Summary
여기 previtrification 개입 및 후 지구 온난화 복구 동안 blastocyst 수축 하 고 다시 확장의 강도 따라 시간 경과 형태학 프로토콜 선물이. 프로토콜의 응용 프로그램에서 체 외에서 수정 시간 경과 현미경을 장착 가능 하며 최적의 blastocyst vitrification 방법의 개발에 것이 좋습니다.
Abstract
이 문서 blastocyst morphometry blastocyst의 볼륨 vitrification 전후 개별 단계 변경의 정확한 모니터링에 대 한 시간 경과 microphotography에 따라 비 침 투 적인 방법을 설명 합니다. 메서드는 blastocyst 수축 및 다시-확장 다른 사전 및 사후 vitrification 단계를 관찰 하 여 blastocyst cryoprotectants의 다른 농도에 노출의 가장 최적의 타이밍에 대 한 검색에 유용할 수 있습니다. 이 방법론 blastocyst vitrification 프로토콜을 최적화할 수 있습니다. 이 형태학 방법의 유용성의 더 나은 데모, vitrification에 대 한 두 개의 다른 blastocyst 준비 프로토콜 비교; 붕괴 하는 인공 blastocoel를 사용 하 여 하나 고 하나 vitrification 전에이 개입 없이. 두 blastocysts' 볼륨 변화는 시간 경과 microphotography 뒤 사진 편집 소프트웨어 도구에 의해 측정. Previtrification 단계에서 매 20 초 및 이후 지구 온난화 기간에 5 분 마다 측정 가져옵니다. 시간 단위 당 blastocyst 크기의 변화는 라인 다이어그램에 그래픽으로 표시 됩니다. 결과 있는 그대로 blastocyst 먼저 축소 및 다음 천천히 입력 vitrification 액체가 채워진 blastocoel와 blastocoel은 긴 평형 previtrification 단계 보여. 인위적으로 축소 blastocyst 전체 평형 단계 긴축된 단계에 남아 있습니다. Vitrification 단계 동안, 그것은 또한 변경 되지 않습니다의 볼륨. Blastocyst morphometry previtrification 단계 동안 인위적으로 축소 된 blastocysts의 일정 볼륨을 보여줍니다, 때문에 그것은이 단계 짧은 것 같다. 설명된 프로토콜 중와 속도 볼륨 변경, 부분 blastocoel 수축 또는 총 blastocyst의 수의 강도 기준 cryopreservation 후 blastocyst 행동의 많은 추가 비교 매개 변수를 제공합니다. 붕괴, 그리고 총 blastocoel 다시 확장 하는 시간 또는 부 화 하는 시간.
Introduction
체 외에서 수정 프로그램 (IVF)에서 인간의 preimplantation 배아의 cryopreservation 요즘 대부분 IVF 실험실에서 일상적인 연습 이다. 느린 배아 동결 방법 특정 cryoprotectants 및 얼음 nucleation (시드)에서 유도 되었다 때-7 ° c, 배아의 제어 냉각을 컴퓨터 제어 냉동 고의 도입으로 1985 년에 임상으로 사용 되기 시작 합니다 주변 cryoprotective 매체1. 연속 냉각에 의해 얼음 결정 성장 할 것, 나머지 액체 분수와, 따라서, 탈수의 hyperosmolality를 일으키는 원인이 되 고 배아 세포의 수축 량. -30 ° C 또는-80 ° C, 배아는 저장을 위해 액체 질소에 뛰어들었다 것 이다. 냉각 하는 동안 배아 또는 oocytes 일어나 cryopreservation 프로토콜2를 개선 하는 데 도움이 특별히 적응된 cryomicroscopes에 의해서만 관찰 될 수 있었다. Blastocysts, 높은 볼륨 및 더 액체 포함 된 배아 단계의 그 일3에서 덜 유망한 임상 결과 주었다.
돌파구는 blastocyst의 cryopreservation에 있는 세포의 탈수 일어났다 cryoprotectants4의 높은 농도 사용 하 여 냉각 하기 전에 vitrification 방법의 소개 했다. Vitrification 전에 blastocoel에서 액체의 제거는 또한 두 trophectoderm 셀5사이 기계적인 개방 함으로써 얻을 수 있습니다. Vitrification 온난 후 즉각적인 blastocyst 생존 율은 90%, 그리고 임상 결과 다음 위에 자 궁 캐비티에 vitrified 따뜻하게 blastocyst의 이전은 거의 결과 신선한 전송 후 배아가 cryopreservation 메서드는 아직 표준화 된6,7되지 않았습니다. Vitrification 프로토콜 (a) 종류와 cryoprotectants, (b) previtrification 단계 수의 농도 (c)의 각 단계, (d), vitrification 전에 붕괴 하는 인공 blastocoel의 사용 기간에 따라 다릅니다 (e). 8vitrified 배아 해야하는에서 방법, (f) blastocyst 확장 단계, 및 (g) 평형/vitrification 온도 축소. Cryoprotectants는 셀에 대 한 독성이 있을 수 있습니다, blastocyst 노출 시간이이 솔루션에는 잘 정의 해야 합니다. 그러나, 일부 cryopreservation 미디어 제조 업체는 매우 유연한 프로토콜을 허용합니다.
과학자의 관심 새로운 생체 이식6,,910의 더 나은 예측을 찾을 목적으로 blastocyst 다시 확장 능력을 공부에 일반적으로 집중 된다. 인간 blastocysts cryoprotectants vitrification 고 무슨 blastocysts vitrification 온난 후 발생 하기 전에 추가의 다른 단계에서 탈수, 어떻게 cryoprotectants 있을 때 셀, 그리고 어떻게 된 blastocysts rehydrate에서 제거 하 고 다시 온난 후 확장, 잘 설명도 이해. 목표에 대 한 방법론의 개발 및 다른 cryopreservation 단계 blastocyst 행동의 정량 모니터링은, 따라서, 근거입니다.
다양 한 제조 업체의 시간 경과 현미경, 그건 이제 사전에서 blastocyst의 동작 및 사후 vitrification 단계 모니터링 가능. 추가 컴퓨터 도구를 포함 하 여 그들의 크기 (morphometry)의 측정 또한 수행할 수 있습니다. 으로 감소를 측정 또는 주어진된 시간에 배아 크기에서 증가 디하이드레이션 및 리하이드레이션 동안 배아의 morphodynamics의 평가 객관성을 가능 하다.
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Protocol
여기에 설명 된 모든 메서드는 19 4 월 2016 (0120-204/2016-2 호)에 국가 의료 윤리 위원회에 의해 승인 되었습니다.
1입니다. 현미경 녹화 시스템의 설정
- 현미경의 난방 격판덮개를 해제 합니다.
- 어떤 치료를 하기 전에 카메라 장착 거꾸로 현미경 blastocyst의 스냅숏을. 확대는 blastocyst 기록 된 참고 하도록 하십시오.
2. 선택과 Vitrification 위한 Blastocysts의 Prepreparation
- 유일한 완전히 확장 된 하루 5 또는 하루 6 blastocysts cryopreservation 적어도 몇 안 세포 질량 (ICM) 세포와 응집력 trophectoderm에 대 한 선택 합니다.
- 축소 된 blastocoel와 레이저 치료 blastocysts에 대 한 주제 구멍 직경 4.3에서 9.4 µ m에 이르는 짧은 레이저 펄스 (0.4-0.7 ms) blastocyst tangentially zona pellucida, 두 개의 인접 한 trophectodermal 셀의 교차점에를 감독. 5 분 동안 완전히 또는 부분적으로 붕괴 blastocyst 허용.
- 그대로 blastocoel와 치료 blastocysts, vitrification 전에 특정 치료를 수행 합니다.
참고: 이러한 blastocysts 그대로 간주 됩니다.
3. 평형 단계 Cryoprotectant 및 페 트리 접시의 준비
- Aseptically 평형 미디어를 채우기 위해 oocyte 노출 (µ m 직경 135)에 대 한 사용 pithe 피 펫 (M-199 HEPES 버퍼링 매체 7.5 %DMSO, 7.5% 에틸렌 글리콜, 20%와 DSS) microdroplet 영역을 위해 특별히 설계 된 9 잘 배양 접시의 구멍에 시간 경과 현미경 검사 법 그리고 기록입니다.
참고: Oocyte 노출은 oocyte 둘러싸고 적 운 세포를 제거 하는 프로세스입니다. Oocyte 노출에 대 한 한 피 펫의 사용 공기 방울의 생성을 피하기 위해 도움이 됩니다. - 재래식 미디어의 30 µ L 함께 microdroplet 영역을 오버레이.
4. 평형 솔루션에서 Blastocyst의 전송
- 실 온 (평형 단계)에서 10 분 동안 microdroplet 접시의 microdroplet 영역의 아래쪽에 레이저 치료 또는 그대로 blastocyst 평형 매체에 잠수함.
- blastocyst 평형 매체에 전송 되 자 마자 10 분 카운트 다운을 시작 합니다.
5. 평형 단계에서 Blastocyst의 기록
- 카메라 장착 된 현미경에는 blastocyst와 microdroplet 접시를 전송 합니다. 사용 하 여 같은 확대 이전 같은 blastocyst의 스냅샷을 복용에 대 한. 위치는 microdroplet 접시는 blastocyst 녹음의 중심에 배치 되도록.
- 레코딩 소프트웨어 현미경으로 녹음을 시작 합니다. 참고 녹음 시작 카운트 다운 시간.
주: 재래식 솔루션 10 분 노출 시는 그대로 (그림 1, 비디오 1)과 (그림 2, 비디오 2) 축소 blastocyst의 녹음의 대표적인 결과 참조 하십시오.
6입니다.는 Blastocyst의 vitrification
- Aseptically의 vitrification 솔루션 (M-199 HEPES 버퍼링 매체 15 %DMSO, 15% 에틸렌 글리콜, 20 %DSS, 0.5 M 자당) 페 트리 접시 2 분 카운트다운이 종료 되기 전에 50 µ L 드롭 분배.
- 10 분 카운트다운 종료 하는 blastocyst vitrification 30에 대 한 솔루션 신속 하 게 전송 하는 때 기록 중지 실 온에서 s.
- 부드럽게는 blastocyst 플라스틱 vitrification 솔루션 내에서 적어도 1 x.
- 밀 짚 vitrification를 사용 하 여 로드는 blastocyst. 로드, 물개, 및 80 내 액체 질소 (LN)에 빠지게 짚 vitrification 110을 초과 하지 않는 s s vitrification 솔루션 초기 노출 후.
7. 평형 단계 기록된 Blastocyst의 비디오 편집
- 소프트웨어를 편집 하는 비디오로 녹화 된 비디오 파일을 가져옵니다.
- 이 이번에 20 s. 참고 프레임 번호를 시간 표시 막대 슬라이더를 이동 합니다.
참고:이 번호는 불필요 한 비디오 프레임을 시키면서 사용 됩니다. 만 모든 20 프레임 s 사용 됩니다. - 비디오 탭, 다음 프레임 속도...를 클릭 합니다. 프레임 속도 변환, 아래 여 Decimate 필드를 확인 하 고 앞에서 설명한 프레임 번호를 입력 합니다. 확인을 클릭 하 여 확인 합니다. 클릭 파일 → 내보내기 → 이미지 시퀀스.
- 출력 형식으로 JPEG를 선택, 이미지의 저장 순서를 디렉터리를 설정 하 고 확인을 클릭 합니다.
참고:이 디렉터리 기록된 blastocyst의 최대 30 이미지에 만들어집니다 시퀀스 vitrification의 평형 단계.
8. 평형 단계에서 생성 된 이미지에서 Blastocyst의 단면적의 측정
- 비디오 분석 소프트웨어를 엽니다. 창 탭을 클릭 하 고 타임 라인을 선택 합니다.
- 타임 라인 창에서 필름 스트립 기호를 클릭 하 고 선택 vitrification의 평형 단계 전에 blastocyst의 이미지를 추가 하려면 미디어 추가... -어떤 것이 있었다면 레이저 개입 하기 전에.
참고:이 이미지는 가장 확장 된 상태에서 blastocyst 표시 됩니다 하 고 그것의 단면적을 기준으로 될 것입니다. - (Vitrification의 평형 단계)의 비디오 편집 소프트웨어와 함께 이전에 생성 된 해당 blastocyst의 이미지 시퀀스를 추가 합니다.
- 이미지 → 분석 → 선택 데이터 포인트 → 이동 사용자 정의 데이터 포인트를 선택 창을 엽니다.
- 모든 데이터 요소를 취소 다음만 영역 을 선택 하 고 확인을 클릭 하 여 확인.
- 첫 번째 이미지에 타임 라인 창에서 시간 표시 막대 슬라이더를 이동 합니다.
- 창 탭을 클릭 하 고 도구를 선택 합니다.
참고:이 왼쪽에 [도구] 패널을 활성화 합니다. - 빠른 선택 도구를 선택 합니다.
- 터치는 blastocyst의 가장자리 blastocyst 내부 도구 마커를 배치 합니다. 클릭 blastocyst의 외부 가장자리에 도구 마커를 배치 하 여 있는 blastocyst를 약술 하 고 마우스 왼쪽된 버튼을 전체 blastocyst의 단면적까지 blastocyst의 외부 가장자리를 따라 도구 마커를 드래그 선택 되어.
참고: Zona pellucida 아니다 해야 합니다 그래서 측정 부분 제외 (그림 5). - 타임 라인 창에서 측정 로그 를 클릭 하 고 측정 기록 버튼을 누릅니다.
참고:이 선택한 영역을 기록 합니다. - 다시 타임 라인으로 돌아갑니다, 그리고 이미지를 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 취소를 선택 합니다.
- 다음 이미지를 시간 표시 막대 슬라이더를 이동 하 고 아래 해당 타일에 클릭 합니다.
- 빠른 선택 도구와 새로운 이미지에서 blastocyst 개요. 측정을 반복 합니다.
- 이 절차 (단계 8.9 ~ 8.13) 이미지에 의해 이미지를 반복 하 여 모든 이미지의 횡단면 지역 측정 및 기록 합니다.
- 결국, 측정 로그에 지역 변수에서 모든 측정을 선택 하 고.txt 파일에 수출 이동 합니다.
참고: 단면적의 단위는 정사각형 픽셀.
9. 평형 단계 만든 이미지에서 기록 된 Blastocyst의 횡단면 영역 데이터 파일의 편집
- .Txt 파일에서 스프레드시트 편집기 기록된 blastocyst의 횡단면 영역 데이터를 전송.
- 첫 번째 단면적 값 참조 값 1 표현으로 (변환) 값을 참조 하는 모든 다른 값의 일부분을 사용 합니다.
- 새로운 변수 Area_r를 만들고 아래 코드 영역 값 (기준 값)을 제외 하 고.
- Area_r 변수 옆 시간 변수 만들고 첫 번째 시간 값을 추가 합니다.
참고: 첫 번째 시간 값 평형 해결책 기록 카메라 장착 된 현미경의 발병에는 blastocyst 노출 된 순간부터 전달 시간을 나타냅니다. - 20를 추가 하 여 각 다음 연속 시간 값을 계산 이전 시간 값을 s.
참고:이 녹음 하는 동안 만든 불필요 한 비디오 프레임을 전 멸에 사용 되는 시간 간격입니다.
10. 온난화는 Blastocyst의
- 온난화에 대 한 미디어를 준비 합니다.
- 하루는 blastocyst 온난 전에 aseptically 3 150 µ L 상품 4-잘 접시에 복구 매체의 분배. 또한, aseptically microdroplet 9-잘 접시 시간 경과 현미경을 위해 특별히 디자인 하 고 기록에 복구 매체 분배. 파라핀 오일 복구 매체를 커버 하 고 6% CO2 와 5% O237 ° C에서 preincubate.
참고: 복구 매체 추가 인간 혈 청 알 부 민 (HSA)와 blastocyst 단계 배아에 대 한 재배 매체가입니다. 복구 매체에서 HSA 12 mg/mL 이어야 한다. 9-잘 접시에 구멍을 채우기 위해 oocyte 노출에 대 한 피 펫을 사용 하 여 공기 방울의 생성을 피하기 위해 다음 오버레이 복구 매체의 30 µ L로 microdroplet 지역. - 온난화는 blastocyst의 날, aseptically 솔루션 (TS)에 4-잘 접시의 단일 잘 녹고의 500 µ L를 분배 하 고 CO2없이 인큐베이터에서 37 ° C 따뜻한 있습니다.
- 실내 온도에, aseptically를 분배 한 50 µ L 방울 희석 솔루션 (DS) 및 2 개의 50 µ L 세척 솔루션 (WS)의 멸 균 페 트리 접시에. 파라핀 오일 DS WS1 및 WS2 방울 커버.
참고: 페 트리 접시 대신 4-잘 접시도 사용할 수 있습니다.
- 하루는 blastocyst 온난 전에 aseptically 3 150 µ L 상품 4-잘 접시에 복구 매체의 분배. 또한, aseptically microdroplet 9-잘 접시 시간 경과 현미경을 위해 특별히 디자인 하 고 기록에 복구 매체 분배. 파라핀 오일 복구 매체를 커버 하 고 6% CO2 와 5% O237 ° C에서 preincubate.
- 따뜻한는 blastocyst.
- LN 저장소에서 제거 하 고 지구 온난화 절차에 대 한 준비는 LN 가득 휴대용 저수지에 빨 대를 빠르게 전송할 vitrified blastocyst와 HSV 빨 대를 식별 합니다.
- 집게와 빨 대를 들어 올려 노출 색된 처리 로드에 충분. 자체 조정 와이어 스 트리 퍼를 사용 하 여 색깔된 처리 막대의 높이에 빨 대를 잘라.
- 처리 로드를 잡아 신속, 아직 통제 운동, 밀 짚에서 그것을 추출 하 고 즉시 처리 로드의 곡선된 주걱 37 ° C TS 급락.
- 부드럽게 하는 blastocyst 분리 그것 TS에 1 분의 총에 대 한 처리 로드를 소용돌이 친다.
- 실내 온도에, 전송에서 blastocyst 연속적으로 DS, WS1 및 WS2 각 매체에서 4 분.
- 지구 온난화 절차 후 복구 매체와 4-잘 접시는 blastocyst 전송 하 고 부드럽게 pipetting으로 모든 3 상품에 그것을 씻어.
참고: 세척 약 1 분에 실시 됩니다. - 복구 매체와 시간 경과 9-잘 접시는 blastocyst 전송. (6% CO2 와 5% O237 ° C)에서 인큐베이터에서 시간 경과 카메라 아래 9-잘 접시를 놓습니다.
참고: 시간 경과 카메라 아래 9-잘 접시는 인큐베이터에 배치와 함께 계속, Thre 온난화 절차 약 17 분 지속.
11. 복구 후 온난화 동안 Blastocyst 다시 확장의 시간 경과 기록
- 시간 경과 기록 소프트웨어를 실행 합니다.
- 기록 카메라를 선택 하십시오.
- 라이브 모드 단추를 누릅니다.
- 이미지에 마우스 커서를 놓고 스크롤 단추를 사용 하 여 그것을 확대 하려면. 클릭 하 고 마우스 왼쪽된 버튼 배치 화면 blastocyst와 잘 커서 이동.
- 초점, 아래는 blastocyst의 녹음 평면 초점을 위 아래 녹색 화살표를 사용 합니다. 빛의 강도, 빛의 강도 설정 합니다.
- 노출 시간 및 감마 설정 현미경 매개 변수 버튼을 클릭 합니다.
- 라이브 모드 닫기를 누릅니다.
- 프로젝트 시작 버튼을 눌러 및 프로젝트 데이터 입력 문화 접시 유형 (3 x 3 또는 4 x 4)을 선택 하 고 기록 하나를 제외한 모든 위치를 선택 취소.
- 5 분 마다 그림을 캡처 타이밍을 설정 합니다.
- 승인 버튼을 눌러 녹음을 시작 합니다. 150 분 이상 기록.
- 프로젝트를 중지 버튼을 눌러 녹음을 중지 합니다.
참고: 복구 기간에 후 지구 온난화는 그대로 (그림 3)과 (그림 4) 축소 blastocyst의 녹음의 대표적인 결과 보기
12. 다시 확장 후 온난화 동안 기록된 Blastocyst의 비디오 편집
- 프로젝트 폴더에가 고는 약 80 KB 크기에 기록 된 이미지를 찾습니다.
- 다른 폴더를 만들고 그것에 이러한 이미지를 전송 합니다. 만든 시간에 따라 숫자에 이미지를 이름을 바꿉니다. 소프트웨어 이미지 시퀀스를 편집 하는 비디오로 그들을 가져옵니다.
- 비디오 탭 → 필터 → 이동 추가 및 선택 Null 변환 필터.
- 오른쪽에 있는 자르기 버튼을 클릭 하 고 떠나 볼 수만 필드 기록된 blastocyst 이미지 자르기. 확인 및 확인다시 확인 합니다.
- 클릭 파일 → 내보내기 → 이미지 시퀀스. 출력 형식으로 JPEG를 선택, 이미지의 저장 순서를 디렉터리를 설정 하 고 확인을 클릭 합니다.
참고: 이것은 비디오 분석 소프트웨어에서 추가 측정을 위해 준비 하는 크기 (자른된) 이미지를 만듭니다.
13. 시간 경과 기록 소프트웨어를 사용 하 여 만든 이미지에 대 한 비디오 분석 소프트웨어에서 측정 비율 설정
- 시간 경과 기록 소프트웨어의 분석기를 실행 합니다.
- 기록 된 blastocyst 프로젝트를 엽니다.
- 기록 된 blastocyst와 필드에서 분석 단추를 클릭 합니다.
참고: 새로운 분석 창이 열립니다. 측정 도구를 표시 하려면 측정 버튼을 클릭 합니다. - 전체 이미지의 너비를 측정 하는 측정 도구를 사용 합니다.
- 이미지에 마우스 하 고 그것을 저장. 속성에서 이미지의 너비 (픽셀) 확인 합니다.
- 이미지의 실제 너비를 픽셀 단위로 너비를 나눕니다.
참고:이이 이미지의 단일 픽셀의 실제 길이 계산합니다. - 비디오 분석 소프트웨어를 실행 합니다.
- 창 탭을 클릭 하 고 타임 라인을 선택 합니다.
- 타임 라인 창에서 필름 스트립 기호를 클릭 하 고 이후 따뜻한 다시 확장 blastocyst의 이미지 시퀀스를 추가 하려면 미디어 추가... 를 선택 합니다.
- 클릭 이미지 → 분석 → 측정 비율 설정 → 사용자 정의 측정 비율 창을 엽니다. 픽셀 길이 입력 1; 논리 길이 입력 픽셀 (단계 13.6);의 이전에 계산 된 실제 길이 논리 단위에 대 한 입력 µ m. 프리셋 저장.
14. 다시 확장 후 따뜻한 동안 작성 된 이미지에서 Blastocyst의 단면적의 측정
- 측정 비율 설정 및 가져온 이미지 시퀀스 일단 측정 blastocyst의 횡단면 지역 같은 방법으로 단계에서 설명한 8, 유일한 차이이 측정에서 측정 된 횡단면 영역2 µ m에 있는 단위 .
15. 다시 확장 후 따뜻한 동안 만들어진 이미지에서 기록 된 Blastocyst의 횡단면 영역 데이터 파일의 편집
- .Txt 파일에서 스프레드시트 편집기 기록된 blastocyst의 횡단면 영역 데이터를 전송.
- 시간 변수를 지역 변수 옆 고 처음 시간 값을 추가 합니다.
참고:이 경우에, 첫 번째 시간 값은 0 분은는 설정 시간 경과 기록의 발병. 각 다음 연속 시간 값 이전 시간 값을 5 분을 추가 하 여 계산 됩니다. 5 분 2 연속 시간 경과 기록 사이 사용 되는 시간 간격입니다.
16입니다. 라인 다이어그램 생성
- Vitrification 또는 재 확장 후 온난화의 평형 단계 시간에서 blastocyst의 횡단면 지역 변화의 시간 줄거리를 만들기 위한 통계 분석 소프트웨어에서 스프레드시트 데이터 파일을 가져옵니다.
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Representative Results
데모, 우리는 하나의 previtrification에 한 후 지구 온난화 단계 blastocyst morphodynamics을 보였다. 한 차이 blastocyst의 볼륨에 평형 단계의 끝에와 문화 매체는, 사실, 배아 수축 강도 보여 얼음 결정 화에 대 한 배아 보존의 강도 회복의 시작 부분에.
그것은 비디오 1과 그림 1 에서 발견 될 수, 평형 솔루션에서 그대로 blastocyst 완전히 축소 되지 않았다. blastocoel 부분적 으로만 계약을 하지만 10 분 이내 그것 천천히 다시 확장 크기의 70%에 도달. 이, 반대로 인위적으로 축소 blastocyst는 완전히 비우지는 blastocoel 레이저 치료 후 즉시 하지만 재래식 솔루션에 볼륨 더 (그림 2, 비디오 2) 변화 하지 않았다. 복구 매체에 blastocoel 다시 확장의 프레 젠 테이 션 (그림 3 및 그림 4) microphotographs와 선 다이어그램 blastocoel 성장의 다른 패턴을 보여줍니다. blastocyst의 단면적의 단일 측정의 디스플레이 그림 5에 표시 됩니다.
Vitrification cryoprotectants의 높은 농도와 매체에 그대로 blastocysts 집중적으로 축소 다시 한번 축소 blastocyst의 볼륨 거의 불변에 남아 있었다 동안. 그래픽 프레 젠 테이 션에서 여기에 제시 된 프로토콜을 사용 하 여 그것은 분명 그대로 blastocyst 평형 솔루션 및 vitrification 중간에 한 번에 한 번, blastocoel (그림 6)의 단계적 감소를 겪 습 동안에 (그림 7) 레이저로 개입의 시작 부분에 수축 된 단계에 도달 하는 blastocyst 쓰 러 졌다. 이 평형 단계의 10 분 축소 된 blastocysts, 정말 필요 하다 또는이 기간 단축 될 수 있는 질문을 포즈.
Blastocoel 다시 확장의 프레 젠 테이 션은 선형 또는 여러 크게 또는 작게 수축 (그림 8)와 함께 중단 될 수 있습니다.
그림 1: 재래식 솔루션에 노출 하는 동안 그대로 blastocyst의 변경에의 시간 경과 microphotography. 단일 이미지는 매 20 초를 기록 했다. 눈금 막대는 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 재래식 솔루션에 노출 하는 동안 인위적으로 축소 blastocyst의 변경에의 시간 경과 microphotography. 단일 이미지는 매 20 초를 기록 했다. 눈금 막대는 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: recoverypost 온난 동안 그대로 blastocyst의 변화의 시간 경과 microphotography. 단일 이미지는 5 분 마다 기록 되었다. 눈금 막대는 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: recoverypost 온난 동안 축소 blastocyst의 변화의 시간 경과 microphotography. 단일 이미지는 5 분 마다 기록 되었다. 눈금 막대는 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 디스플레이 blastocyst의 단면적의 단일 측정의. 비디오 분석 소프트웨어에서 적절 한 선택 도구는 blastocyst 둘러싸고 신중 하 게 됩니다. Zona pellucida 측정에서 항상 제외 됩니다. 눈금 막대는 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 표현의 변화는 그대로 blastocyst의 단면적에. 이러한 패널 복구 후 온난화 동안 평형 솔루션 vitrification 및 (B) (A)에 노출 동안 변화는 그대로 blastocyst의 단면적에 표현을 보여줍니다. 단면적의 단위 vitrification 전에 초기 blastocyst의 횡단면 영역에 상대적입니다. 패널 A 와 B 를 연결 하는 파선은 상상, vitrification를-196 ° C에 냉각 하 고 37 ° c 온난 동안 변화를 나타내는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7: 축소 blastocyst의 단면적에 변화 표현. 이러한 패널 복구 후 온난화 동안 단면적 (A) 평형 솔루션 vitrification에 (B)에 노출 시 축소 blastocyst 및 (C)의 변경의 표현을 보여줍니다. 단면적의 단위 축소와 vitrification 전에 초기 blastocyst의 단면적에 상대적입니다. 패널 A 에 파선 상상 이며 blastocyst 붕괴 하는 동안 시작 및 끝 지점을 나타냅니다. 또한 패널 B 와 C사이 가상 파선 vitrification를-196 ° C에 냉각 하 고 37 ° c 온난 동안 변화를 나타냅니다. B 와 C 패널에서 실선만는 단면적의 실제 측정의 평형 및 복구 프로세스 동안. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 8: 온난 후 blastocyst 복구의 서로 다른 패턴의 그래픽 프레 젠 테이 션. 눈금 막대는 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
비디오 1: 재래식 솔루션에 노출 하는 동안 그대로 blastocyst의 변경에의 시간 경과 비디오. 비디오를 실시간으로 거의 10 분을 최근 변경 내용을 나타냅니다. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.)
비디오 2: 재래식 솔루션에 노출 하는 동안 축소 blastocyst의 변경에의 시간 경과 비디오. 비디오를 실시간으로 거의 10 분을 최근 변경 내용을 나타냅니다. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.)
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Discussion
동안 blastocyst morphodynamics의 전후 cryopreservation 또한 실시 될 수 있습니다 유사한 악기와 다른 제조 업체에서 소프트웨어 도구를 사용 하 여 관찰에 대 한 프로토콜. 발생 학에 대 한 조정 시간 경과 시스템 배아 개발의 지속적인 모니터링을 허용 합니다. 이 작품의 목적은 vitrification를 자신의 온난 후 blastocysts의 준비 동안 blastocyst 동작의 정량화를 소개 했다. 이 변경에는 날짜 표시줄에 형태학의 객관적인 측정에 의해 수행 되었다. 이러한 측정의 취득된 결과 수학적으로 분석 하 고 다른 결과와 비교 될 수 있습니다. 설명된 프로토콜에 따라 할 수 있는 매개 변수 중에서 blastocyst의 크기에서 변화, 그것의 안 세포 질량, blastocoel, 또는 zona pellucida 특정 기간 내. 크기의 볼륨으로도 계산 후, 그리고 큰 blastocyst 횡단면, blastocyst 둘레 또는 직경, 표면 영역으로 표시할 수 있습니다.
이전 연구에서 시간 경과 시스템을 사용 하 여, blastocoel 속도 측정만 신선한 배아11에 되었다. Vitrified 따뜻하게 blastocysts blastocysts' 크기만 온난 후 즉시 고 배아 전송 되기 전에 측정 했다 또는 기간 분석을 따뜻하게 blastocysts는 zona pellucida9,10에 다시 확장 . 우리의 이전 연구8에 자세한 blastocyst 다시 확장 역학 분석 되었다. 이 연구에서는 형태학 프로토콜은 이미 온난 후 속도 blastocyst 다시 확장의 패턴을 추적 하기 위해 사용 되었습니다. 비록 이러한 blastocyst 성장 생체 이식에 대 한 높은 예측 값을 하지 나타났습니다, 그들은 후 사용할 수 있습니다 잠재적인 blastocyst 복구의 비교를 위해 vitrification과 다른 cryopreservation 미디어와 프로토콜 온난화 . 즉, blastocoel 재 확장 중에서 blastocyst의 큰 수축 cryopreservation, 그리고 액체가 채워진 blastocoel에 의해 압력을 저항을 하지 못하는 동안 발생할 수 있는 trophectodermal 계층의 약점을 제안 합니다.
설명된 형태학 프로토콜 cryopreservation, 후 뿐만 아니라 속도 볼륨, 부분 blastocoel 수축 또는 총 수 변경의 강도 측정 하 여 blastocyst 행동의 많은 추가 비교 분석을 제공할 수 있습니다. blastocyst 축소, 총 blastocoel 다시 확장 하는 시간 또는 부 화 하는 시간. 또한, 그것은 또한 결과에 제시 했다 blastocyst cryoprotectants의 다른 농도에 노출의 가장 최적의 타이밍을 결정 하기 위한 previtrification 단계 동안 사용할 수 있습니다. Vanderzwalmen 그 외 여러분 그 vitrification 또한 세포내 삼 투 압력 외부 cryoprotectant 솔루션12평형에 도달 하지 않는 경우 성공적인 수 쥐 oocytes에 나타났다. 보존 동안 blastocysts의 기록에 대 한 유일한 문제가 단계는 기간 제한 시간이; vitrification 솔루션에 태아는 cryoprotectants의 높은 농도에 노출 하 고 90 초 미만 있는 밀 짚으로 포장 한다. 이러한 측정 연구에 대 한 기부는 blastocysts만을 사용 하 여 추천 될 것 이다. 그럼에도 불구 하 고, 임상적으로 사용 가능한 blastocysts 수 기록 하 고 다시 직후 측정 온난화, 희석에 그들이 어떻게 행동을 관찰 하는 목적으로 솔루션을 세척. 복구 매체 세척 솔루션에서 blastocyst 이동, 후 즉시 blastocysts 바닥에서 떠 경향이 있다. 이 기록 중 같은 초점면에서 태아를 유지에 어려움을 나타낼 수 있습니다. 이 문제를 해결 하려면 매체의 병합된 방울과 접시를 준비 하는 것이 좋습니다. 비슷한 문제는 Vanderzwalmen 그 외 여러분 에 의해 관찰 되었다 12.
추가 연구에서 cryoprotectants에 인위적으로 축소 된 blastocysts의 노출의 길이 감소 될 수 있었다, 따라서 이러한 화학 물질의 독성 효과 최소화 하는 여부를 탐험이 유용할 것 이다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품 연구 프로그램 P3-0327 및 연구 프로젝트 J3-7177, 슬로베니아어 연구 재단에 의해 설립 된의 일부입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted microscope Eclipse TE2000-U | Nikon, Japan | / | |
| Saturn 5 Laser System | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Digital camera DC1 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Digital camera DC2 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Cronus 3.7 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | microscope recording software |
| Incubator with 6% CO2, 5% O2 | Binder, Germany | / | |
| Primo Vision microscope | Vitrolife, Sweden | 16600 | |
| Primo Vision Capture software | Vitrolife, Sweden | 16608 | time-lapse recording software |
| Adobe Photoshop CS6 Extended software | Adobe Systems Incorporated, USA | / | video analysis software |
| VirtualDub | Avery Lee | / | video editing software |
| Microsoft Office Excell | Microsoft, USA | / | spreadsheet editor |
| PrimoVision culture dish | Vitrolife, Sweden | 16604 | |
| G2-plus medium | Vitrolife, Sweden | 10132 | cultivation medium for blastocyst stage embryos |
| Human Serum Albumins | Vitrolife, Sweden | 10064 | |
| Paraffin oil | Vitrolife, Sweden | 10029 | |
| Equilibration solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90131 | |
| Vitrification solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90132 | |
| Thawing solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90134 | |
| Dilution solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90135 | |
| Washing solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90136 | |
| HSV Vitrification straws | CryoBio System, France | 025246, 025249, 025250, 025248 | |
| Liquid nitrogen | / | ||
| Cryo vessel Biosafe 120 MD β | Cryotherm, Germany | 229286 | |
| Cryo tank | Cryotherm, Germany | ||
| Forceps | / | / | |
| Scisors | / | / | |
| Pippete for blastocyst manipulation | Gynetics, Belgium | ID275/10 | diameter 275 µm |
| Pipette for oocyte denudation | Vitromed, Germany | V-DEN-135 | diameter 135 µm |
| Pipettor EZ-Grip | Research Instruments | 7-72-2802 | |
| Digital interval timer Assistent | Glaswarenfabrik Karl Hecht | 41977010 | |
| IBM SPSS Statistics 21 | IBM, USA | / | statistical analysis software |
| Self adjusting wire stripper | Knipex, Germany | 1262180 |
References
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