Summary
Detta manuskript beskrivs syntesen av en enkel vägg nanorör (SWCNT)-konjugerat MALAT1 antisense gapmer DNA oligonukleotiden (SWCNT-anti-MALAT1), vilket visar SWCNT pålitlig leverans och den potenta terapeutiska effekten av anti-MALAT1 in vitro- och in vivo. Metoder som används för syntes, modifiering, konjugation, och injektion av SWCNT-anti-MALAT1 beskrivs.
Abstract
Den enkel vägg nanorör (SWCNT) är en ny typ av nanopartiklar, som har använts för att leverera flera typer av läkemedel in celler, till exempel proteiner, oligonukleotider och syntetiska småmolekylär droger. SWCNT har anpassningsbara dimensioner, en stor yta vid ytliga och flexibelt kan binda med droger genom olika modifieringar på dess yta. Därför är det ett idealiskt system att transportera narkotika in i celler. Långa icke-kodande RNAs (lncRNAs) är ett kluster av icke-kodande RNA längre än 200 nt, som inte kan översättas till protein men spelar en viktig roll i biologiska och patofysiologiska processer. Metastaser-associerade lunga adenokarcinom avskrift 1 (MALAT1) är en mycket lncRNA. Det visades att högre MALAT1 nivåer är relaterade till den dåliga prognosen av olika cancerformer, inklusive multipelt myelom (MM). Vi har visat att MALAT1 reglerar DNA reparation och cell död MM; MALAT1 kan således betraktas som ett terapeutiskt mål för MM. Effektiv leverans av den antisense oligo till hämma/knockdown MALAT1 in vivo är dock fortfarande ett problem. I denna studie vi ändra SWCNT med PEG-2000 och konjugat en anti-MALAT1 oligo till det, testa leveransen av denna förening in vitro-, injicera det intravenöst i en disseminerad MM musmodell och iaktta en signifikant hämning av MM progression, vilket indikerar det SWCNT är en perfekt leverans shuttle för anti-MALAT1 gapmer DNA.
Introduction
SWCNT är en roman nanomaterial som kan leverera olika typer av läkemedel, såsom proteiner, små molekyler och nukleinsyror, stabilt och effektivt med perfekt tolerabilitet och minsta toxicitet i vitro1 och invivo2. En functionalized SWCNT har utmärkt biokompatibilitet och vatten löslighet, kan användas som en transfer för mindre molekyler och kan bära dem för att penetrera cellmembranet3,4,5.
lncRNAs är ett kluster av RNA (> 200 nt) som transkriberas från genomet till mRNA men kan inte översättas till proteiner. Ökande bevis har visat att lncRNAs delta i regleringen av gen uttryck6 och är involverade i initiering och progression av de flesta typer av cancer, inklusive MM7,8,9. MALAT1 är en kärn-berikat kodande utskrift 2 (NEAT2) och en mycket lncRNA10. MALAT1 redovisas initialt i metastaserande icke-småcellig lung cancer (NSCLC)11, men har varit i ökad utsträckning i många tumörer5,12,13. Det är en av de mest högt uttryckt lncRNAs och korreleras med en dålig prognos i MM8,14. Uttrycket är MALAT1 betydligt högre i dödlig kurs extramedullär MM patienter jämfört med dem som endast diagnostiserats som MM15.
I en tidigare studie, vi har bekräftat att anti-MALAT1 oligos kraftfullt leda till DNA-skador och apoptos i MM16 med hjälp av gapmer DNA antisense oligonukleotider inriktning MALAT1 (anti-MALAT1) i MM celler. Gapmer DNA är sammansatt av antisense DNA och kopplat av 2'-OMe-RNAs, vilket kan snabba MALAT1 klyvning av RNase H aktivitet en gång bunden17. Invivo leverans effektiviteten i antisense oligos begränsar fortfarande dess kliniska användning.
För att testa leverans effekten av SWCNT för anti-MALAT1 gapmer oligos, den anti-MALAT1 gapmer DNA är konjugerat till DSPE-PEG2000-Amin functionalized SWCNT. Den SWCNT-anti-MALAT1 är sedan injiceras intravenöst i en MM disseminerad musmodell; en slående hämning observeras efter fyra behandlingar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment med djur var godkända av den Cleveland klinik IACUC (institutionella djur vård och användning kommittén).
1. Sammanfattning av Functionalized SWCNTs
- Blanda 1 mg SWCNTs, 5 mg DSPE-PEG2000-Amin och 5 mL steriliserat nuclease-fritt vatten i en scintillation glasflaska (20 mL). Skaka den väl att upplösa alla reagenser helt.
- Sonikera injektionsflaskan i ett vatten bad någon sonikator en energinivå på 40 W för 1 h i rumstemperatur (RT, 20 min x 3, byta vatten varje 20 min för att undvika överhettning). Sedan Centrifugera det 24 000 x g för 6 h och samla in supernatanten. Denna funktionella SWCNT lösning kan förvaras vid 4 ° C i 2 månader.
- Tillsätt 1 mL av SWCNT lösningen från steg 1.2 till en 100 kDa MWCO centrifugal filterenhet, följt av 4 mL steriliserat nuclease-gratis vatten. Centrifugera i 10 min vid 4000 x g vid RT ta bort extra DSPE-PEG2000-Amin. Upprepa tillägg av 4 mL vatten och centrifugeringen 5 x. Mer än 0,5 mL överblivna SWCNT lösning kommer att vara kvar i filtret efter varje centrifugering.
- Mätning av koncentrationen av SWCNT lösningen överblivna i filtret med hjälp av en UV/VIS-spektrometer på 808 nm efter den sista tvättningen. Den slutliga koncentrationen är normalt omkring 50 mg/L (beräknat enligt den metod som utvecklats av Kam et al.18).
Obs: Säkerställa att DSPE-PEG-functionalized SWCNTs är vattenlösliga efter steg 1.4 och är stabila i olika biologiska lösningar utan synliga aggregering efter några veckor.
2. konjugering av Anti-MALAT1 Gapmer DNA flankerad av 2'-O modifierade RNAs till Functionalized SWCNT
- Lägg till 0,5 mg Sulfo-LC-SPDP till 450 µL av DSPE-PEG2000-Amin functionalized SWCNT. Tillsätt 50 µL 10 x PBS och sedan Inkubera i 2 h på RT.
- Ta bort extra Sulfo-LC-SPDP, Lägg till reaktionen från steg 2.1 till en 100 kDa MWCO centrifugal filterenhet, följt av 4 mL nuclease-gratis vatten. Centrifugera i 10 min vid 4000 x g vid RT. Upprepa tillägg av 4 mL vatten och centrifugeringen 5 x.
- Lägga till 200 nM thiol-modifierade anti-MALAT1-Cy3 gapmer DNA i 1,5 mL kommersiella DTT lösning och inkubera i 90 min på RT. rena produkten med en NAP-5 kolumn, efter tillverkarens protokollet. Eluera de anti-MALAT1-Cy3 med 500 µL av steriliserad nuclease-fri 1 x PBS.
Obs: Den functionalized SWCNT kan lagras med extra DTT, som skulle klyva disulfide obligationer bildas under lagring av de thiolated anti-MALAT1 gapmer DNA. Lade till DTT kan avlägsnas genom aNAP-5 kolumn före konjugering med SWCNT. - Samla den sulfo-LC-SPDP-behandlade DSPE-PEG2000-Amin SWCNT lösning kvar i filtret och späd med 500 µL anti-MALAT1-Cy3 lösning. Sedan, inkubera det vid 4 ° C under 24 h. De konjugerade SWCNT-anti-MALAT1 kan lagras vid 4 ° C i 3 veckor. Efter samma förfarande, kan den konjugerade SWCNT med rusning antisense oligo syntetiseras och användas som SWCNT-kontroll.
3. svansen ven injektion av SWCNT-Anti-MALAT1
-
Generera en disseminerad musmodell MM.
- För att uppnå de bästa resultaten i jämförelse, slumpmässigt ordna 14 nicka. CB17-Prkdcscid/J möss (8 veckor gamla) i rättegång eller kontroll grupper (sju i varje grupp) med samma hane/hona förhållande.
- Ren drift bänken och sterilisera den med 70% alkohol.
- Använd en värme lampa för att värma med musen för att hjälpa svansen ven ska visas. Hindra musen ordentligt med en svans injektion fasthållning.
- Injicera 5 x 106 MM.1S-Luc-mCherry celler i 50 µL av PBS genom svansen utan bedövning. Tryck på injektionsstället med en spritkompress för 30 s. Mark injicerade musen och returnera den till en ren bur.
-
Starta behandlingen på dag 7 efter MM.1S cell injektionen.
- Injicera 50 µL av PBS som innehåller SWCNT-anti-MALAT1 i svansen ven av musen. Använda PBS som innehåller SWCNT-kontroll som en kontroll.
- Tryck på injektionsstället med en spritkompress för 30 s.
- Observera den lokala blödningar på svansen och det allmänna beteendet av musen 1 min och sedan returnera den till en ren bur. Iaktta alla injicerade möss igen innan han återvände buren i racket, se till att injektionerna tolereras väl.
-
Upprepa injektionen var 7 dagar tills uppsägning av experimentet.
- Avsluta experimentet när den allmänna hälsan hos musen försämrar: när inte äta eller dricka, uppkomsten av blek tassar, någon subkutan blödning, andnöd, minskad aktivitet, en förlamning av de nedre extremiteterna, eller en beröringsbara massan i den buken observeras.
4. utvärdering av sjukdomsförloppet
- Bedöma allmän status för möss varje dag efter MM.1S-Luc-mCherry cell injektionen. Var särskilt uppmärksam om möss utvecklar paralyserar i nedre extremiteterna.
-
Utvärdera den tumörtillväxt använder ett i vivo imaging system 1 x per vecka, före SWCNT-anti-MALAT1 injektionen.
- Förbereda färska 15 mg/mL D-Luciferin med 1 x PBS.
- Söva möss med en isofluran spridare (3 – 5% för induktion och 1 – 3% för underhåll, beroende på status för möss).
- Injicera 150 mg/kg D-Luciferin i varje mus intraperitonealt, 5 min innan imaging; sedan image mössen i en liggande ställning med ett spektrum som tänkbar system.
- Samla sekventiell bilder av möss varje 2 min, tills luminiscens mättnad uppnåtts. Justera intervalltiden enligt D-Luciferin upptag/signalen.
- Använd CO2 att offra möss när uppsägningen av experimentet är nådd.
-
Eftersom detta är en MM disseminerad modell, behandla möss enligt följande.
- Väga musen innan dissektion.
- Samla perifert blod från hjärtat för en fullständig blodstatus (CBC) analys utförs av en blodkroppar counter maskin. Räkningarna av vita blodkroppar och röda blodkroppar, liksom förhållandet mellan lymfocyter, är de primära index.
- Isolera mjälte och tynga. Beräkna förhållandet mellan mjälte-och/eller kroppsvikt; överväga > 0,5% som mjälte utvidgningen.
- Samla vävnader i benmärg, mjälte, lymfkörtel, njure och vävnaden med synliga metastaser.
- Samla ryggraden om musen utvecklat en förlamning av de nedre extremiteterna.
- Extrahera RNA och protein från benmärgen proverna.
- Fixa alla återstående vävnader i formalin.
- För avkalkning, fördjupa ben proverna i 0,25 M EDTA-lösning (pH 8,0) i 5 dagar efter 24 h fixering.
- Sänk alla prover i 75% alkohol för långsiktig lagring.
- Jämför signalstyrkan för luciferas på samma punkter i två grupper. Från båda grupperna, registrera offer datum för varje mus och beräkna överlevnadskurvor för de två grupperna med programvara.
Obs: Alla förfaranden sammanfattas i figur 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att demonstrera effekten hämning av anti-MALAT1 gapmer DNA i MM, vi slogs ner uttrycket av MALAT1 och använt det i H929 och MM.1S celler. Fyrtioåtta timmar senare celler samlades för analys av knock-down effektivitet och apoptos status i celler transfekterade med anti-MALAT1 gapmer eller kontroll DNA. qRT-PCR resultat visade att anti-MALAT1 gapmer DNA knackade ned det MALAT1 i H929 och MM.1S celler effektivt (figur 2A). Status för apoptos bestämdes av flödescytometri, som avslöjade down-reglerade MALAT1 inducerad apoptos betydligt (figur 2B).
Dessa resultat indikerar att anti-MALAT1 oligos hämma MM effektivt in vitro. Dock en effektiv leverans metod/shuttle för anti-MALAT1 oligos invivo behövs för att utvecklas, som också är hindret antisense oligos i klinisk tillämpning; Därav vårt intresse för SWCNT. SWCNT är ett nytt nanomaterial för drug delivery, som kan utveckla hydrophilicitet och dissolubility efter lämpliga modifieringar; Det kan därför leverera laster i olika former, såsom oligonukleotiden droger. För att validera leverans effektiviteten av SWCNT invivo, functionalized vi först SWCNT med DSPE-PEG2000-aminer, som begåvad hydrophilicitet och bindande specificitet till SWCNT19. Denna funktionella SWCNT behandlades sedan med sulfo-LC-SPDP att skapa fria sulfhydryl grupper, som används för att ansluta med oligo. För att böja den anti-MALAT1 oligo och den sulfo-LC-SPDP-behandlade SWCNT, 5' ändarna av den anti-MALAT1 oligo har modifierats med thiol grupper (S-S); för att synbart spåra leveransen, 3' ände den anti-MALAT1 oligo ändrades med cyanin 3 (Cy3). Efter alla syntes steg, SWCNT-anti-MALAT1-Cy3 erhölls (figur 1)12. Sedan, det lades till odlingsmediet H929-GFP och MM.1S-GFP celler att validera leverans effektiviteten.
Som visas i figur 2C, SWCNT-anti-MALAT1-Cy3 levererades effektivt in i kärnan av MM celler och signifikant suppression av den endogena MALAT1 nivån i både H929 och MM.1S celler (figur 2D). För att undersöka de toxicitet och säkerhet SWCNT i normala celler, lades SWCNT-anti-MALAT1-Cy3 i medlet av BMEC-1 celler vid olika koncentrationer. Lipofectamine var kontrollen behandling; Plain medium användes som grundläggande kontroll (figur 2E). Sedan upptäcktes cellviabilitet med hjälp av en cell livskraft analyssats på dag 1, dag 2 och dag 3. Ingen signifikant skillnad i cell livskraft hämning hittades mellan SWCNT-anti-MALAT1-Cy3 och behandling vid olika doser och tidpunkter. Det fanns ingen skillnad jämfört med vanlig medium (NC) heller, vilket anger att toxiciteten av SWCNT-anti-MALAT1-Cy3 är liknande till kontrollen behandling, som har en begränsad och acceptabel toxicitet för normala celler vid hög dosering.
Nästa, inrättades en mänskliga-MM disseminerad musmodell för att utvärdera behandling effekterna av SWCNT-anti-MALAT1 i vivo. Först varje SCID-beige mus (av 8 veckor gamla) injicerades med 5 x 106 MM.1S-Luc-mCherry celler intravenöst (figur 3). Sammanlagt 14 möss injicerades med MM.1S celler; bland dem, sju möss var slumpmässigt ordnade i en SWCNT-anti-MALAT1-Cy3 behandlingsgrupp, och en annan sju var i kontrollgruppen. Både SWCNT-anti-MALAT1 och SWCNT-kontroll oligos var löses i 0,5 mL 1 x PBS och injiceras genom svansen venerna 7 dagar efter tumör cell injektionen. SWCNT-anti-MALAT1-Cy3 behandlingen upprepades varje 7 dagar tills uppsägning av experimentet. Utvärdera den tumör bördan, observerades luciferin signalen av en in vivo imaging system (IVIS) 30 min efter luciferin injektion 1 x en vecka före SWCNT-oligo injektion. Vi hittade att luciferin signalerar av möss i behandlingsgruppen SWCNT-anti-MALAT1 var anmärkningsvärt lägre jämfört med de av gruppen SWCNT-kontroll behandling efter 21 dagars behandling (från dagen 28). Deras hälsa och överlevnad status var kontrolleras och registreras varje dag och sammanfattas i en Kaplan-Meier-kurva. Från dessa resultat, drog vi slutsatsen att SWCNT-anti-MALAT1 behandling via intravenös injektion kan leverera den anti-MALAT1 oligos till tumörceller effektivt. Vi, sedan, begränsad tumör bördan och extended mössens livslängder (p = 0,04) som förväntat, som är liknande till in vitro-resultat. Vi fann inte några betydande biverkningar av behandlingen i möss under perioden hela experiment som visade att SWCNT-anti-MALAT1 injektionen är en säker behandling för möss; SWCNT är därför en säker och pålitlig invivo leveranssystem för anti-MALAT1.
Figur 1 : Schematisk bild av syntesen, absorption, och i vivo dissociation av en SWCNT-anti-MALAT1-Cy3 gapmer oligo. (A) SWCNT var functionalized med DSPE-PEG2000-aminer och, därefter, konjugerat med anti-MALAT1-Cy3 via disulfid länkage medieras av Sulfo-LC-SPDP. (B) SWCNT-konjugerad anti-MALAT1 injicerades i en mus med MM.1S-Luc-mCherry celler via svans venen. (C) SWCNT-konjugerad anti-MALAT1 tränger fosfolipid lipidens membranet genom infogning eller endocytos. (D) SWCNT-anti-MALAT1 var paketerat i tidig endosomes efter absorption av celler; sedan den tidiga endosome mognat till en sen endosome och samman med en Lysosomen att bilda en endolysosome. Endolysosome hjälper släppa anti-MALAT1 från SWCNT genom att bryta den disulfide bond. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : SWCNT-anti-MALAT1 levererades effektivt med minimal toxicitet och inducerad apoptos i cellinjer som MM. SWCNT-anti-MALAT1 gapmer oligo eller SWCNT-kontroll oligo var transfekterade av Lipofectamine in i H929 och MM.1S celler, respektive. Fyrtioåtta timmar senare, vi samlas in celler för (A) analys av MALAT1 uttryck av qRT-PCR och (B) apoptos analys av flödescytometri. (C) H929-GFP och MM.1S-GFP celler var samtidig odlade med SWCNT-anti-MALAT1-Cy3 för 48 timmar; leverans effektiviteten bestämdes av fluorescens Mikroskop (skala barer = 100 µm). (D) den uttryck nivå ofMALAT1 upptäcktes av qRT-PCR, som visade att det var framgångsrikt slogs ner i H929 och MM.1S celler (** p < 0,01, *** p < 0,001). (E) SWCNT och kontrollen behandling lades in i ett odlingsmedium av BMEC-1 celler vid olika doseringar. Spridningen mättes med en cell livskraft analyssats. Denna siffra har ändrats från Hu et al.16. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : SWCNT-anti-MALAT1 undertryckt myelom växer i MM.1S-cell-konstruerade MM disseminerad musmodell. (A) 5 x 106 MM.1S-Luc-mCherry celler var injiceras intravenöst till svans venerna i bestrålade SCID-beige möss (sju i varje grupp); 50 μL av en SWCNT-anti-MALAT1 eller SWCNT-kontroll lösningen injicerades varje 7 dagar via svans ven från den 7: e dagen efter den MM.1S cell injektionen. IVIS användes för att övervaka tumörtillväxt. (B) bakbenen förlamning och tumör börda användes som slutpunkter och överlevnadsdata analyserades av en Kaplan-Meier-analys. Denna siffra har ändrats från Hu et al.16. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fynd har visat att lncRNAs delta i regleringen av många fysiologiska och patofysiologiska förfaranden i cancer, inklusive MM7,8,9. de har potential att vara måltavlan för cancerbehandling, som kan förverkligas genom antisense oligonukleotider20,21,22. US Food and Drug Administration (FDA) har godkänt flera antisense oligonukleotiden läkemedel, inklusive fomivirsen för cytomegalovirus-retinit23, mipomersen för homozygot familjär hyperkolesterolemi24, nusinersen för spinal muskelatrofi25, och eteplirsen för Duchennes muskeldystrofi26. I denna studie, vi ändrade den anti-MALAT1 gapmer DNA med 2'-OMe-RNA och konjugerat det med funktionella SWCNT. SWCNT bär och levererar anti-MALAT1 oligos som transfer, som inte bara förbättrat frändskapet av oligo-målet på grund av dess flexibilitet och flera lastning utan också stabiliserat oligos och bidragit till att förhindra nuclease nedbrytning under leverans27 .
En lämplig ändring på ytan av SWCNTs kan hjälpa det få tillförlitliga spridbarhet i fysiologiskt relevanta, vattenhaltigt miljöer och främja deras biodistribution28,29. Vi brukade DSPE-PEG2000-Amin ändra den SWCNT, vilket har demonstrerats att ympa på SWCNT och förbättra vattenlöslighet av det, och dessutom det visade utmärkt stabilitet utan tätbebyggelsen i biologiska media30. Sulfo-LC-SPDP användes som en crosslinker i experimentet, vilket hjälpte functionalized SWCNT att binda den anti-MALAT1 gapmer DNA genom disulfide koppling, och därefter leverera dem i celler. När SWCNT penetrerad i MM celler, togs de av tidig endosomes (pH ~ 6.0), som sedan mognat till sena endosomes (pH ~ 5.0) åtföljas av en minskad pH värdet31. Fördelen med länken PEG är att limning är stabil vid pH > 6, men upp till 75 – 95% av PEG-länkade läkemedlet släpptes inom 2 timmar efter pH blev mindre än 5,532,33,34. Endosomes transporterar SWCNT-anti-MALAT1 samman med lysosomer (pH ~ 4.5) att bilda en endolysosome, och sedan den disulfide obligationer var katalyseras av lysosomala thiol-reduktas, som aktiverades optimalt vid ett lågt pH35. Detta släppte därefter gratis anti-MALAT1 gapmer DNA. Enligt resultaten experiment in vitro- och in vivo, SWCNT levereras SWCNT-anti-MALAT1 effektivt och hjälpte det fungera på samma sätt i funktion till anti-MALAT1 in vitro.
Den functionalized SWCNTs passet genom fosfolipid lipidens via två mönster: införande36,37 och endocytos38,39. Dessa procedurer hjälper SWCNT leverera laster i celler utan att störa stabiliseringen av cellmembran, därför minskar toxiciteten hos SWCNT. Vi injiceras 50 µL av SWCNT-anti-MALAT1 (~ 40 mg/L) i varje mus (~ 20 g); Således var den slutliga drog koncentrationen 0,1 mg/kg, vilket är mycket lägre än den dosering som vi använde i toxicitet experiment (2 mg/L och 4 mg/L). Som tidigare resultaten visade, SWCNT har en liknande effekt som behandling kontroll (t.ex. Lipofectamine) på cellernas tillväxt och lönsamhet på matchas doseringar. Kontrollen behandling är en gemensam reagens för cell transfection och tros ha en begränsad och acceptabel toxicitet till celler; Vi anser således SWCNT endast har en minimal toxicitet för normala celler.
Som en flygplatstransfer för antisense oligonukleotider är metabolism en annan viktig faktor för säkerheten av SWCNT. Det har visats att functionalized SWCNT utsöndras huvudsakligen genom njurarna, utan glomerulär och tubulär toxicitet40. Vi hittade inte njure dysfunktion-relaterade symtom, såsom oliguri, anuri, ödem, utseende ändras njure, etc., hos möss som accepterade SWCNT injektionen. SWCNTs har alltså inga toxiska effekter på grund av någon onormal ansamling i en mus med en normal njurfunktion.
Vi är de första som konjugat anti känsla oligonukleotider inriktning lncRNA med functionalized SWCNT och använda den för MM behandling. SWCNT är en typ av Roman nanomaterial, som har konsekvent kiralitet, valfri diameter och längd distribution. Efter funktionalisering behandling, SWCNTs utvecklas vattenlöslighet och biokompatibilitet och blir en perfekt biologiska transfer till leverera många gods genom cellmembranet, därmed öka drogen distribution och förbättra effekten av behandlingen. Dessutom kan SWCNT stabilisera anti känsla oligonukleotiden molekyler från nuclease matsmältningen1. Som resultatet visar, den functionalized SWCNT-anti-MALAT1 levereras MALAT1 i MM celler effektivt och hämmade MM tillväxten dramatiskt i cellinjer in vitro- och i en disseminerad musmodell invivo. Hittills har iakttog vi inte toxicitet på grund av SWCNT behandling i dessa experiment. Denna studie visar att SWCNT är en säker och effektiv leveransfordon för antisense oligonukleotiden droger och har potential att användas som bärare för terapeutiska molekyler hos patienter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tacka Lerner Research Institute proteomiska, genomisk, och imaging kärnor för deras hjälp och stöd. Finansiering: Detta arbete stöddes ekonomiskt av NIH/NCI grant R00 CA172292 (till J.J.Z.) och nystartade fonder (till J.J.Z.) och klinisk och translationell vetenskap Collaborative (CTSC) fall Western Reserve University Core Utilization Pilot bidrag (till J.J.Z.). Detta arbete utnyttjas mikroskopet Leica SP8 confocal som köpts med finansiering från nationella institut för hälsa SIG grant 1S10OD019972-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SWCNTs | Millipore-Sigma | 704113 | |
| DSPE-PEG2000-Amine | Avanti Polar Lipids | 880128 | |
| bath sonicator | VWR | 97043-992 | |
| 4 mL centrifugal filter | Millipore-Sigma | Z740208-8EA | |
| UV/VIS spectrometer | Thermo Fisher Scientific | accuSkan GO UV/Vis Microplate Spectrophotometer | extinction coefficient of 0.0465 L/mg/cm at 808 nm |
| Sulfo-LC-SPDP | ProteoChem | c1118 | |
| DTT solution | Millipore-Sigma | 43815 | |
| NAP-5 column | GE Healthcare | 17-0853-01 | |
| in vivo imaging system | PerkinElmer | ||
| NOD.CB17-Prkdcscid/J mice | Charles River lab | 250 | |
| Flow cytometer | Becton Dickinso | ||
| Lipofectamine | Invitrogen | 11668019 | Lipofectamine2000 |
| Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 10437-028 | |
| RMPI-1640 medium | Invitrogen | 11875-093 | |
| MALAT1-QF: | synthesized by IDT Company | 5’- GTTCTGATCCCGCTGCTATT - 3’ | |
| MALAT1-QR: | synthesized by IDT Company | 5’- TCCTCAACACTCAGCCTTTATC - 3’ | |
| GAPDH-QF: | synthesized by IDT Company | 5’- CAAGAGCACAAGAGGAAGAGAG - 3’ | |
| GAPDH-QR: | synthesized by IDT Company | 5’- CTACATGGCAACTGTGAGGAG - 3’ | |
| Quantitative PCR using SYBR Green PCR master mix | Thermo Fisher Scientific | A25780 | |
| RevertAid first-stand cDNA synthesis kit | Thermo Fisher Scientific | K1621 | |
| anti-MALAT1 | synthesized by IDT Company | 5’-mC*mG*mA*mA*mA*C*A*T*T *G*G*C*A*C*A*mC*mA*mG*mC*mA-3’ |
|
| Cell Viability Assay Kit | Promega Corporation | G7570 | CellTiter-GloLuminescent Cell Viability Assay Kit |
| accuSkan GO UV/Vis Microplate Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| centrifugal filter | Millipore-Sigma | UFC910008 | |
| SPSS software | IBM | version 24.0 | |
| D-Luciferin | Millipore-Sigma | L9504 |
References
- Jiang, X., et al. RNase non-sensitive and endocytosis independent siRNA delivery system: delivery of siRNA into tumor cells and high efficiency induction of apoptosis. Nanoscale. 5 (16), 7256-7264 (2013).
- Murakami, T., et al. Water-dispersed single-wall carbon nanohorns as drug carriers for local cancer chemotherapy. Nanomedicine (Lond). 3 (4), 453-463 (2008).
- Kam, N. W., Dai, H. Carbon nanotubes as intracellular protein transporters: generality and biological functionality. Journal of the American Chemical Society. 127 (16), 6021-6026 (2005).
- Kam, N. W., Liu, Z., Dai, H. Functionalization of carbon nanotubes via. cleavable disulfide bonds for efficient intracellular delivery of siRNA and potent gene silencing. Journal of the American Chemical Society. 127 (36), 12492-12493 (2005).
- Kam, N. W., Liu, Z., Dai, H. Carbon nanotubes as intracellular transporters for proteins and DNA: an investigation of the uptake mechanism and pathway. Angewandte Chemie International Edition in English. 45 (4), 577-581 (2006).
- Ntziachristos, P., Abdel-Wahab, O., Aifantis, I. Emerging concepts of epigenetic dysregulation in hematological malignancies. Nature Immunology. 17 (9), 1016-1024 (2016).
- Evans, J. R., Feng, F. Y., Chinnaiyan, A. M. The bright side of dark matter: lncRNAs in cancer. Journal of Clinical Investigation. 126 (8), 2775-2782 (2016).
- Ronchetti, D., et al. Distinct lncRNA transcriptional fingerprints characterize progressive stages of multiple myeloma. Oncotarget. 7 (12), 14814-14830 (2016).
- Wong, K. Y., et al. Epigenetic silencing of a long non-coding RNA KIAA0495 in multiple myeloma. Molecular Cancer. 14, 175 (2015).
- Schmidt, L. H., et al. The long noncoding MALAT-1 RNA indicates a poor prognosis in non-small cell lung cancer and induces migration and tumor growth. Journal of Thoracic Oncology. 6 (12), 1984-1992 (2011).
- Ji, P., et al. MALAT-1, a novel noncoding RNA, and thymosin beta4 predict metastasis and survival in early-stage non-small cell lung cancer. Oncogene. 22 (39), 8031-8041 (2003).
- Luo, J. H., et al. Transcriptomic and genomic analysis of human hepatocellular carcinomas and hepatoblastomas. Hepatology. 44 (4), 1012-1024 (2006).
- Guffanti, A., et al. A transcriptional sketch of a primary human breast cancer by 454 deep sequencing. BMC Genomics. 10, 163 (2009).
- Cho, S. F., et al. MALAT1 long non-coding RNA is overexpressed in multiple myeloma and may serve as a marker to predict disease progression. BMC Cancer. 14, 809 (2014).
- Handa, H., et al. Long non-coding RNA MALAT1 is an inducible stress response gene associated with extramedullary spread and poor prognosis of multiple myeloma. British Journal of Haematology. 179 (3), 449-460 (2017).
- Hu, Y., et al. Targeting the MALAT1/PARP1/LIG3 complex induces DNA damage and apoptosis in multiple myeloma. Leukemia. , (2018).
- Lennox, K. A., Behlke, M. A. Cellular localization of long non-coding RNAs affects silencing by RNAi more than by antisense oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 44 (2), 863-877 (2016).
- Kam, N. W., O'Connell, M., Wisdom, J. A., Dai, H. Carbon nanotubes as multifunctional biological transporters and near-infrared agents for selective cancer cell destruction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (33), 11600-11605 (2005).
- Zeineldin, R., Al-Haik, M., Hudson, L. G. Role of polyethylene glycol integrity in specific receptor targeting of carbon nanotubes to cancer cells. Nano Letters. 9 (2), 751-757 (2009).
- Amodio, N., D'Aquila, P., Passarino, G., Tassone, P., Bellizzi, D. Epigenetic modifications in multiple myeloma: recent advances on the role of DNA and histone methylation. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 21 (1), 91-101 (2017).
- Ahmad, N., Haider, S., Jagannathan, S., Anaissie, E., Driscoll, J. J. MicroRNA theragnostics for the clinical management of multiple myeloma. Leukemia. 28 (4), 732-738 (2014).
- Amodio, N., et al. Drugging the lncRNA MALAT1 via. LNA gapmeR ASO inhibits gene expression of proteasome subunits and triggers anti-multiple myeloma activity. Leukemia. , (2018).
- Highleyman, L. FDA approves fomivirsen, famciclovir, and Thalidomide. Food and Drug Administration. BETA. 5, (1998).
- Smith, R. J., Hiatt, W. R. Two new drugs for homozygous familial hypercholesterolemia: managing benefits and risks in a rare disorder. JAMA Internal Medicine. 173 (16), 1491-1492 (2013).
- Aartsma-Rus, A. FDA Approval of Nusinersen for Spinal Muscular Atrophy Makes 2016 the Year of Splice Modulating Oligonucleotides. Nucleic Acid Therapeutics. 27 (2), 67-69 (2017).
- Nelson, S. F., Miceli, M. C. FDA Approval of Eteplirsen for Muscular Dystrophy. The Journal of the American Medical Association. 317 (14), 1480 (2017).
- Liu, Z., Sun, X., Nakayama-Ratchford, N., Dai, H. Supramolecular chemistry on water-soluble carbon nanotubes for drug loading and delivery. American Chemical Society Nano. 1 (1), 50-56 (2007).
- Ali-Boucetta, H., et al. Multiwalled carbon nanotube-doxorubicin supramolecular complexes for cancer therapeutics. Chemical communications (Cambridge). (4), 459-461 (2008).
- Bianco, A., Kostarelos, K., Partidos, C. D., Prato, M. Biomedical applications of functionalised carbon nanotubes. Chemical communications. (5), Cambridge. 571-577 (2005).
- Hadidi, N., Kobarfard, F., Nafissi-Varcheh, N., Aboofazeli, R. Optimization of single-walled carbon nanotube solubility by noncovalent PEGylation using experimental design methods. International Journal of Nanomedicine. 6, 737-746 (2011).
- Padilla-Parra, S., et al. Quantitative imaging of endosome acidification and single retrovirus fusion with distinct pools of early endosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (43), 17627-17632 (2012).
- Wu, H., Zhu, L., Torchilin, V. P. pH-sensitive poly(histidine)-PEG/DSPE-PEG co-polymer micelles for cytosolic drug delivery. Biomaterials. 34 (4), 1213-1222 (2013).
- Oishi, M., Nagatsugi, F., Sasaki, S., Nagasaki, Y., Kataoka, K. Smart polyion complex micelles for targeted intracellular delivery of PEGylated antisense oligonucleotides containing acid-labile linkages. Chembiochem. 6 (4), 718-725 (2005).
- Dong, H., Ding, L., Yan, F., Ji, H., Ju, H. The use of polyethylenimine-grafted graphene nanoribbon for cellular delivery of locked nucleic acid modified molecular beacon for recognition of microRNA. Biomaterials. 32 (15), 3875-3882 (2011).
- Arunachalam, B., Phan, U. T., Geuze, H. J., Cresswell, P. Enzymatic reduction of disulfide bonds in lysosomes: characterization of a gamma-interferon-inducible lysosomal thiol reductase (GILT). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (2), 745-750 (2000).
- Lelimousin, M., Sansom, M. S. Membrane perturbation by carbon nanotube insertion: pathways to internalization. Small. 9 (21), 3639-3646 (2013).
- Thomas, M., Enciso, M., Hilder, T. A. Insertion mechanism and stability of boron nitride nanotubes in lipid bilayers. J Phys Chem B. 119 (15), 4929-4936 (2015).
- Jin, H., Heller, D. A., Strano, M. S. Single-particle tracking of endocytosis and exocytosis of single-walled carbon nanotubes in NIH-3T3 cells. Nano Letters. 8 (6), 1577-1585 (2008).
- Jin, H., Heller, D. A., Sharma, R., Strano, M. S. Size-dependent cellular uptake and expulsion of single-walled carbon nanotubes: single particle tracking and a generic uptake model for nanoparticles. American Chemical Society Nano. 3 (1), 149-158 (2009).
- Ruggiero, A., et al. Paradoxical glomerular filtration of carbon nanotubes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (27), 12369-12374 (2010).
