JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

Измерение силы чувствительных белка динамики в живых клетках, используя комбинацию люминесцентные методы

Published: November 02, 2018
doi:
10.3791/58619
, ,
1Department of Biomedical Engineering,Duke University

Summary

Здесь мы представляем протокол для одновременного использования Фёрстер резонанса энергии на основе передачи напряжения датчиков для измерения нагрузки и флуоресценции восстановления белка после Фотообесцвечивание для измерения динамики белков, позволяя измерения силы чувствительных динамика белков в живых клеток.

Abstract

Клетки воспринимают и отвечают к физические сигналы в их среде путем преобразования механических раздражителей в биохимически обнаружить сигналы в процессе, называемом mechanotransduction. Важным шагом в mechanotransduction является передача сил между внешней и внутренней среды. Для передачи силы, должны быть устойчивый, непрерывный физической связи, созданные серии белок белковых взаимодействий. Данный белок белковых взаимодействия механические нагрузки могут иметь либо не влияет на взаимодействие, приводят к быстрее диссоциации взаимодействия, или даже стабилизировать взаимодействия. Понимание как молекулярные нагрузки диктует, что оборот белка в живых клетках могут предоставить ценную информацию о состоянии механических белка, в свою очередь разъяснению ее роли в mechanotransduction. Существующие методы для измерения силы чувствительных белка динамики отсутствуют прямые измерения нагрузки протеина или полагаться на измерениях, выполненных вне сотовой связи. Здесь мы описываем протокол для передачи флуоресценции рекуперации энергии резонанса Фёрстер после Фотообесцвечивание (Лада-FRAP) технику, которая позволяет измерение динамики белков чувствительных к силе в живых клеток. Этот метод является потенциально применимы к любой датчик на основе ладу напряженности, содействие изучению динамики белков чувствительных к силе в различных внутриклеточных структур и различных типов клеток.

Introduction

Внеклеточная среда является богатым источником биохимические и физические сигналы, которые определяют поведение клеток. В частности физической природы микроокружения может посредничать основных клеточных функций, включая рост клеток, миграции и дифференциации1,2,3,4. Dysregulation механики микроокружения является важнейшим компонентом многих заболеваний, которые еще не имеют надлежащего лечения, таких как рак5, атеросклероз6и фиброз7. Полное понимание как клетки конвертировать физические раздражители в биохимически обнаружить сигналы, процесс называется mechanotransduction, требует выяснения молекулярных механизмов посредничества передачи силы, как в и из клеток и в рамках нескольких внутриклеточных структур.

Внутри внутриклеточных структур белки постоянно переворачивая; Привязка и отмена привязки, основанные на прочность их взаимодействия с обязательными партнерами8. Для силы успешно передаваться через физическое расстояние должен быть непрерывная цепь белок белковых взаимодействий, означает, что оборот белка должно быть достаточно медленно, чтобы сохранить и передавать силы для его привязки партнер9. В то время как белок белковых взаимодействий, как правило, состоят из нескольких non ковалентные связи между доменами белка, взаимодействие часто задумана как связанного состояния, которое может переход на свободные государства под различные условия10, 11. для данного протеин взаимодействия, вполне возможно, что силы может иметь не влияет на срок службы взаимодействия, известный как «идеальный Бонда», сократить срок службы взаимодействия, известный как «скольжения Бонда» или увеличить время существования взаимодействия , известный как «поймать Бонда»10. Таким образом существует сложная взаимосвязь между белка нагрузки и динамики белков, который мы называем силу учитывающих динамику.

К пониманию эффект нагрузки на динамику Бонд, ряд весьма информативным эксперименты были проведены на уровне одной молекулы. Использование изолированных белков, или фрагментов белков и методы манипуляции, такие как Магнитные пинцеты, Оптический пинцет и атомно-силовой микроскопии, эти исследования продемонстрировали силу чувствительных белок белковых взаимодействий для нескольких соответствующих 11,белки12. Обе интегринов13 и cadherins14, которые являются трансмембранные белки важны для формирования клеток матрица и ячеек взаимодействий, соответственно, показали изменения в динамике за загрузки. В ячейке vinculin набирается для обоих Талина15 и α-катенина16 в зависимости от силы и может сформировать улов Бонд с актина17, указывающее решающую роль для vinculin фокуса спаек (ФАС) и adherens развязок (Айс ) под нагрузкой. Сингл молекулярных исследований позволяют для изоляции определенных белок белковых взаимодействий и дать однозначные результаты, но они не учитывают сложность клеточной среды.

Достопримечательность эксперименты показали, что несколько внутриклеточных структур, в том числе ФАС и AJs, являются mechanosensitive и активизации Ассамблеи в ответ на внутренне создаваемом или внешне применяется нагрузок18,19, 20,21,22. Кроме того несколько теоретических моделей предполагают, что mechanosensitive Ассамблея может управляться силой чувствительных белка динамика23,24,25. Для изучения динамики этих сил чувствительных в живых клеток, были приняты несколько косвенные подходы. FRAP и родственные методы обеспечивают сравнительно простой методологии для измерения динамики белка в клетках26,27,,2829. Однако измерения нагрузки белка был более ограниченным. Обычным подходом является сравнение динамики белков в клетках с и без воздействия ингибитор цитоскелета, используется для снижения общей ячейки сократимости8,30,31. Концептуально это сравнение между высокой нагрузкой и низкой нагрузки государством. Однако существует не количественная оценка нагрузки через белка в любом государстве, и может быть непреднамеренным биохимические эффекты ингибитора, такие потери ключевых привязки сайтов вдоль F-актина накаливания. Другой подход, характерные для ФАС, был для измерения общей силы нагрузки на подложке с помощью тяги силовой микроскопии приблизительное молекулярной нагрузки и изучить взаимосвязь с динамикой одного белка в Англии32ф. Хотя этот подход и позволяет для количественной оценки общей силы, он не предоставляет молекулярно конкретную информацию. ФАС состоят из более чем 200 различных белков, многие из которых может нести нагрузку33. Таким образом измерение общей силы вывод FA потенциально скрывает возможность нескольких путей передачи силы и надежно не обеспечивают измерение нагрузки на определенных белков.

В отличие от предыдущих подходов в mechanobiology, появление на основе ладу напряжение датчиков позволяет прямое измерение нагрузок, испытываемых специфических белков внутри живых клеток34,35,36. Здесь мы представляем протокол, который сочетает в себе на основе ладу напряжение датчиков на основе FRAP измерения динамики белков. Мы называем эту технику FRAP ладу. Этот подход позволяет одновременное измерение белка нагрузки и динамики белков, таким образом позволяя оценки динамики белков чувствительных к силе в живых клеток (рис. 1). Уже FRAP ладу техника применялась к изучению силы чувствительных динамики механических компоновщика белка vinculin37. Напряжение датчиков были разработаны для многочисленных белков, которые актуальны в различных внутриклеточных структур. Например датчики разработаны для vinculin34 и Талине38,39 в ФАС, cadherins и catenins в AJs40,,41,42, nesprin в ядерный комплекс линк 43, α-актинина44 и filamin36 цитоскелета и MUC-1 в Гликокаликс45, среди прочих46. Аналогично FRAP это широко используемый метод был использован на mechanosensitive белков внутри фокуса спайки8,31, adherens развязок47, актина кора26и ядро48. Продвигаясь вперед, FRAP ладу техника должна быть широко применимо к любому этих существующих датчиков или недавно разработали датчики, позволяя для измерения силы учитывающих динамику в разнообразных условиях и внутриклеточных структур. С этой целью мы предоставляем подробную, обобщенные протокол для реализации метода FRAP ладу применимые в этих различных систем. Надеюсь это даст возможность широкого ряда экспериментов, выяснения роли различных белков mechanosensitive в регулировании передачи силы и в посредничестве поведение клеток.

Protocol

1. создать образцы для изображений Стабильно Экспресс напряжение датчика конструкции в нужной ячейки типа. Клонировать конструкция датчика напряжения в pRRL вектор или других вирусных выражение плазмиды.Примечание: Несколько различных молекулярного клонирования инструмен?…

Representative Results

ЛАД-FRAP состоит из комбинации двух люминесцентные методы, Лада и FRAP. Как мы сосредоточены на эффекты белка нагрузки, мы использовали на основе ладу напряжение датчиков34,46. Эти датчики часто основаны на напряжение зондирования модуль, сос?…

Discussion

ЛАД-FRAP метод позволяет для прямого измерения динамики белков чувствительных к силе, свойство, которое было трудно непосредственно зонд внутри живых клеток. Чувствительность динамики белков в молекулярных нагрузки имеет решающее значение для функции белка как силы передатчик или датч…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана национальной науки фонд CAREER Award (NSF-CMMI-14-54257) а также гранты от Американской ассоциации сердца (16GRNT30930019) и национальных институтов здравоохранения (R01GM121739-01) присуждена д-р Хоффман Брентон и национального Наука фонд исследовательских стипендий присуждена Кэтрин Ротенберг. Содержание является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения NSF или низ.

Materials

0.05% Trypsin-EDTA Thermo Fisher 25300062
16% Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 30525-89-4
60x Objective NA1.35 Olympus UPLSAPO 60XO
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) Gibco 15240-062
Automated Stage Prior Scientific H117EIX3
Custom Dichroic Mirror Chroma Technology Corp T450/514rpc
Custom mTFP1 Emission Filter Chroma Technology Corp ET485/20m
Custom mTFP1 Excitation Filter Chroma Technology Corp ET450/30x
Custom Venus Excitation Filter Chroma Technology Corp ET514/10x
DMEM-gfp Live Cell Visualization Medium Sapphire MC102
Dulbecco's Modified Eagle's Medium  Sigma Aldrich D5796 with L-glutamine and sodium bicarbonate
Fetal Bovine Serum HyClone SH30396.03
Fibronectin, Human Corning 47743-654
FRAPPA Calibration Slide Andor provided along with FRAPPA unit
FRAPPA System with 515 nm Laser Andor
Glass-bottomed Fluoro Dishes World Precision Instruments FD35
HEK293-T Cells ATCC CRL-3216
Hexadimethrine Bromide, Polybrene Sigma Aldrich H9268-5G
High-glucose Dulbecco's Modified Eagle's Medium Sigma Aldrich D6429
Inverted Fluorescent Microscope Olympus IX83
JMP Pro Software SAS
Lambda 10-3 Motorized Filter Wheels Sutter Instruments LB10-NW
LambdaLS Arc Lamp with 300W Ozone-Free Xenon Bulb Sutter Instruments LS/OF30
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-027
MATLAB Software Mathworks
MEM Non-Essential Amino Acids Thermo Fisher 11140050
MetaMorph for Olympus Olympus
Micro-Humidification System Bioptechs 130708
MoFlo Astrios EQ Cell Sorter Beckman Coulter B25982
Objective Heater Medium Bioptechs 150819-13
OptiMEM Thermo Fisher 31985070
Phosphate Buffered Saline Sigma Aldrich D8537
pMD2.G Envelope Plasmid Addgene 12259
pRRL Vector gift from Dr. Kam Leong (Columbia University)
psPax2 Packaging Plasmid Addgene 12260
sCMOS ORCA-Flash4.0 V2 Camera Hamamatsu Photonics C11440-22CU
Sorvall Legend XT/XF Centrifuge Thermo Fisher 75004505
Stable Z Stage Warmer Bioptechs 403-1926
Venus Emission Filter Semrock FF01-571/72
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DuFort, C. C., Paszek, M. J., Weaver, V. M. Balancing forces: architectural control of mechanotransduction. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (5), 308-319 (2011).
  2. Mammoto, T., Ingber, D. E. Mechanical control of tissue and organ development. Development. 137 (9), 1407-1420 (2010).
  3. Sun, Y., Chen, C. S., Fu, J. Forcing stem cells to behave: a biophysical perspective of the cellular microenvironment. Annual Review of Biophysics. 41, 519-542 (2012).
  4. Wozniak, M. A., Chen, C. S. Mechanotransduction in development: a growing role for contractility. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (1), 34-43 (2009).
  5. Broders-Bondon, F., Nguyen Ho-Bouldoires, T. H., Fernandez-Sanchez, M. E., Farge, E. Mechanotransduction in tumor progression: The dark side of the force. The Journal of cell biology. 217 (5), 1571-1587 (2018).
  6. Simmons, R. D., Kumar, S., Jo, H. The role of endothelial mechanosensitive genes in atherosclerosis and omics approaches. Archives of Biochemistry and Biophysics. 591, 111-131 (2016).
  7. Wells, R. G. Tissue mechanics and fibrosis. Biochimica et Biophysica Acta. 1832 (7), 884-890 (2013).
  8. Lele, T. P., et al. Mechanical forces alter zyxin unbinding kinetics within focal adhesions of living cells. Journal of Cellular Physiology. 207 (1), 187-194 (2006).
  9. Hoffman, B. D., Grashoff, C., Schwartz, M. A. Dynamic molecular processes mediate cellular mechanotransduction. Nature. 475 (7356), 316-323 (2011).
  10. Dembo, M., Torney, D. C., Saxman, K., Hammer, D. The reaction-limited kinetics of membrane-to-surface adhesion and detachment. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 234 (1274), 55-83 (1988).
  11. LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Hoffman, B. D. Molecular-Scale Tools for Studying Mechanotransduction. Annual Review of Biomedical Engineering. 17, 287-316 (2015).
  12. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
  13. Kong, F., Garcia, A. J., Mould, A. P., Humphries, M. J., Zhu, C. Demonstration of catch bonds between an integrin and its ligand. The Journal of Cell Biology. 185 (7), 1275-1284 (2009).
  14. Rakshit, S., Zhang, Y., Manibog, K., Shafraz, O., Sivasankar, S. Ideal catch, and slip bonds in cadherin adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (46), 18815-18820 (2012).
  15. del Rio, A., et al. Stretching Single Talin Rod Molecules Activates Vinculin Binding. Science. 323 (5914), 638-641 (2009).
  16. Seddiki, R., et al. Force-dependent binding of vinculin to alpha-catenin regulates cell-cell contact stability and collective cell behavior. Molecular Biology of the Cell. 29 (4), 380-388 (2018).
  17. Huang, D. L., Bax, N. A., Buckley, C. D., Weis, W. I., Dunn, A. R. Vinculin forms a directionally asymmetric catch bond with F-actin. Science. 357 (6352), 703-706 (2017).
  18. Chrzanowska-Wodnicka, M., Burridge, K. Rho-stimulated contractility drives the formation of stress fibers and focal adhesions. The Journal of Cell Biology. 133 (6), 1403-1415 (1996).
  19. Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages. Cell. 88 (1), 39-48 (1997).
  20. Liu, Z., et al. Mechanical tugging force regulates the size of cell-cell junctions. Proceedings of the National Academy of Science. 107 (22), 9944-9949 (2010).
  21. Riveline, D., et al. Focal contacts as mechanosensors: externally applied local mechanical force induces growth of focal contacts by an mDia1-dependent and ROCK-independent mechanism. The Journal of Cell Biology. 153 (6), 1175-1186 (2001).
  22. Brevier, J., Vallade, M., Riveline, D. Force-extension relationship of cell-cell contacts. Physical Review Letters. 98 (26), 268101 (2007).
  23. Bershadsky, A., Kozlov, M., Geiger, B. Adhesion-mediated mechanosensitivity: a time to experiment, and a time to theorize. Current opinion in cell biology. 18 (5), 472-481 (2006).
  24. Chan, C. E., Odde, D. J. Traction dynamics of filopodia on compliant substrates. Science. 322 (5908), 1687-1691 (2008).
  25. Wu, Z., Plotnikov, S. V., Moalim, A. Y., Waterman, C. M., Liu, J. Two distinct actin networks mediate traction oscillations to confer focal adhesion mechanosensing. Biophysical Journal. 112 (4), 780-794 (2017).
  26. Fritzsche, M., Charras, G. Dissecting protein reaction dynamics in living cells by fluorescence recovery after photobleaching. Nature Protocols. 10 (5), 660-680 (2015).
  27. McNally, J. G. Quantitative FRAP in analysis of molecular binding dynamics in vivo. Methods of Cell Biology. 85, 329-351 (2008).
  28. Wehrle-Haller, B. Analysis of integrin dynamics by fluorescence recovery after photobleaching. Methods in Molecular Biology. 370, 173-202 (2007).
  29. Carisey, A., Stroud, M., Tsang, R., Ballestrem, C. Fluorescence recovery after photobleaching. Methods of Molecular Biology. 769, 387-402 (2011).
  30. Carisey, A., et al. Vinculin regulates the recruitment and release of core focal adhesion proteins in a force-dependent manner. Current Biology. 23 (4), 271-281 (2013).
  31. Wolfenson, H., Bershadsky, A., Henis, Y. I., Geiger, B. Actomyosin-generated tension controls the molecular kinetics of focal adhesions. Journal of Cell Science. 124, 1425-1432 (2011).
  32. Dumbauld, D. W., et al. How vinculin regulates force transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (24), 9788-9793 (2013).
  33. Zaidel-Bar, R., Itzkovitz, S., Ma’ayan, A., Iyengar, R., Geiger, B. Functional atlas of the integrin adhesome. Nature Cell Biology. 9 (8), 858-867 (2007).
  34. Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
  35. LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Berginski, M. E., Urs, A. N., Hoffman, B. D. Construction, imaging, and analysis of FRET-based tension sensors in living cells. Biophysical Methods in Cell Biology. 125, 161-186 (2015).
  36. Meng, F., Suchyna, T. M., Sachs, F. A fluorescence energy transfer-based mechanical stress sensor for specific proteins in situ. The FEBS Journal. 275 (12), 3072-3087 (2008).
  37. Rothenberg, K. E., Scott, D. W., Christoforou, N., Hoffman, B. D. Vinculin Force-Sensitive Dynamics at Focal Adhesions Enable Effective Directed Cell Migration. Biophysical journal. 114 (7), 1680-1694 (2018).
  38. Austen, K., et al. Extracellular rigidity sensing by talin isoform-specific mechanical linkages. Nature Cell Biology. 17 (12), 1597-1606 (2015).
  39. Kumar, A., et al. Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity. The Journal of Cell Biology. 213 (3), 371-383 (2016).
  40. Acharya, B. R., et al. Mammalian Diaphanous 1 Mediates a Pathway for E-cadherin to Stabilize Epithelial Barriers through Junctional Contractility. Cell Reports. 18 (12), 2854-2867 (2017).
  41. Borghi, N., et al. E-cadherin is under constitutive actomyosin-generated tension that is increased at cell-cell contacts upon externally applied stretch. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (31), 12568-12573 (2012).
  42. Conway, D. E., Williams, M. R., Eskin, S. G., McIntire, L. V. Endothelial cell responses to atheroprone flow are driven by two separate flow components: low time-average shear stress and fluid flow reversal. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298 (2), H367-H374 (2010).
  43. Arsenovic, P. T., et al. Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension. Biophysical Journal. 110 (1), 34-43 (2016).
  44. Ye, N., et al. Direct observation of alpha-actinin tension and recruitment at focal adhesions during contact growth. Experimental Cell Research. 327 (1), 57-67 (2014).
  45. Paszek, M. J., et al. The cancer glycocalyx mechanically primes integrin-mediated growth and survival. Nature. 511 (7509), 319-325 (2014).
  46. Gayrard, C., Borghi, N. FRET-based Molecular Tension Microscopy. Methods. 94, 33-42 (2016).
  47. de Beco, S., Gueudry, C., Amblard, F., Coscoy, S. Endocytosis is required for E-cadherin redistribution at mature adherens junctions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (17), 7010-7015 (2009).
  48. Östlund, C., et al. Dynamics and molecular interactions of linker of nucleoskeleton and cytoskeleton (LINC) complex proteins. Journal of Cell Science. 122 (22), 4099-4108 (2009).
  49. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. . The interactions of retroviruses and their hosts. , (1997).
  50. Komatsubara, A. T., Matsuda, M., Aoki, K. Quantitative analysis of recombination between YFP and CFP genes of FRET biosensors introduced by lentiviral or retroviral gene transfer). Scientific Reports. 5, 13283 (2015).
  51. Nasri, M., Karimi, A., Farsani, M. A. Production purification and titration of a lentivirus-based vector for gene delivery purposes. Cytotechnology. 66 (6), 1031-1038 (2014).
  52. . Generating Stable Cell Lines with Lentivirus Available from: https://www.addgene.org/protocols/generating-stable-cell-lines (2016)
  53. Roederer, M. Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 45 (3), 194-205 (2001).
  54. Malkani, N., Schmid, J. A. Some secrets of fluorescent proteins: distinct bleaching in various mounting fluids and photoactivation of cyan fluorescent proteins at YFP-excitation. PLoS One. 6 (4), e18586 (2011).
  55. Chen, H., Puhl, H. L., Koushik, S. V., Vogel, S. S., Ikeda, S. R. Measurement of FRET efficiency and ratio of donor to acceptor concentration in living cells. Biophysical journal. 91 (5), L39-L41 (2006).
  56. Rothenberg, K. E., Neibart, S. S., LaCroix, A. S., Hoffman, B. D. Controlling Cell Geometry Affects the Spatial Distribution of Load Across Vinculin. Cellular and Molecular Bioengineering. 8 (3), 364-382 (2015).
  57. Carnell, M., Macmillan, A., Whan, R. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP): acquisition, analysis, and applications. Methods of Molecular Biology. 1232, 255-271 (2015).
  58. Trembecka, D. O., Kuzak, M., Dobrucki, J. W. Conditions for using FRAP as a quantitative technique–influence of the bleaching protocol. Cytometry A. 77 (4), 366-370 (2010).
  59. Lavelin, I., et al. Differential effect of actomyosin relaxation on the dynamic properties of focal adhesion proteins. PLoS One. 8 (9), e73549 (2013).
  60. Foote, H. P., Sumigray, K. D., Lechler, T. FRAP analysis reveals stabilization of adhesion structures in the epidermis compared to cultured keratinocytes. PLoS One. 8 (8), e71491 (2013).
  61. Zal, T., Gascoigne, N. R. Photobleaching-corrected FRET efficiency imaging of live cells. Biophysical Journal. 86 (6), 3923-3939 (2004).
  62. Hodgson, L., Shen, F., Hahn, K. Biosensors for characterizing the dynamics of rho family GTPases in living cells. Current Protocols in Cell Biology. 46 (1), (2010).
  63. Day, R. N. Measuring protein interactions using Förster resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy. Methods. 66 (2), 200-207 (2014).
  64. Rapsomaniki, M. A., et al. easyFRAP: an interactive, easy-to-use tool for qualitative and quantitative analysis of FRAP data. Bioinformatics. 28 (13), 1800-1801 (2012).
  65. Zamir, E., et al. Molecular diversity of cell-matrix adhesions. Journal of cell science. 112 (11), 1655-1669 (1999).
  66. Bakolitsa, C., et al. Structural basis for vinculin activation at sites of cell adhesion. Nature. 430 (6999), 583-586 (2004).
  67. De Los Santos, C., Chang, C. W., Mycek, M. A., Cardullo, R. FRAP, FLIM, and FRET: Detection and analysis of cellular dynamics on a molecular scale using fluorescence microscopy. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 587-604 (2015).
  68. Periasamy, A., Wallrabe, H., Chen, Y., Barroso, M. Chapter 22: Quantitation of protein-protein interactions: confocal FRET microscopy. Methods in Cell Biology. 89, 569-598 (2008).
  69. Stehbens, S., Pemble, H., Murrow, L., Wittmann, T. Imaging intracellular protein dynamics by spinning disk confocal microscopy. Methods in Enzymology. , 293-313 (2012).
  70. Zeug, A., Woehler, A., Neher, E., Ponimaskin, E. G. Quantitative intensity-based FRET approaches–a comparative snapshot. Biophysical Journal. 103 (9), 1821-1827 (2012).
  71. Ehrlicher, A. J., Nakamura, F., Hartwig, J. H., Weitz, D. A., Stossel, T. P. Mechanical strain in actin networks regulates FilGAP and integrin binding to filamin A. Nature. 478 (7368), 260-263 (2011).
  72. Guo, B., Guilford, W. H. Mechanics of actomyosin bonds in different nucleotide states are tuned to muscle contraction. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (26), 9844-9849 (2006).
  73. Lee, C. Y., et al. Actin depolymerization under force is governed by lysine 113:glutamic acid 195-mediated catch-slip bonds. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (13), 5022-5027 (2013).
  74. Cost, A. L., Ringer, P., Chrostek-Grashoff, A., Grashoff, C. How to Measure Molecular Forces in Cells: A Guide to Evaluating Genetically-Encoded FRET-Based Tension Sensors. Cellular and Molecular Bioengineering. 8 (1), 96-105 (2015).
  75. Bertocchi, C., et al. Nanoscale architecture of cadherin-based cell adhesions. Nature Cell Biology. 19 (1), 28-37 (2017).
  76. Case, L. B., et al. Molecular mechanism of vinculin activation and nanoscale spatial organization in focal adhesions. Nature Cell Biology. 17 (7), 880-892 (2015).
  77. Chen, H., Cohen, D. M., Choudhury, D. M., Kioka, N., Craig, S. W. Spatial distribution and functional significance of activated vinculin in living cells. The Journal of Cell Biology. 169 (3), 459-470 (2005).
  78. Kim, T. J., et al. Dynamic visualization of alpha-catenin reveals rapid, reversible conformation switching between tension states. Current Biology. 25 (2), 218-224 (2015).
  79. Yao, M., et al. Mechanical activation of vinculin binding to talin locks talin in an unfolded conformation. Scientific reports. 4, 4610 (2014).

Tags

Force-sensitive Protein DynamicsFluorescent TechniquesMechanobiologyVinculinTalinCadherinsNesprinTension Sensor ConstructFibronectinFRAP LaserAcceptor FluorophoreMechanically-sensitive ProteinsCell-cell InteractionsCell-environment InteractionsMolecular ScaleLiving Cells

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Rothenberg, K. E., Puranam, I., Hoffman, B. D. Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques. J. Vis. Exp. (141), e58619, doi:10.3791/58619 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image