Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

-Voor-stapmodus zuivering van macromoleculaire complexen met behulp van RNA gekoppeld aan biotine en een foto-cleavable Linker

Published: January 3, 2019 doi: 10.3791/58697
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Integrative Program for Biological and Genome Sciences, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Biochemistry and Biophysics, University of North Carolina at Chapel Hill

Summary

RNA/eiwitcomplexen gezuiverd met behulp van botin-streptavidine strategie worden geëlueerd oplossing onder denatureren voorwaarden in een vorm die ongeschikt zijn voor verdere zuivering en de functionaalanalyse. Hier beschrijven we een wijziging van deze strategie dat gebruik maakt van een foto-cleavable linker in RNA en een zachte UV-elutie stap, inheemse en volledig functionele RNA/eiwitcomplexen oplevert.

Abstract

Voor vele jaren, is het uitzonderlijk sterk en snel gevormde interactie tussen Biotine en daar met succes gebruikt voor gedeeltelijke reiniging van biologisch belangrijke RNA/eiwitcomplexen. Echter deze strategie vertoont een grote nadeel dat het breder gebruik beperkt: de interactie van biotine/daar slechts onder voorwaarden die ook het verstoren van de integriteit van de eluted complexen, vandaar uitschakeling denaturering kan worden doorbroken hun latere functionaalanalyse en/of verdere zuivering door andere methoden. De eluted monsters zijn bovendien vaak besmet met de achtergrond eiwitten die nonspecifically met daar kralen associëren, bemoeilijken de analyse van de gezuiverde complexen door zilveren kleuring en massaspectrometrie. Deze beperkingen wilt opheffen, ontwikkelden we een variant van de biotine/daar strategie waarin Biotine is aangesloten op een substraat van RNA via een foto-cleavable linker en de complexen geïmmobiliseerd op daar kralen zijn selectief geëlueerd aan oplossing in een inheemse vorm door lange golf UV, verlaten de achtergrond eiwitten op de parels. Kortere RNA-bindende substraten kunnen gesynthetiseerd worden chemisch met biotine en de foto-cleavable linker covalent gekoppeld aan het einde 5' van het RNA, overwegende dat langer RNA substraten kunnen worden voorzien van de twee groepen door een aanvullende oligonucleotide. Deze twee varianten van de UV-elutie-methode zijn getest voor zuivering van de U7 snRNP-afhankelijke verwerking complexen die Histon pre-mRNAs aan de 3'-eind klieven en zij allebei bewezen te gunstig vergelijken met andere eerder zuivering methodes ontwikkeld. De UV-geëlueerd monsters bevatte gemakkelijk detecteerbare hoeveelheid de U7 snRNP dat gratis grote eiwit contaminanten en geschikt voor een directe analyse van massaspectrometrie en functionele testen was. De beschreven methode kan gemakkelijk worden aangepast voor de zuivering van andere RNA-bindende complexen en gebruikt in combinatie met single - en double-stranded DNA bandplaatsen om DNA-specifieke proteïnen en macromoleculaire complexen te zuiveren.

Introduction

In eukaryoten ondergaan RNA polymerase II gegenereerde mRNA precursoren (pre-mRNAs) verschillende evenementen van de rijping in de kern voordat hij volledig functionele mRNA sjablonen voor de eiwitsynthese in het cytoplasma. Een van deze gebeurtenissen is 3' eind verwerking. Voor de overgrote meerderheid van de pre-mRNAs omvat 3' eind verwerking decollete gekoppeld aan polyadenylatie. Deze twee stappen-reactie wordt gekatalyseerd door een relatief overvloedige complex bestaande uit meer dan 15 eiwitten1. Dierlijke replicatie-afhankelijke Histon pre-mRNAs worden verwerkt aan de 3'-eind door een ander mechanisme waarin de hoofdrol wordt gespeeld door U7 snRNP, een lage overvloed complex bestaande uit snRNA van de U7 van ~ 60 nucleotiden en meerdere eiwitten2,3 . De U7 snRNA baseparen met een specifieke opeenvolging Histon pre-mRNA en één van de subeenheden van de U7 snRNP katalyseert de splitsingsproducten-reactie, het genereren van volwassen Histon mRNA zonder een poly(A) staart. 3' eind verwerking van Histon pre-mRNA vereist ook stam-Loop bindende eiwit (SLBP), die een geconserveerde stam-lus ligt bindt stroomopwaarts van de breukzijde en verbetert de aanwerving van de U7 snRNP naar de substraat2,3. Studies die gericht zijn op het identificeren van de afzonderlijke onderdelen van de U7 snRNP geweest uitdagend vanwege de lage concentratie van de U7 snRNP in dierlijke cellen en de tendens van het complex te distantiëren of gedeeltelijke proteolyse ondergaan tijdens het zuiveringsproces ongehinderd door het gebruik van milde detergentia4,5,6, hoge zout wast en/of meerdere chromatografische stappen7,-8,9.

Onlangs, om te bepalen van de samenstelling van de machines voor het behandelen van de U7-afhankelijke, was een kort fragment van Histon pre-mRNA met biotine op 3' of 5' geïncubeerd met een nucleaire extract en de geassembleerde complexen werden vastgelegd op daar beklede agarose kralen5,6,10. Als gevolg van de uitzonderlijk sterke interactie tussen Biotine en daar, waren de eiwitten geïmmobiliseerd op daar kralen geëlueerd onder de voorwaarden door te koken in SDS denaturering en geanalyseerd door zilveren kleuring en massaspectrometrie. Terwijl deze eenvoudige aanpak een aantal onderdelen van de U7 snRNP vastgesteld, leverde het relatief ruwe monsters, vaak besmet met een groot aantal achtergrond eiwitten nonspecifically gebonden aan daar kralen, sommige onderdelen van potentieel te maskeren de machines voor het behandelen en voorkomen van hun detectie op zilver gekleurde gels5,6,10. Nog belangrijker is, deze aanpak ook uitgesloten geen functionele studies met de geïsoleerde materiaal en haar verdere zuivering aan homogeniteit door aanvullende methoden.

Een aantal wijzigingen werden voorgesteld na verloop van tijd inspelen op het vrijwel onomkeerbare karakter van de interactie van biotine/daar, met de meeste van hen wordt ontworpen ofwel verzwakken de interactie of een chemisch cleavable spacer arm in de Biotine-bevattende reagentia11,12. Het nadeel van alle wijzigingen van deze was dat ze aanzienlijk de doeltreffendheid van de methode en/of vaak vereist niet-fysiologische omstandigheden tijdens de elutie stap verminderen, de integriteit of de activiteit van de gezuiverde eiwitten in gevaar te brengen.

Hier beschrijven we een andere aanpak om de inherente probleem te verhelpen van de strategie van biotine/streptavidine met behulp van RNA substraten waarin Biotine covalent is bevestigd aan de 5' einde via een foto-cleavable 1-(2-nitrofenyl) ethyl-groep die is gevoelig voor de lange golf UV13,14. Wij testten deze aanpak voor de zuivering van de beperkende machines voor het behandelen van U7-afhankelijke van Drosophila en zoogdieren nucleaire extracten15. Na een korte broedtijd van Histon pre-mRNA met biotine en de foto-cleavable linker met een nucleaire extract, de geassembleerde verwerking complexen zijn geïmmobiliseerd op daar kralen, grondig gewassen en voorzichtig vrijgegeven aan oplossing in een native formulier door blootstelling aan ~ 360 nm UV licht. De UV-elutie-methode is zeer efficiënt, snel en eenvoudig, voldoende hoeveelheden van de U7 snRNP te visualiseren van de componenten ervan door Splinter kleuring van zo weinig zoals 100 µL van het extract15oplevert. Het materiaal UV-geëlueerd is gratis achtergrond eiwitten en geschikt voor directe massaspectrometrie analyse, extra zuivering stappen en enzymatische tests. Dezelfde methode kan worden vastgesteld voor de zuivering van andere RNA/eiwitcomplexen, die relatief korte RNA bandplaatsen vereisen. Biotine en de foto-cleavable linker kunnen ook worden covalent bevestigd aan één - en dubbelstrengig DNA, de UV-elutie-methode voor de zuivering van diverse complexen van de DNA/proteïne potentieel uit te breiden.

Chemische synthese van RNA substraten met covalent gekoppeld Biotine en de foto-cleavable linker is praktisch alleen met de sequenties die overschrijd niet ~ 65 nucleotiden, steeds dure en inefficiënte voor aanzienlijk langere sequenties. Om aan te pakken dit probleem, ontwikkelden we ook een alternatieve benadering die geschikt is voor veel langer RNA-bindende doelstellingen. In deze benadering RNA van elke lengte en nucleotide sequentie is gegenereerd in vitro van de Transcriptie T7 of SP6 en gegloeid om een korte aanvullende oligonucleotide dat bevat Biotine en de foto-cleavable linker eind 5' (trans configuratie). De resulterende duplex wordt vervolgens gebruikt voor het zuiveren van individuele bindende proteïnen of macromoleculaire complexen op daar kralen na hetzelfde protocol beschreven voor de RNA-substraten met foto-cleavable Biotine covalent aangesloten (cis configuratie). Met deze wijziging, kan de foto-cleavable Biotine worden gebruikt in combinatie met in vitro gegenereerd afschriften met honderden nucleotiden, uitbreiding van de UV-elutie-methode voor de zuivering van een brede waaier van RNA/proteïne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. substraat voorbereiding

Opmerking: RNA substraten korter dan ~ 65 nucleotiden kunnen chemisch gesynthetiseerd worden met biotine (B) en de linker van de foto-cleavable (pc) (samen aangeduid als foto-cleavable biotine of pcB) covalent gekoppeld aan het RNA 5' einde (cis configuratie). RNA substraten met aanzienlijk langere bandplaatsen moeten gegenereerde in vitro van de Transcriptie T7 (of SP6) en vervolgens naar een korte aanvullende adapter oligonucleotide met PCB's deel aan de 5'-eind (trans gegloeid configuratie) (Figuur 1).

  1. Voor bandplaatsen bestaande uit minder dan ~ 65 nucleotiden, gebruik een commerciële fabrikant (Tabel of Materials) te synthetiseren chemisch RNA van belang met pcB covalent gekoppeld aan het RNA 5' einde (figuur 1A en figuur 2A). Ontbinden in steriel water tot de gewenste concentratie wordt bereikt en op te slaan in kleine porties bij-80 ° C.
  2. Voor bandplaatsen aanzienlijk meer dan ~ 65 nucleotiden, vorm een gedeeltelijke duplex van een in vitro gegenereerd RNA van belang en een aanvullende adapter oligonucleotide met de pcB groep eind 5' (figuur 3A).
    1. De Transcriptie T7 op een gelineariseerde plasmide-DNA of een passende PCR-sjabloon voor het genereren van RNA met de bindende site van belang uitgebreid aan de 3'-eind door een willekeurige ~ 20-nucleotide-volgorde uitvoeren.
    2. Gebruik een commerciële fabrikant (Tabel of Materials) te synthetiseren chemisch een adapter oligonucleotide dat complementair is aan de 3'-uitbreiding in het RNA T7-gegenereerd en bevat pcB eind 5' (figuur 3A).
      Opmerking: Twee 18-atoom spacers en 2-3 niet-complementaire nucleotiden kunnen worden geplaatst aan het einde 5' van de oligonucleotide om potentiële sterische hinder tussen de afhankelijke complex en daar kralen. Het is ook wenselijk dat de oligonucleotide gelijkmatig wordt gewijzigd met een groep 2' O-methyl ter verbetering van de sterkte van de duplex en om weerstand tegen verschillende nucleasen te bieden.
    3. Ontharden de T7 gegenereerde RNA aan de pcB adapter oligonucleotide.
      1. Mix 20 pmol van RNA en 100 pmol van de adapter pcB oligonucleotide (1:5 molaire verhouding) in een 1,5 mL tube met 100 µL van bindende buffer met de volgende samenstelling: 75 mM KCl, 15 mM HEPES pH 7,9, 15% glycerol, 10 mM ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA).
        Opmerking: Het is belangrijk dat u een minimale hoeveelheid van de adapter oligonucleotide dat volstaat om te vormen van een duplex met de meeste (zo niet alle) pre-mRNA substraat gebruikt in de onthardende reactie. Dit kon worden gemakshalve bepaald door labeling van RNA substraat eind 5' met 32P, gloeien de gelabelde substraat met steeds grotere hoeveelheden de adapter oligonucleotide met behulp van diverse buffer voorwaarden en het toezicht op de handhaving van de radioactieve signaal op daar kralen na meerdere wasbeurten van de parels met de bindende buffer.
      2. Plaats de buis in kokend water gedurende 5 minuten.
      3. Laat het water om af te koelen tot kamertemperatuur.

2. complexe assemblage

  1. 1 mL van een muis nucleaire extract (of een ander uittreksel van keuze) te vullen met 80 mM EDTA pH-8 om een eindconcentratie van 10 mM tot het blokkeren van niet-specifieke metaal-afhankelijke nucleasen die aanwezig in het extract zijn.
    Opmerking: Dit zal resulteren in het aanpassen van de buffer in het extract op de dezelfde samenstelling als die in de bindende buffer (zie stap 1.2.3.1). EDTA heeft geen invloed op in vitro verwerking van Histon pre-mRNAs maar in het zuiveren van proteïnen of eiwitcomplexen die in een magnesium-afhankelijke manier monteren schadelijk kan zijn. In deze gevallen moet de EDTA worden vermeden.
  2. 5-10 pmol van het RNA-substraat gelabeld met de pcB-groep in DIS toevoegen (zie stap 1.1) of trans (zie stap 1.2.3.3) tot 1 mL van het extract met 10 mM EDTA.
    Nota: Het bedrag van RNA moet zorgvuldig worden geëvalueerd in een reeks van proef experimenten. Met behulp van teveel RNA substraat voor de zuivering van een beperkende complex misschien contraproductief, de achtergrond van niet-specifieke RNA-bindende proteïnen zonder enig effect op de opbrengst van specifieke proteïnen aanzienlijk te verhogen.
  3. Incubeer de RNA-substraat met het extract voor 5 min op ijs, af en toe het mengen van het monster.
    Opmerking: Zowel de tijd en de temperatuur van de incubatie moeten worden empirisch vastgesteld en variëren aanzienlijk, afhankelijk van de specifieke aard van het RNA/eiwit complex.
  4. Draai het incubatie-mengsel in een vooraf gekoelde microcentrifuge gedurende 10 minuten bij 10.000 x g zorgvuldig verzamelen het supernatant vermijden van overdracht van de pellet te verwijderen elke potentiële precipitaten.

3. immobilisatie van het RNA/eiwitcomplexen op daar kralen.

  1. ~ 100 µL van daar agarose kraal schorsing van een commerciële leverancier (Tabel of Materials) overbrengen naar een 1,5 mL-buis en verhoog het volume met de bindende buffer (75 mM KCl, 15 mM HEPES pH 7,9, 15% glycerol, 10 mM EDTA).
    Opmerking: Deze buffer moet dezelfde samenstelling als die in de onthardende mengsel en in het extract gebruikt voor complexe montage (stap 2.1).
  2. Verzamel de kralen aan de onderkant van de buis door spinnen voor 2-3 min op 25 x g en het supernatant gecombineerd.
  3. Herhaal de procedure wassen/spinnen 2 - 3 keer naar de kralen met de bindende buffer equilibreer.
    Opmerking: Aan het eind van deze stap, de pellet van de parels moet een volume van ~ 30 µL.
  4. Laad het supernatant met de geassembleerde complex (stap 2.4) over de geëquilibreerd daar agarose kralen.
  5. Draaien van 1 uur bij 4 ° C tot het immobiliseren van RNA en de afhankelijke complexen op de parels.
  6. Het verzamelen van de parels aan de onderkant van de buis door spinnen voor 2-3 min op 25 x g.
    Opmerking: Gebruik een schommel uit rotor te voorkomen aanzienlijk verlies van de parels als ze de neiging zich te houden aan de kant van de buis in hoekige rotoren.
  7. De bovendrijvende substantie gecombineerd en spoel de kralen tweemaal met 1 mL van de bindende buffer, met behulp van de dezelfde CENTRIFUGEEROMSTANDIGHEDEN.
  8. Voeg 1 mL van de bindende buffer en draai het monster 1 uur bij 4 ° C.
    Opmerking: Deze stap kan worden verkort als het complex gevormd op het substraat neiging om zich te distantiëren.
  9. Spin down de kralen voor 2-3 min op 25 x g, voeg 1 mL van de buffer en spoel de suspensie tot een nieuwe koker.
  10. Voor een extra 1 uur of korter, als het complex niet stabiel is draaien, spin down voor 2-3 min op 25 x g en de kralen overbrengen in een buis 500 µL in 200 µL van bindende buffer.

4. UV-elutie.

  1. Inschakelen van een hoge intensiteit UV-lamp uitstralen van 365 nm UV licht gedurende 5-10 minuten vóór het bereiken van volledige schittering.
    Opmerking: Dit is essentieel voor het bereiken van de maximale energie van UV emissie aan het begin van de bestraling.
  2. Vul de bodem van een petrischaal (100 mm x 15 mm) met opeengepakte ijs en stapel het over de deksel van de schotel.
  3. Kort vortex de buis met het geïmmobiliseerdet complex, plaats het horizontaal op ijs en dekking met de voorverwarmde lamp, ervoor te zorgen dat het monster zich bevindt binnen de afstand van de oppervlakte van de bol 2-3 cm.
    Opmerking: Als de afstand te groot is, gebruik extra petrischalen of andere geschikte objecten om het monster dichter naar de lamp.
  4. Bestralen voor een totaal van 30 min, vaak omkeren en vortexing de buis om uniforme Gasbedwelming met behulp van de schorsing UV en oververhitting te voorkomen.
    Opmerking: Om te zorgen voor extra koeling, de UV-elutie stap kan worden uitgevoerd in een koude kamer. Overschakelen naar een petrischaal met vers ijs in geval van buitensporige ijs smelten.
  5. Spin down de kralen voor 2-3 min op 25 x g en het verzamelen van de bovendrijvende substantie.
  6. Opnieuw draaien de bovendrijvende vloeistof met behulp van dezelfde voorwaarden en het verzamelen van de bovendrijvende substantie.
    Opmerking: Laat een kleine hoeveelheid van de bovendrijvende vloeistof op de bodem om te voorkomen dat residuele kralen.

5. analyse door zilveren kleuring gevolgd door massaspectrometrie.

  1. Gebruik SDS/polyacrylamide gelelektroforese een fractie van het supernatans dat UV-geëlueerd en de zelfde breuk van het materiaal liet op de kralen na UV elutie worden gescheiden.
    Opmerking: De analyse kan ook een aliquoot deel van de parels uit het monster vóór UV-elutie genomen.
  2. De gel bevat vlek gescheiden eiwitten met behulp van een commercieel beschikbare silver kleuring kit.
  3. Evaluatie van de doeltreffendheid van UV-elutie door het vergelijken van de intensiteiten van de eiwitten aanwezig in het UV-geëlueerd supernatant en die links op de parels na UV-bestraling.
  4. Accijnzen van de bands van de proteïne van belang en het bepalen van hun identiteit door de Spectrometrie van de massa, met behulp van standaard protocollen10,15.

6. de globale analyse van UV-geëlueerd monster door massaspectrometrie.

  1. Direct een fractie van het supernatans dat UV-geëlueerd analyseren door Spectrometrie van de massa om te bepalen van de gehele proteoom van het gezuiverde materiaal op onpartijdige wijze.
    Opmerking: Dit kan gebeuren door-oplossing behandeling van de gezuiverde monsters met trypsine gevolgd door standaard massa spectrometrie protocollen bij het bepalen van de identiteit van de genereren peptiden10,15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De UV-elutie-methode werd getest met twee chemisch gesynthetiseerde RNA substraten covalent aangesloten eind 5' op de pcB-groep (cis configuratie): pcB-SL (Figuur 1) en pcB-dH3/5 m RNAs (Figuur 2). De 31-nucleotide pcB-SL RNA bevat een structuur van de stam-lus gevolgd door een 5-nucleotide één gestrande staart en de volgorde is identiek aan de 3'-eind van volwassen Histon mRNA (dwz., na de splitsing van Histon pre-mRNA door U7 snRNP). Deze unieke reeks is een bekende bindende site twee eiwitten aanwezig in de zoogdieren cytoplasmatische Fractie: SLBP en 3' hExo16,17,18. pcB-dH3 / 5m is een 63-nucleotide fragment van Drosophila H3 Histon pre-mRNA en bevat naast de stam-lus een opeenvolgende die Drosophila U7 snRNP (Figuur 2 bindt).

dH3 Ext (125 nucleotiden) is een voorbeeld van langere RNA substraten die kunnen worden gegenereerd door de Transcriptie T7 en voorzien van biotine en een foto-cleavable spacer in trans door gloeien aan pcB/22mer, een chemisch gesynthetiseerde adapter oligonucleotide ( trans configuratie). pcB/22mer bevat de twee groepen aan het 5'-eind en bestaat uit 22 2' O-methyl-voorkomt nucleotiden (figuur 3A). 19 nucleotiden aan de 3'-eind van de pcB/22mer(underlined in the sequence in Figure 3A) zijn een aanvulling op het laatst 19 nucleotiden van het dH3 Ext pre-mRNA. Deze pre-mRNA naast langer niet aanzienlijk verschilt van de synthetische pcB-dH3 / 5m, met dezelfde twee belangrijke verwerking signalen: stam-lus en U7-bindende site.

pcB-SL RNA was geïncubeerd met 1 mL voor S100 extract bereid door ultracentrifugatie (100.000 x g voor 1 h) van de cytoplasmatische breuk verkregen muis myeloma cellen19 en het effect en doeltreffendheid van UV-elutie werden eerst geanalyseerd door zilveren kleuring. Een aantal eiwitten werden ontdekt op daar kralen voor UV-elutie (figuur 1B, lane 1). Bestraling met lange golf UV vrijgegeven slechts enkele van deze proteïnen tot het supernatant (figuur 1B, lane 3), een niet-specifieke achtergrond te verlaten op de parels (figuur 1B, lane 2), vandaar wijzend op het belang van de UV-elutie stap. Grote UV-geëlueerd eiwitten werden geïdentificeerd door de Spectrometrie van de massa als 3' hExo en SLBP, met SLBP wordt vertegenwoordigd door volledige lengte eiwit (FL) en een aantal kortere afbraakproducten (DP). Kleinere hoeveelheden van andere proteïnen, geïdentificeerd als verschillende RNA-bindende eiwitten (RBPs), werden ook selectief vrijgegeven aan oplossing door UV-bestraling (figuur 1B, lane 3).

pcB-dH3 / 5m pre-mRNA (Figuur 2) of dH3 Ext pre-mRNA gegloeid aan pcB/22mer (Figuur 3) werden geïncubeerd met 1 mL van een nucleaire uittreksel uit Drosophila Kc cellen formulierverwerking complexen20,21. Om te beter beoordelen de specificiteit van eiwitten die zich aan elke Histon pre-mRNA binden, een negatieve controle in parallel werd voorbereid door het toevoegen van twee concurrenten om de nucleaire uitpakken: SL-RNA dat sequesters van SLBP, en een korte antisense oligonucleotide die paren met als basis de snRNA van de U7 en voorkomt dat de interactie van de U7 snRNP met haar site op de pre-mRNA.

De UV-elutie stap van de geïmmobiliseerdet pcB-dH3 / 5m pre-mRNA resulteerde in een selectieve versie van slechts een klein aantal eiwitten aan het supernatant (figuur 2B, lane 1), met een intens achtergrond van niet-specifieke proteïnen resterende op de parels (figuur 2B , lane 3). Deze proteïnen, gelabeld A-ik, door massaspectrometrie werden geïdentificeerd als onderdelen van de U7 snRNP15. Het monster bevat ook gedeeltelijk gedegradeerd SLBP dat op 10 kDa migreert en kan alleen worden zichtbaar op hogere concentratie die SDS/polyacrylamide gels. Alle deze proteïnen zijn niet waargenomen in aanwezigheid van de twee concurrenten van verwerking die binding van U7 snRNP aan Histon pre-mRNA (figuur 2B, lane 2) blokkeren.

Dezelfde componenten van Drosophila U7 snRNP werden vrijgegeven aan oplossing door UV-bestraling van een geïmmobiliseerdet duplex bestaande uit dH3 Ext pre-mRNA en pcB/22mer (figuur 3B, lane 1). Dit voorbeeld bevat bovendien meerdere RNA-bindende proteïnen die wisselwerking met de pcB/22mer oligonucleotide in overmaat gebruikt om te vormen van een duplex met dH3 Ext pre-mRNA. In tegenstelling tot de subeenheden van de U7 snRNP, deze contaminerende proteïnen, evenals alle de achtergrond eiwitten die bleef op de parels, bleef in het bijzijn van de concurrenten van de verwerking (figuur 3B, vergelijk rijstroken 1 en 2, en de banen 3 en 4).

Een klein deel van de UV-supernatant met verwerking complexen en het hetzelfde deel van het UV-supernatant van een negatieve controle (bereid in de aanwezigheid van de twee concurrent oligonucleotides en vandaar ontbreekt verwerking complexen) kunnen rechtstreeks worden geanalyseerd door Spectrometrie van de massa zonder een voorafgaande scheiding van het eluted proteïnen door het gel elektroforese15. Deze methode is zeer gevoelig voor het opsporen van alle eluted eiwitten ongeacht hun grootte en overvloed en in combinatie met het negatief monster biedt een volledige en onpartijdige lijst van proteïnen toe die specifiek associëren met Histon pre-mRNA uit te voeren van 3' eind reactie wordt verwerkt.

Figure 1
Figuur 1: zuivering van muis cytoplasmatische eiwitten gebonden aan pcB-SL RNA. (A) A diagram van chemisch gesynthetiseerde pcB-SL RNA (31-nucleotiden). Biotine (Biot) eind 5' wordt gevolgd door een foto-cleavable groep (pc) gevoelig voor lange golf UV (366 nm), twee 18 atoom spacers en 31 nucleotiden die vormen van de structuur van de geconserveerde stam-lus aan de 3'-eind van volwassen Histon mRNAs gevonden. (B) pcB-SL RNA was geïncubeerd met S100 cytoplasmatische uittreksel uit muis myeloma cellen. Het RNA en eiwitten gebonden werden gezuiverd op daar kralen, uitgebreid gewassen, UV geëlueerd en geanalyseerd door zilver kleuring (lane 3). Eiwitten geïmmobiliseerd op daar kralen voor UV elutie en achtergelaten op de parels nadat UV elutie worden weergegeven in de banen 1 en 2, respectievelijk. Positie van eiwit grootte markers (in kDa) wordt aangegeven naar links.

Figure 2
Figuur 2: Zuivering van Drosophila verwerking complexen gemonteerd op pcB-dH3/5 m pre-mRNA. (A) een diagram van chemisch gesynthetiseerd Drosophila-specifieke pcB-dH3/5 m pre-mRNA (63-nucleotiden). Biotine (Biot) eind 5' wordt gevolgd door een foto-cleavable groep (pc), twee 18-atoom tussenschotten en 63 nucleotiden die de twee reeks elementen essentieel verwerking bevatten: stam-lusstructuur en U7-bindende site. Vijf nucleotiden rond de grote breukzijde gelegen tussen de twee elementen zijn gewijzigd met een 2' O-methyl groep te blokkeren het splijten de U7 snRNP tijdens complexe vergadering (twee elkaar kruisende lijnen). (B) pcB-dH3/5 m was geïncubeerd met een nucleaire extract van Drosophila te monteren verwerking complexen. In de negatieve controle bevat het nucleaire extract twee verwerking concurrenten te blokkeren van de binding van SLBP en U7 snRNP aan Histon pre-mRNA. De geassembleerde complexen waren geïmmobiliseerd op daar kralen, uitgebreid gewassen en vrijgegeven aan oplossing door de blootstelling van het monster aan de lange golf UV. De dezelfde breuken van het UV-geëlueerd materiaal (UV-sups) en de kralen na UV-elutie (UV-kralen) werden geanalyseerd door zilveren kleuring. Positie van eiwit grootte merkers (in kDa) en streptavidine (SA) is aangegeven naar rechts.

Figure 3
Figuur 3: Zuivering van Drosophila verwerking complexen op dH3 Ext pre-mRNA gekoppeld aan de foto-cleavable groep in transgemonteerd. (A) A diagram van de dH3 Ext duplex gegenereerd door gloeien T7 gegenereerde dH3 Ext pre-mRNA en chemisch gesynthetiseerde pcB/22mer oligonucleotide met de volgende reeks: 5' Biot/pc/18S/18S/mAmGmUmAmGmCmUmUmAmCmAmCmUmCmGmAmGmCmCmUmAmC. In de oligonucleotide, Biotine (Biot) wordt geplaatst aan het einde 5' en wordt gevolgd door de linker foto-cleavable (pc). De laatste 19 nucleotiden (onderstreept in de bovenstaande volgorde) zijn een aanvulling op de 3'-uitbreiding toegevoegd aan de dH3 Ext pre-mRNA. De aanwezigheid van 2' O-methyl wijzigingen (niet aangegeven in de figuur) dient twee doelen: het stabiliseert de oligonucleotide tegen extract nucleasen en verhoogt de sterkte van de duplex gevormd met de dH3 Ext pre-mRNA. (B) dH3 Ext dubbelzijdig was geïncubeerd met een Drosophila Kc nucleaire uitpakken in de afwezigheid of aanwezigheid van concurrenten, geïmmobiliseerd op daar kralen, uitgebreid gewassen en UV-geëlueerd samen met de afhankelijke eiwitten verwerken. De dezelfde breuken van het UV-geëlueerd materiaal (UV-sups, rijstroken 1 en 2) en de kralen na UV-elutie (UV-kralen, stegen 3 en 4) werden geanalyseerd door zilveren kleuring. Specifieke componenst van de verwerking-complexen (die zijn uitgeschakeld door de verwerking van concurrenten) worden aangegeven met A tot F letters. Grote aspecifieke RNA bindende proteïnen (die zijn UV-geëlueerd maar aanhouden in aanwezigheid van de twee concurrenten van verwerking) worden aangegeven met een sterretje. Positie van eiwit grootte markers (in kDa) wordt aangegeven naar rechts. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De hier beschreven methode is eenvoudig en naast het opnemen van een foto-cleavable linker en de UV-elutie stap verschilt niet van de gebruikte methoden die van de zeer sterke wisselwerking tussen Biotine en daar profiteren. De UV-elutie stap is zeer efficiënt, meestal het vrijgeven van meer dan 75% van de geïmmobiliseerdet RNA en eiwitten uit daar kralen, waardoor er achter een hoge achtergrond van proteïnen toe die niet-specifiek aan de kralen binden bijbehorende. Doordat deze achtergrond, levert de UV-elutie stap opmerkelijk zuivere monsters geschikt voor directe analyse door zilveren kleuring, massaspectrometrie en functionele testen.

Als gevolg van waarbij een relatief weinig en eenvoudige stappen, de UV-elutie-methode is zeer reproduceerbaar is, voorziet in voldoende hoeveelheden van de U7 snRNP zilveren kleuring van zo weinig zoals 100 µL van muis en Drosophila nucleaire extracten15. De methode is een aantrekkelijk alternatief voor andere experimentele strategieën eerder gebruikt voor het zuiveren van RNA/eiwitcomplexen, met inbegrip van tagging RNA substraten met een MS2 bindende site en bijbehorende complexen op amylose parels via een fusie MS2-MBP immobilizing eiwit. De MS2 strategie, terwijl succesvol in het isoleren van relatief overvloedige spliceosomes en canonieke 3' eind complexen22,23, verwerking mislukt opleveren van voldoende hoeveelheden van de verwerking van complexen met U7 snRNP (ZD, ongepubliceerde resultaten), die is ongeveer 100 keer minder geconcentreerd in dierlijke cellen dan de grote U1 spliceosomal snRNP.

Veel aspecten van het protocol moeten worden gewijzigd om te voldoen aan verschillende doelen van de individuele onderzoek en om optimale resultaten met andere complexen van RNA/proteïne te produceren. Ten eerste is het belangrijk aan het bedrag van het RNA-substraat gebruikt voor de complexe montage met het bedrag van dit complex dat in het extract bestaat. Voor het beperken van complexen, met inbegrip van de U7 snRNP, is met behulp van teveel substraat contraproductief, alleen het verhogen van de achtergrond van aspecifieke RNA-bindende proteïnen in het UV-supernatant. Ten tweede, het is ook belangrijk om de lengte en de temperatuur van incubatie te bevorderen van krachtige vergadering van het complex, voorkomen op hetzelfde moment zijn dissociatie als gevolg van potentiële proteolyse of buitensporige aantasting van het RNA te optimaliseren.

Een sleutel moeilijk in het werken met de U7-afhankelijke verwerking complexen en soortgelijke RNA/eiwitcomplexen die enzymatische activiteiten dragen is dat ze na het volledig geassembleerd als gevolg van katalyse kunnen distantiëren. Splitsing van Histon pre-mRNAs treedt snel op ook bij lage temperaturen, aanzienlijke vermindering van de opbrengst van de gezuiverde verwerking complexen. Om te voorkomen dat dit ongewenste effect, werden de grote breukzijde en vier nabijgelegen nucleotiden in pcB-dH3 / 5m pre-mRNA gewijzigd tijdens chemische synthese met 2' O-methyl groepen (5m)10. Deze pre-mRNA is bijna volledig resistent tegen splijten door U7 snRNP en kan worden geïncubeerd met een nucleaire extract bij kamertemperatuur gedurende 60 minuten zonder aantoonbare verstoring van het complex. De T7 gegenereerde dH3 die ext gegloeid aan pcB/22mer mist deze wijzigingen en de incubatie met een nucleaire extract is uitgevoerd op het ijs gedurende 5 minuten of korter om te beperken katalyse. pcB-SL RNA bevat volwassen 3' einde van Histon mRNA en in cytoplasmatische extracten geen toevoeging verwerking ondergaan. 3' hExo, oftewel de magnesium-afhankelijke 3' - 5'-exonuclease is geschikt voor het verwijderen van 2-3 nucleotiden van de enkele gestrande staart in vivo24,25 maar in vitro die zijn activiteit wordt geremd door de aanwezigheid van EDTA16. Dientengevolge, kan pcB-SL RNA worden geïncubeerd in cytoplasmatische extracten bij kamertemperatuur voor een langere tijd zonder nadelige gevolgen, hoewel meestal een korte incubatietijd op ijs is voldoende om te vormen van een ternaire complex van het RNA met SLBP en 3' hExo.

Van de twee alternatieve varianten van de UV-elutie-methode, met behulp van RNA substraten met biotine en de foto-cleavable linker in cis (covalent verbonden aan het einde 5' van RNA) is over het geheel genomen eenvoudiger en levert relatief zuiver monsters. Een belangrijke beperking van deze aanpak is dat de twee fracties covalent kunnen worden aangesloten op RNA substraten niet meer dan ~ 65 nucleotiden. Langere RNA-bindende doelstellingen kunnen worden aangesloten op de pcB-groep in trans via een adapter oligonucleotide. Echter, deze aanpak kan leiden tot hogere achtergrond van niet-specifieke eiwitten die de neiging om teveel van de adapter oligonucleotide binden. Daarom is het belangrijk om te gebruiken alleen een minimale molaire overmaat van de oligonucleotide voldoende te binden het pre-mRNA substraat gebruikt in het experiment.

De reeks, de lengte en de chemische aard van adapter oligonucleotides kan gevarieerd worden ter verbetering van hun vermogen om te baseren paar met de aanvullende reeksen in het RNA substraten, terwijl het verminderen van hun vermogen tot interactie met aspecifieke RNA-bindende proteïnen. Tot slot kunnen langer pre-mRNA substraten duplex met adapter oligonucleotides worden geïmmobiliseerd op daar kralen voordat het wordt gebruikt voor complexvorming. Een voordeel van deze pre-selectie aanpak is dat het uit de steekproef RNA-moleculen die verzuimd te ontharden aan de oligonucleotide elimineert. Deze moleculen behouden een normale kunnen samenvoegen tot een complex in het extract, maar zijn niet in staat om te binden daar kralen, gedeeltelijk vermindering van de opbrengst van de zuivering.

Naast het zuiveren complexen gemonteerd op de single-stranded RNA substraten, kan de UV-elutie-methode op een vergelijkbare manier worden gebruikt voor het zuiveren van proteïnen of eiwitcomplexen die single - en double-stranded DNA-sequenties binden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen

Acknowledgments

Wij danken onze collega's en medewerkers voor hun bijdrage aan ons werk. Deze studie werd ondersteund door de NIH GM 29832 verlenen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Streptavidin-Agarose Sigma S1638-5ML
High-intensity, long-wave UV lamp Cole-Parmer UX-97600-00
Replacement bulb Cole-Parmer UX-97600-19 100 Watts Mercury H44GS-100M bulb emitting 366 nm UV light (Sylvania)
RNAs and oligonucleotides containing biotin and photo-cleavable linker in cis Dharmacon (Lafayette, CO) or Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) Requst a quote in Dharmacon
Beckman GH 3.8 swing bucket rotor Beckman
RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (T7 polymerase) Promega P1300
RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (SP6 polymerase) Promega P1280
Pierce Silver Stain Kit ThermoFisher Scientific 24612

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mandel, C. R., Bai, Y., Tong, L. Protein factors in pre-mRNA 3'-end processing. Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (7-8), 1099-1122 (2008).
  2. Dominski, Z., Carpousis, A. J., Clouet-d'Orval, B. Emergence of the beta-CASP ribonucleases: highly conserved and ubiquitous metallo-enzymes involved in messenger RNA maturation and degradation. Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (6-7), 532-551 (2013).
  3. Dominski, Z., Marzluff, W. F. Formation of the 3' end of histone mRNA: getting closer to the end. Gene. 396 (2), 373-390 (2007).
  4. Yang, X. C., Torres, M. P., Marzluff, W. F., Dominski, Z. Three Proteins of the U7-Specific Sm Ring Function as the Molecular Ruler To Determine the Site of 3 '-End Processing in Mammalian Histone Pre-mRNA. Molecular and Cellular Biology. 29 (15), 4045-4056 (2009).
  5. Sabath, I., et al. 3 '-End processing of histone pre-mRNAs in Drosophila: U7 snRNP is associated with FLASH and polyadenylation factors. RNA. 19 (12), 1726-1744 (2013).
  6. Skrajna, A., et al. U7 snRNP is recruited to histone pre-mRNA in a FLASH-dependent manner by two separate regions of the stem-loop binding protein. RNA. 23 (6), 938-951 (2017).
  7. Smith, H. O., et al. Two-step affinity purification of U7 small nuclear ribonucleoprotein particles using complementary biotinylated 2'- O-methyl oligoribonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 88, 9784-9788 (1991).
  8. Pillai, R. S., et al. Unique Sm core structure of U7 snRNPs: assembly by a specialized SMN complex and the role of a new component, Lsm11, in histone RNA processing. Genes and Development. 17 (18), 2321-2333 (2003).
  9. Pillai, R. S., Will, C. L., Luhrmann, R., Schumperli, D., Muller, B. Purified U7 snRNPs lack the Sm proteins D1 and D2 but contain Lsm10, a new 14 kDa Sm D1-like protein. EMBO Journal. 20 (19), 5470-5479 (2001).
  10. Yang, X. C., et al. A Complex Containing the CPSF73 Endonuclease and Other Polyadenylation Factors Associates with U7 snRNP and Is Recruited to Histone Pre-mRNA for 3 '-End Processing. Molecular and Cellular Biology. 33 (1), 28-37 (2013).
  11. Shimkus, M., Levy, J., Herman, T. A chemically cleavable biotinylated nucleotide: usefulness in the recovery of protein-DNA complexes from avidin affinity columns. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 2593-2597 (1985).
  12. Hirsch, J. D., et al. Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: uses for protein labeling, detection, and isolation. Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).
  13. Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. Photocleavable biotin phosphoramidite for 5'-end-labeling, affinity purification and phosphorylation of synthetic oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 24 (2), 361-366 (1996).
  14. Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. Photocleavable affinity tags for isolation and detection of biomolecules. Methods in Enzymology. 291, 135-154 (1998).
  15. Skrajna, A., Yang, X. C., Dadlez, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. Protein composition of catalytically active U7-dependent processing complexes assembled on histone pre-mRNA containing biotin and a photo-cleavable linker. Nucleic Acids Research. 46 (9), 4752-4770 (2018).
  16. Dominski, Z., Yang, X. C., Kaygun, H., Dadlez, M., Marzluff, W. F. A 3 ' exonuclease that specifically interacts with the 3 ' end of histone mRNA. Molecular Cell. 12 (2), 295-305 (2003).
  17. Yang, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. Characterization of 3'hExo, a 3' exonuclease specifically interacting with the 3' end of histone mRNA. Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30447-30454 (2006).
  18. Tan, D., Marzluff, W. F., Dominski, Z., Tong, L. Structure of histone mRNA stem-loop, human stem-loop binding protein, and 3'hExo ternary complex. Science. 339 (6117), 318-321 (2013).
  19. Mayeda, A., Krainer, A. R. Preparation of HeLa cell nuclear and cytosolic S100 extracts for in vitro splicing. Methods in Molecular Biology. 118, 309-314 (1999).
  20. Dominski, Z., et al. 3' end processing of Drosophila histone pre-mRNAs: Requirement for phosphorylated dSLBP and co-evolution of the histone pre-mRNA processing system. Molecular and Cellular Biology. 22, 6648-6660 (2002).
  21. Dominski, Z., Yan, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F. Differences and similarities between Drosophila and mammalian 3 ' end processing of histone pre-mRNAs. Rna-a Publication of the Rna Society. 11 (12), 1835-1847 (2005).
  22. Jurica, M. S., Licklider, L. J., Gygi, S. R., Grigorieff, N., Moore, M. J. Purification and characterization of native spliceosomes suitable for three-dimensional structural analysis. RNA. 8 (4), 426-439 (2002).
  23. Shi, Y., et al. Molecular architecture of the human pre-mRNA 3' processing complex. Molecular Cell. 33 (3), 365-376 (2009).
  24. Thomas, M. F., L'Etoile, N. D., Ansel, K. M. Eri1: a conserved enzyme at the crossroads of multiple RNA-processing pathways. Trends in Genetics. 30 (7), 298-307 (2014).
  25. Lackey, P. E., Welch, J. D., Marzluff, W. F. TUT7 catalyzes the uridylation of the 3' end for rapid degradation of histone mRNA. RNA. 22 (11), 1673-1688 (2016).

Tags

Biochemie kwestie 143 affiniteit zuivering RNA/eiwitcomplexen biotine streptavidine foto-cleavable linker UV-elutie U7 snRNP 3' eind verwerking
-Voor-stapmodus zuivering van macromoleculaire complexen met behulp van RNA gekoppeld aan biotine en een foto-cleavable Linker
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Skrajna, A., Yang, X. C., Dominski,… More

Skrajna, A., Yang, X. C., Dominski, Z. Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker. J. Vis. Exp. (143), e58697, doi:10.3791/58697 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter