Summary
Wir präsentieren Protokolle hierin für High Yield Isolierung des physiologisch aktiven Thylakoids und Protein Transport Assays für die Chloroplasten Twin Arginin Translokation (CpTat), sekretorische (cpSec1) und Signalwege Anerkennung Teilchen (CpSRP).
Abstract
Chloroplasten sind die Organellen in grünen Pflanzen verantwortlich für zahlreiche wichtige Stoffwechselwege, die vor allem Photosynthese. Innerhalb der Chloroplasten der Thylakoidmembran-Membran-System beherbergt die photosynthetische Pigmente, Reaktion-Zentrum-komplexe und die meisten der Elektron-Träger, und ist verantwortlich für Licht-abhängige ATP-Synthese. Über 90 % der Chloroplasten Proteine sind im Zellkern codiert, übersetzt in die Zellflüssigkeit und anschließend in die Chloroplasten importiert. Protein-Weitertransport in oder über der Thylakoidmembran Membran nutzt eine der vier Translokation Wege. Hier beschreiben wir eine hochverzinsliche Methode zur Isolierung von Transport-kompetente Thylakoids aus Erbsen (Pisum Sativum), zusammen mit Transport-Assays durch drei Energie-abhängige CpTat, cpSec1 und CpSRP-vermittelten Signalwege. Diese Methoden ermöglichen Experimente bezüglich Thylakoidmembran Protein Lokalisierung, Transport-Energetik und die Mechanismen der Protein Translokation über biologische Membranen.
Introduction
Fast alle die proteinhaltige Maschinen verantwortlich für die ordnungsgemäße Chloroplasten Funktion muss aus dem Zytosol1umgesiedelt werden. Die Chloroplasten-Umschläge sind Protein Substrate durch das Translocon der äußeren Membran (TOC) und die Translocon der inneren Membran (TIC)2eingeführt. Weitere Ausrichtung auf die Thylakoidmembran erfolgt Membran und Lumen durch Twin Arginin Translokation (CpTat)3, die sekretorischen (cpSec1)4, Signal Anerkennung Teilchen (CpSRP)5, und die spontane Aufnahme Wege6 . Eine Methode für die High Yield Isolierung der physiologisch aktiven Chloroplasten und der Thylakoidmembran Membranen ist notwendig zur Messung der Energetik und Kinetik einer Translokation Veranstaltung, zu die vielfältigen Transportmechanismen in jeder Weg zu verstehen und zu lokalisieren eine bestimmtes Protein Substrat für eines der sechs verschiedene Fächer der Chloroplasten von Interesse.
Die Isolation der Membranen aus den Chloroplasten bietet bessere experimentelle Kontrolle über Umweltfaktoren (z. B. Salz und Substrat-Konzentrationen, die Anwesenheit von ATP/GTP und pH-Bedingungen), die die Messung der Transport Energetik zu beeinflussen und Kinetik. Dieser in-vitro- Umgebung eignet sich für die Erforschung der mechanistischen Details der Translokation aus den gleichen Gründen. Darüber hinaus während predictive Software für die Lokalisierung der Chloroplasten Proteine7,8verbessert hat, bieten in-vitro- Transport-Assays einer schnelleren Methode zur Bestätigung über Mikroskopie-basierte fluoreszierenden Proben, die erfordern Sie eine genetisch codierte fluoreszierende Tag, Pflanzentransformation und/oder spezifische Antikörper. Hier präsentieren wir Ihnen Protokolle für Chloroplasten und Thylakoidmembran Isolationen von Erbsen (Pisum Sativum), sowie für Transport-Assays für jeden der die ENERGIEABHÄNGIGE Thylakoidmembran Translokation Wege optimiert.
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Protocol
1. erste Materialien
- Ca. 55 g Erbsen für 3 Stunden in 400 mL destilliertem Wasser einweichen und dann säen in einem Plastikbehälter (35 cm x 20 cm x 6 cm) im Boden mit dünnen Schicht von Vermiculit bedeckt.
- Wachsen Sie das Tablett mit Erbsen bei 20 ° C unter 12/12 h hell/dunkel (50 µE/m2s)-Zyklus für 9 bis 15 Tage.
- Bereiten Sie Protein Substrat nach eine bevorzugte Methode.
Hinweis: Haben wir Protein Substrate mit einer Vielzahl von Methoden, einschließlich 1) in-vitro- Transkription von gereinigte Plasmide gefolgt von Übersetzung mit WEIZENKEIM-Extrakte oder Kaninchen Retikulozytenzahl Lysates in Gegenwart von [3H]-Leucin oder [35S]-Methionin, 2) in-vitro- Übersetzung mit einem gekoppelten Transkription/Übersetzung-Kit wie die TnT-kits von Promega mit enzymatische wie oben beschrieben, und 3) Reinigung des überexprimieren Protein in E. Coli. Radioaktiven in-vitro- Übersetzung-Produkte sind in der Regel mit 50 mM kalt Aminosäure vor dem Gebrauch im Transport Reaktionen abgeschreckt. Jede dieser Methoden erfordert in der Regel einige Optimierungen für jedes neue Protein-Substrat. Ein Beispiel für eine gekoppelte in-Vitro -System finden Sie unter Ling und Jarvis (2016)9.
(2) Chloroplasten Isolation und Quantifizierung
Hinweis: Der erste Schritt bei der Vorbereitung des Thylakoids ist die Isolierung der intakten Chloroplasten10. Alle Materialien sollten während der Zubereitung kühl gelagert werden. Wiederfreisetzung des Chloroplasten sollte schonend behandelt werden, da Bruch bei diesem Schritt anschließenden Thylakoidmembran Ertrag erheblich einschränken kann.
- Bereiten Sie nach Lösungen im voraus.
- 2 x Schleifen Puffer (2xGB): 100 mM K-HEPES pH 7.3, 660 mM Sorbit, 2 mM MgCl2, 2 mM MnCl2, 4 mM EDTA, 0,2 % BSA.
- 2 x Importpuffer (2xIB): 100 mM K-Tricine oder K-HEPES pH 8.0, 660 mM Sorbit, 8 mM MgCl2.
Hinweis: Ohne erkennbare Unterschiede wurden Konzentrationen von MgCl2 von 3 mM bis 10 mM verwendet.
- Bereiten Sie eine kontinuierliche dichtegradient durch Zentrifugieren eine Mischung aus 15 mL Percoll und 15 mL 2xGB 30.900 g in einem festen Winkel-Rotor für 30 min bei 4 ° C mit der Bremse aus.
- Ca. 25 g 9-15 Tage alten Erbsen ernten und in 95 mL 1xGB zu homogenisieren. Entweder einen Mixer mit geschärften klingen oder ein Polytron wurden erfolgreich eingesetzt. Filtern Sie diese Mischung durch mindestens 2 Schichten von Miracloth in einem Trichter.
Hinweis: Begrenzung der Höhe der Stammzellen Gewebe ist nicht notwendig aber erleichtern den Prozess der Homogenisierung, wodurch es Chloroplasten-Bruch, die mit längeren blending auftreten können. - Pellet-3.000 g in eine schwingende Eimer Rotor für 5 min bei 4 ° C, und sanft in 1 mL 1xGB aufzuwirbeln. Ein Pinsel kann die sanfteste Wiederfreisetzung Technik sein.
- Sorgfältig Schicht die grüne Suspension auf die Percoll Farbverlauf und Zentrifuge bei 8.000 g in eine schwingende Eimer Rotor für 10 min bei 4 ° C mit der Bremse aus.
- Ernten Sie sorgfältig das untere grüne Band mit intakten Chloroplasten in ein frisches Gefäß. Drehen Sie die wiederhergestellten intakten Chloroplasten bei 1.800 g in eine schwingende Eimer Rotor für 5 min bei 4 ° C, verwerfen Sie den überstand und Aufschwemmen Sie sanft das Pellet in 1xIB. Wiederholen Sie diese Waschschritt noch einmal resuspending in 30 mL 1xIB jedes Mal mit der endgültigen Wiederfreisetzung in 1 mL 1xIB.
- Quantifizierung der Chlorophyllgehalt (Chl) mischen Sie 10 µL voll resuspendierte Chloroplasten mit 5 mL 80 % Aceton und Filter durch Filterpapier Whatman 1 (Nenndicke 180 µm). Aufnehmen der Extinktion bei 720 nm, 663 nm und 645 nm in einem Spektrophotometer und berechnen die Chl-Konzentration mit Hilfe der folgenden Formel11:
[Chl] mg/mL = [40.2* (ein663 – ein720) + 101.4* (A645 – ein720)] * 0,1 - Chloroplasten, 1 mg/mL Chl Entsprechungen mit 1xIB anpassen.
3. Isolierung des Thylakoids
Hinweis: Thylakoids sind durch hypotone Lyse der intakten Chloroplasten vorbereitet. Dies wird erreicht, indem man die Chloroplasten in eine Hypotonische Puffer fehlt Sorbit. Isolierte Thylakoids eignet sich für die Prüfung eines die Translokation Wege muss, Stromale Extrakt (SE) jedoch auch isoliert während dieser Vorbereitung sind entweder cpSec1 oder CpSRP Wege untersucht werden.
- Bereiten Sie vor der Zeit die folgenden Lösungen.
- Hypotone Lysis Puffer: 50 mM K-Tricine oder K-HEPES pH 8.0, 8 mM MgCl2.
- 2 x grobe Stroma-Puffer (für Konzentration der SE): 100 mM K-HEPES pH 8.0, 660 mM Sorbit, 8 mM MgCl2.
- Laemmli Probenpuffer (für SDS-PAGE, ergänzt mit EDTA): 125 mM Tris pH 6,8, 10 % SDS, 20 % Glycerin, 0,05 mg/mL Bromophenol blue, 10 % β-Mercaptoethanol, 10 mM EDTA.
- Wenn SE Wiederherstellung nicht erforderlich ist, Zentrifugieren der intakten Chloroplasten bei 1.000 g in eine schwingende Eimer Rotor für 6 min bei 4 ° C.
- Verwerfen Sie den überstand und Aufschwemmen Sie bis 1 mg/mL in hypotone Lysis Puffer. Inkubation auf Eis im Dunkeln für 10 min, mit gelegentlichen mischen.
- Thylakoids durch Zentrifugieren bei 3.200 g in schwingende Eimer Rotor für 8 min bei 4 ° c zu erholen Waschen Sie die Thylakoids zweimal, jeweils mit 1 bis 2 mL Lyse-Puffer resuspending. Mit 1 mL 1xIB aufschwemmen und requantify Chl als oben in den Chloroplasten-Isolierung-Protokoll.
4. Stromazellen Extrakt Erholung und Konzentration
- Wenn SE Wiederherstellung erforderlich ist, teilen Sie die intakten Chloroplasten in 600 µL-Aliquots in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen und Zentrifugieren Sie jedes Rohr bei 1.000 g in schwingende Eimer Rotor für 6 min bei 4 ° c
Hinweis: Dieser Band ist praktisch, wenn mit 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen, die Störung des späteren Pellets für passives Membranen zu verhindern hilft.- Bis 1 mg/mL Chl in hypotone Lysis Puffer Aufschwemmen Sie und inkubieren Sie auf Eis im Dunkeln für 10 min, wie in Schritt 3.2.1.
- Jedes Rohr bei 3.200 X g in schwingende Eimer Rotor für 8 min bei 4 ° C zentrifugiert und die hellen grünen oder gelben überstand folgende Chloroplasten Lyse zu einem neuen Microcentrifuge Schlauch mit ein gleiches Volumen von 2 x grobe Stroma Puffer übertragen.
- Thylakoids mit 2 Bände der Lyse Puffer (annähernd 0,5 mg/mL) waschen und sammle durch Zentrifugation bei 3.200 g in schwingende Eimer Rotor für 8 min bei 4 ° c Aufschwemmen Sie bis 1 mg/mL Chl in 1xIB auf Eis.
- Zentrifugieren Sie grobe Stroma bei 42.000 g in einem festen Winkel-Rotor für 30 min bei 4 ° C, Reste Membranen zu entfernen. Immunoblotting für äußeren und inneren Umschlag Proteine kann verwendet werden, um die Reinheit des Überstands zu überprüfen.
- Sammeln Sie 95 % des Volumens aus jeder Tube, ohne zu stören die kleinen gelb-grün-Pellets. Beachten Sie das Volumen jedes Röhrchen entnommen.
- Zur Vorbereitung des konzentrierten Stromazellen Extraktes (SE) bündeln Sie die gesammelten Überstände und konzentrieren Sie fünffache mit einem 4 mL 30 kDa MWCO Konzentrator zu.
Hinweis: SE vorbereitet auf diese Weise entspricht Stroma abgeleitet aus Chloroplasten bei 2,5 mg/mL CHL. Falls erforderlich, kann SE um das Zehnfache auf 5 mg/mL Chl äquivalente konzentriert sein. SE wird goldener Farbe und zähflüssig sein. Dies erfordert in den Lab Legende RT Zentrifuge mit schwingenden Eimer Rotor ca. 10 min pro mL konzentriert.
5. transport durch die CpTat Weg
Hinweis: Im Gegensatz zu den cpSec1 oder CpSRP, der CpTat Weg erfordert nicht lösliche Bestandteile oder exogen Energiequellen hinzugefügt; nur der lichtgetriebenen Proton Motor ist erforderlich3. Daher nur vereinzelte Thylakoids und Substrat Protein sind erforderlich für den Assay. Typische Substrate sind Übergangsformen von den 17 kDa (wie in Abbildung 1zu sehen) bzw. 23 kDa-Untereinheiten der Sauerstoff entwickelt komplexe, iOE17 und iOE23, aber Vorläufer Formen, prOE17 und prOE23, kann auch erfolgreich transportiert werden. Vorläufer-Formen haben die gesamte zweiseitige N-terminale targeting-Sequenz, während Zwischenformen nur die Thylakoidmembran targeting Sequenz.
- Bereiten Sie CpTat Transport-Mix mit 0,33 mg/mL Chl Thylakoids, 5 mM ATP aus einem Lager in 1xIB und 8 mM Dithiothreitol (DTT) aus einem Lager in 1xIB, auf Eis zubereitet zubereitet. ATP ist nicht unbedingt erforderlich, für diese Reaktion, wenn unter Beleuchtung durchgeführt.
- Initiieren Transport durch die Einführung von 01:30 Volumen durch Volumen Substrat Protein in den Transport mischen. Wenn Substrat Protein in 1xIB nicht bereit ist, bereiten Sie eine 1:1 Verdünnung mit 2xIB zuerst, dann verwenden 01:30 Volumen von Volumen des verdünnten Substrates in den Transport-Mix.
Hinweis: Konzentrationen des Substrates variiert je nach Art der Zubereitung. In der Regel werden in Vitro Vorbereitungen für nanomolaren mikromolaren Beträge ermöglichen, während Überexpression mikromolaren millimolaren Beträge ermöglichen wird. Nachweismethoden sind auch berücksichtigen, wie Autoradiographie und Fluorography empfindlicher als Immunoblotting sind. - Beleuchten Sie die Aufhängung in 80-100 µE/m2s der photosynthetisch aktiven Strahlung (PAR) für 10 min bei Raumtemperatur. Wenn Transport Kinetik erforderlich sind, bereits equilibrate Thylakoids und Reaktion Mischung auf Raumtemperatur und für bis zu 30 min beleuchten.
- Stoppen Sie Transportreaktion mit einem 8-fold Verdünnung der eiskalte 1xIB zu und wieder Thylakoids durch Zentrifugation bei 3.200 g in Microcentrifuge für 5 min bei 4 ° C.
- Entfernen Sie verbleibende Substrat, das nicht transportiert wurde, Aufschwemmen der Thylakoidmembran Pellet in 120 µL 1xIB und externen Protein zu verdauen, durch Zugabe von 6 µL von 2 mg/mL Thermolysin und 10 mM CaCl2 in 1xIB.
- Brüten Sie die Protease-Reaktion für 40 min auf Eis, und dann stillen Sie die Protease durch Verdoppelung mit 25 mM EDTA vorbereitet in 1xIB zu.
- Thylakoids durch Zentrifugieren bei 3.200 g in einem Microcentrifuge für 5 min bei 4 ° c zu erholen Waschen Sie wiederhergestellte Thylakoids in 120 μl 5 mm EDTA in 1xIB und Übertragung auf einen neuen Schlauch.
- Zentrifugieren Sie bei 3.200 g in einem Microcentrifuge für 5 min bei 4 ° C. In einem entsprechenden Volumen von Laemmli Probenpuffer ergänzt mit 10 mM EDTA aufzuwirbeln. Ein Volumen von 40 µL ist in der Regel genug zu erkennen Substrat auf einem SDS-PAGE-Gel und schont Probe für Wiederholung bei Bedarf Gele.
- Proben in ein kochendes Wasserbad für 10 min und Analysieren von SDS-PAGE. Autoradiographie, Fluorography oder westliche Beflecken von gebietsfremden oder Epitop-markierten Proteinen haben erfolgreich eingesetzt für die Erkennung von transportierten Proteine.
6. transport durch den cpSec1 Weg
Hinweis: Transport durch die cpSec1-Translocon erfordert die Stromazellen Protein cpSecA112,13, beschafft durch Überexpression in E. Coli14,15 oder durch die Konzentration Stroma wiederhergestellt werden können während der Thylakoidmembran isoliert. Eine typische Substrat ist der 33 kDa-Untereinheit des Sauerstoffs entwickelt komplexe (prOE33), wie in Abbildung 2dargestellt.
- Bereiten Sie den cpSec1-Transport-Mix mit 0,33 mg/mL Chl Thylakoids, 0,83 mg/mL Chl gleichwertige SE oder 1,5 μg rekombinantes cpSecA1 und 5 mM ATP auf Eis, und 10 min inkubieren. Eine typische Transport Reaktionsgemisch hier ist 72 μL von 60 μl aufgrund der SE Zusatz.
- Wenn rekombinante cpSecA1 statt SE genutzt werden, gereinigtes cpSecA1 mit einem gleichen Volumen des 2xIB anpassen, dann verdünnen zu einer bequemen Konzentration die Transport-Reaktionen (z. B. 0,75 µg/µL) hinzu.
Hinweis: Für die langfristige Lagerung, cpSecA1 lagert auf Eis in einem kontrollierten, gekühlten Raum nach der Reinigung als Einfrieren schafft Aktivität.
- Wenn rekombinante cpSecA1 statt SE genutzt werden, gereinigtes cpSecA1 mit einem gleichen Volumen des 2xIB anpassen, dann verdünnen zu einer bequemen Konzentration die Transport-Reaktionen (z. B. 0,75 µg/µL) hinzu.
- Initiieren Transport durch die Einführung von 01:10 Volumen durch Volumen Substrat Protein für den Transport mischen. Wenn Substrat Protein in 1xIB nicht bereit ist, bereiten Sie eine 1:1 Verdünnung mit 2xIB und den Transport Mix fügen Sie 01:10 Volumen von Volumen des verdünnten Proteins hinzu.
- Inkubieren Sie die Reaktion bei Raumtemperatur für 10 min unter 80 – 100 µE/m2s PAR. Wiederum können längere Zeiten für Kinetik oder bestimmten Substraten erforderlich sein.
- Nach der Lichtbehandlung, verdünnen 8-fach mit eiskalten 1xIB und Zentrifuge Reaktionen bei 3200 g in Microcentrifuge für 5 min bei 4 ° C.
- Thermolysin behandelt und mit EDTA als oben in Schritten 5,5 bis 5,7 ablöschen.
- Zentrifugieren bei 3.200 g in Microcentrifuge für 5 min bei 4 ° C und das Pellet in einem entsprechenden Volumen von Laemmli Probenpuffer ergänzt mit 10 mM EDTA Aufschwemmen. Legen Sie im kochenden Wasserbad für 10 min vor der Verladung auf SDS-PAGE Gel.
7. Aufnahme durch die CpSRP Weg
Hinweis: Die CpSRP-vermittelte Integration von Licht, die Ernte komplexe Proteine (LHCP) in Abbildung 3 zu sehen erfordert cpSRP54, cpSRP43 und CpFtsY16. Diese Komponenten sind die Transportreaktion durch konzentrierte Stromazellen Extrakt, für den cpSec1-Transport-Protokoll zur Verfügung gestellt.
- Bereiten Sie die CpSRP Mix mit 0,33 mg/mL Chl Thylakoids, 0,83 mg/mL entspricht SE Chl und 5 mM ATP auf Eis zu transportieren und 10 min inkubieren.
- Initiieren Transport durch die Einführung von 01:10 Volumen durch Volumen Substrat Protein für den Transport mischen. Wenn Substrat Protein in 1xIB nicht bereit ist, bereiten Sie eine 1:1 Verdünnung mit 2xIB und den Transport Mix fügen Sie 01:10 Volumen von Volumen des verdünnten Proteins hinzu.
- Inkubieren Sie Reaktion bei Raumtemperatur für 10 min bei 80 – 100 µE/m2s PAR.
- Nach der Lichtbehandlung, verdünnen 8-fach mit eiskalten 1xIB und Zentrifuge Reaktionen bei 3.200 g in Microcentrifuge für 5 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen und das Pellet in 120 µL 1xIB Aufschwemmen.
- Thermolysin als oben in den Abschnitten 5,5 bis 5,7 behandeln. Thermolysin Verdauung ist hier notwendig, erfolgreiche Membran Integration zu bewerten. Waschen Sie wiederhergestellte Thylakoids in 120 μl 5 mm EDTA in 1xIB und Übertragung auf einen neuen Schlauch.
- Zentrifugieren bei 3.200 g in Microcentrifuge für 5 min bei 4 ° C und Aufschwemmen der Pellet wieder in einem entsprechenden Volumen von 2 X Laemmli-Puffer mit 10 mM EDTA ergänzt. Legen Sie im kochenden Wasserbad für 10 min vor der Analyse von SDS-PAGE.
Hinweis: Die Integration von Reifen LHCP (mLHCP) bemisst sich durch das Auftreten von einer Protease-geschützte Abbauprodukt (mLHCP-D) ca. 1,5-2 kDa kleiner als die uncleaved mLHCP17.
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Representative Results
Um erfolgreich transportiert Substratmenge einschätzen zu können, ist es sinnvoll, einen oder mehrere "prozentuale Eingabe" Bahnen gehören. Für die unten dargestellten Daten wurde 10 % des endgültigen Transportreaktion ohne Thylakoids verwendet. Diese "prozentuale Eingabe" hilft auch, um die Größe des Substrats Vorläufer zu visualisieren. Der Prozentsatz ist eine bekannte und definierte Menge an Substrat mit denen zu vergleichen, die transportiert Substrat gegen und kann skaliert werden oben oder unten wie nötig verwenden zunächst Protein vorbereitet. Darüber hinaus ist es ratsam, weniger als 4 µg Chl Äquivalente in eine einzige Spur auf 0,75 mm Polyacrylamid-Gele Band verziehen und Verschmieren zu vermeiden zu laden. Alle Substrate unten waren vorbereitet und radioaktiv mit in-vitro- Übersetzung-Kits.
Transport von iOE17 durch CpTat Weg
Abbildung 1 . Transport von iOE17through den CpTat Weg. Fluorograph von [3H]-iOE17 Transport-Assay und Thermolysin Behandlung des Substrats nicht transportiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Erfolgreiche CpTat Transport von den meisten Tat Substrate kann durch eine Verschiebung der Größe nach Spaltung der N-terminale Signal-Peptid3erkannt werden. In Substraten keine spaltbaren Signalpeptid18,19 besteht, ist Protease Behandlung erforderlich, um das Substrat zu offenbaren, das die Membran, dadurch immer unzugänglich für die Verdauung durch die Protease gekreuzt. In Abbildung 1verarbeitet Transport des iOE17 ergibt eine Größe-Verschiebung von ca. 2-3 kDa zwischen dem eingeführten Substrat und die ausgereifte Form. Non-transportiert Substrat wird durch Protease-Behandlung (Bahn 4) abgebaut.
Transport von prOE33 durch cpSec1 Weg
Abbildung 2 . Transport von prOE33 durch cpSec1 Weg. Autoradiograph [35S]-prOE33-Transport-Assay mit SE, gereinigtes cpSecA1 oder beides gleichzeitig. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Transport durch den cpSec1 Weg (Abbildung 2) kann durch eine Verschiebung der Größe in der Reife Substrat ausgewertet werden, wenn das Substrat eine spaltbaren Thylakoidmembran targeting Signal sowie Protease Schutz transportierte Substrat20enthält.
Integration von PrLHCP durch CpSRP Weg
Abbildung 3 . Integration von PrLHCP durch CpSRP Weg. Autoradiograph [35S]-PrLHCP und die Verdauung, die Produkt-mLHCP-D nach dem Einfügen in die Thylakoidmembran Membran. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Einfügen von PrLHCP in die Thylakoidmembran Membran über den CpSRP Weg kann durch Thermolysin Verdauung ausgewertet werden. Eine Verschiebung der Größe von ca. 1,5-2 kDa ist bezeichnend für erfolgreiche Membran einsetzen wie die Membran das uncleaved Reife Protein von vollständige Proteolyse15schützt. In Abbildung 3ist die Protease-geschützte Produkt mLHCP-D deutlich sichtbar.
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Discussion
Chloroplasten und Thylakoidmembran isolation
Übermäßiger Bruch führt in armen Chloroplasten Isolierung und damit schlechte Thylakoidmembran nach Trennung im Verlauf ergeben. Es empfiehlt sich, die geerntete Gewebe sanft zu homogenisieren, indem sichergestellt wird, dass sämtliches Material eingetaucht ist, vor dem Mischen und pulsieren in 15 s Zyklen bis vollständig homogenisiert. Verwenden Sie ggf. mehrere kürzere Runden mit weniger Gewebe in jeder Runde.
Kühl-alle Materialien, die geernteten Gewebe in Berührung hilft isolierte Chloroplasten, Aktivität bis zu 2 Stunden zu behalten. Es ist wichtig, die Chloroplasten auf Eis nach Isolierung als auch im Dunkeln zu halten.
Es ist wichtig, Magnesium in Puffer Kontaktaufnahme mit isolierten Thylakoids aufzunehmen. Andernfalls führt zu granal Entstapelung und wirkt sich kritisch auf die Generation der Proton treibende Kraft bei der Beleuchtung21. Thylakoids wurden im Verkehr Reaktionen zu 2 Stunden nach der Isolation bei der auf dem Eis und im Dunkeln gehalten eingesetzt.
Optimierung der Transport Reaktionen
Isolierte Thylakoids schnell zu begleichen und ungleiche Chl Entsprechungen zwischen Reaktionen führen kann. Als solches ist es wichtig, die Thylakoids gründlich vor der Anwendung vor allem bei der Einrichtung einer großen Anzahl von Proben, mischen.
Der Tat Weg
Transporteffizienz durch die Tat Weg auf übermäßiges Waschen von den Thylakoids seit Tha4 reduziert werden (TatA) kann teilweise aus der Membran22extrahiert werden. In solchen Fällen ist es hilfreich, die Thylakoidmembran waschen Schritte vor der Transportreaktion zu reduzieren. Darüber hinaus können längere Beleuchtung Zeiten Erkennung verbessern, wo Substrate schlecht unter typischen Bedingungen transportiert werden.
CpSec1 Weg
Wenn die cpSec1 Weg zu prüfen, sollte die Menge an cpSecA1 in konzentrierter SE Transport, unterstützen, sondern dass Transport schwach sein kann. Effizienter Transport in isolierten Thylakoids kann durch die Zugabe von gereinigten cpSecA1 für bestimmte Proteine profitieren, obwohl Stromazellen Chaperone in SE auch helfen können, die Effizienz der Transport15. Vorbereitungen des cpSecA1 Proteins sollte weiter, nicht vor dem Gebrauch im Verkehr, eingefroren werden, da dies Transportaktivität reduziert. Ebenso ist gefrorene SE weniger wirksam als frisch zubereitete Extrakt. Wie Tat Transport helfen längere Inkubationszeiten in der Transport-Mischung bei schwierigen Untergründen.
CpSRP Weg
Während Rekonstruktion des CpSRP Verkehr mit einzelnen Komponenten durchgeführten23gewesen ist, ist es zweckmäßig, cpSRP43, cpSRP54, liefern und CpFtsY SE Thermolysin Widerstand ist die strengsten Kriterien für die lhcp-Integration16, 17, aber alkalischen Extraktion kann als gut17durchgeführt werden. Während Vorstufen oft eingefroren und bei-80 ° C für viele Transport-Reaktionen gespeichert werden können, sollten PrLHCP von in-vitro- Synthese vorbereitet für den Transport sofort nach der Synthese ohne zu frieren verwendet werden.
Charakterisierung eines neuartigen Substrates Targeting ist Weg
In Fällen, wo die Translokation weg genommen durch ein neuartiges Substrat unbekannt ist, ist es ratsam, zuerst mögliche Signal Peptide in Silico mit der Aminosäure-Sequenz der Vorläufer oder Zwischenform zu untersuchen. Der CpTat Weg erfordert in der Regel eine bestimmte Twin Arginin Konsens Motiv in das Signalpeptid und kein ATP für den erfolgreichen Transport unter PAR3. Im Gegensatz zu der Tat Weg erfordert der cpSec1 Weg ATP und das cpSecA1-Protein. Gescheiterten Transport unter Bedingungen fehlen diese Komponenten schlägt die cpSec1 Weg20. Der CpSRP Weg erfordert, dass das Signal Anerkennung Teilchen in der SE Failed gefunden, mit gereinigtem cpSecA1 und ATP zu transportieren, aber ein Mangel an Twin Arginin Konsens Motiv in das Signalpeptid, schlägt die CpSRP Weg23.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Dieses Manuskript wurde mit finanzieller Unterstützung durch die Abteilung von Chemie, Geowissenschaften und Biosciences, 408 Büro der Grundlagenwissenschaften Energie an das US Department of Energy durch Grant DE-SC0017035 vorbereitet
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pisum sativum seeds | Seedway LLC, Hall, NY | 8686 - Little Marvel | |
| Miracloth | Calbiochem, Gibbstown, NJ | 475855-1 | |
| 80% Acetone | Sigma, Saint Louis, MO | 67-64-1 | |
| Blender with sharpened blades | Waring Commercial | BB155S | |
| Polytron 10-35 | Fischer Sci | 13-874-617 | |
| Percoll | Sigma, Saint Louis, MO | GE17-0891-01 | |
| Beckman J2-MC with JA 20 rotor | Beckman-Coulter | 8043-30-1180 | |
| Sorvall RC-5B with HB-4 rotor | Sorvall | 8327-30-1016 | |
| 100 mM dithiothreitol (DTT) in 1xIB | Sigma, Saint Louis, MO | 12/3/83 | Can be frozen in aliquots for future use |
| 200 mM MgATP in 1xIB | Sigma, Saint Louis, MO | 74804-12-9 | Can be frozen in aliquots for future use |
| Thermolysin in 1xIB (2mg/mL) | Sigma, Saint Louis, MO | 9073-78-3 | Can be frozen in aliquots for future use |
| HEPES | Sigma, Saint Louis, MO | H3375 | |
| K-Tricine | Sigma, Saint Louis, MO | T0377 | |
| Sorbitol | Sigma, Saint Louis, MO | 50-70-4 | |
| Magnesium Chloride | Sigma, Saint Louis, MO | 7791-18-6 | |
| Manganese Chloride | Sigma, Saint Louis, MO | 13446-34-9 | |
| EDTA | Sigma, Saint Louis, MO | 60-00-4 | |
| BSA | Sigma, Saint Louis, MO | 9048-46-8 | |
| Tris | Sigma, Saint Louis, MO | 77-86-1 | |
| SDS | Sigma, Saint Louis, MO | 151-21-3 | |
| Glycerol | Sigma, Saint Louis, MO | 56-81-5 | |
| Bromophenol Blue | Sigma, Saint Louis, MO | 115-39-9 | |
| B-Mercaptoethanol | Sigma, Saint Louis, MO | 60-24-2 |
References
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