Summary
Этот протокол обеспечивает основанную на Фиджи, удобную методологию наряду с простыми инструкциями, объясняющие, как надежно анализировать поведение актомиозина в отдельных клетках и изогнутых эпителиальных тканях. Нет навыков программирования не требуется, чтобы следовать учебник; все шаги выполняются в полуинтерактивной манере с использованием графического пользовательского интерфейса Фиджи и связанных с ними плагинов.
Abstract
Дрозофилы незрелые яйца называются яичными камерами, и их структура напоминает примитивные органы, которые претерпевают морфологические изменения от круглой до эллипсоидной формы во время развития. Этот процесс развития называется oogenesis и имеет решающее значение для генерации функциональных зрелых яиц для обеспечения следующего поколения мух. По этим причинам яичные камеры служили идеальной и соответствующей моделью для понимания развития органов животных.
Было разработано несколько протоколов по культивированию in vitro, но в этих протоколах есть несколько недостатков. Один включает в себя применение различных охватывает, которые оказывают искусственное давление на изображения яичных камер для того, чтобы обездвижить их и увеличить изображение плоскости приобретения окружной поверхности проанализированных яичных камер. Такой подход может негативно повлиять на поведение тонкого актомиозина, который генерирует способность вращать яичные камеры вокруг своей более длинной оси.
Таким образом, чтобы преодолеть это ограничение, мы культуры Drosophila яичные камеры свободно в средствах массовой информации для того, чтобы надежно анализировать актомиозина машины вдоль окружности яичных камер. В первой части протокола мы предоставляем инструкцию с подробным описанием того, как анализировать актомиозиновое оборудование в ограниченной плоскости приобретения в локальном сотовом масштабе (до 15 ячеек). Во второй части протокола мы предоставляем пользователям новый плагин на основе Фиджи, который позволяет просто йодицию определенного тонкого слоя окружной поверхности яичных камер. Затем в следующем протоколе описывается, как анализировать сигналы актомиозина в масштабе ткани (Ят;50 клеток). Наконец, мы выявляем ограничения этих подходов как на локальном клеточном, так и в тканевом масштабе и обсуждаем его потенциальное будущее развитие и возможное применение.
Introduction
Постоянное развитие новых технологий визуализации и программного обеспечения с применением в науке о жизни оказало огромное влияние на понимание основных принципов жизни. Одной из основных задач является надежная визуализация процессов развития в сочетании с их живой визуализацией в различных тканях. Ткани являются частями органов и органов, и, как таковые, большинство из них не легко доступны для визуализации. Таким образом, протоколы, которые позволяют их вскрытия и in vitro культивирования были разработаны для того, чтобы визуализировать биологические события, которые достаточно отражают in vivo ситуации в живом теле.
За последние десятилетия культивирование и живое изображение яичных камер Дрозофилы, ацинар-подобных структур, напоминающих примитивные органы, внесло огромный вклад в понимание основных принципов развития примитивных органов1 , 2 , 3. В настоящее время существует несколько протоколов культивирования, и их использование зависит от времени приобретения, типа ячейки, подимеющейся на изображении, и их доступности (например, внутренней зародышевой линии против внешней соматической линии)4.
Общей чертой во всех этих протоколах культивирования является необходимость иммобилизации проанализированных яичных камер, которые отображают высокую сократительую активность в жидких носителях. Сократительная активность яичных камер вызвана главным образом мышечным листом, который покрывает длинную строку подключенных яичных камер5,6,7. Таким образом, для достижения надлежащей иммобилизации молодых яичных камер,различные подходы были разработаны, с участием покрытия яичные камеры с крышками 6,8,9 или гибкие одеяла4, 10 или встраивание их в низкоплавительную точку агарозы3,11. Эти подходы популярны, поскольку они также позволяют изображения большего визуального плана из-за тонкого уплощения окружной поверхности яичных камер.
Однако, недавно, было показано, что молодые яичные камеры (этап 1-8) вращаются вокруг их передней задней оси6 и что это движение ткани питается от тонкой сети актомиозина близко к окружной поверхности этих молодых яичных камер 12. Таким образом, искусственное изменение клеточной поверхности, вызванное тонким уплощением этой ткани, может негативно сказаться на поведении силового актомиозина. Контрапункт заключается в том, что если ткань яичной камеры не сплющена, микроскопическая визуализация белков на окружной поверхности яичных камер становится еще более ограниченной уменьшением размера плоскости приобретения.
Таким образом, мы объединили протоколы от Prasad et al.9 и лаборатории Селеста Берг4,10 и далее модифицировали их так, чтобы в разработанном методе не использовалось покрытие/гибкое одеяло/агароз. Дрозофилы яичные камеры свободно культивируются в средствах массовой информации и протокол, представленный здесь применяется только перевернутая микроскопия. Протокола две части. Первая часть сосредоточена на анализе сигналов атомиозина в локальном клеточном масштабе (до 15 клеток) в яйцеклетках. Во второй части мы фокусируемся на преодолении ограничений, связанных с небольшой плоскостью приобретения, вызванной бесплатной культивированием яичных камер. В этой связи мы разработали новый фиджийский вычислительный метод с полуинтерактивным графическим пользовательским интерфейсом, который выборочно извлекает и разворачивает определенные слои поверхности окружной ткани. За этим следует протокол, который описывает, как анализировать актомиозин в масштабе ткани (т.е. клетки. Поскольку селективная экстракция определенного тонкого слоя изогнутых эпителиальных тканей не была легковозможна с помощью классической проекции z-стека(рисунок1), этот простой в использовании метод служит важным условием для всестороннего понимания поведение тонкой (злт;1 мкм) сети актомиозина в масштабе ткани в яйцеклетках Drosophila.
Кроме того, для облегчения протокола, мы предоставляем пример замедленного фильмов (TLMs) и образцы файлов флуоресцентно помечены немышечной обычного поведения Миозина II (см. Дополнительный файл 3). Миозин II является моторным белком и представляет собой активную сократителемую часть актомиозина. Для того, чтобы изображение Myosin II, мы используем Drosophila трансгенных линий, которые содержат модифицированные нормативные световой цепи Myosin II называется MRLC::GFP (см. Таблица материалов для деталей)12,13. Для визуализации клеточных мембран протокол основан на коммерческих красителей (см. ТаблицуМатериалов). Этот протокол подходит не только для анализа малых субклеточных MRLC: GFP сигналы12, но и для любых аналогичных размеров субклеточных частиц вокруг 300 мкм, таких, как те, которые наблюдаются с Life-Act::GFP12,14.
Хотя оба эти протоколы представлены с использованием in vitro культивированных камер дрозофилы яйцо, приобретение сигналов actomyosin также может быть выполнена с использованием других тканей на оптимизацию культивирования средств массовой информации и в зависимости от наличия либо флуоресцентно помеченных белков с соответствующими коммерческими красителями или, например, микроинъекций мРНК для получения преходящих профилей экспрессии генов. Аналогичным образом, фиджийский протокол для извлечения тонкого слоя из окружной поверхности может быть применен в более общем плане к эллипсоидным и органоподобным тканям.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол содержит инструкции о том, как анализировать актомиозин в местной клеточной и ткани масштаба в дрозофилы яйцеклеток. Локальный подход позволяет пользователям анализировать детальное поведение актомиозина в 15 яйцеклетках на одну яичную камеру и требует приобретения TLMs в течение короткого периода времени (5–10 мин) с помощью высокоскоростной визуализации и перевернутого конфокального микроскопа. В отличие от этого, шкала тканей предоставляет пользователям информацию о актомиозине в 50-100 клетках и требует приобретения TLMs в течение длительного периода времени (30 мин) с помощью низкоскоростной визуализации и перевернутого вращающегося дискового микроскопа (см. рисунок 2 и рекомендуемые параметры в каждой шкале в таблице 1). Решение о том, в каком масштабе анализировать сигналы актомиозина полностью зависит от научного вопроса пользователя. Сопровождаемые тестовые TLMs должны помочь принять это решение.
1. Местная клеточная шкала (LCS)
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы вскрыть и изображение в пробирке культивированные камеры яйца Drosophila, следуйте протоколу, описанному в дополнительномфайле 1 . Для анализа приобретенных TLMs, продолжить со следующим протоколом. Ссылки на сопроводительные тестовые файлы TLMs предоставляются в дополнительном файле 3.
- Обработка данных TLMs в локальном сотовом масштабе (LCS)
- Отбеливатель коррекции TLMs, чтобы компенсировать интенсивность распада флуоресцентных этикеток
- Убедитесь, что современное приложение Фиджи устанавливается на компьютер, используемый, следуя этим инструкциям: Фиджи
- Разделите цветовые каналы, нажав на изображение
- Выполните коррекцию отбеливателя на обоих каналах с помощью изображения
ПРИМЕЧАНИЕ: Если получены неудовлетворительные результаты, исследуйте, какие методы коррекции в этом плагине лучше всего подходят (например, используйте Гистограмму соответствия вместо простого соотношения).
- Сегментация клеток для создания клеточной маски для TLMs
- Если Фиджи еще не открыта, вновь открыть его (и убедитесь, что он является актуальным) после Справка
- Если это еще не сделано, скачать макрос TissueCellSegmentMovie.ijm (из http://adm.irbbarcelona.org/matlab/TissueCellSegmentMovie.ijm). Перетащите и падение этого сценария на Фиджи.
- Откройте исправленный файл TLM .tiff (см. раздел 1.1.1). Разделите каналы отбеливателя-исправленного файла с помощью изображения
- Запустите загруженный скрипт на активном мембранном канале ячейки выбранного TLM, нажав значок Run в открытом скрипте. Установите гауссианское размытие до 2.500 и чувствительность обнаружения клеток до -1 и нажмите OK. Для того, чтобы получить хорошую маску клетки, не меняйте эти параметры выше. Установите расчетную толерантность к шуму между 10-20 для TLMs, приобретенных с целью 63x и нажмите OK.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для других целей могут потребоваться различные параметры. Чем чище фон в TLM, тем ниже расчетная допуск к шуму. - Сгенерированная клеточная маска появляется в анализируемом TLM, а также в новом окне под названием ParticleStack (G),и, кроме того, появляется маленькое окно под названием Action Required. Из клеточной маски на TLM, сосредоточиться только на клетках в центре TLM и выбрать те, которые могут обеспечить полный и четко определенные очертания по всему TLM.
- Если выбранные ячейки содержат искусственные/дополнительные контуры ячеек, используйте окно инструмента слияния под названием Action Required в TLM. Для последних следуйте инструкциям в окне.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что контуры клеток четко определены и соответствуют реальным клеточным мембранам в TLM, так как любая неточность может повлиять на последующий анализ. Дополнительные настройки и изменения, такие как удаление нежелательных ячеек, могут быть сделаны позже с помощью инструмента Surface manager (описано в разделе 1.1.3). - Когда выбранные клетки в центре красиво соответствуют реальной клеточной мембраны, сохранить ParticleStack как файл .tiff следующие файла
- Загрузка генерируемой ячейки в Surface manager
- Установите Surface Manager Plugin15 в использованную установку Фиджи. Следуйте инструкциям Викториновой и др.16.
- Открытый Surface Manager с помощью плагинов (ru) и сегментации (3D).
ПРИМЕЧАНИЕ: Окно Surface manager отображает несколько кнопок действия справа и пустое окно слева. Чтобы увидеть все кнопки действия, может потребоваться растянуть окно в его высоте / ширине. Обратите внимание, что временные рамки будут отображаться как z-ломтики. - Откройте соответствующий файл ParticleStack .tiff в Surface Manager, нажав файлику и выберите изображение для открытия (например, ParticlesStack1.tif).
- В Surface Manager щелкните кнопку изображения Прочитаного контура и установите индекс Jacquard до 60%.
ПРИМЕЧАНИЕ: Загрузка файла ParticlesStack1.tif может занять до нескольких минут, в зависимости от вычислительной мощности компьютера. - После загрузки каждая ячейка будет назначена с номером S и появится в левой части окна диспетчера Surface.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы показать контуры и имена ячеек для всех ячеек, отметьте флажок Show all и отокажите флажки меток в нижней части окна surface manager. Рекомендуется использовать эту функцию, как только номера клеток были проверены на их правильность. - Нажмите на первый номер S; импортированный контур ячейки из ParticlesStack1.tif отображается на TLM. Проверьте каждый импортированный номер S на качество контура ячейки на протяжении tLM и удалите нежелательные ячейки, отображающие неправильные контуры клеток. Для этого выделите контур ячейки и нажмите на кнопку Удалить.
ПРИМЕЧАНИЕ: Также можно исправить неточные контуры клеток и добавить новые контуры клеток. Об этом говорится в разделе обсуждения. - Сохраните все исправленные ячейки в виде файла RoiSet.zip, нажав кнопку «Сохранить на диске».
ПРИМЕЧАНИЕ: Если сеанс необходимо прервать, можно загрузить файл RoiSet в Surface manager позже: открыть TLM на Фиджи (Файл и открыть)и выбрать TLM. Открытый менеджер поверхности через Плагины (ru) : сегментация (Sgt; Surface manager(3D). Загрузите соответствующий файл RoiSet.zip, нажав кнопку Load с диска и выбрав подходящий файл RoiSet.zip. Дважды проверьте, соответствуют ли загруженные маски клеток загруженным TLM.
- Коррекция для дрейфа тканей в TLMs
ПРИМЕЧАНИЕ: Во время приобретения TLMs эффекты дрейфа могут наблюдаться из-за эпителиального вращения или нежелательного движения. В обоих случаях, мы рекомендуем исправить для любого дрейфа для того, чтобы упростить ручной анализ актомиозина позже. Корректировка дрейфа требуется только для ручного анализа актомиозина. Этот учебник требует современного программного обеспечения Фиджи с MultiStackReg Plugin (https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#multistackreg) установлен.- Откройте отбеливатель-исправленный TLM на Фиджи через файл и откройте и выберите отбеливатель-исправленный файл, созданный с помощью учебника, упомянутого выше.
- Разделите каналы и выберите тот, который определяет клеточные мембраны с помощью изображения
- Используйте следующий протокол, когда контуры клеток не являются заметно гладкими: Процесс Установите его на 1-2 для цели 63x и нажмите OK, а затем да. Нажмите процесс ,gt; Двоичный йgt; Преобразование в маску с помощью настроек по умолчанию; затем нажмите OK.
- Загрузите MultiStackReg Plugin следующие Плагины
- Убедитесь, что Стек 1 установлен на канал клеточной мембраны, действие 1 настроено на выравнивание, а преобразование настроено на перевод. Проверьте чекбокс Файл преобразования, а затем нажмите OK.
- Повторно откройте выбранный TLM, MultiStackReg Plugin, и сохраненный файл преобразования с помощью файла и открыть и выбрать TLM. Разделите цветовые каналы, используя изображение
- Загрузите MultiStackReg Plugin, нажав на плагины Выберите файл преобразования нагрузки как действие 1.
- Оставьте Преобразование как жесткое тело и нажмите OK. Выберите ранее сохраненный файл трансформации и нажмите OK снова.
- Слияние каналов изображения и сохранить зарегистрированных TLM в качестве файла .tiff следующие изображения Сохранить файл, нажав файла (ru) сохранить как
ПРИМЕЧАНИЕ: Есть альтернативные способы, чтобы исправить для ткани дрейфа на Фиджи, а именно через Плагины (ru)
- Отбеливатель коррекции TLMs, чтобы компенсировать интенсивность распада флуоресцентных этикеток
- Анализ импульсов актомиозина в Surface manager в LCS
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап протокола позволяет ученым определить, присутствуют ли импульсы актомиозина в анализируемых тканях, и понять детальное поведение, а также направленность сигналов атомиозина.- Откройте Фиджи и убедитесь, что TLM и соответствующая маска ячейки открыта в Surface manager.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что Фиджи установлен и актуален, а плагин Surface Manager (шаг 1.1.3.1). - Откройте TLM с файлом и откройте и выберите TLM, чтобы открыть (например, TestMovie1'bleach.tif). Загрузите Surface менеджер Plugin через плагины (gt; Сегментация) Загрузите сохраненную маску ячейки, созданную в учебнике здесь (например, ParticlesStack1.tif) через файл и выберите маску ячейки (например, ParticlesStack1.tif). Загрузите соответствующий регион интереса (ROI, например, TestMovie1-RoiSet.zip). Смотрите рисунок 3A.
- Переключитесь на канал интереса к выбранной TLM.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы различать каналы, следуйте цветовому коду, указанному вокруг TLM. - В Surface Manager щелкните кнопку Статистика, чтобы получить окно под названием Среднее серое значение Slice by Slice (рисунок3B). Обратите внимание, что будут отображаться средние/средние значения интенсивности актомиозина в данном анализируемом канале в определенных контурах ячейки с течением времени, а также другие параметры, связанные с областью клетки и формой клетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Значения интенсивности находятся в арбитражных единицах (A.U.); область ячейки находится в пикселях и должна быть преобразована в квадратные микрометры. - Сохранить полученные значения в виде файла электронной таблицы. Нажмите на окно статистики, файл
ПРИМЕЧАНИЕ: Проверить полученные статистические значения можно позже следующим образом: открыть tLM, исправленную отбеливателем, на Фиджи и открытый surface manager. Загрузите соответствующий RoiSet.zip в TLM, нажав на кнопку Load с диска и откройте файл. Сохраненная маска с контурами ячейки будет загружена, а имена ячеек будут отображаться в левом окне диспетчера Surface. Нажмите кнопку Статистика для статистических значений.
- Откройте Фиджи и убедитесь, что TLM и соответствующая маска ячейки открыта в Surface manager.
- Ручной анализ отдельных субклеточных атомиозиновых сигналов в LCS
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол требует наибольшей концентрации и занимает много времени. В общем, один приобретенный TLM может быть удобно проанализирован в течение 1 дня. Это не включает время для подготовки мухи до их вскрытия, само вскрытие и приобретение изображения.- Откройте выбранную, отбеливающую и зарегистрированную (дрифт-исправленную) TLM в обновленном приложении Фиджи. В качестве примера теста используйте tLM, исправленный отбеливателем и дрифт-исправленным TLM (например, TestMovie1-bleach-reg.tif).
- Отрегулируйте яркость и контрастность, чтобы увидеть индивидуальные сигналы актомиозина с помощью изображения
- Выровняйте TLMs в том же направлении относительно оси ткани/тела. В случае яичных камер, выровнять переднюю сторону яичных камер всегда слева от изображения / submovie / TLM до анализа.
- Разделите выбранный фильм на короткие 30 субфильмов и временный проект каждого из них. Сохранить несвоевременно прогнозируемые и проецированные по времени субфильмы с соответствующими названиями. Храните исходный источник.
ПРИМЕЧАНИЕ: Submovies могут быть созданы из оригинальных TLMs путем первого удаления нежелательных кадров с помощью изображения Определите, чтобы срезы были удалены, и установите приращение. Преобразуйте в RGB перед использованием удаления среза при приращении No 1. Для времени-проект 30 s submovie, нажмите изображение Пропустите каждый второй 30 s submovie для того, чтобы избежать подсчета сигналов актомиозина 2x в двух последующих 30 s submovies. - Поместите проецируемое во времени изображение рядом с соответствующим подфильмом 30 s(рисунок 4A,B). Определите сигнальную линию на проецируемом на время субфильме. Определите направление движения сигнала актомиозина (0–360 градусов) вдоль этой линии в оригинальном субфильме, вручную воспроизвовав субфильм. Используйте инструмент Угол (в баре Фиджи) вручную измерить направление движения сигнала относительно определенной оси ткани или аналогичного доступного инструмента.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фиджи работает только по шкале от 0 до 180 дюймов(рисунок 4C),и требуется перерасчет полученных значений по шкале от 0 до 360 градусов. Сигнальная линия соответствует траектории движения сигнала актомиозина с течением времени. - Чтобы избежать дублирования при анализе сигналов атомиозина, отметьте анализируемые сигнальные линии в клетках в проецируемом на время субфильме(рисунок 4B,D).
- Проанализируйте все выбранные ячейки в подфильме 30 s и сохраните полученные углы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Анализировать только субклеточные цитоплазмические актомиозные сигналы в клетках с четко определенными клеточными очертаниями на протяжении TLM. Исключите отдельные клетки с менее чем 15-20 обнаруженными сигналами во всем TLM. Игнорировать сигналы атомиозина, которые перемещаются по клеткам из-за их неизвестного происхождения. Пример количества сигналов для одной исследуемой ячейки в подфильме 30 s показан на рисунке 4D. - Продолжайте до тех пор, пока не будут проанализированы все 30 субфильмов одного TLM, и сохраните все измеренные углы атомиозиновых сигналов одного TLM в файле электронной таблицы.
- Суммируйте все измеренные углы по сравнению с соответствующим числом TLMs (в зависимости от эксперимента). Участок процент направления проанализированных сигналов актомиозина, например, в виде диаграммы розы с диапазоном от 0 до 360 "с предпочтительным программным обеспечением.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения статистически значимых результатов рекомендуется проанализировать от пяти до десяти независимых яичных камер любой стадии яичной камеры.
2. Шкала тканей
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы вскрыть и изображение в пробирке культивированные камеры яйца Drosophila, следуйте протоколу в дополнительномфайле 2 . Для анализа приобретенных TLMs, продолжить со следующим протоколом ниже. Сопровождаемые тестовые файлы TLMs помещаются в дополнительный файл 3.
- Селективная поверхностная экстракция изогнутых эпителиальных тканей
Примечание:Этот протокол позволяет пользователям выборочно извлекать тонкий слой актомиозина в изогнутой эпителиальной ткани с течением времени. Этот этап протокола удобен для пользователя и основан на интуитивно понятном графическом интерфейсе. Можно удобно проанализировать (экстракт поверхности) несколько TLMs. Использование TestMovie2.czi (отДополнительный файл 3) в качестве примера теста TLM.- Открыть до современных приложений Фиджи ( Фиджи
- Убедитесь, что Ellipsoid Surface Projection Plugin15 установлен. Следуйте Викторинова идр. 16.
- Откройте TLM и экспортировать его в качестве файла XML/HDF5, нажав на плагины (BigDataViewer) и экспортировать текущий образ как файл XML/HDF5.
ПРИМЕЧАНИЕ: Требуется определить траекторию экспорта. Сохранение само по себе может занять несколько минут и зависит от длины TLM. - Откройте экспортированный файл в Ellipsoid Поверхностная проекция, нажав на плагины (gt; BigDataViewer)
ПРИМЕЧАНИЕ: Появится новое окно с сагитальными видами яичной камеры и диалогом для руководства пользователем по обработке. Подробную информацию о том, как перемещаться в представлении срезов, можно найти в https://imagej.net/BigDataViewer. - Окно диалога под названием «Проекция яичников» имеет несколько вкладок. В первой вкладке диалогов под названием Bounding box определите границы x и y яичной камеры в TLM вместе с шириной z ограничивающего ящика (т.е. глубина z-стек/яичной камеры) и набором нажатий (рисунок5A).
- Чтобы определить границы, перетащите кнопки рядом с x, y и z или определите координаты числа в коробках x, y и z. Убедитесь, что границы достаточно щедры, чтобы получить часть яичной камеры интереса в поверхности добычи. Выбранные части яичной камеры выделены розовым цветом.
- Переключитесь на вкладку под названием «Найти капли в проекции яичников окна». Определите сигму и минимальное пиковое значение; затем, нажмите вычислить для выявления сигналов актомиозина(Рисунок 5B), который будет отображаться как зеленые капли. Повторяй этот шаг с различными параметрами до тех пор, пока не будет найдено достаточное количество пятен (около 100).
ПРИМЕЧАНИЕ: Sigma 1'u20123 с минимальным пиковым значением 20 х u2012100 работает лучше всего для выявления атомиозина сигналов стадии-6 до -8 яичных камер. Выявление сигналов атомиозина является важным шагом и зависит от качества сигнала и его размера. Важно подтвердить правильный размер существующих капли. Отсутствие видимых зеленых пятен/blobs на изображении означает, что следующий шаг не будет работать. Просмотрите выбранные самолеты z, чтобы увидеть капли. - Чтобы спроектировать эллипсоид, продолжайте со вкладкой под названием Fit ellipsoid. Установите случайные образцы до 10000, вне / внутри отсечения расстояние до 1'u201210, а затем, нажмите Вычислить (Рисунок5C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Чем ниже расстояние отсечения, тем точнее будет желаемый эллипсоид. После этого вкладка под названием Projection автоматически откроется и позволяет определение поверхности извлечения. Настройки должны быть оптимизированы. - Продолжить дальше с вкладкой называется проекция (Рисунок 5D). Наложите минимальное и максимальное расстояние проекции (т.е. ширину желаемого эллипсоида). Необходимо установить минимальное и максимальное расстояние проекции, чтобы розовый определенный эллипсоидный регион включает в себя весь внешний слой яичной камеры. Определите расстояние среза (рекомендуется 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Примеры неправильной и оптимальной эллипсоидной подгонки, приводящей к неверным и оптимальным параметрам проекции, показаны на рисунке 6A,C. Тонкий окружной слой интереса может быть определен позже. Убедитесь, что розовая область эллипсоида с определенной шириной на яичной камере видна перед нажатием вычисления. Важно, чтобы желаемый эллипсоид (розовая одна линия) красиво вписывается в эллипсоидную поверхность яичной камеры для того, чтобы получить наилучшие результаты. Если эллипсоидная подгонка не очень хорошая, организуйте различные настройки до получения желаемой поверхности.- Установите ширину выходного производства (800 фунтов) и высоту (400 фунтов) эллипсоида. Установить, от какого времени, в какой момент времени поверхности извлечения должны быть созданы (т.е., определить длину извлечения TLM). Выберите либо сферическую, либо цилиндрическую проекцию. При необходимости переверните и выровняйте Y.
- Нажмите вычислить для получения поверхности извлечения для обоих каналов в новых окнах под названием Image. Отрегулируйте яркость и контраст полученных окон изображения, чтобы иметь возможность увидеть прогнозируемые сигналы актомиозина, нажав на изображение, отрегулируйте яркость/ контрастность.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пример сравнения проекции в результате неправильной и оптимальной эллипсоидной припадок показан на рисунке 6B,D.
- Если извлечение поверхности выглядит хорошо, сохраните изображения (оба канала по отдельности) как .tiff. Кроме того, сохраните файл окна журнала для будущей ссылки на то, как была извлечена поверхность этой конкретной яичной камеры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это особенно важная информация, если извлеченный тонкий слой должен быть возвращен в исходную развернутую форму (только для разработчиков). - Слияние каналов с предпочтительным цветовым кодом на Фиджи.
ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости проект выбрал слои z-stack с актомиозином сигналов. Проекция выбранных слоев z-стека необходима, когда фокус приобретения несколько меняется с течением времени в TLM. Для достижения наилучших результатов проектирует не более одного-двух z-stack слоев. - Сохранить результаты как файлы .tiff.
ПРИМЕЧАНИЕ: Репрезентативные примеры тонких слоев (селективная базальная и апикальная поверхность), представляющие сигнал Myosin II (MRLC:GFP) из эпителия фолликула управления и тудентовых яичных камер fat2.
- Обработка данных выборочно извлеченной поверхности ткани
- Отбеливатель-правильно TLMs для того чтобы компенсировать для распада интенсивности флуоресцентных ярлыков.
- Открыть Фиджи. Откройте TLM (например, TestMovie2'extraction.tif из дополнительного файла3) с помощью файла (rugt; Open. Выберите изображение, чтобы открыть его.
- Разделите цветовые каналы и преобразовать их в 16-битные изображения, если это необходимо, нажав изображение Преобразуйте каналы в 16-битные изображения (из 32-битных изображений) с помощью изображения
- Выполните коррекцию отбеливателя на обоих каналах с помощью изображения
ПРИМЕЧАНИЕ: Если получены неудовлетворительные результаты, необходимо изучить, какие методы коррекции в этом плагине подходят лучше всего (например, использовать Гистограмма Соответствие вместо простого соотношения). - Слияние каналов из двух отбеливатель-исправленных изображений, нажав изображение Сохранить слияние изображения в виде файла .tiff, нажав файла
ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости отрегулируйте контраст и яркость для каналов.
- Сегментация клеток для создания клеточной маски для TLMs
- Если Фиджи еще не открыта, вновь открыть его (и убедитесь, что он является актуальным, нажав Справка
- Если это еще не сделано, скачать макрос TissueCellSegmentMovie.ijm (http://adm.irbbarcelona.org/matlab/TissueCellSegmentMovie.ijm).
- Перетащите и падение этого сценария на Фиджи. Откройте исправленный файл отбеливателя (например, TestMovie2'bleach.tif из дополнительного файла 3, см. также 2.2.1).
- Разделите каналы отбеливателя-исправленного файла, нажав изображение Отрегулируйте мембранный канал, чтобы обеспечить четкие контуры клеток, нажав на изображение
- Запустите загруженный скрипт на активном мембранном канале ячейки выбранного TLM, нажав значок Run в открытом скрипте. Установите гауссианское размытие до 1.500. Установите чувствительность обнаружения ячейки до -1 и нажмите OK. Установите Ориентировочная допуск шума до 8 фунтов для TLMs, приобретенных с 40x целью и нажмите OK.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для того, чтобы получить хорошую маску клетки, не меняйте эти параметры выше. Для других целей могут потребоваться различные параметры. Чем чище фон в TLM, тем ниже расчетная допуск к шуму. - Сгенерированная клеточная маска появляется в анализируемом TLM, а также в новом окне под названием ParticleStack (G). Кроме того, появляется небольшое окно под названием «Требуемое действие». Из клеточной маски на TLM, сосредоточиться только на клетках в центре TLM и выбрать те, которые могут обеспечить полный и четко определенные очертания по всему TLM.
- Если выбранные ячейки содержат искусственные/дополнительные контуры ячеек, используйте окно инструмента слияния под названием Action, требуемое в TLM. Для последних следуйте инструкциям в окне.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что контуры клеток четко определены и соответствуют реальным клеточным мембранам в TLM, так как любая неточность может повлиять на последующий анализ. Дополнительные настройки и изменения, такие как удаление нежелательных ячеек, могут быть сделаны позже с помощью инструмента Surface manager (описано в учебнике ниже). - При выбранных клетках в центре красиво соответствуют реальной клеточной мембраны, сохранить ParticleStack как файл .tiff следующие файла Приступить к выполнению загрузки сгенерированной клеточной маски и анализа актомиозина в Surface Manager, как это было ранее выполнено в разделах 1.1.3 и 1.2 (также подробно описано в разделах 2.2.3 и 2.3).
- Загрузка генерируемой ячейки в Surface manager
- Если Surface Manager Plugin уже установлен в используемой установке Fiji, приступай к шагу 2. Если нет, следуйте Викториновой и др.16. Для разработчиков, только исходный код также доступен15.
- Открытый Surface Manager, нажав на плагины (gt; Сегментация) ( Surface manager (3D).
ПРИМЕЧАНИЕ: Окно Surface manager отображает несколько кнопок действия справа и пустое окно слева. Чтобы увидеть все кнопки действия, может потребоваться растянуть окно в его высоте / ширине. Обратите внимание, что временные рамки будут отображаться как z-ломтики. - Откройте соответствующий файл ParticleStack.tif в Surface Manager через файл и выберите изображение, чтобы открыть (например, ParticleStack2.tif из дополнительного файла 3).
- В Surface Manager щелкните кнопку изображения Прочитаного контура и установите индекс Jacquard до 60%.
ПРИМЕЧАНИЕ: Загрузка файла ParticleStack.tif может занять до нескольких минут, в зависимости от мощности компьютера. - После загрузки каждая ячейка будет назначена с номером S и появится в левой части окна surface manager(рисунок 7A).
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы показать контуры и имена ячеек для всех ячеек, отметьте флажок Show all и отокажите флажки меток в нижней части окна surface manager. Рекомендуется использовать эту функцию, как только номера клеток были проверены на их правильность. - Нажмите на первый номер S; импортированный контур ячейки из ParticleStack.tif отображается на TLM. Проверьте каждый импортированный номер S на качество контура ячейки на протяжении tLM и удалите нежелательные ячейки, отображающие неправильные контуры клеток. Для этого выделите контур ячейки и нажмите на кнопку Удалить.
ПРИМЕЧАНИЕ: Также можно исправить неточные контуры клеток и добавить новые контуры клеток. Об этом говорится в разделе обсуждения. - Сохраните все исправленные ячейки в виде файла RoiSet.zip, нажав кнопку «Сохранить на диске».
ПРИМЕЧАНИЕ: Если сеанс необходимо прервать, можно загрузить файл RoiSet.zip в Surface manager позже: открыть TLM на Фиджи через файл и выберите TLM. Открытый менеджер поверхности следующим образом: Плагины (ru): Сегментация (SGT; Surface manager(3D). Загрузите соответствующий RoiSet.zip, нажав кнопку Load с диска и выбрав подходящий файл RoiSet.zip (например, TestMovie2-RoiSet.zip). Дважды проверьте, соответствуют ли загруженные маски клеток загруженным TLM.
- Отбеливатель-правильно TLMs для того чтобы компенсировать для распада интенсивности флуоресцентных ярлыков.
- Анализ импульсов актомиозина у менеджера Surface
ПРИМЕЧАНИЕ: Откройте Фиджи и убедитесь, что TLM и соответствующая маска ячейки открыта в Surface manager. Убедитесь, что Фиджи установлен и актуален, а также Surface Manager Plugin (https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager).- Откройте TLM с файлом и откройте и выберите TLM, чтобы открыть (например, TestMovie2'bleach.tif). Загрузите плагин Surface manager через плагины,gt; Сегментация (SGT; Surface manager(3D). Загрузите сохраненную маску ячейки, созданную в учебнике здесь (например, ParticlesStack2.tif) через файл и выберите маску ячейки (например, ParticlesStack2.tif). Загрузите соответствующую рентабельность инвестиций (например, TestMovie2-RoiSet.zip).
- Переключитесь на канал интереса к выбранной TLM.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы различать каналы, следуйте цветовому коду, указанному вокруг TLM. - В Surface manager щелкните кнопку Статистика, чтобы получить окно под названием Среднее серое значение Slice by Slice (рисунок7B). Обратите внимание, что будут отображаться средние/средние значения интенсивности актомиозина в данном анализируемом канале в определенных контурах ячейки с течением времени, а также другие параметры, связанные с областью клетки и формой клетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Значения интенсивности находятся в A.U.; область ячейки находится в пикселях и должна быть преобразована в квадратные микрометры. - Сохранить полученные значения в виде файла электронной таблицы: нажмите на окно статистики, файл
ПРИМЕЧАНИЕ: Проверить полученные статистические значения можно позже следующим образом. Откройте отбеливатель-исправленный TLM на Фиджи. Менеджер open Surface. Загрузите соответствующий RoiSet.zip в TLM, нажав на кнопку Load с диска и откройте файл. Сохраненная маска с контурами ячейки будет загружена, а имена ячеек будут отображаться в левом окне диспетчера Surface. Нажмите кнопку Статистика для статистических значений.
ПРИМЕЧАНИЕ: Что касается ручного анализа отдельных субклеточных сигналов атомиозина,то невозможно провести ручной анализ субклеточных атомиозиновых сигналов в масштабе ткани. Оптимизация необходима для анализа индивидуальных сигналов атомиозина в полутканевом масштабе, как подчеркивается в разделе обсуждения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот протокол позволяет ученым исследовать поведение актомиозина сетей в эпителиальных тканях. Это возможно только тогда, когда подробный анализ поведения актомиозина в локальном клеточном масштабе (несколько клеток) сочетается с аналогичным анализом в масштабе тканей (многие клетки). Тем не менее, эпителиальные ткани часто изогнуты и извлечение тонкого слоя этих тканей ранее было не легко возможно, как показано в дрозофилы яичных камер (Рисунок 1). Представленный здесь протокол предоставляет пользователям простые инструкции, описывающие, как анализировать поведение актомиозина в обоих этих масштабах(рисунок 2).
Первая часть этого протокола фокусируется на инструкциях по анализу импульсов актомиозина с помощью плагина Surface manager (рисунок3). Он также описывает, как вручную анализировать индивидуальное поведение актомиозина в локальной клеточной шкале(рисунок 4). Вторая часть этого протокола объясняет, как извлечь тонкий слой эпителиальной ткани с помощью плагина Ellipsoid Surface Projection (рисунок5 и рисунок 6). Только тогда можно анализировать импульсы актомиозина в масштабе ткани с помощью плагина Surface manager (рисунок7). Представитель результаты и сравнение поведения актомиозина в вращающейся контроля и статические fat2 мутант Дрозофила яйцеклетки в местной клеточной и ткани масштаба показано на рисунке 8 и в соответствующем фильме 1, Фильм 2, Фильм 3, Фильм 4, Фильм 5, и фильм 6 (для деталей, см. Рисунок 8).
Рисунок 1: Селективная экстракция тонкого слоя изогнутой поверхности ткани. (A) Для того, чтобы получить достаточную информацию о актомиозиновых сетях в окружно изогнутых эпителиях, необходимо приобрести глубокий z-стек (розовый) над большинством видимых тканей, как показано на изогнутый эпителий фолликула (серый) дрозофилы яйцеклетки. (A') Однако простая проекция такого z-стека приводит к смешиванию целых актомиозинов сетей в фолликуловых клетках. Myosin II визуализировано с MRLC::GFP (зеленый) показывает сильно выраженную внутреннюю (апикальную) область фолликуловых клеток в такой z-проекции и почти никакой информации от базальной (внешней) стороны, где Myosin II отображает сильный фенотип пунарной полярности клеток, но его интенсивность сигнала низкая12. Чтобы избежать такого смешивания, как показано в панели A',мы разработали удобный, Фиджи на основе плагина под названием Ellipsoid Surface Projection в BigDataViewer18, что позволяет (B) селективного извлечения определенных, тонкий слой (розовый ) актомиозина из изогнутогоэпителия (B'), как показано на Myosin II (зеленый) в выбранной извлечения базальной (внешней) стороны эпителия фолликула. Сравните разницу в сигнале Myosin II (MRLC::GFP) в панелях A' и B'. Обратите внимание на планарную поляризованную картину Myosin II в панели B'. Контуры ячейки красным цветом. Передняя сторона находится слева. Шкала бар 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Планар поляризованная сеть актомиозина в местных клеточных и тканевых масштабах. Изображение актомиозина в разных масштабах позволяет анализировать различные числа эпителиальных клеток, а именно :( A) до 15 клеток в локальном клеточном масштабе и (B) 50-100 клеток в масштабе ткани в эпителии фолликула культивированного Дрозофилы яйцеклетки. Nonmuscle Myosin II визуализируется с помощью MRLC::GFP (зеленый) и генотип используемой трансгенной линии указан в таблицематериалов. Контуры клеток находятся в пурпурном цвете. Передняя сторона находится слева. Шкала баров No 5 мкм (A); 50 мкм (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Пример анализа импульсов Myosin II в Surface manager в локальном клеточном масштабе. (A) Стек частиц загружается в Surface manager. Обратите внимание, что все идентифицированные ячейки в TLM отображаются в окне диспетчера Surface. Важно удалить все нежелательные или неполные ячейки по всему TLM. (B) Статистика, полученная на Myosin II (MRLC::GFP) для выбранных ячеек, отображается в окне под названием Средний серый значение Slice by Slice in Surface manager. MRLC::GFP показан зеленым цветом, в то время как клеточные мембраны в красном цвете. Передняя сторона находится слева. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Пример ручного анализа отдельных сигналов Myosin II в локальном клеточном масштабе. (A) Выбранный 30 s-длинней субфильм расположен рядом с (B) его проекция времени. Обратите внимание, что при проекции времени Myosin II (MRLC:GFP) показывает более длинные линии траектории (см. панель B)в отдельных ячейках, чем в отдельных временных рамках (см. панель A). Индивидуальные линии в клетках должны быть проанализированы для их углового направления относительно передней задней оси яичных камер. (C) Обратите внимание, что Фиджи не измеряет 0 "-360", но только 0 "-180" для сигналов, указывающих вверх и 0 "-179" для сигналов, указывающих вниз. Имейте в виду, что 0 "нетипично помещается справа от анализируемого изображения. (D) Основываясь на этой информации, линии, которые движутся с (вверх по розовому) или против (вниз по желтому) направление эпителиального вращения в конкретной камере яйца должны быть binned определить, является ли симметрия нарушение проанализированных сигналов присутствует в течение клетки, а затем для нескольких клеток в анализируемых тканях. MRLC::GFP показан зеленым цветом, в то время как клеточные мембраны в красном цвете. Передняя сторона находится слева. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Пример генерации эллипсоида, подтянутого в масштабе тканей. Для того, чтобы поместить эллипсоид на яичную камеру с помощью плагина Ellipsoid Surface Projection в BigDataViewer, необходимо определить (A ) ограничивающий ящик, который включает в себя большинство отсканированных тканей. Далее, важно (B) для определения сигнальных точек, которые являются необходимым условием для оптимального поколения эллипсоидов подходят. (C) Когда эллипсоид подходят не является оптимальным и не красиво окружают яичную камеру, это приводит к (D) плохой ткани слоя экстракции. Смотрите извлечение и более поздние результаты проекции на рисунке 6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Сравнение неправильной и оптимальной эллипсоидной подгонки и соответствующих проекций поверхности. (A) Когда эллипсоид не установлен должным образом, (B) окончательная проекция поверхности не обеспечит полные данные сигнала в тонком слое проанализированных тканей. (C) Однако, при установке оптимально, это гарантирует равное обнаружение сигнала тонкого слоя в ткани. (D) Обратите внимание, что оптимальная проекция поверхности содержит несколько тонких слоев в виде поверхностного проецируемого z-stack с течением времени, которые могут быть разделены впоследствии, как показано на рисунке 8. Сигналы Myosin II (MRLC::GFP, белый) и мембранные сигналы (белые) сначала сливаются перед проекцией (панели A и C),но на самой поверхностной проекции эти каналы разделены (см. проекции Myosin II в панели B и D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 7: Пример анализа импульсов Myosin II в Surface manager в масштабе ткани. (A) Стек частиц загружается в Surface manager. Обратите внимание, что все идентифицированные ячейки в TLM отображаются в окне диспетчера Surface. Важно удалить все нежелательные или неполные ячейки по всему TLM. (B) Статистика, полученная на Myosin II (MRLC::GFP) импульсы (средний или средний) для выбранных ячеек с течением времени показаны в окне под названием Среднее серое значение Slice в менеджере surface. Обратите внимание, что более сильные точки Myosin II могут влиять на окончательную меру интенсивности внутренней интенсивности миозина II. Это является результатом проблемы, что эти точки Myosin II могут показаться мигрировать за пределы контура ячейки, где есть неправильное определение контура ячейки в сгенерированной маске ячейки. MRLC::GFP показан зеленым цветом, в то время как клеточные мембраны в красном цвете. Передняя сторона находится на вершине. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 8: Репрезентативные результаты сети Myosin II в эпителии фолликуля Drosophila. Репрезентативные примеры динамического myosin II (MRLC:GFP) поведения (A и B) в локальной клеточной шкале и (C-F) в шкале ткани для контроля и fat2 мутант Дрозофила яйцеклетки. Подробную информацию об используемых генотипах можно ознакомиться в таблице материалов. Обратите внимание, что MRLC::GFP сигналы (зеленый) двигаться перпендикулярно передней задней (AP) оси контроля яичные камеры. Эта полярность теряется в fat2 мутантных яичных камерах и приводит к анисотропным миозина II импульсов / колебаний12. При ручном анализе небольших MRLC::GFP сигналы (300 мкм) и количественное их угловое направленное движение, как описано в протоколе, нарушение симметрии MRLC::GFP сигналы могут наблюдаться с предпочтением против направления эпителия вращения в анализируемых яичной камере12 (рисунок 4). Соответствующие фильмы: панель А и фильм 1, панель B - Фильм 2, панель C - Фильм 3, панель D - Фильм 4, панель E - Фильм 5, и панель F Фильм 6. Очертания клеток показаны в пурпурном цвете. Передняя сторона находится слева. Шкала баров 5 мкм (A и B) и 50 мкм (C-F). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Рекомендуемые параметры для кратковременной высокоскоростной визуализации в локальном клеточном масштабе: | |||
| Я. | Ткань интереса свободно помещенная в культивируя средство (т.е. никакие скольжения крышки, гибкие одеяла, etc.) | ||
| Ii. | 63x цель воды с числовой диафрагмы | ||
| Iii. | Перевернутый конфокальный микроскоп | ||
| Iv. | Одиночный самолет | ||
| V. | 6-12 s временные интервалы | ||
| Vi. | 5-10 минут TLMs | ||
| Vii. | Требование к хранению данных на TLM до 100 МБ | ||
| Рекомендуемые параметры для длительной низкоскоростной визуализации в масштабе ткани: | |||
| Я. | Ткань интереса свободно помещенная в культивируя средство (т.е. никакие скольжения крышки, гибкие одеяла, etc.) | ||
| Ii. | 40x водные цели и численная диафрагма | ||
| Iii. | Перевернутый вращающийся дисковый микроскоп | ||
| Iv. | z-стеки для приобретения около половины яичной камеры | ||
| V. | 60 с интервалами времени | ||
| Vi. | По крайней мере 30 минут TLMs | ||
| Vii. | Требование к хранению данных около 1 ГБ | ||
Таблица 1: Рекомендуемые параметры изображения.
Фильм 1: Представитель динамическое поведение Myosin II (MRLC::GFP) в клеточной шкале в контрольной камере яйца Дрозофилы. Обратите внимание, что MRLC:GFP (зеленый) предпочитает двигаться перпендикулярно оси AP яичных камер. Очертания клеток находятся в пурпурном цвете. Базальный вид. Передняя сторона находится слева. Шкала бар 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. Нажмите правой кнопкой мыши для загрузки.
Фильм 2: Представитель динамическое поведение Myosin II (MRLC::GFP) в клеточной шкале в fat2 мутант Drosophila яйцо камеры. Обратите внимание, что MRLC::GFP импульсов (зеленый) и больше не планар выровнены перпендикулярно ap оси статических камер яйцо. Очертания клеток находятся в пурпурном цвете. Базальный вид. Передняя сторона находится слева. Шкала бар 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. Нажмите правой кнопкой мыши для загрузки.
Фильм 3: Представитель динамическое поведение базального myosin II (MRLC::GFP) в масштабе ткани в контрольной камере яйца Дрозофилы. Обратите внимание, что только тонкий базальный (внешний) MRLC::GFP слой извлекается из почти половины эпителия фолликула яичной камеры. MRLC::GFP в зеленом и клеточные очертания в пурпурном. Обратите внимание на разницу в уровне детализации полученного MRLC::GFP сигнальное поведение здесь (представляющее шкалу тканей) по сравнению с фильмом 1 (представляющий клеточное масштаб). Передняя сторона находится слева. Шкала бар 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. Нажмите правой кнопкой мыши для загрузки.
Фильм 4: Представительное динамическое поведение базального миозина II (MRLC::GFP) в масштабе ткани в камере яйца fat2 мутанта Drosophila. Обратите внимание, что MRLC::GFP (зеленый) импульсы сильно на базальной стороне почти половины эпителия фолликула fat2 мутанта яичной камеры и не в состоянии генерировать синхронизированную силу, необходимую для содействия эпителиального вращения. Очертания клеток находятся в пурпурном цвете. Передняя сторона находится слева. Шкала бар 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. Нажмите правой кнопкой мыши для загрузки.
Фильм 5: Представительное динамическое поведение акическом Миозина II (MRLC:GFP) в масштабе ткани в контрольной камере яйца Дрозофилы. Только тонкий слой MRLC::GFP извлекается из апикальной (внутренней) стороны почти половины эпителия фолликула яичной камеры. Обратите внимание, что MRLC::GFP (зеленым цветом) показывает различное динамическое поведение здесь, на апикальной стороне по сравнению с базальной стороной эпителия фолликула (как показано в фильме 3). Очертания клеток находятся в пурпурном цвете. Передняя сторона находится слева. Шкала бар 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. Нажмите правой кнопкой мыши для загрузки.
Фильм 6: Представитель динамическое поведение акическом Myosin II (MRLC::GFP) в масштабе ткани в fat2 мутант Drosophila яйцеклетки. Изменено динамическое поведение MRLC::GFP (зеленый) извлечены из тонкой апикальной области почти половины эпителия фолликула статической камеры яйца туманта fat2. Очертания клеток находятся в пурпурном цвете. Передняя сторона находится слева. Шкала бар 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. Нажмите правой кнопкой мыши для загрузки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Критические шаги и устранение неполадок для вскрытия и культивирования яичных камер
Если слишком много мух помещаются в небольшой флакон, муха пища может превратиться грязной после 2-3 дней из-за большого количества кормления личинок и взрослых мух попасть в ловушку в мухи пищи. В таком случае, переверните остальные мухи в новый флакон со свежей пищей и уменьшить их количество. В частности, исключить женщин, которые застряли в пище.
Смесь Шнайдера (SM) должна быть подготовлена заранее и может храниться при 4 градусах По области в течение 14 дней. Имейте в виду, что старая смесь может содержать кристаллы, которые могут повредить поверхность яичных камер. Всегда смешивайте SM со свежедобавленным инсулином и дайте ему достаточно времени для достижения комнатной температуры. Это защищает камеры яичка против холодного удара, который может иметь отрицательное влияние на росте microtubules и planar выравнивание цитоскелета (как увидено в превращаясь крыле Drosophila 19).
Яичные камеры и выбранные овариолы очень хрупкие и, из-за их небольшого размера, могут плавать в SMI (SM с инсулином). Рекомендуется, чтобы позволить им спонтанно тонуть в SMI. Они также часто придерживаются вскрытия щипц / кактус инструмент. В таком случае, пусть они освобождаются от вскрытия устройств, мягко перемещая их в SMI. Избегайте сжатия и прикосновения к ним непосредственно во все времена. При необходимости исключите эти яичные камеры/овариолы из дальнейшего протокола.
Как вскрытие стереоскоп не является надежным для идентификации поврежденных яичных камер / овариолов, яичные камеры / овариолы должны быть проверены с помощью CellMask или FM 4-64 красителя под конфокальный / спиннинг диск микроскопа. Поврежденные яичные камеры показывают экстремальную окраску по сравнению с неповрежденным фоном яичной камеры ткани. Никогда не приобретайте TLM с сильными патчами красителя.
Критические шаги и устранение неполадок для in vitro живой визуализации яичных камер
Если свободно размещены яичные камеры в SMI по-прежнему двигаться, проверьте еще раз под конфокальный микроскоп, чтобы увидеть, есть ли еще какие-либо упускается из виду остатки мышечного листа и мусора, плавающие в SMI. Удалите их и попробуйте еще раз. Из яичных камер, 90% должны быть стабильными и неподвижными во время последующего изображения.
Чтобы убедиться, что выбранная яичная камера/овариол стабильна, используйте высокоскоростную визуализацию (6 с интервалами) в течение 1 мин. Нестабильные яичные камеры будут двигаться к этой точке. Тем не менее, рекомендуется смотреть всю запись замедленного пребывания, чтобы иметь возможность мягко исправить потенциальное неожиданное движение изображенной яичной камеры. Это можно сделать путем двигать микроскопический этап/таблицу, которая держит тарелку Петри с культурными камерами/ovarioles яичка, к первоначально положению так, что камера яичка интереса снова в изображенном, сфокусированном окне.
Остановите изображение, если появляется внезапное и неожиданное движение изображенной яичной камеры. Проверьте амортизм таблицы микроскопа, и избежать ходить возле микроскопа во время приобретения, как это может привести к нарушению изображения приобретения из-за вибрации, вызванные.
Если клеточный мембранный краситель не виден после 30 мин и используемая лазерная линия верна, добавьте больше красителя и увеличьте его концентрацию для следующего приобретения.
Если сигналы актомиозина кажутся размытыми, проверьте NA используемой цели. NA ниже 1,3 уменьшит качество изображения. Кроме того, убедитесь, что использованное масло погружения было применено правильно к воде 63x цели. При необходимости добавить или заменить его.
Если яичные камеры сжимаются и наблюдаемые клеточные мембраны деформируются, проверьте, правильно ли закрыта крышка. Если крышка отсутствует или не закрыта должным образом, яичные камеры могут высохнуть из-за испарения SMI в течение времени приобретения.
Если вращение яичных камер замедляется или останавливается, уменьшайте мощность лазера. Если отверстие появляется в яичной камере, оно было сожжено лазером. Уменьшите мощность лазера.
Если актомиозин сигнализирует отбеливатель после 2 мин во время приобретения TLM, уменьшить мощность лазера и увеличить усиливание сигнала в программном обеспечении микроскопа.
После того, как TLM эпителия фолликула одной яичной камеры был приобретен, рекомендуется избегать визуализации снова в той же области ткани этой яичной камеры. Однако, как яичные камеры вращаются вокруг их оси AP, можно повторить приобретение TLM с помощью этой неповрежденной яичной камеры примерно через 30 минут. При визуализации эпителия фолликула в одной яичной камере, другие яичные камеры не будут отбелены / повреждены, даже если они расположены в том же овариоле или в другом овариоле в SMI.
Если все эти требования будут выполнены, процент успешно изображенных яичных камер должен быть около 90%-100% для стадий 6-8, около 50%-60% для стадий 3-5, и около 20%-30% для стадий 1--2. Отказ в основном из-за движения яичных камер или повреждения их во время их вскрытия / манипуляции.
Критические шаги и устранение неполадок для обработки данных
Во время генерации маски с использованием предоставленного скрипта на Фиджи может случиться так, что существует множество генерируемых клеточных контуров, которые не отражают фактические клеточные мембраны в TLM. Это часто вызвано высоким фоновым шумом, особенно когда красители для пятен клеточных мембран используются. В таком случае, чтобы избежать утомительной коррекции нежелательных очертаний клеток в сгенерированной маске, запустите сегментацию снова и установите параметры в оптимальном соответствии. Это можно сделать путем регулировки параметры допустимой шумоизоляции.
При загрузке одного из файлов ParticleStack.tif, содержащих контуры ячейки, в Surface manager время погрузки линейно шкалирует с количеством контуров ячейки и может занять несколько минут. Если загрузка нарушена или неверна, повторите ее. Убедитесь, что окно загрузки находится в фокусе и никакая другая программа не используется.
Иногда контур ячейки должен быть исправлен в некоторых кадрах; в таком случае используйте кнопку Brush. Нарисуйте правильный контур ячейки в одном конкретном кадре, перетащив мышь вокруг клеточной мембраны. Перейдите на другой кадр TLM, а затем вернитесь к таймфрейму с коррекцией: неправильный контур ячейки теперь должен быть заменен. Затем, перейдите еще раз к следующему кадру, чтобы исправить это. Теперь инструмент Brush переключится в режим стирания. При необходимости исправьте контуры в следующих временных рамках, нажав на существующую контур ячейки, а затем нажав кнопку «Добавить» для создания нового контура ячейки. Удалите старый номер S из окна surface manager и переименуем контур новой ячейки, при необходимости нажав кнопку Rename.
Если вся важная ячейка отсутствует на протяжении TLM, создать новую наброски маски, нажав Unselect Создайте новый контур ячейки в первом кадре TLM, нажав вдоль клеточной мембраны. Затем перейдите к последнему кадру TLM и сделайте то же самое для выбранной ячейки. Запустив фильм вовремени, контуры ячейки будут интерполированы. При необходимости исправьте с помощью инструмента Brush. После завершения, нажмите кнопку «Добавить» и переименуйте контур ячейки, нажав кнопку «Переименование». Чем больше очков/кликов для создания нового контура ячейки, тем лучше работает интерполяция.
Помимо эпителиального вращения, TLMs иногда страдают от нежелательного движения. Поэтому рекомендуется исправить для таких дрейфа тканей в этих TLMs. Поступая таким образом, TLMs также корректируются для эпителиального вращения яичных камер, и клеточные мембраны становятся жесткими. Это упрощает ручной анализ сигналов актомиозина. Однако такой подход не позволяет ученым различать, движутся ли наблюдаемые сигналы актомиозина или статичны по отношению к клеточной мембране. Если целью такого анализа является различие между статическими и активными движениями актомиозина, то коррекция дрейфа тканей не должна применяться. Мы обнаружили, что большинство сигналов актомиозина активно перемещаются относительно клеточной мембраны и лишь незначительная их часть кажется статичной.
Критические шаги и устранение неполадок для анализа субклеточных сигналов атомиозина
Если генерируемая статистика содержит выбросы, убедитесь, что любые чрезвычайно низкие или высокие значения по отношению ко всему набору данных действительно отражают поведение в ячейке и не являются артефактами. Это можно сделать путем идентификации ячейки, содержащей выбросы, и проверки качества контура ячейки в то время, когда было измерено низкое/высокое значение. Часто такие экстремальные значения являются результатом дефектных контуров клеток, которые неправильно измеряют часть другой ячейки. Это может быть особенно очевидно, когда большие капли вмешиваются в контур клетки соседней клетки. В таком случае крайне важно исправить контуры клеток и повторить измерение.
Чтобы сделать количественную помощь проще, проанализируйте сигналы в одной конкретной поверхности клетки и продолжайте по одному до тех пор, пока все клетки не будут проанализированы в субфильме. Результаты ручного анализа субклеточных сигналов актомиозина не могут показать нарушение симметрии в одной клетке и одной конкретной яичной камере. Мы испытали, что актомиозин явно не нарушает симметрию по отношению к движению ткани в lt;10% вращающихся яичных камер (этапы 6-8). Этот процент увеличивается вокруг стадии 412. Мы также обнаружили, что нет никакой разницы, анализируются ли 5 мин или 10 мин при определении предпочтительного направления движения сигнала актомиозина в яичной камере12.
Критические шаги и устранение неполадок для селективного извлечения актомиозина сигналов из изогнутых тканей
Неправильный размер капли (идентифицированные сигналы) приведет к отсутствии капли и программа будет заморозить на следующем этапе. В этом случае, принудительного выхода Фиджи и недавно перезапустить плагин Ellipsoid Surface Projection. Сделайте то же самое, когда программа не реагирует после нажатия Compute. Это часто свидетельствует о том, что были выбраны неподходящие параметры.
Если Есть слишком много капли и / если они сосредоточены в сторону одной стороны проанализированной яичной камеры, это может повлиять на разработан эллипсоид и не обеспечивают правильную пригодность для яичной камеры. Вернитесь к идентификации капли и попытаться организовать их размер в сочетании с X-, y-, и z-оси выбор яичной камеры. Неспособность создать хорошую эллипсоидную подгонку также часто возникает, когда используются неподходящие настройки расстояния отсечения.
Полученные проекции иногда могут выглядеть нецеленаправленными, или, возможно, полученная плоскость z фактически перемещается между слоями клеток вблизи поверхности яичной камеры. Это, как правило, признак плохо установки эллипсоидов, где одна область эллипсоида устанавливается слишком далеко от яичной камеры. Старайтесь соответствовать эллипсоид так, что он поддерживает такое же расстояние от окружности яичной камеры.
Ограничения метода и новых подходов
Этот бесплатный культивирование яичных камер опускает тонкое уплощение поверхности яичной камеры. С этой целью этот метод имеет свои преимущества и недостатки. При использовании конфокальной микроскопии, он предоставляет пользователям с высоким разрешением и высокоскоростной визуализации, которая надежно раскрывает поведение актомиозина в клетках по окружности яичных камер в течение короткого периода времени (5-10 мин). Однако, делая это, он ограничивает размер одной плоскости, которые могут быть изображены с конфокальной микроскопии с течением времени. В общем, можно изображение до 15 клеток на яичную камеру на стадиях 6-8, но только около двух клеток в яичных камерах на стадии 1-5. Поэтому мы определили этот метод здесь как подходящий только для локальной клеточной шкалы.
Чтобы преодолеть эти ограничения по размеру, которые вызваны ограниченным размером одной конфокальной плоскости, мы разработали альтернативный подход на основе Фиджи под названием Ellipsoid Surface Projection, для использования в масштабе ткани. Это сочетает в себе вращающуюся дисковую микроскопию с полуинтерактивной поверхностной экстракции яичных камер в масштабе тканей. Таким образом, сигналы атомиозина могут быть получены одновременно для более чем 50-100 клеток из одной анализируемой яичной камеры. Важно отметить, что этот подход генерирует очень большие наборы данных приобретенных данных (йгига байты), имеет более низкое разрешение (он использует 40x против цели 63x), а также обеспечивает более низкую скорость изображения (это занимает 60 с для сканирования через половину ткани яичного ромашки ber «этапы 6–8» и, как таковой, он в 10 раз медленнее, чем ограниченный метод конфокальной плоскости.
По сравнению с другими существующими программами для извлечения многослойных проекций с параметризированных поверхностей, плагин, разработанный для этого протокола, ориентирован на простоту использования и интерактивную визуальную обратную связь на каждом этапе процесса. Другие инструменты, такие как MATLAB на основе ImSaNE20, используемые Чэнь и др.21, сосредоточиться на обработке широкого спектра параметризированных и непараметризированных моделей поверхности и различных методов проекции. Например, ImSaNE требует, чтобы данные были предварительно обработаны и выровнены определенным образом, и частично требует внешних инструментов в промежуточных шагах. В отличие от этого, плагин, представленный здесь, обрабатывает любое изображение 3D/4D/5D (последовательность), которое может быть открыто на Фиджи без внешней предварительной обработки. В то время как ImSaNE очень настраиваема (программируема) путем редактирования скриптов MATLAB, мы предоставляем минимальный набор опций в одном рабочем процессе, который с учетом конкретной проблемы, обсуждаемой здесь. Каждый шаг интерактивного рабочего процесса дает результаты, которые могут быть немедленно визуально проверены и скорректированы в случае необходимости.
Решение о том, какой из этих подходов к визуализации, местная клеточная или тканевая шкала, является наилучшим для конкретного эксперимента, зависит исключительно от научного вопроса, на который необходимо ответить (т.е. более высокое и низкое разрешение; короткое и длительное время приобретения). Хорошим компромиссом между этими двумя шкалами может быть объединение обоих подходов, тем самым получение изображения сигналов атомиозина в полутканевом масштабе (т.е. 20-30 клеток). Для этого требуется вращающийся дисковый микроскоп, водяной 63-x объектив с NA No1.3 и установленные настройки z-stack для 20-30 клеток яичной камеры. Этот гораздо более мелкий z-стек (в отличие от z-стека, необходимого для приобретения половины яичной камеры) позволяет быстрее сканировать менее 60 с. Полученное здесь время может быть использовано либо для повторного приобретения z-stack для ускорения обработки изображений, либо для восстановления образца (временных переплетов) между отдельными z-стеками. С последним, более длиннее время приобретения (30 мин) TLMs вращая камер яичка может быть достигано. Этот подход полутканей гарантирует достаточное разрешение для актомиозина сигналов и изображения большего количества клеток в то же время в течение более длительных периодов времени.
Будущие приложения и видение
Оба описанных метода (в локальном клеточном и тканевом масштабе) обеспечивают простой и недорогой подход (за исключением микроскопных устройств) с ограниченными побочными эффектами на актомиозина сети и могут быть реализованы и легко приняты для других расчлененных тканей животных. Единственным предварительным условием здесь является существующий культивирующий протокол в чашке Петри для изогнутой ткани интереса, доступных трансгенов, а также маркеров или методов маркировки.
В сочетании со световой лист флуоресценции микроскопии22, это также возможно изображение актомиозина машины в тото (т.е., изображение полной внешней окружной поверхности Drosophila яйцеклетки камер одновременно, а затем впоследствии развернуть с помощью плагина Ellipsoid Surface Extraction). Однако, Есть несколько ограничений, которые должны быть решены с точки зрения пригодности для высокоскоростной визуализации актомиозина сигналов, а именно 1) встраивание яичных камер в низкой точки плавления агарозы или их прилипания к капилляру во время визуализации; ii) низкочисленное отверстие использованных водяных линз, которые не обеспечивают достаточного разрешения сигнала атоммиозина; iii) дополнительное время, необходимое для приобретения нескольких углов яичных камер, что предотвращает высокоскоростную визуализацию.
С этой целью можно предвидеть, что с уточнением параметров микроскопа, таких как скорость сканирования через эпителиальную ткань и улучшение используемых микроскопических линз, подробный анализ актомиозина машины, в будущем, позволяют перспективные результаты с высоким разрешением, которые должны быть получены в ткани и в масштабе тото в течение длительных периодов времени.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы очень благодарны Мириам Остерфилд для обмена ее советы по in vitro жизни изображения яичных камер, используя подход, принятый из лаборатории Селеста Берг4. Мы также благодарим Себастьяна Тоси за сценарий Фиджи, который позволяет сегментации клеток.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Schneider Medium | Gibco | 21720-024 | [+]-Glutamine |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | [+] 10.000 Units/mL Penicillin [+] 10.000 µg/mL Streptomycin |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F135 | Heat inactivated |
| Insulin Solution Human | Sigma | I9278 | |
| 50 mL Falcon tubes | Eppendorf | sterile | |
| Millex-GV filter | Millipore | SLGV033NS | 33 mm |
| Glass Bottom Microwell Dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | 35 mm Petri dish, 14 mm Microwell, No. 1.5 cover glass |
| Forceps | A. Dumont & Fils | #55 | |
| CellMask Deep Red (cell membrane dye) | Invitrogen | C10046 | |
| FM4-64 (cell membrane dye) | ThermoFisher/Invitrogen | T13320 | |
| Depression dissection slide | Fisher Scientific | 12-560B | |
| Microscopic equipment | |||
| Steromicroscope | e.g. Zeiss | Stemi SV 6 | |
| Inverted confocal microscope | e.g. Zeiss/Olympus | ||
| Spinning disc microscope | e.g. Zeiss/Andor | ||
| Microscopic glass/cover glass | e.g. Thermo Scientific/Menzel Glas | ||
| Cactus tool | |||
| Wironit needle holder | Hammacher | 9160020 | |
| Cactus spine | Echinocactus grusonii/barrel cactus | ||
| Drosophila stocks used in the manuscript | |||
| AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP | For detail see Rauzi et al.: Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodeling. Nature 2010, Vol. 468, pg. 1110-1115. | ||
| AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP; fat258D/fat2103C | For detail see Viktorinova et al.: Epithelial rotation is preceded by planar symmetry breaking of actomyosin and protects epithelial tissue from cell deformations. PLoS Genetics 2017, Vol. 13, Issue 11, pg. e1007107. |
References
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. Journal of Visualized Experiments. (60), e3679 (2012).
- Hudson, A. M., Cooley, L.
- Cetera, M., Lewellyn, L., Horne-Badovinac, S. Cultivation and Live Imaging of Drosophila Ovaries. Methods of Molecular Biology. 1478, 215-226 (2016).
- Peters, N. C., Berg, C. A. In Vitro Culturing and Live Imaging of Drosophila Egg Chambers: A History and Adaptable Method. Methods of Molecular Biology. , 35-68 (2016).
- Spradling, A. C. Developmental Genetics of Oogenesis. The Development of Drosophila melanogaster, Volume 1. Bate, M., Arias, A. M. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 1-70 (1993).
- Haigo, S. L., Bilder, D. Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation. Science. 331, 1071-1074 (2011).
- Andersen, D., Horne-Badovinac, S. Influence of ovarian muscle contraction and oocyte growth on egg chamber elongation in Drosophila. Development. 143, 1375-1387 (2016).
- Pokrywka, N. J. Live imaging of GFP-labeled proteins in Drosophila oocytes. Journal of Visualized Experiments. (73), e50044 (2013).
- Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nature Protocols. 2, 2467-2473 (2007).
- Dorman, J. B., James, K. E., Fraser, S. E., Kiehart, D. P., Berg, C. A. bullwinkle is required for epithelial morphogenesis during Drosophila oogenesis. Developmental Biology. 267, 320-341 (2004).
- Cetera, M., et al. Epithelial rotation promotes the global alignment of contractile actin bundles during Drosophila egg chamber elongation. Nature Communications. 5, 5511 (2014).
- Viktorinova, I., Henry, I., Tomancak, P. Epithelial rotation is preceded by planar symmetry breaking of actomyosin and protects epithelial tissue from cell deformations. PLOS Genetics. 13, e1007107 (2017).
- Rauzi, M., Lenne, P. F., Lecuit, T. Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodelling. Nature. 468, 1110-1114 (2010).
- Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis. Developmental Biology. 393, 209-226 (2014).
- Haase, R. Surface manager. , Available from: https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager (2018).
- Viktorinova, I., Haase, R., Pietzsch, T., Henry, I., Tomancak, P. Actomyosin dynamics: Required Software and dependencies. , Available from: https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#surface-manager-and-ellipsoid-surface-projection-plugins (2018).
- Pietzsch, T. BigDataViewer. , Available from: https://imagej.net/BigDataViewer (2017).
- Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets. Nature Methods. 12, 481-483 (2015).
- Turner, C. M., Adler, P. N. Distinct roles for the actin and microtubule cytoskeletons in the morphogenesis of epidermal hairs during wing development in Drosophila. Mechanisms of Development. 70, 181-192 (1998).
- Heemskerk, I., Streichan, S. J. Tissue cartography: compressing bio-image data by dimensional reduction. Nature Methods. 12, 1139-1142 (2015).
- Chen, D. Y., Lipari, K. R., Dehghan, Y., Streichan, S. J., Bilder, D. Symmetry Breaking in an Edgeless Epithelium by Fat2-Regulated Microtubule Polarity. Cell Reports. 15, 1125-1133 (2016).
- Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nature Methods. 12, 30-34 (2015).
