Summary
Qui, valutiamo gli effetti dell'estratto d'acqua dei tombolens di Ruta sulla formazione della rete navale utilizzando un saggio di formazione del tubo su una matrice sotterranea gelata.
Abstract
L'angiogenesi è un fenomeno che comprende diversi processi, come la proliferazione delle cellule endoteliali, la differenziazione e la migrazione, che portano alla formazione di nuovi vasi sanguigni e coinvolgono diversi percorsi di trasduzione del segnale. Qui dimostriamo che il test di formazione dei tubi è un semplice metodo in vitro per valutare l'impatto dei prodotti naturali sull'angiogenesi e per studiare i meccanismi molecolari coinvolti. In particolare, in presenza dell'estratto d'acqua di Ruta graveolens (RGWE), le cellule endoteliali non sono più in grado di formare una rete cellulare e che gli effetti di RGWE sulla formazione di tubi endoteliali delle cellule ombelicali umane (HUVEC) sono aboliti attivazione coniugale di MEK.
Introduction
L'angiogenesi è un processo fisiologico che porta alla formazione di nuovi vasi sanguigni da quelli preesistenti e si verifica durante l'embriogenesi e la crescita degli organi. In età adulta, l'angiogenesi si attiva solo nell'ovaia ciclistica, nella placenta durante la gravidanza e durante la guarigione e la riparazione della ferita. L'angiogenesi dipende dalla capacità delle cellule endoteliali di proliferare, differenziare e migrare per formare una rete vascolare intatta1. Tuttavia, in diversi disturbi, come le malattie infiammatorie, metaboliche e reumatiche, i processi angiogenici sono alterati e l'angiogenesi diventa eccessiva. Inoltre, i processi angiogenici incontrollati stimolano anche la progressione del tumore e la metastasi1. Per questi motivi, nell'ultimo decennio, gli studi di ricerca si concentrano sullo sviluppo di nuove strategie terapeutiche volte all'inibizione dell'eccessiva angiogenesi nei disturbi del cancro, oculare, articolare o della pelle2,3.
Il fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) rappresenta l'obiettivo principale delle attuali terapie antiangiogeniche4e sono stati sviluppati e sintetizzati diversi anticorpi monoclonali anti-VEGF per prevenire l'eccessiva angiogenesi. Tuttavia, queste droghe sintetiche mostrano gravi effetti collaterali e hanno un rapporto costo-beneficio sfavorevole5,6. Pertanto, è imperativo trovare nuove strategie terapeutiche per limitare l'angiogenesi eccessiva con effetti collaterali minimi per integrare e combinare con farmaci attualmente utilizzati. Questi nuovi farmaci possono essere trovati tra i prodotti naturali che sono caratterizzati da un'elevata diversità chimica e specificità biochimica.
In questo articolo, proponiamo un metodo semplice per valutare l'impatto del RGWE sulla capacità degli HUVEC di formare tubuli su una matrice sotterranea gelata in vitro5. Infatti, RGWE è una miscela di metaboliti secondari come flavonoidi e polifenoli tra i quali la rutina è il componente principale5. Molti di loro sono già stati testati come agenti anti-infiammatori e vasoprotettivi7,8,9,10,11. Inoltre, abbiamo recentemente dimostrato che RGWE, ma non la rutina, è in grado di inibire la capacità HUVEC di formare tubuli su una matrice sotterranea gelata e che questo fenomeno è mediato dal percorso MEK-ERK, indicando RGWE come un potenziale strumento terapeutico in grado di prevenire l'eccessiva formazione di nuovi vasi sanguigni5.
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Protocol
1. Preparazione RGWE
- Raccogliere le foglie di R. graveolens dalle piante durante i mesi primaverili / estivi sotto la supervisione di un botanico.
NOT: In questo caso, le foglie sono state raccolte presso la Sezione Sperimentale di Piante Medicinali nell'Oro Botanico di Napoli, Italia5. La pianta è spontanea, perenne ed è presente nelle regioni mediterranee (Figura1). - Pesare 250 g di foglie e tritarle finemente con le forbici.
- Mettere le foglie in una fiaschetta conica e aggiungere 1 L di acqua distillata a 250 g di foglie tritate e portare che a ebollizione a 110 gradi C per 60 m. Coprire il flacone con un foglio di alluminio per evitare un'eccessiva evaporazione.
- Utilizzare carta da filtro da 3 mm per separare le foglie bollite dalla fase liquida che rappresenta l'estratto d'acqua.
- Filtrare la fase liquida attraverso un filtro da 0,22 m, raccogliendolo in un bicchiere. Coprire il becher con il parafilm e congelare l'estratto a -80 gradi durante la notte.
- Fare 10 - 15 fori con un ago nel parafilm e liofilizzare l'estratto in un liofilizzatore. Si noti che può richiedere un paio di giorni per ottenere la polvere.
- Pesare la polvere ottenuta, dividerla in aliquote e conservarla a 4 gradi centigradi fino a quando necessario. È possibile conservarlo per un anno.
- Quando necessario per gli esperimenti, preparare una soluzione di riserva, diluindo la polvere con acqua distillata ad una concentrazione standard di 50 mg/mL. Separarlo in aliquote di piccolo volume (ad esempio, 1 mL). Questa preparazione può essere conservata a -20 gradi centigradi, ma non può essere conservata a 4 gradi centigradi per più di un paio di giorni a causa delle ossidazioni delle molecole. Evitare di congelare e disgelare.
2. Cultura cellulare
- Coltivare HUVEC in mezzo di crescita delle cellule endoteliali: mezzo basale endoteliale integrato con 1 zombi/mL di idrocortisone e 1 fattore di crescita epiderlica ng/mL, 10% FBS, e penicillina/streptomicina a 37 gradi centigradi in un'atmosfera di 5% CO2.
- Quando l'80% confluente, dividere le cellule al rapporto di 1:3 ogni passaggio. Utilizzare celle da due a cinque passaggi, che non mostrano apparenti differenze in risposta a fattori di crescita. Dopo il sesto passaggio, le cellule diventano senescenti e non formano tubi sulla matrice del seminterrato gelata.
3. Trasfezione
- Quando gli HUVEC sono confluenti al 70%, transfetali con il gene desiderato.
- Per una piastra da 100 mm, utilizzare 1 g di vettore vuoto pCDNA3 come controllo e 1 g di vettore pCDNA3 contenente il gene di interesse (in questo caso MEK attivo [caMEK], in questo caso).
- Complesso di 1 g di DNA con 3 g di lipofectamine 2.000, diluito con mezzo siero ridotto (vedi Tabella deimateriali) al volume finale di 200 .L. Rimuovere il mezzo dalle celle e sostituirlo con 1 mL di mezzo completo fresco; quindi, aggiungere la soluzione di traduzione alle cellule. Incubare le cellule nell'incubatrice a 37 , con il 5% di CO2. È anche possibile utilizzare altri agenti di trasfezione diversi dalla lipofectamine 2.000, seguendo le istruzioni del produttore.
- Aggiungere 7 mL di mezzo fresco completo 3 h dopo la trasfezione e, quindi, incubare ulteriormente le cellule a 37 s per 24 - 48 h prima di procedere con i prossimi saggi. Il giorno dopo la trasfezione, sostituire il mezzo con un nuovo mezzo completo.
4. Saggio di formazione del tubo
- Raffreddare una piastra da 96 pozzee e pipette a 4 gradi centigradi per 1 h prima di preparare il seminterrato gelittato.
- Al momento della preparazione del seminterrato, mettere la piastra sul ghiaccio (0 gradi centigradi) e aggiungere 50 - L di matrice fredda in ogni pozzo, evitando la formazione di bolle. Si noti che la fiala contenente matrice deve essere mantenuta sul ghiaccio durante la procedura poiché la matrice diventa solida a temperatura ambiente.
- Mettere la piastra nell'incubatrice a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2 per almeno 30 min per consentire al seminterrato di polimerizzare.
- Nel frattempo, raccogliere le cellule. Lavare gli HUVEC con 1 mL di una soluzione EDTA 0.25% trypsin/0.53 mM; quindi, aggiungere 2 mL della soluzione trypsin-EDTA e incubare a 37 gradi centigradi per 5 min. Osservare le cellule al microscopio invertito per verificare che lo strato cellulare sia completamente disperso. Quindi, raccogliere il mezzo in cui le cellule sono sospese e raccogliere le cellule staccate con centricità a 264 x g per 3 min. Risospendele in 1 mL di salina tampone fosfato (PBS).
- Per contare le celle, aggiungere 0,2 mL della sospensione cellulare a 0,5 mL di PBS e 0,3 mL di 0,4% soluzione trypan blu. Dopo 5 min a temperatura ambiente, contare le cellule in una camera di Bàrker.
- Risospendere le cellule in un mezzo completo alla concentrazione di 2 x 104 cellule/50 . Seme loro sul seminterrato gelato alla concentrazione di 2 x 104 cellule per pozzo e lasciarle stabilirsi su di esso.
- Prestare attenzione al numero delle celle. Troppe o troppo poche cellule potrebbero non formare tubi nel modo giusto sul seminterrato geliato.
- Preparare dosi crescenti di RGWE (0,01, 0,1 e 1 mg/mL), diluendo la soluzione di riserva in mezzo di coltura o rutina (12, 120 e 300 g/mL), il tutto nel volume finale di 50 gradi/ pozzetto, e aggiungerli a 50 gradi l/pozze di sospensione cellulare. Il volume finale in ogni pozzo sarà di 100 gradi. Preparare da quattro a sei pozzi per ogni condizione sperimentale. Come controllo, diluire l'acqua distillata (veicolo) nel mezzo di coltura ad un rapporto di 1:50.
- Incubare le cellule nell'incubatrice a 37 e 5% di CO2 per un tempo che va da 6 a 24 h.
- Osservare le cellule in un intervallo di tempo che va da 6 a 24 h dopo il semina, utilizzando un microscopio a contrasto di fase con un ingrandimento di 10X. Gli HUVEC sono in grado di formare strutture simili a tubi entro 6 h, ma è possibile osservare risultati migliori dopo 12 - 18 h. Fotografare le strutture simili a tubi su ogni pozzo e fotografare una media da tre a cinque campi casuali in ogni pozzo.
- Dopo l'acquisizione dell'immagine, le cellule possono essere staccate dalla matrice del seminterrato e conteggiate per valutare l'effetto del trattamento sul numero di cellule. Per ogni pozzo, rimuovere il mezzo, aggiungere dispase ad una concentrazione di 24 U/mL, e mettere la piastra a 37 gradi centigradi per 1 h. Quindi, da ogni pozzo, raccogliere il mezzo in cui le cellule sono sospese e raccogliere le cellule staccate con centrifugazione a 264 x g per 3 min. Risospende le resospendi in 0,2 mL di PBS. Per contare le celle, aggiungere 0,2 mL di sospensione cellulare a 0,5 mL di PBS e 0,3 mL di 0,4% soluzione trypan blu. Dopo 5 min a temperatura ambiente, contare le cellule nella camera di Bàrker.
- Per quantificare i risultati dell'analisi della formazione dei tubi, è possibile contare il numero di punti di diramazione in cui si uniscono almeno tre tubi. Utilizzando il software di immagine appropriato, contare per ogni campo in ogni micrografo il numero di punti di diramazione e calcolare la media - l'errore standard (SE) per ogni condizione sperimentale. Utilizzare un test ta due code per valutare la significatività statistica.
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Representative Results
Per valutare l'influenza di RGWE sull'angiogenesi, abbiamo eseguito un test di formazione di tubi su una matrice del seminterrato gelata. Quando vengono coltivati su di esso, gli HUVEC formano strutture simili a tubi che provengono da cellule che appaiono allungate e che si collegano tra loro per formare una rete cellulare (Figura 2). Nella Figura 3, si mostra che il numero di filiali in HUVEC trattati con RGWE è stato significativamente inferiore rispetto alle condizioni di controllo. In particolare, in presenza di 0,1 mg/mL e 1 mg/mL RGWE, il numero dei rami è inferiore rispettivamente del 40% e del 60% rispetto alla condizione di controllo. Dal momento che la rutina è stata indicata come la componente principale di RGWE5, abbiamo analizzato il suo effetto sul saggio di formazione del tubo HUVEC. Come mostrato nella Figura 4, la rutina da sola non è in grado di influenzare la capacità degli HUVEC di formare una rete cellulare. Quindi, abbiamo usato il saggio di formazione dei tubi per studiare i meccanismi molecolari alla base dell'inibizione indotta da RGWE della formazione dei tubi. La via di segnalazione intracellulare MEK/ERK esercita un ruolo fondamentale nei processi angiogenici. Gli HUVEC trafettati da caMEK sono stati trattati con RGWE e coltivati su una matrice del seminterrato gelata. Come mostrato nella Figura 5, nelle cellule endoteliali trasfette caMEK, RGWE non inibisce più la formazione di tubi, mentre le cellule trastrattate fittizie, utilizzate come controllo, formano ancora una rete di cellule cellulari sulla matrice del seminterrato gelata e sono reattive a RGWE, indicando così che che l'effetto dell'RGWE nell'angiogenesi è mediato dal percorso MEK-ERK.
Figura 1: Ruta graveolens. Un arbusto di Ruta graveolens. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Gli HUVEC formano strutture simili a tubi su una matrice del seminterrato gelata. Fotografie microscopiche rappresentative di HUVEC coltivate in piatto in polistirolo (a sinistra) e su matrice del seminterrato gelata (a destra). Barra della scala: 10 m.
Figura 3: RGWE inibisce la formazione di tubi negli HUVEC. (A) Fotografie microscopiche ad alta potenza degli HUVEC coltivati su una matrice sotterranea gelata trattata con RGWE (0, 0,01, 0,1 e 1,0 mg/mL). La barra della scala è di 10 m. (B) La percentuale del punto di diramazione HUVEC (grigio scuro) in presenza di RGWE (0,01, 0,1 e 1,0 mg/mL) rispetto alle celle non trattate (0 mg/mL) e del test di esclusione blu trypan (grigio chiaro) sugli HUVISTO trattati (0,01) e del test di esclusione blu trypan (grigio chiaro) sugli HUVISTO trattati (0,01 , 0,1 e 1 mg/mL) o no (0 mg/mL) con RGWE per 24 h. I risultati sono espressi come la media: la SE di tre esperimenti indipendenti. La rilevanza statistica è stata ottenuta da un test t-test a due code.
Figura 4: La rutina non influisce sulla formazione del tubo HUVEC. (A) Fotografie microscopiche ad alta potenza di HUVEC seminate su una matrice del seminterrato gelata e trattate (12, 120 e 300 g/mL) o meno (0 g/mL) con rutina per 24 ore. La barra della scala è di 10 m. (B) La percentuale di punto di diramazione HUVEC (grigio scuro) in presenza di dosi crescenti di rutina (12, 120 e 300 x/mL) rispetto alle condizioni di controllo (0g/mL) e al test di esclusione blu trypan (grigio chiaro) sugli HUVEC trattati (12 , 120 e 300 mL) o no (0 g/mL) con rutina per 24 h. I risultati sono espressi come la media: la SE di tre esperimenti indipendenti. La rilevanza statistica è stata ottenuta mediante un test t-test a due code.
Figura 5: Il percorso MEK media gli effetti di RGWE sulla formazione di tubi HUVEC. (A) Fotografie microscopiche ad alta potenza di HUVEC trafettate con vettore vuoto (traduzione simulata) o con caMEK, semi sulla matrice del seminterrato gelata e trattate con dosi crescenti di RGWE (0, 0,01, 0,1 e 1 mg/mL). La barra della scala è di 10 m. (B) La percentuale del numero di punti di diramazione in HUVECs mock-trafettati (grigio scuro) e negli HUVEC trastati con caMEK (grigio chiaro) e trattata con dosi crescenti di RGWE (0,01, 0,1 e 1 mg/mL) rispetto al controllo condizioni (0 mg/mL). :p < 0.01 rispetto alla condizione di controllo; § p < 0.05 rispetto alle cellule trascate con il vettore vuoto e trattate con la stessa quantità di RGWE. I risultati sono espressi come la media: la SE di tre esperimenti indipendenti. La rilevanza statistica è stata ottenuta da un test t-test a due code.
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Discussion
I composti naturali sono caratterizzati da un'elevata diversità chimica e specificità biochimica e rappresentano una fonte di molecole potenzialmente terapeutiche. Qui, mostriamo come ottenere l'estratto d'acqua dalla pianta R. graveolens e proponiamo il saggio di formazione dei tubi come un metodo facile da eseguire, affidabile e quantitativo utile per studiare gli effetti di RGWE sull'angiogenesi. È importante far bollire le foglie di R. graveolens per 1 h per essere sicuri di ottenere l'estratto d'acqua completo. L'ebollizione per meno di 1 h non ha permesso l'estrazione di tutte le molecole, e l'estratto non ha potuto esercitare l'effetto biologico previsto.
Il test di formazione del tubo rappresenta un test in vitro per studiare i meccanismi molecolari alla base dei diversi passaggi che portano alla formazione di nuovi vasi sanguigni. Questo test consente ai ricercatori di identificare i composti in grado di modulare l'angiogenesi, nonché le proteine e le cascate di segnalazione coinvolte. Inoltre, questo test consente ai ricercatori di testare sostanze che possono influenzare, allo stesso tempo, la proliferazione delle cellule endoteliali, l'adesione, la migrazione e l'attività della proteasi, tutti i meccanismi importanti nella formazione dei vasi sanguigni. Utilizzando solo questo tipo di test, mostriamo che RGWE, ma non la sua solina componente principale, è in grado di ridurre la capacità degli HUVEC di formare strutture simili a tubi senza compromettere la vitalità cellulare e che questo effetto dipende dall'attivazione del percorso MEK-ERK. Tuttavia, è importante eseguire il test con il giusto numero di celle. Infatti, troppo poche o troppe cellule non potevano consentire la giusta formazione dei tubi. Per questo motivo, si consiglia di eseguire un test preliminare per trovare il numero corretto di cellule. Inoltre, il numero di passaggi cellulari è importante quanto il numero di cellule poiché, per ottenere il corretto saggio saggio di formazione del tubo, le cellule devono essere passate da due a cinque volte. Dopo il passaggio 6, si verificano meccanismi di senescenza che possono compromettere la formazione del tubo giusto.
L'analisi della formazione dei tubi è un saggio molto riproducibile, e fa luce sulla fisiologia delle cellule endoteliali, anche se non è lo standard d'oro per lo studio tridimensionale della formazione del tubo8,9,10, 11. I modelli tridimensionali di collagene e fibrina hanno dimostrato di essere migliori per le indagini sulla tubulogenesi vascolare, la germogliazione e l'interazione endoteliale cellula-pericite. Tuttavia, rispetto al saggio di formazione di tubi sulla matrice del seminterrato gelata, questi test sono più dispendiosi in termini di tempo e denaro11, suggerendo che il primo potrebbe essere un buon test per ottenere risultati preliminari che possono essere la base per studi in vivo più mirati. Infine, il saggio di formazione del tubo può essere effettuato in 24 h, dal momento che gli HUVEC non trasformati sono in grado di formare strutture simili a tubi entro 6 h12,13.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato da Fondi di Ateneo ai fondi di Luca Colucci-D'Amato e ValeRE Program a Maria Teresa Gentile e al fondo AIRC IG18999 a Maurizio Bifulco.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HUVEC cells | Clontech | C2519A | |
| FBS | Invitrogen | 10270106 | |
| EBM-2 basal medium | Clontech | cc3156 | |
| Single quot kit- supplemets and growth factors | clontech | cc4147 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| 96-well plates | Thermo Scientific | 167008 | |
| 15 mL conical tubes | Sarstedt | 62,554,502 | |
| 10 mL disposable serological pipette | Sarstedt | 861,254,001 | |
| 5 mL disposable serological pipette | Sarstedt | 861,253,001 | |
| 1,000 μL pipette | Gilson | Pipetman classic | |
| 100 μL pipette | Gilson | Pipetman classic | |
| 20 μL pipette | Gilson | Pipetman classic | |
| p1000 pipette tips | Sarstedt | ||
| p20-200 pipette tips | Sarstedt | 70,760,502 | |
| Burker chamber | Fortuna | ||
| Trypan blu stain | Gibco | 15250-061 | |
| DPBS | Gibco | 14190-094 | |
| mill-ex 0.22 μm filters | Millipore | SLGS033SS | |
| Lyophilizer | VirTis-SP Scientific | ||
| Incubator | Thermo Scientific | ||
| CO2 | AirCos | ||
| Pen-Strep | Gibco | 15070-063 | |
| 100 mm dish | Sarstedt | 833,902 | |
| pcDNA3 | Invitrogen | v79020 | |
| Lipofectamine-2000 | Invitrogen | 11668027 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | Reduced serum medium |
| Rutin | Sigma-Aldrich | R5143-50G | |
| Axiovert 25 microscope | Zeiss | ||
| AmScope MD500 camera | AmScope | ||
| Dispase | Thermo Scientific | D4818 | |
| Lab heater | Falc | ||
| ParaFilm | American National Can |
References
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