化されたマイクロ プレート法を提供します。
植物栄養コンテンツ25,26,27を求める別の注目すべき方法は、近赤外分光法 (NIRS) です。農業で放医研の技術を用い、食糧生産。この方法は、非侵襲的、非破壊、任意の湿式化学法に要する時間が大幅に短縮、植物組織の個々 の部分に横からさまざまなスケールで適用できます。この手法は栄養素を直接測定し、校正のための興味の植物化学物質の正確な湿式化学測定に依存しています。記載方法には、校正は可溶性と消化栄養素の定量化に基づくし、非栄養元素代理によるバイアスではないことを確保する、植物栄養分析の将来重要な場所があ。
植物性の水溶性タンパク質を測定するために紹介した方法と可消化炭水化物含有環境生物科学にとって重要な意義があります。植物組織の組成に関する情報の富にもかかわらず植物栄養素内容に関する情報がひどく欠けています。コンテンツ ・栄養コンテンツと高い順生態学的プロセスは、この種のデータの取得工場との強い関係を認めるが不可欠栄養素と元素対策の関連付けに存在する制限を与え植物生理学、栄養生態学、植物-植食者の相互作用、食物網動態11,28,29,30のフィールドを進んでいます。それ、植物性水溶性タンパク質と消化性の炭水化物含量を測定する明確かつ親しみやすい方法論を提供することを収集し、今後の研究にこの種のデータを組み込む研究者を奨励する願っています。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
おかげで甘いトウモロコシのフィールドのコレクションと支援してきた私たちのコラボレーターのすべて、ラボック、テキサス州のドミニク ・ Reisig とダン モット ノースカロライナ州立大学、テキサス A & M 大学でパット ポーターを含みます。フィオナを Clissold にプロトコルの最適化を支援するため、この原稿の編集を提供するための感謝します。この仕事に支えられ一部にテキサス A & M C. エヴァレット Salyer 親睦 (昆虫学科) とバイオ テクノロジー リスク評価助成プログラム競争は、米国農務省から号 2015-33522-24099 を付与 (ガスに与えられるとSTB)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| microplate reader (spectrophotometer) | Bio-Rad | Model 680 XR | |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent concentrate | Bio-Rad | #5000006 | 450mL |
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