Summary
RNA/protein kompleksleri Botin-streptavidin strateji kullanarak saf ve daha fazla fonksiyonel analiz için uygun olmayan bir biçimde denaturing koşullarda çözüm için eluted. Burada, yerel ve tamamen işlevsel RNA/protein kompleksleri verimli bir fotoğraf yarilabilir bağlayıcı RNA ve nazik bir UV-elüsyon adım kullanır bu stratejinin bir değişiklik açıklar.
Abstract
Uzun yıllar boyunca, biotin ve streptavidin arasında son derece güçlü ve hızlı bir şekilde biçimlendirilmiş etkileşim başarılı bir şekilde biyolojik olarak önemli RNA/protein kompleksleri kısmi saflaştırılması için kullanılmıştır. Ancak, bu strateji daha geniş kullanımı sınırlayan bir büyük dezavantaj muzdarip: biotin/streptavidin etkileşimi sadece denaturing de bu nedenle iyileştirmelerden eluted kompleksleri bütünlüğünü bozmaya koşullar altında bölünebilecek onların sonraki fonksiyonel analiz ve/veya diğer yöntemlerle daha fazla arıtma. Buna ek olarak, eluted örnekleri sık sık streptavidin boncuklar, gümüş boyama ve kütle spektrometresi tarafından arıtılmış kompleksleri analizini komplike nonspecifically ilişkilendirmek arka plan proteinler ile kontamine. Biotin/streptavidin strateji biotin bir fotoğraf yarilabilir bağlayıcı üzerinden bir RNA substrat eklenen ve streptavidin boncuk üzerinde immobilize kompleksleri seçerek çözüm için eluted bir türevi geliştirdiğimiz bu sınırlamalarını aşmak için bir yerli forma göre uzun dalga UV, arka plan proteinlerin üstündeki bırakarak. Daha uzun RNA yüzeylerde iki grup ile tamamlayıcı oligonükleotid tarafından sağlanabilir, ancak daha kısa RNA bağlama yüzeylerde kimyasal olarak biotin ve kovalent bağlı 5' ucuna RNA, fotoğraf yarilabilir bağlayıcı ile sentezlenmiş. UV-elüsyon yöntemi bu iki çeşidini histon pre-mRNA'ların 3' sonunda ayırmak U7 snRNP bağımlı işleme kompleksleri arınma için test edildi ve olumlu diğerine daha önce karşılaştırmak için arıtma yöntemleri geliştirilmiş ispatlayamadılar. UV eluted örnekleri büyük protein kirletici içermez ve fonksiyonel deneyleri ve kütle spektrometresi ile doğrudan analiz için uygun U7 snRNP kolayca saptanabilir miktarda yer. Açıklanan yöntemi kolayca diğer RNA bağlama kompleksleri arıtma için uyarlanmış ve DNA-spesifik proteinler ve makromoleküllerin kompleksleri arındırmak için tek ve çift iplikçikli DNA bağlayıcı siteleri ile birlikte kullanılır.
Introduction
Ökaryotlarda RNA polimeraz II tarafından oluşturulan mRNA öncüleri (pre-mRNA) çekirdek birkaç olgunlaşma olayları sitoplazmada protein sentezi için tamamen işlevsel mRNA şablonlar olmadan önce tabi. Bu olaylar, 3' uç işleme biridir. Pre-mRNA'ların büyük çoğunluğu için 3' uç işleme için Poliadenilasyon birleştiğinde bölünme içerir. Bu iki aşamalı reaksiyon nispeten bol kompleksi tarafından katalizlenir 15'ten fazla protein1/ oluşan. Hayvan çoğaltma bağımlı histon pre-mRNA'ların 3' sonunda göre U7 snRNP, düşük bereket U7 snRNA ~ 60 nukleotid ve birden fazla protein2,3 oluşan karmaşık kilit rol oynadı farklı bir mekanizma tarafından işlenir . U7 snRNA baz çifti ile histon pre-mRNA ve U7 snRNP alt birimleri biri belirli bir sırada tromboksan bölünme tepki, Olgun histon üreten mRNA olmadan bir poli(a) kuyruğu. histon pre-mRNA son işlem 3' de sap-ilmik bağlayıcı Protein (korunmuş bir sap-ilmik bulunan bağlayan SLBP), gerektirdiği bölünme sitesinin ters yönde ve U7 snRNP substrat2,3istihdamı artırır. U7 snRNP tek tek bileşenlerini tanımlayan amaçlayan çalışmalar U7 snRNP hayvan hücrelerinde düşük konsantrasyon ve ayırmak veya kısmi proteolizis kullanarak bir sonucu olarak arıtma sırasında geçmesi için karmaşık eğilimi nedeniyle zorlu olmuştur Hafif Deterjan4,5,6, yüksek tuz yıkar ve/veya birden fazla kromatografik adımları7,8,9
Son zamanlarda, U7-bağımlı işleme makineleri kompozisyonu belirlemek için kısa bir parçası histon pre-mRNA içeren biotin 3' ya veya 5' nükleer bir özü ile inkübe ve birleştirilmiş kompleksleri streptavidin kaplı üzerinde ele geçirildi Özel boncuk5,6,10. Biotin ve streptavidin arasında son derece güçlü etkileşim nedeniyle streptavidin boncuk üzerinde immobilize proteinler koşullar altında denaturing içinde SDS kaynatılarak eluted ve gümüş boyama ve kütle spektrometresi tarafından analiz etti. Bu basit yaklaşım U7 snRNP bileşenleri bir dizi tespit ederken, genellikle çok sayıda potansiyel olarak bazı bileşenleri maskeleme streptavidin boncuk için nonspecifically bağlı arka plan proteinler ile kirlenmiş nispeten ham örnekleri vermiştir işleme makineleri ve gümüş onların algılamayı engelliyor jelleri5,6,10lekeli. Önemlisi, bu yaklaşım aynı zamanda herhangi bir fonksiyonel çalışmalar izole malzeme ve homojenliği için daha fazla onun arıtma ile ek yöntemler tarafından durdurulmasını emretti.
Biotin/streptavidin etkileşimi, etkileşimi de zayıflamaya veya kimyasal olarak yarilabilir spacer kolundan sağlamak için tasarlanmış olan çoğu hemen hemen geri dönüşü olmayan doğa yönelik olarak zaman içinde değişiklikler bir dizi teklif edildi biotin içeren reaktifler11,12. Tüm bu değişiklikler olumsuz önemli ölçüde bütünlüğü veya etkinlik arıtılmış proteinlerin tehlikeye elüsyon adımı sırasında Yöntem ve/veya sık sık gerekli fizyolojik olmayan şartlarda verimliliğini azaltmak oldu.
Burada, içsel sorun gidermek için farklı bir yaklaşım tarif RNA kullanarak biotin/streptavidin stratejisinin yüzeylerde içinde biotin kovalent bağlı 5' üzerinden bir fotoğraf yarilabilir 1-(2-nitrophenyl) son olduğunu etil yan duyarlı uzun dalga UV13,14. Drosophila bu yaklaşımdan sınırlayıcı U7-bağımlı işleme makineleri arıtma için test ettik ve15memeli nükleer ayıklar. Histon pre-mRNA içeren biotin kısa kuluçka nükleer bir özü ile fotoğraf yarilabilir bağlayıcı, birleştirilmiş işlem kompleksleri streptavidin boncuk üzerinde immobilize, iyice yıkanmış ve yavaşça bir yerli çözüm için serbest form tarafından ~ 360 nm UV ışığa maruz kalma. UV-elüsyon çok verimli, hızlı ve doğru sözlü, U7 snRNP özü15kadar az 100 µL boyama gümüş tarafından bileşenlerinden görselleştirmek için yeterli miktarda verimli yöntemdir. UV eluted ücretsiz arka plan proteinlerin ve doğrudan kütle spektrometresi analizi, ek arıtma adımları ve enzimatik deneyleri için uygun bir malzemedir. Yöntemin kısa RNA bağlayıcı siteleri gerektiren diğer RNA/protein kompleksleri arıtma için kabul edilebilir. Biotin ve fotoğraf yarilabilir bağlayıcı da kovalent için tek - ve çift iplikçikli DNA, potansiyel olarak çeşitli DNA/protein kompleksleri arıtma için UV-elüsyon yöntemi uzanan iliştirilebilir.
Kovalent içeren RNA yüzeylerde kimyasal sentez biotin bağlı ve fotoğraf yarilabilir bağlayıcı pahalı ve verimsiz önemli ölçüde uzun serileri için sadece ~ 65 nükleotit, fazla olamaz sıralarıyla pratik oluyor. Bu sorunu çözmek için Ayrıca daha fazla RNA bağlayıcı hedefler için uygun olan alternatif bir yaklaşım geliştirmiştir. Bu yaklaşımda, RNA herhangi bir uzunluk ve nükleotid sırası T7 veya SP6 transkripsiyon tarafından oluşturulan vitro olduğunu ve kısa bir tamamlayıcı oligonükleotid komplementer biotin ve sonunda 5' (trans fotoğraf yarilabilir bağlayıcı içeren yapılandırma). Sonuç çift yönlü daha sonra bireysel proteinler veya makromoleküllerin kompleksleri streptavidin boncuk kovalent bağlı fotoğraf yarilabilir biotin içeren RNA yüzeyler için açıklanan aynı protokol sonrası üzerinde arındırmak için kullanılır (CIS yapılandırma). Bu değişiklik ile fotoğraf yarilabilir biotin, nükleotit, UV-elüsyon yöntemi, bir geniş aralığı RNA/protein arıtma uzanan yüzlerce içeren oluşturulan vitro tutanaklar ile birlikte kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. yüzey hazırlama
Not: RNA yüzeylerde ~ 65 nükleotit kimyasal olarak biotin (B) ve kovalent bağlı RNA 5' ucuna (CIS yapılandırma) (birlikte fotoğraf yarilabilir biotin veya pcB olarak anılacaktır) fotoğraf yarilabilir (pc) bağlayıcı ile sentezlenmiş daha kısa. Önemli ölçüde uzun bağlayıcı siteleri içeren RNA yüzeylerde T7 (veya SP6) transkripsiyon tarafından oluşturulan vitro olmak gerekir ve daha sonra pcB yan vasıl belgili tanımlık son 5' (trans içeren bir kısa tamamlayıcı adaptör oligonükleotid ona komplementer yapılandırma) (Şekil 1).
- Az ~ 65 nükleotit ile oluşan bağlayıcı siteleri kullanmak için ticari üretici (Tablo reçetesi) kimyasal olarak ilgi RNA sentez için pcB ile kovalent RNA 5' sonuna kadar (Şekil 1A ve Şekil 2A) bağlı. İstenen konsantrasyonu elde etmek ve küçük aliquots-80 ° C'de depolamak için steril su dağıtılması
- Bağlayıcı siteleri için önemli ölçüde ~ 65 nükleotit, formu daha uzun bir vitro kısmi bir dubleks RNA faiz ve pcB yan vasıl belgili tanımlık son 5' (Şekil 3A) içeren bir tamamlayıcı adaptör oligonükleotid oluşturulan.
- T7 transkripsiyon Doğrusallaştırılmış plazmid DNA ya da uygun bir PCR şablon RNA ile 3' sonunda ~ 20-nükleotid rasgele dizisi tarafından genişletilmiş ilgi bağlama sitesi oluşturmak için gerçekleştirin.
- Ticari üretici (Tablo reçetesi) kimyasal olarak 3' uzantı T7 tarafından oluşturulan RNA olarak tamamlayıcı ve pcB (Şekil 3A) 5' sonunda içeren bir adaptör oligonükleotid sentezlemek için kullanın.
Not: Sonunda 5' potansiyel steric engel ilişkili karmaşık ve streptavidin boncuklar arasında azaltmak için oligonükleotid iki 18-atom çubukları ve 2-3 sigara-tamamlayıcı nükleotit yerleştirilebilir. Bu da oligonükleotid düzgün bir 2' O-metil grubu çift yönlü gücünü artırmak için ve çeşitli enzimler karşı direnç sağlamak üzere ile olarak tercih edilir. - PcB adaptör oligonükleotid için T7 tarafından oluşturulan RNA tavlamak.
- Tüp bağlama arabellek ile aşağıdaki oluşturma içeren 100 µL Mix 20 pmol RNA'ın ve 1,5 ml adaptör pcB oligonükleotid (1:5 molar oranı) 100 pmol: 75 mM KCl, 15 mM HEPES pH 7.9, % 15 gliserol, 10 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA).
Not: Bir çift yönlü tavlama tepki olarak kullanılan çoğu (hepsi değilse de) pre-mRNA substrat ile birlikte oluşturmak yeterli adaptör oligonükleotid az miktarda kullanılması önemlidir. Bu uygun RNA yüzey vasıl belgili tanımlık son 5' 32P, artan adaptör oligonükleotid kullanımının tutarları ile etiketlenmiş substrat tavlama ile etiketleme tarafından çeşitli koşullar ve tutma izleme arabellek tespit edilemedi streptavidin boncuk boncuk bağlama arabellek ile birkaç yıkamadan sonra radyoaktif işaretimle. - Tüp 5 min için kaynar suda koyun.
- Su oda sıcaklığında soğumasını sağlar.
- Tüp bağlama arabellek ile aşağıdaki oluşturma içeren 100 µL Mix 20 pmol RNA'ın ve 1,5 ml adaptör pcB oligonükleotid (1:5 molar oranı) 100 pmol: 75 mM KCl, 15 mM HEPES pH 7.9, % 15 gliserol, 10 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA).
2. karmaşık derleme
- Bir fare nükleer özü (veya seçtiğiniz başka bir özü) 1 mL 80 mM EDTA pH 8 son konsantrasyonu hulâsa içinde var olan belirsiz metal bağlı enzimler engellemek için 10 mm ile ek.
Not: Bu bağlama arabellek olarak bu kompozisyon aynı özü arabellekte ayarlayarak neden olur (bkz. Adım 1.2.3.1). EDTA histon pre-mRNA'ların işlenmesi vitro etkilemez ama proteinler veya magnezyum bağımlı bir şekilde bir araya protein kompleksleri arındırıcı zararlı olabilir. Bu gibi durumlarda, EDTA kaçınılmalıdır. - 5-10 pmol pcB yan CIS içinde tagged RNA substrat olarak ekleyin (bkz. Adım 1.1) veya trans (bkz. Adım 1.2.3.3) 10 mM EDTA içeren ekstresinin 1 ml.
Not: RNA miktarı bir dizi deneme deney dikkatli bir şekilde değerlendirilmesi gerekir. Belki de ters, nonspesifik RNA proteinler arka plan belirli proteinlerin verim üzerinde herhangi bir etkisi kalmadan artan önemli bir sınırlayıcı kompleks arıtma çok fazla RNA substrat kullanarak. - RNA substrat 5 min buz üzerinde zaman zaman örnek karıştırma için özü ile kuluçkaya.
Not: Hem zaman ve sıcaklık, kuluçka ampirik olarak kurulacak gerekir ve önemli ölçüde, RNA/protein kompleksi özel niteliğine bağlı olarak değişebilir. - Herhangi bir potansiyel precipitates kaldırmak ve dikkatle süpernatant Pelet aktarma kaçınarak toplamak için 10.000 x g, 10 min için önceden soğutulmuş bir microcentrifuge kuluçka karışımı spin.
3. RNA/protein kompleksleri Streptavidin boncuk üzerinde immobilizasyon.
- ~ 100 µL streptavidin özel boncuk süspansiyon, ticari bir tedarikçiden (Tablo reçetesi) 1,5 mL tüp aktarmak ve bağlama arabellek (75 mM KCl, 15 mM HEPES pH 7.9, % 15 gliserol, 10 mM EDTA) ile hacmi artar.
Not: Bu arabellek aynı kompozisyon tavlama karışımı ve karmaşık derleme (adım 2.1) için kullanılan özü bu kadar olmalıdır. - 2-3 dk 25 x g de iplik tarafından tüpün dibinde boncuk toplamak ve süpernatant Aspire edin.
- 2 - 3 kez aynı çamaşır/iplik yordamı yineleyin boncuk bağlama arabellek ile equilibrate için.
Not: Bu adımın sonunda boncuklar Pelet hacmi olmalıdır ~ 30 µL. - Montajı karmaşık (adım 2.4) içeren süpernatant dengelenmiş streptavidin özel boncuk üzerinde yük.
- 4 ° C'de RNA ve ilişkili kompleksleri boncukları üzerinde hareketsiz için 1 h döndürün.
- 2-3 dk 25 x g de iplik tarafından tüpün dibinde boncuk toplamak.
Not: bir salıncak rotor dışarı açısal rotor tüpte tarafına uygun eğilimi varsa boncuk önemli kaybı önlemek için kullanın. - Süpernatant Aspire edin ve boncuk iki kez aynı aralıklarla koşullar kullanarak bağlama arabellek 1 mL ile durulayın.
- Bağlama arabellek 1 mL ekleyin ve örnek 4 ° C'de 1 h döndürün
Not: yüzey üzerinde oluşan karmaşık ayırmak eğilimi varsa bu adımı kısaltılmış. - Spin aşağı 2-3 dk 25 x g, boncuk, arabellek 1 mL ekleyin ve süspansiyon için yeni bir tüp transfer.
- İçin ek bir 1 saat veya daha kısa, karmaşık istikrarlı değilse döndürmek, 2-3 dk 25 x g de spin aşağı ve bağlama arabellek 200 µL 500 µL tüpte boncuk aktarmak.
4. UV-elüsyon.
- Yüksek yoğunluklu UV lambası tam parlaklık ulaşmadan önce 5-10 dk için 365 nm UV ışık yayan açın.
Not: Bu başında UV emisyon radyoterapi maksimum enerji elde etmek için önemlidir. - Sıkıca paketlenmiş buz ile Petri kabına (100 mm x 15 mm) alt doldurmak ve çanak'ın kapağı yığını.
- Kısaca girdap immobilize kompleksi içeren tüp yere yatay olarak buz ve kapak üzerinde önceden ısıtılmış lambalı sağlanması örnek ampul ve yüzey 2-3 cm mesafe içinde yer alır.
Not: mesafe çok büyükse, ek Petri yemekler veya uygun diğer nesneleri ampul için örnek daha yakın getirmek için kullanın. - Toplam 30 dk, sık sık ters çevirme ve vortexing için tek tip süspansiyon maruz UV sağlamak ve aşırı ısınmayı önlemek için tüp ışınlatayım.
Not: ek soğutma sağlamak için UV-elüsyon adım soğuk bir odada yürütülen olabilir. Bir petri aşırı buz erime durumunda taze buz ile geçin. - Spin aşağı 2-3 dk 25 x g de boncuk ve süpernatant toplamak.
- Aynı koşul kullanma süpernatant yeniden spin ve süpernatant toplamak.
Not: alt kısmında kalan boncuk aktarılmasını önlemek için az miktarda süpernatant bırak.
5. numune analizine gümüş boyama tarafından kütle spektrometresi tarafından takip.
- Kullanım SDS/polyacrylamide jel elektroforez UV eluted süpernatant bir kısmını ve UV elüsyon takip boncuk artan malzeme aynı kısmını ayırmak için.
Not: Analiz de bir aliquot örnek UV-elüsyon önce geri boncuk içerebilir. - Ayrılmış proteinlerin boyama seti piyasada bulunan gümüş kullanarak içeren jel leke.
- UV-elüsyon verimliliğini proteinlerin süpernatant UV eluted ve UV-ışınlama takip boncuk kalanların mevcut yoğunluklarda karşılaştırarak değerlendirin.
- Protein bantları ilgi tüketim ve kütle spektrometresi tarafından standart protokolleri10,15kullanarak kimliklerini belirlemek.
6. UV eluted örnek kütle spektrometresi tarafından küresel analizi.
- Doğrudan UV eluted süpernatant bir kısmını arıtılmış malzemenin tüm Proteom tarafsız bir şekilde belirlemek için kütle spektrometresi tarafından analiz.
Not: Bu standart kütle spektrometresi iletişim kuralları oluştur peptidler10,15kimliğini belirlemek için tarafından takip tripsin ile arıtılmış örnekleri çözüm tedavi ile yapılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
UV-elüsyon yöntemi iki kimyasal olarak sentezlenmiş RNA yüzeylerde kovalent bağlı 5' sonunda pcB yan (CIS yapılandırma) ile test edildi: pcB-SL (Şekil 1) ve pcB-dH3/5 m RNA'ların (Şekil 2). 31-nükleotit pcB-SL RNA bir 5-nükleotit tek telli kuyruk tarafından takip bir sap-ilmik yapısını içerir ve kendi sırasını 3' sonuna olgun histon aynıdır mRNA (i.e., bölünme histon pre-mRNA göre U7 snRNP sonra). İki protein memeli sitoplazmik kesir sunmak için bu eşsiz bir bilinen bağlama site sırasıdır: SLBP ve 3' hExo16,17,18. pcB-dH3 / 5m 63-nükleotit parçası Drosophila H3 histon pre-mRNA ve sap-ilmik ek olarak Drosophila U7 snRNP (Şekil 2) bağlar bir dizi içerir.
dH3 Ext (125 nukleotid) T7 transkripsiyon tarafından üretilen ve biotin ve trans içinde fotoğraf yarilabilir ayırıcı ile pcB/22mer için bir kimyasal olarak sentezlenmiş adaptör oligonükleotid ( tavlama tarafından sağlanan daha uzun RNA yüzeylerde örneğidir Trans yapılandırma). pcB/22mer 5' uç adlı iki grup içerir ve 22 2' O-metil-modifed nükleotit (Şekil 3A) oluşur. 19 nükleotit sonunda 3' pcB/22mer(underlined in the sequence in Figure 3A) için dH3 Ext pre-mRNA nükleotid son 19 tamamlayıcı niteliktedir. Bu pre-mRNA daha uzun olmasının yanı sıra önemli ölçüde sentetik pcB-dH3/5 m--dan farklı değildir, aynı içeren iki işlem sinyalleri anahtar: sap-ilmik ve U7-bağlama site.
pcB-SL RNA fare miyelom hücreleri19 ve etkisi elde sitoplazmik kesir ultrasantrifüj (100.000 x g 1 h için) tarafından hazırlanan S100 ekstresinin 1 mL ile inkübe ve UV-elüsyon verimliliğini ilk gümüş boyama tarafından analiz. Proteinler bir dizi streptavidin boncuk UV-elüsyon (Şekil 1B, lane 1) önce tespit edildi. Işınlama uzun dalga UV ile yayımlanan bu proteinler yalnızca bazılarını süpernatant için (Şekil 1B, lane 3), özel olmayan bir arka plan boncuk (Şekil 1B, lane 2) bırakarak, dolayısıyla UV-elüsyon adım önemini vurgulayan. Büyük UV eluted proteinler olarak 3' hExo ve SLBP, tam uzunlukta protein (FL) ve daha kısa bozulma ürünleri (DP) tarafından temsil SLBP ile kütle spektrometresi tarafından tespit edilmiştir. Çeşitli RNA bağlayıcı proteinler (RBPs) tanımlanan diğer proteinlerin küçük miktarlar da seçmeli olarak UV ışınlama (Şekil 1B, lane 3) çözüm için serbest bırakıldı.
form işleme kompleksleri20,21hücreleri pcB-dH3 / 5m pre-mRNA (Şekil 2) veya dH3 Ext pre-mRNA pcB/22mer için (Şekil 3) komplementer Drosophila Kc nükleer ayıklamak 1 mL ile inkübe. Her histon pre-mRNA bağlayan proteinler özgüllüğü daha iyi değerlendirmek için bir negatif kontrol paralel olarak nükleer için iki rakip ayıklamak ekleyerek hazırlanmıştır: SL RNA SLBP tüketiyor ve çiftleri ile temel bir kısa antianlamlı oligonükleotid U7 snRNA ve U7 snRNP etkileşim pre-mRNA kendi sitesinde engeller.
Boncuk (Şekil 2B kalan non-spesifik proteinlerin yoğun bir arka plan ile az sayıda protein seçici bir serbest bırakmak için süpernatant (2B şekil, lane 1), UV-elüsyon adım immobilize pcB-dH3 / 5m pre-mRNA sonuçlandı , lane 3). Bu proteinler etiketli A-ı, U7 snRNP15bileşenleri olarak kütle spektrometresi tarafından tespit edildi. Kısmen de yer alan örneğin 10 kDa geçirir SLBP bozulmuş ve sadece yüksek konsantrasyon SDS/polyacrylamide jelleri görünür olabilir. Bu proteinler U7 snRNP histon pre-mRNA (2B şekil, lane 2) için bağlayıcı blok iki işleme rakip huzurunda tespit edilmedi.
Drosophila U7 snRNP aynı bileşenlerden çözüm için UV ışınlama dH3 Ext pre-mRNA ve pcB/22mer (3B rakam, lane 1) oluşan bir immobilize Dubleks tarafından serbest bırakıldı. Bu örnek ayrıca pcB/22mer oligonükleotid aşan bir dubleks dH3 Ext pre-mRNA ile oluşturmak için kullanılan etkileşim birden çok RNA bağlayıcı proteinler yer. U7 alt birimleri aksine snRNP, bu bulaşıcı proteinler gibi boncuk üzerinde kaldı tüm arka plan proteinlerin kalıcı işleme rakip varlığında (Şekil 3B, şerit 1 ve 2 ve 3 ve 4 şerit karşılaştırın).
UV süpernatant içeren işlem kompleksleri küçük bir kısmını ve UV-süpernatant bir negatif kontrol (iki rakip oligonucleotides huzurunda hazırlanan ve bu nedenle işlem kompleksleri eksik) üzerinden aynı kısmını doğrudan olabilir Kütle spektrometresi eluted proteinlerin önceki bir ayrım olmadan jel elektroforez15tarafından analiz. Bu yöntem ne olursa olsun onların boyut ve bereket tüm eluted proteinler saptamada çok hassastır ve olumsuz örnek ile birlikte özellikle histon pre-3' ucu yapmak için mRNA ile ilişkilendirmek proteinler, tam ve tarafsız listesini sağlar işleme tepki.
Şekil 1: fare sitoplazmik protein saflaştırma bağlı pcB-SL için RNA. Kimyasal Sentez pcB-SL RNA (31-nukleotid) (A) A diyagramı. Biotin (Biot) vasıl belgili tanımlık son 5' bir fotoğraf yarilabilir yan tarafından (pc) uzun dalga UV duyarlı takip (366 nm), iki 18 atom çubukları ve 3' sonunda olgun histon mRNA'ların bulundu korunmuş sap-ilmik yapısını oluşturan 31 nükleotit. (B) pcB-SL RNA S100 sitoplazmik fare miyelom hücreleri ayıklamak ile inkübe. RNA ve ilişkili proteinler streptavidin boncuklar, kapsamlı bir şekilde yıkanmış, eluted ve (lane 3) boyama gümüş tarafından analiz UV üzerinde saf. Proteinler streptavidin boncuk UV elüsyon önce üzerinde immobilize ve UV elüsyon gösterilir sonra şerit 1 ve 2, sırasıyla üstündeki yaptı. Bulunduğu protein boyutu işaretleri (kDa) sola gösterilir.
Resim 2: Drosophila işleme kompleksleri arıtma pcB-dH3/5 m pre-mRNA üzerinde toplandı. (A) bir diyagram kimyasal sentez Drosophila-belirli pcB-dH3/5 m pre-mRNA (63-nukleotid). Biotin (Biot) vasıl belgili tanımlık son 5' fotoğraf yarilabilir yan (pc), iki 18-atom çubukları ve iki sıra öğeleri temel işlem içeren 63 nükleotit tarafından takip etti: sap-ilmik yapı ve U7-bağlama site. İki öğe arasında bulunan büyük bölünme sitesinde çevresinde beş nükleotit bir 2' ile O-metil grubu bölünme göre U7 snRNP karmaşık montaj sırasında engellemek için (çapraz çizgiler) değiştirildi. (B) pcB-dH3/5 m işleme kompleksleri montajı ile bir Drosophila nükleer bir özü inkübe. Negatif denetiminde, SLBP ve U7 snRNP histon pre-mRNA için bağlantısını engellemek için iki işleme rakip nükleer özü içerir. Monte kompleksleri streptavidin boncuk üzerinde immobilize, kapsamlı bir şekilde yıkanmış ve örnek maruz uzun dalga UV eriyik-e doğru serbest bırakmak. UV eluted malzeme (UV-sups) ve UV-elüsyon (UV-boncuklar) takip boncuk aynı kesirler gümüş boyama tarafından analiz edildi. Protein boyutu işaretleri (içinde kDa) ve streptavidin (SA) konumunu sağda gösterilir.
Şekil 3: Drosophila işleme kompleksleri arıtma Ext pre-mRNA transfotoğraf yarilabilir grubuna bağlı dH3 üzerinde toplandı. (A)A diyagramı T7 tarafından oluşturulan dH3 Ext pre-mRNA ve kimyasal olarak sentezlenmiş pcB/22mer oligonükleotid aşağıdaki sıra ile TAV tarafından oluşturulan dH3 Ext dubleks: 5' Biot/pc/18S/18/mAmGmUmAmGmCmUmUmAmCmAmCmUmCmGmAmGmCmCmUmAmC. Oligonükleotid biotin (Biot) 5' sonunda yerleştirilir ve fotoğraf yarilabilir (pc) bağlayıcı tarafından takip edilir. (Yukarıdaki sırayla altı çizili) son 19 nükleotit dH3 Ext pre-mRNA için eklendi 3' uzantısı için tamamlayıcı niteliktedir. 2' (resimde gösterilen değil) O-metil değişiklikler varlığı iki amaca hizmet eder: özü nükleaz karşı oligonükleotid stabilize ve dH3 Ext pre-mRNA ile oluşan çift yönlü gücünü arttırır. (B) dH3 ext çift yönlü bir Drosophila ile Kc nükleer inkübe ayıklamak yokluğunda veya rakip streptavidin boncuklar, kapsamlı bir şekilde yıkanmış ve UV eluted ilişkili proteinler ile birlikte üzerinde immobilize, işleme huzurunda. UV eluted malzeme (UV-sups, şerit 1 ve 2) ve UV-elüsyon (UV-boncuk, şerit 3 ve 4) takip boncuk aynı kesirler gümüş boyama tarafından analiz edildi. İşleme kompleksleri (bu rakipler işleyerek ortadan kalkar) belirli componenst F harfleri ile gösterilir. Büyük non-spesifik RNA proteinler (UV eluted ama iki işleme rakip huzurunda kalıcı olanlar) yıldız işareti ile gösterilir. Bulunduğu protein boyutu işaretleri (kDa) sağda gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada anlatılan yöntem basit ve bir fotoğraf yarilabilir bağlayıcı ekleme yanı sıra ve UV-elüsyon adım biotin ve streptavidin arasında son derece güçlü etkileşim yararlanmak sık kullanılan yöntemlerden farklı değildir. UV-elüsyon adım çok etkilidir, genellikle immobilize RNA % 75'den fazla serbest ve streptavidin boncuklar, boncuklar için özel olarak sigara bağlayan proteinler yüksek bir arka plan geride bırakarak gelen proteinler ilişkili. Bu arka plan ortadan kaldırarak, UV-elüsyon adım gümüş boyama, kütle spektrometresi ve fonksiyonel deneyleri tarafından son derece saf örnekleri doğrudan analiz için uygun verir.
Nispeten az sayıda ve basit adımları içeren, bir sonucu olarak UV-elüsyon Yöntem son derece tekrarlanabilir, U7 snRNP yeterli miktarda gümüş fare kadar az 100 µL boyama için sağlayan ve15 Drosophila nükleer ayıklar. Daha önce RNA/protein kompleksleri, RNA yüzeylerde MS2 bağlama sitesi ile etiketleme ve ilişkili kompleksleri Amiloz boncuk MS2 MBP füzyon yoluyla üzerinde immobilizing gibi arındırmak için kullanılan diğer deneysel stratejiler için cazip bir alternatif yöntemdir protein. MS2 yöntemi, başarılı ise nispeten bol spliceosomes ve kompleksleri22,23, işleme kurallı 3' ucu izole U7 snRNP (yayınlanmamış ZD, içeren kompleksleri işleme yeterli miktarlarda verim başarısız oldu sonuçları), yaklaşık 100 kat daha az olan daha büyük U1 spliceosomal snRNP hayvan hücre yoğunlaştı.
Pek çok açıdan Protokolü'nün çeşitli bireysel araştırma hedeflerinize ulaşmak için ve diğer RNA/protein kompleksleri ile en iyi sonuçları üretmek için değiştirilmesi gerekir. İlk olarak, hulâsa içinde bulunan miktarı ile bu kompleksin karmaşık montaj için kullanılan RNA substrat miktarı eşleştirmek önemlidir. Kompleksleri, U7 snRNP, dahil olmak üzere sınırlandırmak için çok fazla substrat kullanarak sadece non-spesifik RNA bağlanıcı proteinler arasında UV süpernatant arka artan ters olduğunu. İkinci olarak, uzunluğu ve aynı zamanda onun ayrılma potansiyel proteolizis veya aşırı RNA bozulması nedeniyle önlenmesi karmaşık dinç Meclisi tanıtmak için kuluçka sıcaklığını optimize etmek önemlidir.
Zor U7-bağımlı işleme kompleksleri ve enzimatik faaliyetleri yürütmek benzer RNA/protein kompleksleri ile çalışma içinde bir tam olarak monte sonra onlar kataliz sonucu olarak ayırmak ki anahtarıdır. Histon pre-mRNA'ların bölünme hızla önemli ölçüde saf işleme kompleksleri verimini azaltarak bile düşük ısılarda, oluşur. Bu istenmeyen etkiyi önlemek için büyük bölünme site ve pcB-dH3 / 5m pre-mRNA dört yakındaki nükleotit 2' O-metil gruplarının (5 m)10ile kimyasal sentez sırasında değiştirildi. Bu pre-mRNA neredeyse tamamen bölünme göre U7 snRNP dayanıklıdır ve 60 dk için oda sıcaklığında bir nükleer özü ile tespit karmaşık kesintiye neden olmadan inkübe. Bu değişiklikler ext pcB/22mer için komplementer T7 tarafından oluşturulan dH3 yoksun ve nükleer bir özü ile onun kuluçka kataliz sınırlamak için buz 5 dakika veya daha kısa gerçekleştirilir. pcB-SL RNA içeren olgun 3' histon sonu mRNA ve sitoplazmik özler herhangi bir ek işleme tabi değil. Magnezyum-bağımlı 3' - 5' eksonükleaz aktivitesi olan 3' hExo, 2-3 nükleotid faaliyete EDTA16varlığı ile inhibe vitro ama tek telli kuyruk vivo içinde24,25 temizleyebildiği kötü. Genellikle on Ice kısa kuluçka RNA SLBP ve 3' hExo ile üçlü bir kompleks oluştururlar yeterli olsa da sonuç olarak, pcB-SL RNA herhangi bir yan etkisi olmadan uzun bir süre için oda sıcaklığında sitoplazmik özleri içinde inkübe.
UV-elüsyon yöntemi alternatif iki çeşidini, biotin ve CIS (5' ucuna RNA kovalent bağlı) fotoğraf yarilabilir bağlayıcı RNA yüzeylerde kullanarak genel olarak basit ve nispeten saf örnekleri verir. Bu yaklaşımın önemli bir sınırlama iki grup kovalent ~ 65 nükleotit geçmeyen RNA yüzeylerde bağlı olabilir olduğunu. Daha uzun RNA bağlayıcı hedefler pcB yan içinde trans bir adaptör oligonükleotid yoluyla eklenebilir. Ancak, bu yaklaşım adaptör oligonükleotid aşırı bağlamak eğilimi non-spesifik proteinlerin yüksek arka plan üretebilir. Bu nedenle oligonükleotid deneyde kullanılan tüm pre-mRNA substrat bağlamak yeterli en az bir molar fazlalığı kullanmak önemlidir.
Adaptör oligonucleotides sıra, uzunluk ve kimyasal doğası belirsiz RNA proteinler ile etkileşim için yeteneklerini azaltırken RNA yüzeylerde tamamlayıcı serilerinde çiftiyle üsse yeteneklerini geliştirmek için çeşitli olabilir. Son olarak, daha uzun pre-mRNA yüzeylerde adaptör oligonucleotides ile çift yönlü karmaşık oluşumu için kullanılan önce streptavidin boncuk üzerinde immobilize. Bu ön seçim yaklaşımın bir avantajı bu oligonükleotid tavlamak için başarısız örnek RNA molekülleri üzerinden ortadan kaldırır olduğunu. Bu moleküller özü bir kompleks içine birleştirmek için normal bir yetenek korur ancak streptavidin boncuklar, kısmen arıtma verimini azaltarak bağlamak mümkün değildir.
Tek iplikçikli RNA yüzeyler üzerinde monte kompleksleri arındırıcı ek olarak, benzer bir şekilde UV-elüsyon Yöntem proteinler veya tek ve çift iplikçikli DNA dizilere protein kompleksleri arındırmak için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa yoktur
Acknowledgments
Bizim iş için bizim meslektaşları ve işbirlikçileri katkılarından dolayı teşekkür ederiz. Bu çalışmada NIH tarafından desteklenen GM 29832 verin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Streptavidin-Agarose | Sigma | S1638-5ML | |
| High-intensity, long-wave UV lamp | Cole-Parmer | UX-97600-00 | |
| Replacement bulb | Cole-Parmer | UX-97600-19 | 100 Watts Mercury H44GS-100M bulb emitting 366 nm UV light (Sylvania) |
| RNAs and oligonucleotides containing biotin and photo-cleavable linker in cis | Dharmacon (Lafayette, CO) or Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) | Requst a quote in Dharmacon | |
| Beckman GH 3.8 swing bucket rotor | Beckman | ||
| RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (T7 polymerase) | Promega | P1300 | |
| RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (SP6 polymerase) | Promega | P1280 | |
| Pierce Silver Stain Kit | ThermoFisher Scientific | 24612 |
References
- Mandel, C. R., Bai, Y., Tong, L.
- Dominski, Z., Carpousis, A. J., Clouet-d'Orval, B. Emergence of the beta-CASP ribonucleases: highly conserved and ubiquitous metallo-enzymes involved in messenger RNA maturation and degradation. Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (6-7), 532-551 (2013).
- Dominski, Z., Marzluff, W. F. Formation of the 3' end of histone mRNA: getting closer to the end. Gene. 396 (2), 373-390 (2007).
- Yang, X. C., Torres, M. P., Marzluff, W. F., Dominski, Z. Three Proteins of the U7-Specific Sm Ring Function as the Molecular Ruler To Determine the Site of 3 '-End Processing in Mammalian Histone Pre-mRNA. Molecular and Cellular Biology. 29 (15), 4045-4056 (2009).
- Sabath, I., et al. 3 '-End processing of histone pre-mRNAs in Drosophila: U7 snRNP is associated with FLASH and polyadenylation factors. RNA. 19 (12), 1726-1744 (2013).
- Skrajna, A., et al. U7 snRNP is recruited to histone pre-mRNA in a FLASH-dependent manner by two separate regions of the stem-loop binding protein. RNA. 23 (6), 938-951 (2017).
- Smith, H. O., et al. Two-step affinity purification of U7 small nuclear ribonucleoprotein particles using complementary biotinylated 2'- O-methyl oligoribonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 88, 9784-9788 (1991).
- Pillai, R. S., et al. Unique Sm core structure of U7 snRNPs: assembly by a specialized SMN complex and the role of a new component, Lsm11, in histone RNA processing. Genes and Development. 17 (18), 2321-2333 (2003).
- Pillai, R. S., Will, C. L., Luhrmann, R., Schumperli, D., Muller, B. Purified U7 snRNPs lack the Sm proteins D1 and D2 but contain Lsm10, a new 14 kDa Sm D1-like protein. EMBO Journal. 20 (19), 5470-5479 (2001).
- Yang, X. C., et al. A Complex Containing the CPSF73 Endonuclease and Other Polyadenylation Factors Associates with U7 snRNP and Is Recruited to Histone Pre-mRNA for 3 '-End Processing. Molecular and Cellular Biology. 33 (1), 28-37 (2013).
- Shimkus, M., Levy, J., Herman, T. A chemically cleavable biotinylated nucleotide: usefulness in the recovery of protein-DNA complexes from avidin affinity columns. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 2593-2597 (1985).
- Hirsch, J. D., et al. Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: uses for protein labeling, detection, and isolation. Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).
- Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. Photocleavable biotin phosphoramidite for 5'-end-labeling, affinity purification and phosphorylation of synthetic oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 24 (2), 361-366 (1996).
- Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. Photocleavable affinity tags for isolation and detection of biomolecules. Methods in Enzymology. 291, 135-154 (1998).
- Skrajna, A., Yang, X. C., Dadlez, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. Protein composition of catalytically active U7-dependent processing complexes assembled on histone pre-mRNA containing biotin and a photo-cleavable linker. Nucleic Acids Research. 46 (9), 4752-4770 (2018).
- Dominski, Z., Yang, X. C., Kaygun, H., Dadlez, M., Marzluff, W. F. A 3 ' exonuclease that specifically interacts with the 3 ' end of histone mRNA. Molecular Cell. 12 (2), 295-305 (2003).
- Yang, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. Characterization of 3'hExo, a 3' exonuclease specifically interacting with the 3' end of histone mRNA. Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30447-30454 (2006).
- Tan, D., Marzluff, W. F., Dominski, Z., Tong, L. Structure of histone mRNA stem-loop, human stem-loop binding protein, and 3'hExo ternary complex. Science. 339 (6117), 318-321 (2013).
- Mayeda, A., Krainer, A. R. Preparation of HeLa cell nuclear and cytosolic S100 extracts for in vitro splicing. Methods in Molecular Biology. 118, 309-314 (1999).
- Dominski, Z., et al. 3' end processing of Drosophila histone pre-mRNAs: Requirement for phosphorylated dSLBP and co-evolution of the histone pre-mRNA processing system. Molecular and Cellular Biology. 22, 6648-6660 (2002).
- Dominski, Z., Yan, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F. Differences and similarities between Drosophila and mammalian 3 ' end processing of histone pre-mRNAs. Rna-a Publication of the Rna Society. 11 (12), 1835-1847 (2005).
- Jurica, M. S., Licklider, L. J., Gygi, S. R., Grigorieff, N., Moore, M. J. Purification and characterization of native spliceosomes suitable for three-dimensional structural analysis. RNA. 8 (4), 426-439 (2002).
- Shi, Y., et al. Molecular architecture of the human pre-mRNA 3' processing complex. Molecular Cell. 33 (3), 365-376 (2009).
- Thomas, M. F., L'Etoile, N. D., Ansel, K. M. Eri1: a conserved enzyme at the crossroads of multiple RNA-processing pathways. Trends in Genetics. 30 (7), 298-307 (2014).
- Lackey, P. E., Welch, J. D., Marzluff, W. F. TUT7 catalyzes the uridylation of the 3' end for rapid degradation of histone mRNA. RNA. 22 (11), 1673-1688 (2016).
