Summary
Vi presenterar protokoll häri för högavkastande isolering av fysiologiskt aktiva thylakoids och protein transport analyser för kloroplast twin arginin translokation (cpTat), sekretoriska (cpSec1) och signalvägar erkännande partikel (cpSRP).
Abstract
Kloroplaster är organeller i gröna växter ansvarar för att utföra många viktiga metaboliska vägar, främst fotosyntes. Inom kloroplaster, tylakoida membran systemet inrymmer alla fotosyntetiserande pigment, reaktion centrerar komplex och de flesta av de elektron bärarna, och ansvarar för light-dependent ATP-syntes. Över 90% av kloroplast proteiner är kodade i kärnan, översatt i cytosolen och därefter importeras till kloroplast. Ytterligare proteintransport in i eller över det tylakoida membranet använder en av fyra translokation vägar. Här beskriver vi en högavkastande metod för isolering av transport-behöriga thylakoids från ärter (Pisum sativum), tillsammans med transport analyser genom tre energiberoende cpTat, cpSec1 och cpSRP-medierade vägar. Dessa metoder gör det möjligt för experiment som avser tylakoida protein lokalisering, transport Energetik och mekanismerna för protein flyttning över biologiska membraner.
Introduction
Nästan alla av proteinhaltiga maskiner ansvarar för korrekt kloroplast funktion måste vara flyttad från cytosolen1. På kloroplast kuverten importeras protein substrat genom translocon av det yttre membranet (TOC) och translocon av inre membranet (TIC)2. Ytterligare inriktning till tylakoida sker membranet och lumen genom twin arginin translokation (cpTat)3, den sekretoriska (cpSec1)4, signal erkännande partikel (cpSRP)5och den spontana införande vägar6 . En metod för högavkastande isolering av fysiologiskt aktiva kloroplaster och tylakoida membran är nödvändigt att mäta de energetiken och kinetik av en translokation händelse, att förstå de olika transportmekanismer i varje väg, och att lokalisera en visst protein substrat av intresse för någon av de sex skilda fack för kloroplast.
Isolering av membran från kloroplast erbjuder bättre experimentell kontroll över miljöfaktorer (t.ex. salt och substrat koncentrationer, förekomsten av ATP/GTP och pH förhållanden) som påverkar mätningen av transport Energetik och kinetik. Denna in vitro- miljö lämpar sig för utforskandet av mekanistiska detaljerna av flyttning av samma skäl. Dessutom, medan predikterande mjukvara för lokalisering av kloroplast proteiner har förbättrats7,8, ger in vitro- transport analyser en snabbare metod för bekräftelse över mikroskopi-baserade fluorescerande analyser som kräver en genetiskt kodade fluorescerande tagg, växt förvandling och/eller specifika antikroppar. Här presenterar vi protokoll för kloroplast och tylakoida isoleringar från ärter (Pisum sativum), samt för transport analyser optimerad för var och en av energiberoende tylakoida flyttning vägar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. inledande material
- Blötlägg ca 55 g ärtor 3 timmar i 400 mL destillerat vatten och sedan sår i en plastbricka (35 cm x 20 cm x 6 cm) i jord täcks med tunt lager av vermiculit.
- Växa facket av ärter vid 20 ° C under 12/12 h ljus och mörker (50 µE/m2s) cykel för 9 till 15 dagar.
- Förbereda protein substrat enligt en rekommenderad metod.
Obs: Vi har förberett protein substrat med hjälp av olika metoder, inklusive 1) in vitro- transkription från renat plasmider följt av översättning med vetegroddar extrakt eller kanin retikulocyter lysates i närvaro av [3H]-leucin eller [35S]-metionin, 2) in vitro- översättning använda ett kopplat transkription och översättning kit såsom TnT byggsatser från Promega, med radiolabeling som ovan, och 3) rening av överuttryckt protein i E. coli. Radioaktiva in vitro- översättning produkter är allmänt härdas med 50 mM kall aminosyra före användning i transport reaktioner. Dessa metoder kräver normalt vissa optimering för varje ny protein-substrat. Ett exempel på ett kopplat in vitro- system, se Ling och Jarvis (2016)9.
2. kloroplast isolering och kvantifiering
Obs: Det första steget i utarbetandet av thylakoids är isoleringen av intakt kloroplaster10. Allt material bör hållas kallt under beredning. Resuspension av kloroplaster ska hanteras varsamt, eftersom brott i detta steg kan allvarligt begränsa efterföljande tylakoida avkastning.
- Förbered följande lösningar i förväg.
- 2 x slipning buffert (2xGB): 100 mM K-HEPES pH 7,3, 660 mM sorbitol, 2 mM MgCl2, 2 mM MnCl2, 4 mM EDTA, 0,2% BSA.
- 2 x Import buffert (2xIB): 100 mM K-Tricine eller K-HEPES pH 8,0, 660 mM sorbitol, 8 mM MgCl2.
Obs: Koncentrationer av MgCl2 sträcker sig från 3 mM till 10 mM har använts utan observerbara skillnader.
- Förbereda en kontinuerlig täthetlutning genom centrifugering en blandning av 15 mL Percoll och 15 mL 2xGB 30,900 g i en fast vinkel rotor under 30 minuter vid 4 ° C med broms.
- Skörda ca 25 g 9-15 dag gammal ärtor och homogenisera i 95 mL 1xGB. Antingen en mixer med slipade blad eller en Polytron har använts framgångsrikt. Filtrera blandningen genom minst 2 lager av Miracloth i en tratt.
Obs: Begränsa mängden av stem vävnad är inte nödvändigt men kan underlätta processen homogenisering, därigenom minska kloroplast brott som kan uppstå med långvarig blandning. - Pellets på 3 000 g i en svängande hink rotor för 5 minuter vid 4 ° C, och försiktigt Återsuspendera i 1 mL av 1xGB. En pensel kan vara den mest skonsamma resuspension-tekniken.
- Noggrant lager grön fjädringen på toppen av Percoll lutning och centrifugera vid 8000 g i en svängande hink rotor under 10 minuter vid 4 ° C med broms.
- Noggrant skörda lägre gröna bandet som innehåller intakt kloroplaster i en frisk slang. Snurra de återvunna intakt kloroplaster vid 1.800 g i en svängande hink rotor för 5 minuter vid 4 ° C, avlägsna supernatanten och försiktigt återsuspendera pelleten i 1xIB. Upprepa detta tvätta en gång omblandning i 30 mL 1xIB varje gång, med den slutliga resuspension i 1 mL 1xIB.
- För att kvantifiera klorofyllhalt (Chl), blanda 10 µL fullt återsuspenderade kloroplaster med 5 mL 80% aceton och filtrera genom filterpapper Whatman 1 (nominell tjocklek 180 µm). Spela in absorbansen vid 720 nm, 663 nm och 645 nm i en spektrofotometer och beräkna Chl koncentrationen med hjälp av följande formel11:
[Chl] mg/mL = [40.2* (en663 – en720) + 101.4* (en645 – en720)] * 0,1 - Justera kloroplaster 1 mg/ml Chl medel med 1xIB.
3. isolering av Thylakoids
Obs: Thylakoids förbereds av hypoton lys av intakt kloroplaster. Detta uppnås genom att utsätta kloroplaster till en hypoton buffert saknar sorbitol. Isolerade thylakoids kan användas för testmetoder någon av translokation vägar, men stromal extrakt (SE) måste också isoleras under denna beredning om antingen cpSec1 eller cpSRP vägar ska utredas.
- Förbereda före tid följande lösningar.
- Hypoton lyseringsbuffert: 50 mM K-Tricine eller K-HEPES pH 8,0, 8 mM MgCl2.
- 2 x rå Stroma buffert (för koncentration av SE): 100 mM K-HEPES pH 8,0, 660 mM sorbitol, 8 mM MgCl2.
- Laemmli provet buffert (för SDS-PAGE, kompletterat med EDTA): 125 mM Tris pH 6.8, 10% SDS, 20% glycerol, 0,05 mg/mL bromofenolblått, 10% β-merkaptoetanol, 10 mM EDTA.
- Om SE återhämtning inte är nödvändigt, Centrifugera de intakt kloroplaster vid 1000 g i en svängande hink rotor under 6 minuter vid 4 ° C.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera 1 mg/ml i hypoton lyseringsbuffert. Inkubera i isen i mörkret i 10 min, med enstaka blandning.
- Återställa thylakoids genom centrifugering vid 3.200 g i swinging hink rotor i 8 min vid 4 ° C. Tvätta de thylakoids två gånger, omblandning med 1 till 2 mL lyseringsbuffert varje gång. Blandas med 1 mL av 1xIB och requantify Chl som ovan i protokollet kloroplast isolering.
4. stromal extrakt återhämtning och koncentration
- Om det behövs SE återhämtning, dela de intakt kloroplaster i 600 µL portioner i 1,5 mL mikrocentrifugrör och centrifugera varje tub på 1000 g i swinging hink rotor för 6 min vid 4 ° C.
Obs: Denna volym är praktiskt när du använder 1,5 mL mikrocentrifugrör, som hjälper till att förebygga störningar av den slutliga pelleten för resterande membran.- Återsuspendera 1 mg/ml Chl i hypoton lyseringsbuffert och inkubera på is i mörkret i 10 min, som i steg 3.2.1.
- Centrifugera varje rör vid 3,200 x g i swinging hink rotor i 8 min vid 4 ° C och överför ljus gröna eller gula supernatant följande kloroplast Lys till en ny mikrocentrifug rör med en lika stor volym 2 x rå Stroma buffert.
- Tvätta thylakoids med 2 volymer lyseringsbuffert (tillnärma 0,5 mg/mL) och samlar in genom centrifugering vid 3.200 g i swinging hink rotor i 8 min vid 4 ° C. Blandas till 1 mg/mL Chl i 1xIB på is.
- Centrifugera rå stroma vid 42.000 g i en fast vinkel rotor under 30 minuter vid 4 ° C att ta bort kvarvarande membran. Immunoblotting för yttre och inre kuvert proteiner kan användas för att kontrollera renheten av supernatanten.
- Samla in 95% av volymen från varje rör utan att störa de små gul-grön-pelleten. Observera den volym som tas från varje rör.
- För att förbereda koncentrerade stromal extrakt (SE), samman insamlade supernatanterna och koncentrera sig fem gånger med en 4 mL 30 kDa MWCO koncentrator.
Obs: SE beredd på detta sätt är likvärdiga med stroma härrör från kloroplaster vid 2,5 mg/mL Chl. Vid behov kan SE vara koncentrerad tio gånger till 5 mg/mL Chl medel. SE blir gyllene färg och trögflytande. I Labbets Legend RT centrifug med svängande hink rotor, kräver detta ca 10 min per mL koncentrerad.
5. transport genom cpTat vägen
Obs: Till skillnad från den cpSec1 eller cpSRP, den cpTat vägen kräver inte lösliga komponenter eller exogent läggas energikällor. endast ljus-driven proton drivkraft är nödvändiga3. Därför endast isolerade thylakoids och substrat protein krävs för analysen. Typiska substrat är mellanliggande former av de 17 kDa (som kan ses i figur 1) och 23 kDa subenheter av syre utvecklas komplexa, iOE17 och iOE23, respektive, men föregångaren formulär, prOE17 och prOE23, kan också framgångsrikt transporteras. Föregångaren former har hela bipartit N-terminala inriktning sekvensen, medan mellanliggande former har endast den tylakoida inriktning sekvens.
- Förbered cpTat transport mix med 0,33 mg/mL Chl thylakoids, 5 mM ATP från ett bestånd som upprättats i 1xIB, och 8 mM Ditiotreitol (DTT) från en stock som tillagas i 1xIB, på is. ATP är inte strikt nödvändigt för denna reaktion om genomförs under belysning.
- Initiera transport genom att införa 1:30 av volym substrat protein i transport blanda. Om substrat protein inte är beredd i 1xIB, förbereda en 1:1 utspädning med 2xIB först, sedan använda 1:30 volym av volymen av de utspädda substraten i transport mix.
Obs: Koncentrationer av substrat varierar beroende på den förberedelse metoden. In vitro- preparat tillåter vanligtvis för nanomolar mikromolära beloppen, medan överuttryck möjliggör mikromolära millimolar belopp. Identifieringsmetoder måste också beaktas, som autoradiografi och fluorography är mer känsliga än immunoblotting. - Belysa suspensionen i 80-100 µE/m2s av photosynthetically aktiv strålning (PAR) under 10 minuter vid rumstemperatur. Om transport kinetik krävs före jämvikta både thylakoids och reaktion mix till rumstemperatur och lysa för upp till 30 min.
- Stoppa transport reaktionen med en 8-faldig utspädning av iskalla 1xIB och återställa thylakoids genom centrifugering vid 3.200 g i mikrocentrifug för 5 min vid 4 ° C.
- Ta bort återstående substrat som inte transporterats, återsuspendera pelleten tylakoida i 120 µL av 1xIB och smälta yttre protein genom tillsats av 6 µL av 2 mg/mL thermolysin och 10 mM CaCl2 i 1xIB.
- Inkubera proteas reaktionen på is för 40 min och sedan släcka proteasen genom att fördubbla volymen med 25 mM EDTA som tillagas i 1xIB.
- Återställa thylakoids genom centrifugering vid 3.200 g i en mikrocentrifug för 5 min vid 4 ° C. Tvätta återvunna thylakoids i 120 μL av 5 mM EDTA i 1xIB och överföring till en ny tub.
- Centrifugera 3.200 g i en mikrocentrifug för 5 min vid 4 ° C. Återsuspendera i en lämplig volym av Laemmli prov buffert kompletteras med 10 mM EDTA. En volym på 40 µL är vanligtvis nog till upptäcka substratet på ett SDS-PAGE gel och sparar prov för gel, upprepa vid behov.
- Placera prover i kokande vattenbad i ca 10 min och analysera av SDS-PAGE. Autoradiografi, fluorography eller Western blotting av icke-infödda eller epitop-märkta proteiner har framgångsrikt använts för att upptäcka transporteras proteiner.
6. transport genom den cpSec1 vägen
Obs: Transport genom den cpSec1 translocon kräver stromal protein cpSecA112,13, som kan upphandlas via överuttryck i E. coli14,15 eller återvinnas genom att koncentrera stroma under tylakoida isolering. Ett typiskt substrat är den 33 kDa subuniten av syre utvecklas komplexa (prOE33), som kan ses i figur 2.
- Förbereda cpSec1 transport mixen med 0,33 mg/mL Chl thylakoids, 0,83 mg/mL Chl motsvarande europabolags eller 1,5 μg av rekombinant cpSecA1 och 5 mM ATP på isen, och inkubera i 10 min. En typisk transport reaktionsblandningen här är 72 μL, upp från 60 μl på grund av SE tillägg.
- Om rekombinant cpSecA1 kommer att användas i stället för att SE, justera renat cpSecA1 med en lika stor volym av 2xIB och späd till en bekväm koncentration att lägga till transport reaktioner (t.ex. 0,75 µg/µL).
Obs: För långtidsförvaring, lagras cpSecA1 på isen i en kontrollerad, kylda rum efter rening som frysning avskaffar aktivitet.
- Om rekombinant cpSecA1 kommer att användas i stället för att SE, justera renat cpSecA1 med en lika stor volym av 2xIB och späd till en bekväm koncentration att lägga till transport reaktioner (t.ex. 0,75 µg/µL).
- Initiera transport genom att införa 1:10 av volym substrat protein till transport blanda. Om substrat protein inte är beredd i 1xIB, förbereda en 1:1 utspädning med 2xIB och Lägg till 1:10 av volym av proteinet utspädda transport mixen.
- Inkubera reaktionen vid rumstemperatur i 10 min under 80 – 100 µE/m2s PAR. Igen, längre gånger kan vara nödvändigt för kinetik eller vissa substrat.
- Efter ljusbehandlingen, späd 8-fold med iskall 1xIB och centrifugera reaktioner på 3200 g i mikrocentrifug för 5 min vid 4 ° C.
- Behandla med thermolysin och släcka med EDTA som ovan i steg 5,5 genom 5,7.
- Centrifugera 3.200 g i mikrocentrifug för 5 min vid 4 ° C och återsuspendera pelleten i en lämplig volym av Laemmli prov buffert kompletteras med 10 mM EDTA. Placera i kokande vattenbad i ca 10 min före lastning på SDS-PAGE gel.
7. införande genom cpSRP vägen
Obs: CpSRP-medierad integrationen av ljus skörd komplexa proteiner (LHCP) ses i figur 3 kräver cpSRP54, cpSRP43 och cpFtsY16. Dessa komponenter levereras till transport reaktion genom koncentrerade stromal extrakt, som beskrivs för cpSec1 transportprotokoll.
- Förbereda cpSRP transportera mix med 0,33 mg/mL Chl thylakoids, 0,83 mg/mL Chl motsvarande SE och 5 mM ATP på is och inkubera i 10 min.
- Initiera transport genom att införa 1:10 av volym substrat protein till transport blanda. Om substrat protein inte är beredd i 1xIB, förbereda en 1:1 utspädning med 2xIB och Lägg till 1:10 av volym av proteinet utspädda transport mixen.
- Inkubera reaktion i rumstemperatur i 10 min i 80 – 100 µE/m2s PAR.
- Efter ljusbehandlingen, späd 8-fold med iskall 1xIB och centrifugera reaktioner på 3.200 g i mikrocentrifug för 5 min vid 4 ° C. Kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i 120 µL av 1xIB.
- Behandla med thermolysin som ovan i avsnitt 5.5 genom 5,7. Thermolysin matsmältning är nödvändigt här att bedöma framgångsrika membran integration. Tvätta återvunna thylakoids i 120 μL av 5 mM EDTA i 1xIB och överföring till en ny tub.
- Centrifugera 3.200 g i mikrocentrifug för 5 min vid 4 ° C och återsuspendera pelleten igen i en lämplig volym av 2 x Laemmli buffert kompletteras med 10 mM EDTA. Placera i kokande vattenbad i ca 10 min före analys av SDS-PAGE.
Obs: Integration av mogen LHCP (mLHCP) bedöms genom uppkomsten av en proteas-skyddade nedbrytningsprodukt (mLHCP-D) cirka 1,5-2 kDa mindre än uncleaved mLHCP17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att mäta mängden substrat framgångsrikt transporteras, är det användbart att inkludera en eller flera ”procent input” körfält. För de data som presenteras nedan, användes 10% av den slutliga transport reaktionen utan thylakoids. Denna ”procent ingång” bidrar också till att visualisera storleken på föregångaren substratet. Procentsatsen motsvarar en känd, definierad mängd substrat som jämför transporteras substratet mot och kan skalas upp eller ned som nödvändigt använder inledningsvis beredd protein. Dessutom är det lämpligt att läsa mindre än 4 µg av Chl motsvarigheter i en enda körfält på 0,75 mm polyakrylamidgeler att undvika band skevhet och smetar. Alla substrat nedan var beredda och märkt med in vitro- översättning kits.
Transport av iOE17 genom cpTat väg
Figur 1 . Transport av iOE17through cpTat vägen. Fluorograph [3H]-iOE17 transport assay och thermolysin behandling av icke-transporterade substrat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Framgångsrika cpTat transport av de flesta Tat substrat kan upptäckas genom en storlek Skift vid klyvning av den N-terminala signal peptid3. I substrat där ingen cleavable signal peptid finns18,19, krävs proteas behandling att avslöja substratet som passerat membranet, blev därmed otillgängliga för matsmältningen av proteashämmaren. I figur 1behandlas transport av iOE17 resulterar i en storlek-förskjutning av cirka 2-3 kDa mellan introducerade substrat och den mogna form. Icke-transporterade substratet bryts genom proteas behandling (lane 4).
Transport av prOE33 genom cpSec1 väg
Figur 2 . Transport av prOE33 genom cpSec1 väg. Autoradiograph [35S]-prOE33 transport assay med SE, renat cpSecA1, eller båda samtidigt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Transport genom den cpSec1 vägen (figur 2) kan utvärderas genom en storlek Skift i mogen substratet om underlaget innehåller en cleavable tylakoida inriktning signal, samt proteashämmare skydd av transporterade substrat20.
Integration av prLHCP genom cpSRP väg
Figur 3 . Integration av prLHCP genom cpSRP väg. Autoradiograph [35S]-prLHCP och matsmältning till produkt mLHCP-D efter införandet i det tylakoida membranet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Införandet av prLHCP i det tylakoida membranet via den cpSRP vägen kan utvärderas genom thermolysin matsmältningen. En storlek förskjutning av cirka 1,5-2 kDa är vägledande för framgångsrika membran isättning som membran skyddar uncleaved mogna proteinet från komplett proteolys15. I figur 3syns tydligt på Proteas-skyddad produkt mLHCP-D.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kloroplast och tylakoida isolering
Överdriven brott kan resultera i dålig kloroplast isolering och därmed dålig tylakoida avkastning efter separation i övertoningen. Det är bäst att homogenisera skördade vävnaden försiktigt genom att säkerställa att allt material är nedsänkt innan blandning och pulserande i 15 s cykler tills fullt homogeniseras. Om nödvändigt, använda flera kortare rundor av blandning med mindre vävnad i varje omgång.
Kyl alla material som kommer i kontakt med skördade vävnad hjälper isolerade kloroplaster att behålla aktivitet upp till 2 timmar. Det är viktigt att hålla kloroplaster på is i mörkret efter isolering också.
Det är viktigt att inkludera magnesium i buffertar att kontakta isolerade thylakoids. Detta resulterar i granal avstapling och påverkar kritiskt generering av proton drivkraft vid belysning21. Thylakoids har använts i transport reaktioner till 2 timmar efter isolering när den förvaras på is och i mörker.
Optimera transporter reaktioner
Isolerade thylakoids sätter sig snabbt och kan leda till ojämlika Chl medel mellan reaktioner. Som sådan, är det viktigt att blanda thylakoids noggrant före användning, speciellt när du ställer in ett stort antal prover.
Tat vägen
Transporteffektivitet via Tat vägen kan minskas vid överdriven tvättning av thylakoids sedan Tha4 (TatA) delvis kan extraheras från den membran22. I sådana fall är det bra att minska tylakoida tvätta stegen före transport reaktionen. Dessutom kan längre belysning gånger förbättra identifiering där substrat transporteras dåligt under typiska förhållanden.
CpSec1 väg
När testmetoder cpSec1 vägen, bör mängden cpSecA1 i koncentrerad SE stödja transport, men som transport kan vara svag. Effektiva transporter i isolerade thylakoids kan dra nytta av tillägg av renat cpSecA1 för vissa proteiner, även om stromal chaperones i SE kan också bidra till att öka effektiviteten i transport15. Ytterligare, beredningar av cpSecA1 protein bör inte frysas före användning inom transportsektorn, eftersom detta minskar transportverksamhet. Likaså är fryst SE mindre effektiv än nylagade extrakt. Liksom i Tat transport, kan inkubation längre i transport mix hjälpa med svårt substrat.
CpSRP vägen
Beredning av cpSRP transport användning av individuella komponenter har varit utförda23, det är bekvämt att leverera cpSRP43, cpSRP54, och cpFtsY SE. Thermolysin motstånd är de strängaste kriterierna för LHCP integration16, 17, men alkalisk extraktion kan utföras som väl17. Även prekursorer kan ofta frusen och lagras vid-80 ° C för många transporter reaktioner, bör prLHCP utarbetats av in vitro- syntesen användas för transport omedelbart efter syntes utan att frysa.
Karakterisering av romanen substrat inriktning väg
I fall där translokation vägen fattats av romanen substrat är okänd, är det lämpligt att först undersöka möjliga signal peptider i silico med den amino syra ordnar föregångare eller mellanform. Den cpTat vägen kräver vanligtvis en specifik twin arginin samförstånd motiv i signal peptiden och ingen ATP för framgångsrika transport under PAR3. Till skillnad från Tat vägen kräver den cpSec1 vägen ATP och proteinet cpSecA1. Misslyckade transporter i förhållanden som saknar dessa komponenter tyder på cpSec1 väg20. Den cpSRP vägen kräver signal erkännande partikeln hittade i den SE. misslyckades transport med hjälp av renat cpSecA1 och ATP, men brist på twin arginin samförstånd motiv i signal peptiden, antyder den cpSRP väg23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta manuskript var beredd med finansiering av Division of Chemical Sciences, geovetenskaper och biovetenskaper, 408 Office för grundläggande Energivetenskaper av oss Department of Energy genom Grant DE-SC0017035
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pisum sativum seeds | Seedway LLC, Hall, NY | 8686 - Little Marvel | |
| Miracloth | Calbiochem, Gibbstown, NJ | 475855-1 | |
| 80% Acetone | Sigma, Saint Louis, MO | 67-64-1 | |
| Blender with sharpened blades | Waring Commercial | BB155S | |
| Polytron 10-35 | Fischer Sci | 13-874-617 | |
| Percoll | Sigma, Saint Louis, MO | GE17-0891-01 | |
| Beckman J2-MC with JA 20 rotor | Beckman-Coulter | 8043-30-1180 | |
| Sorvall RC-5B with HB-4 rotor | Sorvall | 8327-30-1016 | |
| 100 mM dithiothreitol (DTT) in 1xIB | Sigma, Saint Louis, MO | 12/3/83 | Can be frozen in aliquots for future use |
| 200 mM MgATP in 1xIB | Sigma, Saint Louis, MO | 74804-12-9 | Can be frozen in aliquots for future use |
| Thermolysin in 1xIB (2mg/mL) | Sigma, Saint Louis, MO | 9073-78-3 | Can be frozen in aliquots for future use |
| HEPES | Sigma, Saint Louis, MO | H3375 | |
| K-Tricine | Sigma, Saint Louis, MO | T0377 | |
| Sorbitol | Sigma, Saint Louis, MO | 50-70-4 | |
| Magnesium Chloride | Sigma, Saint Louis, MO | 7791-18-6 | |
| Manganese Chloride | Sigma, Saint Louis, MO | 13446-34-9 | |
| EDTA | Sigma, Saint Louis, MO | 60-00-4 | |
| BSA | Sigma, Saint Louis, MO | 9048-46-8 | |
| Tris | Sigma, Saint Louis, MO | 77-86-1 | |
| SDS | Sigma, Saint Louis, MO | 151-21-3 | |
| Glycerol | Sigma, Saint Louis, MO | 56-81-5 | |
| Bromophenol Blue | Sigma, Saint Louis, MO | 115-39-9 | |
| B-Mercaptoethanol | Sigma, Saint Louis, MO | 60-24-2 |
References
- Ellis, R. Chloroplast protein synthesis: principles and problems. Sub-cellular biochemistry. 9, 237 (1983).
- Li, H. -m, Chiu, C. -C.
- Cline, K., Ettinger, W., Theg, S. M. Protein-specific energy requirements for protein transport across or into thylakoid membranes. Two lumenal proteins are transported in the absence of ATP. Journal of Biological Chemistry. 267 (4), 2688-2696 (1992).
- Skalitzky, C. A., et al. Plastids contain a second sec translocase system with essential functions. Plant physiology. 155 (1), 354-369 (2011).
- Dabney-Smith, C., Storm, A. Plastid Biology. , Springer. 271-289 (2014).
- Kim, S. J., Jansson, S., Hoffman, N. E., Robinson, C., Mant, A. Distinct "assisted" and "spontaneous" mechanisms for the insertion of polytopic chlorophyll-binding proteins into the thylakoid membrane. Journal of Biological Chemistry. 274 (8), 4715-4721 (1999).
- Emanuelsson, O., Nielsen, H., Von Heijne, G. C. hloroP. ChloroP, a neural network-based method for predicting chloroplast transit peptides and their cleavage sites. Protein Science. 8 (5), 978-984 (1999).
- Emanuelsson, O., Brunak, S., Von Heijne, G., Nielsen, H. Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP and related tools. Nature protocols. 2 (4), 953 (2007).
- Ling, Q., Jarvis, R. Analysis of protein import into chloroplasts isolated from stressed plants. Journal of Visualized Experiments. (117), e54717 (2016).
- Lo, S. M., Theg, S. M. Photosynthesis Research Protocols. , Springer. 139-157 (2011).
- Vernon, L. P. Spectrophotometric determination of chlorophylls and pheophytins in plant extracts. Analytical Chemistry. 32 (9), 1144-1150 (1960).
- Knott, T. G., Robinson, C. The secA inhibitor, azide, reversibly blocks the translocation of a subset of proteins across the chloroplast thylakoid membrane. Journal of Biological Chemistry. 269 (11), 7843-7846 (1994).
- Yuan, J., Henry, R., McCaffery, M., Cline, K. SecA homolog in protein transport within chloroplasts: evidence for endosymbiont-derived sorting. Science. 266 (5186), 796-798 (1994).
- Nohara, T., Nakai, M., Goto, A., Endo, T. Isolation and characterization of the cDNA for pea chloroplast SecA Evolutionary conservation of the bacterial-type SecA-dependent protein transport within chloroplasts. FEBS letters. 364 (3), 305-308 (1995).
- Endow, J. K., Singhal, R., Fernandez, D. E., Inoue, K. Chaperone-assisted post-translational transport of plastidic type I signal peptidase 1. Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28778-28791 (2015).
- Luirink, J., Sinning, I. SRP-mediated protein targeting: structure and function revisited. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1694 (1-3), 17-35 (2004).
- Yuan, J., Henry, R., Cline, K. Stromal factor plays an essential role in protein integration into thylakoids that cannot be replaced by unfolding or by heat shock protein. Hsp70. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (18), 8552-8556 (1993).
- Tjalsma, H., van Dijl, J. M. Proteomics-based consensus prediction of protein retention in a bacterial membrane. Proteomics. 5 (17), 4472-4482 (2005).
- Widdick, D. A., Eijlander, R. T., van Dijl, J. M., Kuipers, O. P., Palmer, T. A Facile Reporter System for the Experimental Identification of Twin-Arginine Translocation (Tat) Signal Peptides from All Kingdoms of Life. Journal of Molecular Biology. 375 (3), 595-603 (2008).
- Yuan, J., Cline, K. Plastocyanin and the 33-kDa subunit of the oxygen-evolving complex are transported into thylakoids with similar requirements as predicted from pathway specificity. Journal of Biological Chemistry. 269 (28), 18463-18467 (1994).
- Kirchhoff, H., Borinski, M., Lenhert, S., Chi, L., Büchel, C. Transversal and lateral exciton energy transfer in grana thylakoids of spinach. Biochemistry. 43 (45), 14508-14516 (2004).
- Frielingsdorf, S., Jakob, M., Klösgen, R. B. A stromal pool of TatA promotes Tat-dependent protein transport across the thylakoid membrane. Journal of Biological Chemistry. 283 (49), 33838-33845 (2008).
- Tu, C. -J., Schuenemann, D., Hoffman, N. E. Chloroplast FtsY, chloroplast signal recognition particle, and GTP are required to reconstitute the soluble phase of light-harvesting chlorophyll protein transport into thylakoid membranes. Journal of Biological Chemistry. 274 (38), 27219-27224 (1999).
