Summary
遺伝子機能の研究に興味の遺伝子を過剰発現安定細胞株を確立することは、株それらを介してレトロ ウイルス感染後安定したトランスフェクション ピッキング単一クローンによって行うことができます。この方法で生成される DR3 HT29 細胞が死受容体 3 (DR3) antimitotics によるアポトーシス誘導に貢献機構を解明を紹介します。
Abstract
興味の遺伝子の機能を勉強しては、ノックダウン細胞発現の減少や過剰発現細胞で発現を増加などの表現のレベルを操作することによって実現できます。過渡と安定したトランスフェクションは、外因性の遺伝子発現のため頻繁に使用される 2 つの方法です。トランスフェクションは、安定したトランスフェクションにより宿主細胞のゲノムに統合される外因性の遺伝子、継続的に表現されるに対しにのみ短期的な表現に便利です。その結果、安定したトランスフェクションは長期の遺伝的調節に研究のため通常用いられます。ここでタグ死受容体 3 DR3 関数を探索する (DR3) を過剰発現安定したセルラインを生成するための単純なプロトコルについて述べる。均質性と安定したセルラインの純度を維持するためにレトロ ウイルス感染後単一クローンを選んだ。このプロトコルを使用して生成された安定したセルラインはこうして HT29 細胞におけるアポトーシス応答を再構成すること、抗がん剤の薬剤に敏感な DR3 欠損 HT29 細胞をレンダリングします。また、DR3 にフラグの札良い DR3 抗体の可用性の損失を補償し、体のエージェントは、アポトーシスを誘導する分子機構の生化学的研究を促進します。
Introduction
異種遺伝子発現されている興味のある遺伝子の機能を勉強する.2 つの方法、過渡と安定したトランスフェクション海抜ホスト セル1,2に DNA または RNA のセグメントを挿入する細胞および分子生物学で使用されます。一過性トランスフェクション DNA または RNA 渡すことができない娘細胞、遺伝子は短い期間だけ保持ことができますように。その一方で、固定して transfected セルで外因性の遺伝子は細胞株での発現を維持ホスト細胞のゲノムに統合されます。したがって、安定したトランスフェクションは、長期の遺伝的調節に関する研究の通常予約されている方法です。生体内でのマウス ・ モデルに異種移植片の研究3として、安定したセルラインを移植もことができます。安定したトランスフェクションは、2 つのカテゴリに分けることができます: ウイルスや nonviral。Nonviral 遺伝子導入と比較して、ウイルス感染は、幅広い高効率4,5,6,7で人間の細胞に遺伝子を転送できます。さらに、単一のクローンから安定したセルラインは均質性とクローンの純度の利点を提供しています。
抑制されない細胞の成長と分裂は、がんの最も顕著な特徴です。臨床設定では、体のエージェントは、腫瘍8の多くの種類のための主要な治療をします。しかし、体のエージェントのいくつかの重要な制限は無視できません。まず、これらの化学療法は望ましくないがん細胞とともに正常な細胞も殺すことができるし、したがって、ことが、重篤な副作用8で。第二に、医学: 抗チューブリンの薬はチューブリンのいたるところにある細胞骨格タンパク質9,10としてさまざまな異なったティッシュの表現にもかかわらず、腫瘍のすべてのタイプに対して有効ではありません。医学: 抗チューブリン エージェントに対して有望な効果を示したが理由は不明である卵巣、肺、血液癌臨床治療ではなく、腎臓、大腸、または膵癌11。最後に、同じ種類の腫瘍でも患者に応答できます、antimitotics 異なる予測不可能な方法で。キー エフェクター分子の臨床12に見られる多様な成果の結果、体のエージェントに別の患者の感受性に影響を与える可能性があります。したがって、治療13を最適化するために考慮患者を抗がん剤治療の潜在的な差動感度を撮影する必要があります。
高スループット全体ゲノム siRNA ライブラリ画面を示した DR3 ノックダウンが敏感な細胞における化学療法誘発アポトーシス14DR3 の役割を測定、抗がん剤の薬剤に対して抵抗力をレンダリング可能性があります。腫瘍壊死因子受容体 (TNFR) スーパーファミリーのメンバーとして様々 なシステム15,16,17,18細胞のアポトーシスを仲介する DR3 を報告されています。したがって、我々 は、抗がん剤の薬剤はアポトーシスを誘導する分子機構を研究する DR3 を過剰発現する安定したセルラインを確立に着手します。DR3 の過剰発現を研究するための適切な細胞モデルは、ひと大腸癌細胞株 HT29 DR3 欠損をすることが分かったによって提供することができます。さらに、クリニックで大腸癌は敏感体薬19。
この記事ではレトロ ウイルス感染による HT29 DR3 安定したセルラインを生成を可能にする手法について述べる.さらに西部にしみが付くことを使用してこれらのセルの DR3 式を検証する方法、およびセル実行可能性の試金と形態学的観察を用いた体剤への感受性を評価する方法を示します。セルは単一のクローンから増幅され、したがって、均質な遺伝的背景の利点があります。また、DR3 にフラグ タグを生化学的アプローチによる顕微鏡と遺伝子発現および蛋白質の相互作用の解析から細胞 DR3 の可視化のため使用。さらに、セルは異種マウス体内antimitotics14の応答で腫瘍の進行をさらに分析できます。
DR3 HT29 細胞システムは、どのように antimitotics を殺す癌細胞14の分子機構を研究するための効果的なツールを提供しました。過剰発現とノックダウン細胞は遺伝子の機能を研究するための一般的なツールであるのでこのプロトコル興味やその他の細胞の他の遺伝子にも容易に適合でき、したがって、広く使用されたアプローチと化した。
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Protocol
ここで説明したすべてのマウス実験が承認され、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) 清華大学に従って実施されますのでご注意ください。
1. DR3 過剰発現細胞株の生成
- 3 DR3 cDNA を挿入することによって DR3 式 (pMXs IRES DR3 フラグ) のプラスミドを構築 retroviral ベクトルに対するブラストサイジン pMXs IRES 病原/XhoI の制限のサイトでに C 末端のフラグ x。
- ダルベッコ変法イーグル培地 (DMEM) 4 mL で 60 mm 料理のぷらっと A 細胞を成長します。とき、電池が 80-90% の合流点に達する、次の日は transfect 2 μ g のプラスミド pMXs の IRES-DR3-フラグと細胞のトランスフェクション試薬を使用して (材料の表を参照してください) 製造元のマニュアル20によると。
- 72 時間後の上清を収集、0.45 μ m の滅菌フィルターを使用してメディアを濾液および 4 ° C で暗闇の中でウイルスの懸濁液を保つ
- 60 mm ディッシュに DMEM HT29 細胞を成長し、5% CO2と 37 ° C でセルを孵化させなさい。
- とき、電池が 30-50% の合流点に達する、次の日は、2 ml の 8 μ g ウイルスの懸濁液の 1 ミリリットルあたり 1, 5-ジメチル-1, 5-diazaundecamethylene polymethobromide の存在下でウイルスの懸濁液の細胞に感染します。37 ° C で培養 4-6 時間後ウイルスの懸濁液を吸引新鮮な DMEM の 4 つの mL を追加し、インキュベーターに皿を返します。
- 料理 24 h 感染後からメディアを破棄し、2 ml の prewarmed PBS のセルを慎重に洗います。セルに 1 mL のトリプシン-EDTA を追加し、3 分の 37 ° C で孵化させなさい。
- 細胞の大部分をデタッチ 10 倍の倍率での顕微鏡下で観察し、10% 牛胎児血清 (FBS) を含む完全な DMEM の 2 ml trypsinization を停止します。15 mL チューブに細胞懸濁液を収集し、室温 (RT) で 5 分間 200 x gで細胞を遠心分離します。
- 上澄みを除去し、DMEM の 10 mL の細胞ペレットを再懸濁します。上下に軽くピペッティングでよく混ぜます。300、100、30 の要因によって細胞を希釈します。種子 20 ml 1 μ G/ml ブラストサイジンを含む DMEM の 150 mm 料理の細胞。1 〜 2 週間は 5% CO2と 37 ° C の定温器で孵化させなさい。
- この期間中に 10 倍の倍率で倒立顕微鏡で毎日コロニーを観察します。コロニー径が 1-2 mm 程度は、皿の底の十分に独立したコロニーをマークします。
- 培地を吸引し、洗浄 3 ml に予め温めておいた PBS のセルします。60 mm ディッシュにトリプシン-EDTA の 2 ミリリットルを追加します。オートクレーブ滅菌のクローニング シリンダーをピックアップする滅菌鉗子を使用し、60 mm ディッシュに配置します。トリプシン-EDTA を含んでいるシリンダーをピックアップし、マークされたコロニーの上に静かに置いてください。すべてのクローニング シリンダーのみ 1 つのコロニーが含まれています、近くのコロニーとの汚染を避けるためであることを確認します。
- 3 分間料理をインキュベーターに返します。
- 3 分後に彼らが切断したかどうかを参照してくださいに 10 倍の倍率の顕微鏡の下のセルを確認します。セルを持って持ち上げ、トリプシンを不活化する各シリンダーに培地の 70 μ L を追加します。200 μ L ピペットで細胞懸濁液を優しく混ぜます。この過程で、シリンダーを移動することを確認してください。
- 各植民地から 24 ウェル ウェルあたり DMEM の 1 mL を含む 2 つに細胞懸濁液を転送します。プレート A に 30 μ L/ウェルの細胞懸濁液を追加してインキュベーターに入れて対応する 70 μ L 正しくプレート プレート * ラベルの井戸します。
2. DR3 過剰発現細胞株の検証
- プレート B のセルは 90% の合流点で、メディアを取り出し、慎重に 1 ml の PBS のセルを洗います。完全に PBS を削除し、SDS ページの読み込みバッファー x 1 の 50 μ L を持つ細胞を溶解します。1.5 mL 遠心チューブに 24 ウェル プレートからセル lysates を転送し、100 ° C で 10 分間のサンプルを沸騰
- 15 分間 80 V の定電圧で、その後、1 時間 120 V で 10% ナトリウム dodecyl 硫酸塩 (SDS) ゲルのサンプルを実行します。
- 400 の一定電流でウェットの譲渡によりポリフッ化ビニリデン (PVDF) 膜にタンパク質を譲渡 2 h mA。
- (図 1) のネガティブ コントロールとして野生型 HT29 細胞を用いた反フラグ抗体で異なるクローンの DR3 式をテストします。TBST で解散は 5,000 で 5% 無脂肪牛乳の要因によって一次抗体を希釈 (0.1% を含む含有トリス緩衝生理食塩水トゥイーン 20)。4 ° C でフラグ抗体を用いた膜を一晩インキュベートします。
- TBST 洗浄時間 15 分の合計の 5 分ごとした更新で 200 rpm で脱色シェーカーでそれを揺することによって tbst 膜を洗浄します。
- 5-6 時間のための 4 ° C で 10,000 で 5% 乳脂肪の倍希釈し抗マウス抗体と細胞膜を孵化させなさい。
- 2.5 のステップで記述として再び膜を洗浄します。
- 西洋化学発光 (ECL) 基板を用いた旗式を検出し、ゲルのドキュメンテーション システムで膜をイメージ (材料の表を参照してください)。肯定的なクローンとして DR3 を表現するクローンを識別します。
- 6 ウェル プレートにプレート B の肯定的なクローンに対応、10 cm 皿のそれらの成長まで、細胞を増幅し続けるプレート A のクローンを転送します。肯定的なクローンから成長している細胞の凍結する在庫を行い、将来の使用に備えて-80 ° C で保存します。
3 体のエージェントに対する細胞のアポトーシス応答の評価
注: Diazonamide は、ミラー他のチューブリン不安定のエージェント21がん細胞の増殖を阻害する、顕著な活性を有する海洋の天然物の新しいクラスです。ただし、処置のモードは不明のまま。体のエージェントに細胞の細胞応答をテストするためパクリタ キセルと diazonamide は、野生型 HT29 細胞と DR3 HT29 細胞を治療するために使用されました。薬いたジメチルスルホキシド (DMSO) 10 mM 在庫にするに溶解し、その後、さらに異なる濃度に希釈: 30 nM、100 nM、300 nM、1,000 nM、3,000 nM、および 10,000 DMSO の nM。
- 新鮮で HT29 DR3 HT29 細胞を収集します。セルの自動カウンターを使用して細胞密度を測定します。その後、ウェルあたり 3 x 10 の4セルの密度で DMEM で 12 ウェル プレートでセルをシードします。次の日は、10 nM diazonamide を追加し、ネガティブ コントロールとして 1 %dmso を使用します。治療の 48 時間後 10 倍の倍率 (図 2) で顕微鏡下で細胞を画像します。
- シード HT29 と HT29 DR3 ウェルあたり 3 × 103セルの密度で DMEM の 96 ウェル プレートで細胞し、37 ° C で一晩成長できるようにビンブラスチン投与量 diazonamide 濃度 0.3 を追加 nM、1 nM、3 nM、10 nM、30 nM と 100 nM も、ネガティブ コントロールとして 1 %dmso を使用して。
- 後治療の 48 時間は、製造元のマニュアルに従って発光を利用した細胞の生存率測定キットを使用してセル実行可能性を測定します。
- インキュベーターから 96 ウェル プレートを取り出して、約 30 分間室温で放置します。その後、各ウェルにアッセイ用試薬を 50 μ l 添加常温 2 分、細胞を溶解するプレートを振るし、別 10 分を決定する発光マイクロ プレート リーダー (図 3) を使用して各ウェルの RT でプレートをインキュベートを追加します。
注: セル実行可能性にもそれぞれの相対発光強度を表しますをコントロールも 1 %dmso 処理します。
- インキュベーターから 96 ウェル プレートを取り出して、約 30 分間室温で放置します。その後、各ウェルにアッセイ用試薬を 50 μ l 添加常温 2 分、細胞を溶解するプレートを振るし、別 10 分を決定する発光マイクロ プレート リーダー (図 3) を使用して各ウェルの RT でプレートをインキュベートを追加します。
- のため、生体内研究14生後 6 週間雌性 balb/c ヌードマウスを使用します。
注: マウスは、特定の病原体フリーの条件の下で維持されました。- HT29 DR3 HT29 細胞を trypsinize、そして、37 ° C で prewarmed DMEM を使用して trypsinization を停止50 mL のチューブに細胞懸濁液を収集し、破棄した上清で 10 分の 1,000 rpm で細胞を遠心し、FBS なし DMEM 培地で細胞ペレットを再懸濁します。もう一度セルを遠心し、PBS で細胞ペレットを再懸濁します。
- セルの自動カウンターを使用してセルをカウントし、希釈濃度 2.5 x 10 のセル7セル/mL の PBS を使用します。各マウス (5 x 106セル/マウス)22の右のフランクで HT29 または DR3 HT29 細胞懸濁液 200 μ L の皮下注射を通して腫瘍を生成します。
- 移植後キャリパーごとの 2 d を使用して腫瘍体積 (テレビ) を測定します。計算する次の数式を使用してテレビ: テレビ = 1/2 L x 幅 x 幅 (ここで、w: 腫瘍幅、l: 腫瘍長)。平均腫瘍体積が約 100 mm3になったら、マウスをランダム化コントロールまたは扱われたグループのどちらかに (n = グループあたり 6) し、治療を開始します。
- とおりパクリタ キセル溶液を準備します。まず、総量の 5% のエタノールで完全にパクリタ キセルを溶解し、その後、polyoxyl 35 の最終巻の 5% が水素化ヒマシ油を追加します。最後に、D5W のボリュームの残りの 90% を構成する (5% ブドウ糖水で pH 7.4)。
- パクリタ キセル 3 の 20 の mg/kg の用量で静脈内の注入 1 週間 2 週間あたりの倍。週14x 腫瘍量と体重 3 を測定します。実験を終了し、体重減少 20% または腫瘍体積約 2,000 mm3に達した場合、動物を安楽死させます。
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Representative Results
DR3 を安定して発現する HT29 細胞の特性は図 1に示します。陰性対照となる野生型細胞が外因性の遺伝子発現を示さない間、クローンは DR3 のさまざまなレベルを表現します。ここでは 5 つの複製を示す中でクローン 1 と 5 は DR3 の最高レベルを表現します。1、5 次の実験のためのクローンを選びました。
Diazonamide の投与後 HT29 DR3 と HT29 細胞の形態は、図 2に 10 倍の倍率で倒立顕微鏡で観察されました。10 nM diazonamide 投与 48 h 後、HT29 DR3 は壊れた細胞膜と細胞の残骸 (底板) の明白なアポトーシスを示した。しかし、HT29 のみラウンド アップ細胞の形 (上部パネル) を出展そのままなセルの細胞分裂停止を示した。
HT29 DR3 HT29 細胞 diazonamide による治療は図 3に示す後の細胞の生存率。3 nM diazonamide 投与の 48 時間後 HT29 DR3 に発見された細胞死の 80% 以上は細胞 (赤いカーブ) です。ただし、親 HT29 細胞分裂停止 (青い曲線) の形で diazonamide にのみ若干の応答を示した。したがって、DR3 の過剰発現はこれらの細胞における diazonamide 誘導性アポトーシス経路を再構成しました。
生体内で腫瘍の異種移植実験の結果は、以前紙14に示されています。HT29 の HT29 DR3 腫瘍移植の成功率は 100% です。異種移植腫瘍進行同様に車両制御;ただし、HT29 DR3 異種 HT29 異種 20 mg/kg の用量でパクリタ キセルで処理するよりも速く腫瘍回帰が表示されます。腫瘍生体内でさらに確認、DR3 の異所性発現は antimitotics に敏感な腫瘍細胞をレンダリング HT29 よりパクリタ キセルに HT29 DR3 腫瘍の良い反応を観察します。
図 1: 異なるクローンの DR3 発現解析します。DR3 の表現のレベルは、反フラグ (上部パネル) と抗 β-アクチン抗体 (底面のパネル、内部統制として) を用いてウェスタンブロッティングによって分析されました。親 HT29 細胞は、陰性対照として使用されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: Diazonamide 投与後 HT29 DR3 HT29 細胞の形態解析します。HT29 (上部パネル) HT29 DR3 (底板) は 48 h の 10 nM diazonamide と扱われました。スケールバー = 100 μ m。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: HT29 DR3 と HT29 細胞 diazonamide の用量反応曲線。Diazonamide のシリアルの濃度と治療の 48 時間後細胞生存率を測定しました。エラー バー実験トリプリケートの標準偏差 (SD) を =。DA = diazonamide。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
本稿では、HT29 DR3 安定したセルラインを生成する手法について述べる。DR3 HT29 細胞は、DR3 が体のエージェントによって誘導されるアポトーシスに貢献する分子機構を研究するためのモデルを提供します。このアプローチは、汎用性と再現性です。プロシージャの成功を確保するためプロトコルの 4 つのステップを考慮する必要があります。まず、高を生成するために十分なウイルスの力価はお勧めされる 80%-90% 合流、ぷらっと A 細胞 DNA トランスフェクションを実行します。第二に、光から 2 週間以上覆われているためウイルスの懸濁液を 4 ° C で保存する必要があります。第三に、150 mm 料理に感染した細胞を分割するときに、良く分離コロニーを取得するシリアルの希薄が感染効率が異なるセルに変化するよう勧めします。最後に、単一コロニーを拾うときべきである周囲の植民地すべて混入。
このプロトコルはほとんどの細胞株でうまく動作しますが、単一コロニーを形作りがちではセルの困難な可能性があります。この場合において、蛍光活性化セル (FACS) を並べ替えと組み合わせて抗生物質などの他の細胞選別技術必要になります。
安定したトランスフェクションには、ウイルス ・非ウイルスベクターのメソッドが含まれます。このプロトコルでは低いが、DR3、穿孔などの物理的な方法が細胞23と化学メソッド、脂質を介した DNA トランスフェクションなどに対して毒性が強いことを推論を過剰発現細胞を生成するレトロ ウイルス感染を使用多くの効率のセルのタイプで、潜在的なオフターゲット効果24,25,26。
異所性発現は、遺伝子の機能を解明する直接および効率的な方法です。したがって、このプロトコルは、他のターゲット分子を研究に使用できます。さらに、遺伝子の打撃も機能性の研究で重要です、可能なプロトコルが遺伝子ノックダウン システムに適応することができます。他遺伝子ノックイン、ノックアウトにアプローチに比べて、CRISPR-Cas9 などここで提示されたプロトコルを適用する簡単かつ手頃な価格のすべての研究所。
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Disclosures
著者申告するものがあります。
Acknowledgments
この作品は、(ギニアビサウ) に 53110000117 と清華大学から (X.W.) に 043222019 の補助金によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | C11965500BT | Supplemented with 10% FBS and 1% Penicilin/Streptomycin |
| Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7571 | |
| Paclitaxel | Selleck | S1150 | |
| pMXs-IRES-Blasicidin | Cell Biolabs | RTV-016 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| PBS | Invitrogen | C14190500BT | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Invitrogen | 25200056 | |
| 1,5-Dimethyl-1,5-diazaundecamethylene polymethobromide | Santa Cruz | sc-134220 | |
| Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| Anti-mouse secondary antibody | Jackson ImmumoResearch | 115-035-166 | |
| anti-Flag antibody | Sigma | F-3165 | |
| HT29 cell line | ATCC | HTB-38 | |
| plat-A cell line | Cell Biolabs | RV-102 | |
| PVDF Immobilon-P | Millipore | IPVH00010 | |
| Cloning Cylinder | Sigma | C1059 | |
| Cell Imaging Multi-Mode Reader | Biotek | BTCYT3MV | |
| CKX53 Inverted Microscope | Olympus | CKX53 | |
| 12-well cell culture plates | Nest | 712001 | |
| 60 mm cell culture plates | Nest | 705001 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Nest | 601052 | |
| 0.22 μm steril filter | Millipore | SLGP033RB | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5810000327 | |
| 96 Well White Polystyrene Microplate | Corning | 3903 | |
| Western ECL Substrate | BIO-RAD | 1705060 | |
| ImageQuant LAS 4000 | GE Healthcare | ImageQuant LAS 4000 | |
| Decoloring Shaker | HINOTECH | TS-2000A | |
| Blasticidin | InvivoGen | ant-bl-1 | |
| Automated cell counter | BIO-RAD | TC 20 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985070 |
References
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