Summary
여기, 전 대 한 프로토콜 선물이 vivo 항 원 특정 CD8의 질적 검색+ T 세포. 분석은 단일 셀 정지 적은 양의 혈액 또는 기관에서 가능 합니다. 광범위 한 연구는 세포 독성 T 세포 응답 (예방 접종과 암 immunotherapy 연구)의 분석을 필요로 합니다.
Abstract
바이러스 성 감염, 항 원 특정 CD8 시+ 세포 독성 T 세포 (Ctl) 발생 및 병원 균의 확산을 방지 하기 위해 감염 된 세포의 제거에 기여. 따라서, 항 원 특정 Ctl의 주파수는 특정 항 원에 대하여 T 세포 반응의 강도 나타내는. 이러한 분석은 기본적인 면역학, 백신 개발, 암 immunobiology 및 적응형 면역학에서 중요 한. 백신 분야에서 CTL 응답 바이러스 성 벡터의 구성 요소에 대 한 감독 공동 결정 합니다 (예:, transgene)의 항 원에 대하여 항 원 특정 세포의 생성은 얼마나 효과적. 항 원 특정 Ctl 중 세포내 cytokine 얼룩 또는 항 원 특정 T 세포 수용 체 (TCRs) 및 분석의 직접 얼룩 cytometry 뒤 특정 펩 티 드와 자극에 의해 감지할 수 있습니다. 첫 번째 방법은 오히려 시간이 걸리는 장기에서 세포를 분리 하는 동물의 희생 필요로 하기 때문입니다. 또한, 그것은 수행 하기 어려운 작은 동물에서 혈액의 격리가 필요 합니다. 두 번째 방법은 오히려 빠른, 적은 양의 혈액으로 쉽게 할 수 이며 특정 effector 기능, cytolytic 활동에 의존 하지 않습니다. MHC tetramers 항 원 특정 TCRs를 감지 하는 이상적인 도구입니다.
여기, 우리는 동시에 항 원 특정 바이러스 성 벡터 VSV GP의 immunodominant 펩 티 드에 대 한 Ctl (LCMV GP, VSV NP)와 MHC에 의해 transgenes (OVA, HPV 16 E7 eGFP)를 감지 하는 프로토콜을 설명 난 tetramer 얼룩이 지 고 교류 cytometry. 얼룩이 혈액에서 직접 또는 장기, 비장 등의 단일 셀 정지에서 가능 하다. 혈액 이나 장기의 단일 셀 정지 tetramers와 알을 품는. CD3와 CD8 항 체와 얼룩, 후 항 원 특정 Ctl cytometry에 의해 정량 된다. CD43, CD44, CD62L 또는 다른 사람에 대 한 항 체 항 원 특정 CD8의 정품 인증 상태를 확인 하려면 포함 될 수 있습니다 필요한 경우,+T 세포 및 naïve 및 이펙터 세포 사이 차별을.
Introduction
이 방법의 목표는 시간이 걸리는 펩 티 드 자극에 대 한 필요 없이 흐름 cytometric 분석 하 여 마우스에서 (다) 항 원에 대 한 세포 독성 T 림프 구 (CTL) 응답의 주파수를 평가. 이 메서드는 단일 얼룩에 CTL 하위 집합의 표현 형 및 항 원 특이성을 분석합니다. 우리 중요 한 조직 적합성 복잡 한 최적화 나 (MHC I) tetramer VSV-GP, G의 VSV 당단백질에 의해 대체 되었습니다 vesicular 구내 염 바이러스 (VSV)의 새로운 변종 등 새로운 백신 접근의 효능을 분석 하는 프로토콜을 얼룩이 지는 당단백질 림프 choriomeningitis 바이러스 (LCMV)1,2의 GP. 체액 반응 이외에 백신의 유효성의 중요 한 읽기 하나 또는 여러 개의 항 원에 대 한 CTL 반응의 유도 이다. 일관성과 세포질 응답의 내구성 이런이 맥락에서 중요 하다, 그것은 같은 동물에서 CTL 응답의 활동을 모니터링 하는 데 유리한. 이 또한 동물 숫자, "3Rs"3의 원리에 대 한 중요 한 측면의 감소를 이어질 것입니다. 따라서, 혈액의 약간 20 µ L에서 분석이 목적을 위해 최적입니다.
Tetramers는 90 년대 후반에 개발 되었다4 T 세포 면역학의 분야에서 중요 한 도구가 되었다. Tetramers는 붙일 표시 된 단지 4 개의 MHC의 나 / 바인딩할 TCRs, 단일 펩 티 드에 대 한 특정 펩 티 드 분자. 요즘, 그들은 구입하실 수 있습니다 하거나 기성 품5, 사용자 정의 주문에 모리 대학6 NIH Tetramer 핵심 시설에 무료 또는 랩7에 제작. MHC I와 II tetramers는 CD8에 즉 사용할 수 있는, + 와 CD4+ T 세포, 각각. 시간 절약, 오히려 간단 하 고 쉽게8 프로토콜, 및 감도9표준화 tetramer 얼룩의 힘에 있다. 또한, 동물 희생 될 필요가 없는 작업 경우 혈액, 그리고 최소 양의 샘플 필요 합니다. 1 측정 한 항 원에 국한 되지 않습니다 하지만 여러 가지 항 때 다른 fluorophores와 활용 tetramers 결합 한 얼룩에 분석 될 수 있다. 펩 티 드 화면에서 예를 들어 새로 발견된 된 항 원은 쉽게 tetramers에 통합 하 고 T 세포 부분 집합의 정량화에 대 한 사용 수 있습니다.
Tetramer 얼룩만 특이 하지만 CTL 기능 (즉., cytokine 생산, 이펙터 기능)에 대 한 정보를 제공 하지 않습니다. T 세포 기능, (ICS)를 얼룩이 지는 세포내 cytokine 또는 효소 연결 된 면역 자리 (ELISpot) 분석 결과 요구에 대 한 정보를 얻기 위해 수행8,10. Tetramer 얼룩 및 IC/ELISpot 중복 되지 않습니다 하지만 오히려 서로 보완. ICS/ELISpot cytokine 생산을 유도 하기 위해 생체 외에서 자극은 원래 T 세포 표현 형을 변경 됩니다. Tetramer 얼룩이, 반면에, 나뭇잎 T 세포 손길이 닿지 않은; 원래 형 보존 되 고 분석 될 수 있다. 또한, tetramers의 또 다른 큰 장점은 그 얼룩 결합 될 수 있다 자석 정렬 및 항 원 특정 셀11의 농축입니다. 정렬된 셀 정의 항 원 특이성의 경작 뿐만 아니라 희귀 한 인구의 분석에 대 한 수 있습니다-기능을 하지 다른 방법으로 가능.
여기에 설명 된 프로토콜, tetramer 얼룩으로 IC/ELISpot를 사용 하 여 수행할 수 있습니다 한 기관에서 때문에 아주 작은 물질 (혈액: 20 µ L; 비장: 1 x 106 셀) tetramer 얼룩에 필요한. 그러나, 관심사의 항 원 특정 세포의 주파수에 따라 각각 TCR 및 실험적인 상황의 강도, 필요한 세포의 양을 하기 하거나 자기 농축 적용 해야 할 수 있습니다.
Tetramers 널리 이용 된다, (antitumor) 백신12,13,,1415 또는 immunotherapy16,17, phenotypic 분석의 유효성을 평가 하기 위해 예 공간 T 세포 항 원 특정 하위 집합18,19,20,21,,2223지역화 여기 설명 하는 방법을 정량화 및 phenotypic 분석 murine 항 원 특정 CD8의 포함 하는 것을 목표로 연구에 대 한 적합 한 신속 하 고 편리한 방식으로 그들의 분석에서+ T 세포.
Protocol
모든 방법을 설명 했다 오스트리아 국가 동물 실험 법 ("Tierversuchsgesetz")에 따라 수행 하 고 오스트리아 국가 당국에 의해 동물 재판 권한이 부여 되었다.
1. 버퍼 준비 및 컬렉션 샘플
참고: 사용 마우스 스트레인 분석 epitope에 따라 달라 집니다. MHC 형식 예: 마우스, 표현 된, H-2 Kb C57BL/6 마우스는 적절 한 tetramer 선택 하십시오. 성별 및 나이 동물의 과학적인 질문에 따라 달라 집니다. 설명 하는 실험의 대부분에 대 한 여기를 사용 하 여 여성 쥐 나이의 6-8 주에 실험, 즉, 1. 접종 시작.
- FACS 버퍼 (인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) + 1% 태아 종 아리 혈 청 (FCS) + 0.1% 나트륨 아 지 드 + 2 m m Ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 및 FACS 고정 버퍼 (PBS에 1.5% (v/v) 포름알데히드) 준비.
참고: 두 버퍼에 미리 준비 하는 것이 좋습니다. 사용 될 때까지 4 ° C에 저장. - 혈액: EDTA 코팅 튜브에 마우스의 꼬리 정 맥에서 혈액 마우스 당 20 µ L를 수집24위에서 설명한 대로.
참고: 또한 다른 노선, 예:, 베 나 facialis 또는 복고풍 궤도 부 비 동에 의해 피를 수집 수 있습니다. 그러나, 혈액 수집 방법 국가 동물 실험 법 및 동물 시험 응용 프로그램을 준수 하고있다. 꼬리 정 맥에서 혈액의 컬렉션은 반복적으로 적은 양의 혈액이 필요한 곳 연구에 이상적입니다. 추가 자료는 보상 제어 및 비-얼룩진 제어 필요 합니다. - 비장: 기관 분리 하 고, 주사기의 플런저의 도움으로, 70 nm 및 40 µ m 셀 스 트레이너를 통해 키를 누릅니다. 수 6 단계에 설명 된 대로, 적혈구의 세포를 수행 합니다. 1 x 107 셀/ml PBS에 농도 조정 합니다. 샘플 당 1 x 106 세포가 필요 합니다.
참고: 항상 모의 예방 접종 일부를 포함 하거나 부정적인 제어 벡터 예방 접종 동물을 제어. 위해 ovalbumin (OVA)-긍정적인 컨트롤로 tetramer, OT 1 쥐에서 샘플을 사용할 수 있습니다. 흠 없는 잊지 마세요 및 계산에 보상 컨트롤. 필요한 경우 다른 동물 실험에서에서 샘플이 풀링된 수 있습니다. - 샘플 수집 후는 얼룩과 직접 진행 합니다.
2. 착 색 설정
- 각 샘플에 대 한 하나의 FACS 튜브를 준비 합니다. 튜브를 제대로 분류와 각 관으로 장기 정지 (1 x 106 셀)의 100 μ 또는 혈액의 20 μ를 전송.
- 비장: Centrifuge 600 x g 4-8 ° c에서 5 분 하 고는 상쾌한 삭제. Resuspend 셀 펠 릿을 소용돌이입니다.
참고: 이 약 20 µ L, 혈액 샘플에 대 한 볼륨으로 유사한의 나머지 볼륨 발생 합니다. - 각 채널도 사용할 수에 대 한 보상 샘플에 대 한 하나의 FACS 튜브를 준비 합니다. 흠 없는 컨트롤로 한 추가 샘플을 준비 합니다.
3. tetramer 얼룩
-
각 샘플에 대 한 tetramer 희석의 50 μ를 사용 합니다. 제안 된 tetramers 및 최적화 된 희석, 표 1을 참조 하십시오.
참고: Tetramers 또는 항 체를 사용할 경우 캐비닛 안전의 빛을 해제 하 고 빛 으로부터 샘플을 보호 합니다.- FACS 버퍼 튜브 준비 (볼륨 = 샘플 50 μ × 수 플러스 pipetting 오류에 대 한 보상을 총 볼륨의 10% 추가).
- 표 1에 나열 된 최적의 희석에 tetramer(s)를 추가 합니다. 소용돌이 솔루션입니다.
참고: 나열 된 fluorophores와 전체 항 체 패널 (CD3, CD8, CD43, CD44, CD62L)를 사용 하 여, (PE에 APC) 두 tetramers 포함 될 수 있습니다. 두 tetramers는 단일 얼룩에 결합 될 수 있다 , 즉, 두 tetramers 셀의 얼룩을 동시에 수행할 수 있습니다.
| Tetramer | 펩 티 드 순서 | 대립 유전자 | Fluorophore | 희석 |
| MHC I / OVA | SIINFEKL | H-2 Kb | APC | 1:25 |
| MHC I/VSV-NP | RGYVYQGL | H-2 Kb | PE | 1:25 |
| MHC I / EGFP | HYLSTQSAL | H-2Kd | PE | 1:25 |
| MHC I/LCMV-GP | KAVYNFATC | H-2Db | APC | 1:25 |
| MHC I / HPV 16 E7 | RAHYNIVTF | H-2Db | APC | 1:10 |
표 1: tetramers와 최적의 희석을 제안 했다. 모델 항 (Ovalbumin (OVA)와 향상 된 녹색 형광 단백질 (eGFP)) 또는 병원 체 구성 요소 (Vesicular 구내 염 바이러스 (VSV) nucleoprotein (NP), 림프 Choriomeningitis 바이러스 (LCMV 일부 immunodominant 펩 티 드에 대 한 권장된 tetramers ) 당단백질 (GP)와 인간 유 두 종 바이러스 (HPV) E7 oncoprotein (E7)). 각, 펩 티 드 순서 및 해당 대립 유전자, 뿐만 아니라 권장된 fluorophore 및 최적화 된 희석 나열 됩니다.
- 각 샘플을 소용돌이 tetramer 희석의 50 μ를 부드럽게 추가 합니다. 보상 제어 하 고 흠 없는 샘플만 (tetramer) 없이 FACS 버퍼를 추가 합니다.
- 빛 으로부터 보호 하는 37 ° C에서 20 분에 대 한 샘플을 품 어. 얼룩이 지는 항 체를 tetramer에서 원활 하 게 전환할 수 있도록, 인큐베이션 기간 동안 4 단계에서 설명한 대로 항 체 믹스를 준비 합니다.
참고: 각 개별 tetramer에 대 한 최적의 조건 (희석, 보육 시간 및 온도) 조정 될 필요가 있다.
4입니다. 항 체의 준비
-
각 샘플에 대 한 항 체 혼합의 50 µ L를 준비 합니다.
- FACS 버퍼 튜브 준비 (볼륨 = 샘플 50 μ × 수 플러스 pipetting 오류 보상 총 볼륨의 10% 추가).
- 표 2에 나열 된 항 체는 희석에 추가 합니다.
참고: 과학적인 질문에 따라 여기에 설명 된 것 외에도 다른 마커 조합은 사용할 수 있습니다. 패널에서 CD3와 CD8 항 체를 항상 포함 해야 합니다. - 소용돌이 솔루션입니다.
| 항 체 | Fluorophore | 희석 | µ g/샘플 | 표식 |
| CD3 | PE-Cy7 | 1: 200 | 0.05 | Ctl (CD3+CD8+) |
| CD8 | 태평양 파랑 | 1:750 | 0.013 | |
| V450 | 1: 100 | 0.1 | ||
| CD43 | FITC | 1: 100 | 0.25 | 활성화 (CD43+) |
| CD44 | PE-Cy5 | 1: 250 | 0.04 | 순 (CD44-CD62L+) & 이펙터 (CD44+CD62L-) |
| CD62L | APC-Cy7 | 1: 500 | 0.02 |
표 2: 항 체가 프로토콜에 최적의 희석 사용. 권장된 표면 마커 (CD3, CD8, CD43, CD44 및 CD62L) 첫 번째 열에 나열 됩니다. 각각에 대 한 권장된 fluorophore, 최적화 된 희석 및 항 체/샘플의 양을 표시 됩니다. 지난 칼럼에서 각 표식으로 식별 되는 셀 형식 지정 됩니다.
-
보상 제어에 대 한 항 체를 준비 합니다. 각 보상 제어에 대 한 각 색에 CD8에 대 한 항 체를 사용 합니다.
- 각 채널에 대 한 200 μ FACS 버퍼의 튜브를 준비 하 고 각 색에 CD8에 대해 1: 200 희석 항 체의 1 μ를 추가 합니다.
- 소용돌이 튜브.
- 즉시 얼룩과 진행 합니다.
5. 샘플의 얼룩
- 4-8 ° c.에 600 x g 에 FACS 버퍼 및 5 분 동안 원심 분리기의 ~ 1 mL를 추가 하 여 샘플을 한 번 씻어 원심, 후는 상쾌한 삭제 및 종이 타 올의 스택에 남아 있는 액체를 배수.
참고: 남아 있는 액체를 배출 하는 경우 피를 사용할 때는 주의 해야 합니다. 적혈구의 세포의 용 해 이전 혈액 FACS 튜브의 하단에 충실 하지 것입니다. 또는,는 상쾌한 발음. - 각 셀 펠 릿과 소용돌이를 항 체 혼합의 50 μ를 부드럽게 추가 합니다.
- 해당 보상 제어 및 소용돌이의 셀 펠 릿에 각 보상 혼합의 50 μ를 부드럽게 추가 합니다.
- 흠 없는 제어 및 소용돌이의 셀 펠 릿에 FACS 버퍼의 50 μ를 부드럽게 추가 합니다.
- 빛 으로부터 보호 4 ° C에서 30 분 동안 모든 샘플을 품 어.
- 기관으로 작업할 때: 6 단계를 건너뜁니다. 한 번 ~ 1-2를 추가 하 여 세척 FACS 버퍼와 600 x g 4-8 ° c.에 5 분에 대 한 원심 분리기의 mL 원심, 후는 상쾌한 삭제 및 종이 타 올의 스택에 남아 있는 액체를 배수.
- 혈액으로 작업할 때: 6 (적혈구의 세포) 단계로 진행.
6입니다. 적혈구의 세포의 용 해
- 각 샘플 및 부드럽게 소용돌이에 ACK (염화 염화 칼륨) 버퍼25 의 500 μ를 추가 합니다.
참고: ACK 버퍼 삼투성 붓기와 세포, 특히 적혈구의 이어질 것입니다. - 어둠 속에서 실 온에서 5 분 동안 품 어.
- 4-8 ° c.에 600 x g 에 FACS 버퍼 및 5 분 동안 원심 분리기의 1 mL을 추가 원심, 후는 상쾌한 삭제 및 스택 종이 수건에 나머지 액체를 배수.
참고: 때 펠 릿은 오히려 빨간색, 적혈구의 세포의 용 해를 반복 합니다. - 한 번 ~ 1-2를 추가 하 여 세척 mL FACS 버퍼 및 4-8 ° c.에 600 x g 에 5 분 동안 원심 분리기 원심, 후는 상쾌한 삭제 및 종이 타 올의 스택에 남아 있는 액체를 배수.
7. 흐름 Cytometric 측정 및 분석
- 150-300 μ FACS 고정 버퍼의 각 튜브를 추가 하 고 vortexing에 의해 혼합. 혈액의 20 µ L에 대 한 버퍼의 150 µ L은 충분 합니다.
참고: 고정, 전에 세포는 덩어리의 형성을 방지 하기 위하여 다시 정지 잘 있는지 확인 합니다. 흐름 cytometric 측정을 가능한 한 빨리 진행. - 보상 제어를 측정 하 고 어떤 스펙트럼 중복 수정.
-
C d 3에 대 한 선택 하려면 그림 1 에서 같이 순차 게이츠 설정+/CD8+ 세포.
- 앞으로 및 측면 분산형 (지역) (비-눈금)를 사용 하 여 세포에 게이트.
- 림프 구 인구 내에서 앞으로 분산형 폭 vs 지역 (비-눈금)를 사용 하 여 단일 셀에 게이트.
- 단일 셀 세포 CD3 / CD8 채널 (눈금)를 사용 하 여 플롯 합니다. CD8 식별 게이팅 CD3에 의해+ T 세포+/CD8+ 세포.
- CD8 플롯+ vs Tetramer+ 세포와 CD8에 게이트+ + Tetramer 세포, 그림 2에서 같이.
- 만약에 가능 하다 면는 c d 3에서 20000 셀 (적어도 5000 혈액에서) 기록+/CD8+ 각 샘플에 대 한 게이트, FCS 파일로 저장.
참고: 기록 하는 셀의 크기의 항 원 특정 셀의 주파수에 따라 조정할 수 할 수도 있습니다. - 적절 한 분석 소프트웨어로 FCS 파일을 분석 합니다. (7.3 단원) 위에서 설명한 대로 제어 전략을 사용 하 고 계량 CD8+ + Tetramer 셀.
Representative Results
그림 1 이 프로토콜, 즉 CD3의 대상 셀에 올바르게 게이트 하는 방법을 보여 줍니다+/CD8+ 세포. 그것은 종종 downregulate T 세포 수용 체26,27 세포는 활성화 하 고, 따라서, CD3낮은 셀도는 게이팅에 포함 되어야. CD3 게이팅 후+/CD8+ 셀, 셀 수 있는 긍정적인 tetramer 식별 (그림 2). 대표 몰아내고 부정적인 제어 (순) 마우스에 대 한 뿐만 아니라 동물 중 어느 OVA 은닉 아 데 노비 루스 5 (Adeno-OVA)와 예방 접종 또는 OVA 표현 VSV-GP (VSV-GP-OVA) 표시 됩니다. 두 개의 서로 다른 낮은 말에서 보듯이 tetramers 얼룩에 대 한 같은 튜브에 결합할 수 있습니다. 그러면 두 개의 서로 다른 CTL 특이성의 동시 정량화: 바이러스 (VSV N) 관련 및 transgene 전용 (OVA) Ctl. 우리는 단일 및 이중 tetramer stainings 주는 긍정적인 세포의 유사한 백분율 사용 하 여 각 tetramer에 대 한 확인. 이 프로토콜, 다른 바이러스 관련 (예:., LCMV GP, HPV 16 E7)를 사용 하 여 또는 transgene 전용 (예:., GFP) T 세포 인구 수 분석 (추가 그림 1). 추가 표 1, VSV-GP-OVA와 예방 접종 후 5 동물에 대 한 결과 표시 됩니다-tetramer 얼룩의 견고성을 나타내는.
그림 1: CD8 분석 전략 게이팅 대표+ T 세포 혈. 흐름 cytometric 분석에 사용 되는 제어 전략의 도식 적인 표현입니다. Tetramer 얼룩 및 흐름 cytometric 측정 후 데이터 분석 했다. 세포는 전방 및 측면 분산형 (지역) (비-눈금)로 확인 되었다. 그들에서 단일 셀은 앞으로 분산형 폭 vs 지역 (비-눈금)를 적용 하 여 확인 되었다. CD8+ T 세포 게이팅 CD3에 의해 확인 되었다+/CD8+ 세포 (눈금). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: OVA 및 N 특정 CD8 계량 게이팅 전략 대표+ T 세포가 혈액에. Tetramer+ 세포의 흐름 cytometric 정량화에 대 한 사용 제어 전략의 도식 적인 표현입니다. CD3+/CD8+ 세포 tetramer 분석을 위해 사용 되었다. 위와 중간 패널: CD8 마커 각각 tetramer (눈금)에 대 한 표시 했다. 하단 패널: 두 tetramers 서로 (눈금)에 대 한 표시 했다. 왼쪽: 컨트롤 (순) 마우스; 중간: 마우스 OVA 은닉 아 데 노비 루스 5 (Adeno-OVA); 접종 했다 오른쪽: 마우스 ovalbumin (OVA) 접종 했다-VSV-GP (VSV-GP-OVA)을 표현. 피 접종 후 7 일에 꼬리 정 맥에서 수집 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
CD3의 대표적인 결과 추가 그림 1:+/CD8+ + tetramer 세포 접종 후. Tetramer+ 세포의 흐름 cytometric 정량화의 도식 대표. CD3+/CD8+ 와 CD8 마커 각각 tetramer (눈금)에 대 한 플롯은 셀 tetramer 분석을 위해 사용 되었다. 왼쪽: 마우스 했다 순진한, 오른쪽: 마우스 VSV-GP (위 패널) 접종 했다, 녹색 형광 단백질 (eGFP)를 향상-VSV-GP (중간 패널) 또는 VSV GP 인간 유 두 종 바이러스 (HPV) E7 oncoprotein (E7) 표현 표현 (하단 패널). 피 접종 후 7 일에 꼬리 정 맥에서 수집 된 고 tetramers (LCMV GP, eGFP HPV E7)으로 물. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
여기에 설명 된 프로토콜의 하나의 큰 장점은 적은 양의 혈액 각 측정에 필요한로 동일한 마우스에서 T 세포 응답 시간이 지남에 따라 할 수 있습니다. 그림 3 시간이 지남에 T 세포 응답에 대 한 훌륭한 결과 보여준다. 항 원 특정 Ctl의 수량, 뿐만 아니라 그들의 표현 형 또한 분석할 수 있습니다 (그림 4)이이 프로토콜을 사용 하 여.
CD8의 대표적인 결과 그림 3:+ T 세포 혈 예방 접종 후에 운동. Tetramer+ 세포의 흐름 cytometric 정량화에 대 한 사용 제어 전략의 도식 대표. CD3+/CD8+ 세포 tetramer 분석을 위해 사용 되 고 두 tetramers 서로 (눈금)에 대 한 표시 했다. 상위 패널: 마우스 OVA 은닉 아 데 노비 루스 5 (Adeno-OVA); 접종 했다 패널을 낮추는: 마우스 ovalbumin (OVA) 접종 했다-VSV-GP (VSV-GP-OVA)을 표현. 혈액은 3, 7, 10 및 14 일 접종 후에 꼬리 정 맥에서 수집 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
CD8의 대표적인 결과 그림 4:+ T 세포 활성화 및 예방 접종 후 순 진하고 effector 세포로 분화. 의 흐름 cytometric 정량화에 대 한 사용 제어 전략의 도식 표현 활성화 (CD43+), 순 (CD44-/CD62L+)와 이펙터 (CD44+/CD62L-) CD3+/CD8+ (세포 로그 소수 자릿수)입니다. 왼쪽: 컨트롤 (순) 마우스; 중간: 마우스 OVA 은닉 아 데 노비 루스 5 (Adeno-OVA); 접종 했다 오른쪽: 마우스 ovalbumin (OVA) 접종 했다-VSV-GP (VSV-GP-OVA)을 표현. 피 접종 후 7 일에 꼬리 정 맥에서 수집 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| # 마우스 | %CD43+ | % N VSV Tetramer+ | % OVA Tetramer+ | |
| mock | 1 | 1.7 | 0.45 | 0.41 |
| 2 | 0.77 | 0.69 | 0.15 | |
| 3 | 1.34 | 0.35 | 0.31 | |
| 4 | 1.68 | 0.83 | 0.26 | |
| 5 | 0.84 | 0.47 | 0.23 | |
| VSV-GP-OVA | 1 | 23 | 13.2 | 3.69 |
| 2 | 32.6 | 15.9 | 3.54 | |
| 3 | 22.1 | 11.7 | 2.43 | |
| 4 | 15.1 | 8.89 | 1.79 | |
| 5 | 29.1 | 14.7 | 5.64 |
보충 표 1: 활성화 하 고 항 원 특정 CD3의 비율+/CD8+ 세포 접종 후. 쥐 중 순진한 또는 접종 ovalbumin (OVA)-VSV-GP (VSV-GP-OVA)을 표현 (n = 5). 피 접종 후 7 일에서 꼬리 정 맥에서 수집 된 고 tetramers (VSV-N과 OVA)으로 물. 활성화 (CD43+)와 CD3 항 원 특정 (tetramer+)+/CD8+ 세포 cytometry로 계량 했다.
Discussion
Tetramer 얼룩 표현 형 및 펩 티 드 T 림프 톨의 특이성을 분석 하는 오히려 간단 하 고 단순한 프로토콜입니다. 분석을 위한 혈액의 사용, 여기에 설명 된 대로 최소한 침략 적 이며 수 있습니다 지속적인 모니터링, 예를 들어 백신 연구에. 예방 접종의 분야, 벡터 및 항 원 특정 응답의 정량화는 관심, 벡터 특정 응답 백신 항 원28에 대 한 효과적인 면역 반응을 방해 수 있습니다. 메모는 여기에 설명 된 프로토콜, 두 인구 수 측정할 수 동시에 단일 tetramer 얼룩에 줄여 착 색 다양성 및 샘플입니다. 그러나, 몇 가지 단계를 신중 하 게 해야 할 적절 한 측정 및 신뢰할 수 있는 데이터를 확인 해야 합니다. 꼬리 정 맥에서 혈액을 분석에 사용 하는 경우 하나 미리 엷게24를 유도 하기 위해 동물을 따뜻하게 해야 합니다. 따라서, 짧은 시간에 충분 한 혈액을 수집할 수 있습니다, 동물에 대 한 스트레스 감소 하 고 분석은 훨씬 더에 비해 서 피는 천천히 수집 하는 경우. 또한, 샘플 수집 (혈액 또는 기관), 후 직접 얼룩 좋습니다 TCR downregulation 틀린 부정적인 결과 피하기 위해. 같은 모든 후속 단계에 대 한 적용: 절차 중단 하지 해야 하 고 모든 세척 단계 (프로토콜에 명시 된)로 최소한의 수를 감소. 모든 솔루션 및 이전 및 부 화 후 샘플을 보장 하기 위해 적절 한 얼룩 배려 소용돌이를 한다. 이것은 세포의 응집 방지 하려면 샘플을 수정 하기 전에 특히 중요입니다.
프로토콜을 수정 하면, 측면에서 다른 표면 마커 및 tetramers 사용할 수 있습니다, 분석의 목표에 따라. 그러나, 모든 시 약은 다음 수 적정, 최적의 패널 얼룩 전체와 함께에서 해야 합니다. 여기에 지정 된 tetramers의 일부에 대 한 최적화 공개 우리는 제조업체에서 권장 하는 희석을 증가 시킬 수 있습니다 (1시 10분 권장, 최적화 된 1시 25분) (표 1). 스펙트럼 중복 보상, 보상 구슬 스테인드 셀 대신 사용할 수 있습니다. 에 대해서 tetramer 결합 하는 형광 색소의 선택 하나 상상 한다 밝은 형광을 사용 하 여 신호가 낮을 때에 특히이 탐지-을 용이 하 게 하는으로. 통 정 국제 및 동료29, 우리는 하나의 얼룩과 CD8 완벽 하 게 결합 될 수 있는 PE 또는 APC 결합 tetramers를 사용 하 여 선호+ T 단일 항 원 특이성을 가진 세포는 잘 될 수 있습니다 (그림 2)를 감지. 온도 및 시간, 다양 한 조건 얼룩 tetramer 보육에 관한 존재 한다. 우리의 최적화 과정에서 우리는이 문제를 해결 하 고 tetramer 다른 조건 (예: 4 ° C, 실내 온도 또는 37 ° C)에서 얼룩을 수행. 얻은 결과에서 문학30,31일치에 있는 37 ° C에서 20 분 동안 얼룩에 좋습니다. 장시간된 보육으로 국제화 tetramer30 및 false 네거티브 결과의 발생할 수 있습니다 피해 야 한다.
CD8의 검출에 대 한 오른쪽 항 체의+ 셀 (그리고 잠재적으로 적응) 신중 하 게 고려 하는 또 다른 중요 한 문제 이다. 이 특정 안티-CD8 항 체 복제 인간의32 마우스33 샘플에 있는 TCR tetramers의 블록 바인딩 사실에서 발생 한다. 우리의 tetramer 얼룩 프로토콜, 우리 클론 53-6.7 murine CD8에 대 한 얼룩을 선택+ 셀-복제를 차단 하지 않습니다, 하지만 오히려 tetramer 착 색을 향상 시킵니다.
예를 들어 T 세포 응답의 저명한 면역 응답을 분석할 때 tetramer 얼룩 다소 복잡 한입니다. 그러나, 인구는 좀 더 '문제'는 있을 수 있습니다. 이러한 예로 낮은 친 화력 항 원에 대 한 셀 특정 (종양, 자기), 최근 활성화 이후에 아래로 통제 되는 세포를 그들의 수용 체 또는 드문 셀 하위 집합 (예:. 순진한 전조 또는 메모리 셀 인구). 이러한 경우에, 프로토콜을 얼룩이 지는 클래식 tetramer 개선 하거나 다른 방법으로 결합을 해야 합니다. 예를 들어 단백질 키 니 아 제 억제제 (PKI) dasatinib TCR 국제화를 억제 하 고 tetramer 얼룩이 지기 전에 포함 될 수 있습니다. Tetramers 또한 tetramer 얼룩 후 안티 형광 색소 결합형된 기본 Abs를 포함 하 여 안정 될 수 있습니다. 또한, 형광 강도 두 번째 반대로 Ab 형광 색소 활용 된 Ab29,,3435,36의 추가 의해 증가 될 수 있다. 우리는이 프로토콜에 지정 된 tetramers에 대 한 선택적으로 조건을 최적화 하 고 PKI 또는 추가 Abs를 포함 하지 않았다. 그러나, 다른 tetramer에 대 한 최적의 조건을 개별적으로 조정할 수 있다. 드문 인구에 관해서는 tetramer 얼룩 해야 자기 농축11과 결합 합니다.
촉진 및 FACS tetramer 얼룩의 분석을 확인, 부정과 긍정적인 컨트롤이 포함 되어야 합니다. 부정적인 컨트롤, 우리는 항상 관심의 우리의 tetramer로 같은 스트레인의 순진한 마우스의 세포 얼룩. 또는, 샘플 tetramers 없는 펩 티 드, 하지만 관심 tetramer로 같은 형광 색소와 스테인드 수 있습니다. 이러한 컨트롤은 거짓 긍정적인 신호를 제외 하려면 필수 예., 죽어가는 세포에서 발생. 이것 이외에, propidium 요오드 화물 (PI) 등 라이브/죽은 얼룩을 포함 하는 것이 좋습니다. 이것은 특별 한 중요성의 세포는 격리 후 직접 얼룩이 않을 경우입니다. Autofluorescence 배경 제거를 또 다른 전략은 한 채널에 여러 개의 T 세포 마커를 포함 될 수도 있습니다. 이 채널에서 셀 긍정적인 제외, T 세포 인구를 제외할 수 있습니다. 긍정적인 컨트롤로 OT 1 마우스에서 샘플 사용할 수 있습니다 OVA tetramer, 대 한 예. 다른 tetramers에 대 한이 개별적으로 선택 될 수 있다 (예를 들어., 여러 번 접종 했다 마우스에서 샘플). 모두 다른37, 우리 또한 관찰 CD8 수용 체의 다운 규제 효과 기 T 세포 응답의 하루 7 CTL 활성화 하는 동안. 따라서, 활성화 tetramer+ 효과 기 T 세포의 감소를 방지 하려면 좋습니다 분석에 CD8낮은 셀을 포함 하도록 (적어도 이펙터 단계에서 측정 하는 경우).
하나이 프로토콜에서 검색할 수 있는 정보의 양과 질 공부 하는 항 원에 대 한 지식, 가용성 및 FACS 기계 (레이저와 사용할 수 있는 감지기의 수)의 품질과 tetramer의 특이성에 따라 달라 집니다. 동물 샘플 작업은 면역 반응에 변화는 자연스럽 고 피할 수 없는 것입니다. 따라서, tetramer 얼룩에서 의미 있는 결과 얻으려면, 적어도 3-5 동물 분석 되어야 합니다. 경우 여기에 설명 된 프로토콜 (한 실험에서 모범적인 결과 보충 표 1에서에서 찾을 수 있습니다) 안정적이 고 재현 가능한 결과 줄 것 이다. 이 방법은 완벽 하 게 표현 형 및 CD8의 항 원 특이성을 계량에 적합 하기 전에 설명 했 듯이,+ T 세포 (그림 3, 4; 추가 그림 1), 뿐만 아니라 인간에서에서 마우스에 뿐만 아니라. 그러나, CD8 분석+ T 세포 효과 기 기능, granzyme 유도 된 세포 죽음, IC 또는 ELISpot 수행 해야 같은. 그러나, 하나는 T 세포 기능, 생체 외에서 자극에 의해 측정 된 vivo에서 실제 상황을 나타내지 않을 수 있습니다 마음에 두어야 합니다. Vivo에서 진압 환경 T 세포 기능 체 외 측정은 방지할 수 있습니다.
자체, tetramer에 얼룩 제공 하지 않습니다 모든 정보, 하지만 그것은 T 세포 응답을 특성화 하 고 매우 민감한 방식으로38에 생체 외에서 T 세포 부분 집합을 계량 하는 필수적인 방법 될 진화. Tetramers만을 사용할 수 없습니다 특정 하위 척도를 하지만 또한 그39격리, 제자리 교 잡19,20 지역화 및 낮은 선호도 항 종양 관련40, 등 공부 41. tetramer 기술4의 발견 이후 tetramer 얼룩 되고있다 T 세포 분석 및 응용 프로그램의 범위에 필수적인 도구.
Disclosures
Dorothee 폰 Laer VSV GP의 발명가 이며 소수 생명 공학 회사 ViraTherapeutics GmbH, VSV GP에 대 한 지적 재산권을 보유 하 고 있는 주식을 보유 하 고 있습니다. 다른 작가 대 한 아무 경쟁 금융 관심사는 존재 한다.
Acknowledgments
이 프로젝트는 FWF 오스트리아 과학 기금 (프로젝트 번호 P 25499-B13)와 유럽 연합의 지평선 2020 연구와 혁신 프로그램 부여 계약 번호 681032. NIH Tetramer 핵심 시설을 통해 얻은 다음 시 약: 클래스 I MHC Tetramer vesicular 구내 염 바이러스 nucleoprotein (RGYVYQGL)에 대 한.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Safety cabinet class 2 | VWR | LBCP302411030 | |
| Flow cytometer (e.g. FACSCanto II) | BD | 338962 | |
| Analysis platform for flow cytometry analysis (e.g. FlowJo) | Fisher Scientific Co. L.L.C. | NC0887833 | |
| Binocular microscopes, VisiScope 100 | VWR | 630-1553 | |
| Vortex mixer | Phoenix Instrument | RS-VA 10 | |
| Centrifuge suitable for FACS tubes (e.g. Rotanta 460R) | Hettich | 5660 | |
| Sterile Scalpel Blades Nr. 10 | Braun | BB510 | |
| Cell strainer 40 µm | Sigma | CLS431750 | |
| Cell strainer 70 µm | Sigma | CLS431751 | |
| Neubauer counting chamber | VWR | 630-1506 | |
| Pipettes (20 μL, 200 µL and 1000 μL) | Eppendorf | 4924000037, 4924000061, 4924000088 | |
| Pipette tips, sterile (20 µL, 200 µL, 1,000 µL) | Biozym | 770050, 770200, 770400 | |
| Pipet Boy | Integra | 155 000 | |
| Sterile pipettes (5 mL, 10 mL, 25 mL) | Sarstedt | 86.1253.001, 86.1254.001, 86.1685.001 | |
| Multistep Pipette, HandyStep S | BRAND | 705110 | |
| 12.5 mL Combitips for Multistep Pipette | BrandTech Scientific | 702378 | |
| Microvette CB 300 K2E | Sarstedt | 16.444 | |
| Sterile reaction tubes (1.5 mL, 50 mL) | Sarstedt | 72.692.005, 62.547.254 | |
| FACS tubes (non-sterile) | Szabo Scandic | BDL352008 | |
| PBS | Lonza | LONBE17-516F | |
| Heat-inactivated FCS | ThermoFisher Scientific | 10500064 | |
| Formaldehyde | Roth | 4979.1 | |
| Sodium azide | Roth | K305.1 | |
| PE-Cy7 Rat Anti-Mouse CD3 Molecular Complex | BD | 560591 | Clone 17A2; Lot # 7235504 |
| Pacific Blu Rat Anti-Mouse CD8a | BD | 558106 | Clone 53-6.7; Lot # 5058904 |
| V450 Rat anti-Mouse CD8a | BD | 560469 | Clone 53-6.7; Lot # 5205945 |
| FITC anti-mouse CD43 | BioLegend | 121206 | Clone 1B11; Lot # B233778 |
| PE-Cy5 Rat Anti-Mouse CD44 | BD | 553135 | Clone IM7; Lot # 85660 |
| APC-Cy7 Rat Anti-Mouse CD62L | BD | 560514 | Clone MEL-14; Lot # 7215801 |
| OVA-tetramer/APC | MBL | TB-5001-2 | SIINFEKL, H-2Kb; Lot # T1702008 |
| VSV NP-tetramer/PE | MBL | TS-M529-1 | RGYVYQGL, H-2Kb; Lot # 007 |
| EGFP-tetramer/PE | MBL | TS-M525-1 | HYLSTQSAL, H-2Kd; Lot # 004 |
| LCMV-GP-tetramer/APC | MBL | TB-5002-2 | KAVYNFATC, H-2Db; Lot # T1412006 |
| HPV 16 E7-tetramer/APC | MBL | TB-5008-2 | RAHYNIVTF, H-2Db; Lot # T1804003 |
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