Summary
Microglia, 두뇌의 거주 면역 세포 그들의 환경의 수정에 형태학 변화 신속 하 게 응답. 이 프로토콜 2 광자 현미경을 사용 하 여 쥐의 급성 뇌 조각에서 세로토닌 또는 ATP microglial 프로세스의 매력을 공부 하는 방법을 설명 합니다.
Abstract
Microglial 세포는 상주 타고 난 면역 세포는 뇌의 지속적으로 그들의 긴 프로세스와 그들의 환경을 스캔 하 고, 항상성 장애 시 빠른 형태학 상 변화를 받 다. 예를 들어 레이저 병 변 몇 분에 상해의 사이트를 향해 "방향 운동" 라고도 하는 microglial 프로세스의 중심된 성장을 유도 합니다. 로컬 ATP 또는 세로토닌 (5-hydroxytryptamine [5-HT])를 제공 하 여 비슷한 효과 얻을 수 있습니다. 이 문서에서는, 우리는 프로토콜 ATP 또는 5-젊은 성인 쥐의 급성 뇌 조각에 HT의 로컬 응용 프로그램으로 microglial 프로세스의 방향 성장을 유도 하 고 시간이 지남에 따라이 매력 multiphoton 현미경 검사 법에 의해 이미지를 설명 합니다. 무료 및 오픈 소스 이미지 분석 소프트웨어와 정량화의 간단한 방법을 제안 했다. 여전히 급성 뇌 조각 특징 도전은 감소 하는 세포 생리 상태에 남아 나이 제한 된 시간 이다. 이 프로토콜, 따라서, 특히 성인 쥐에서 조각에에서 몇 시간 동안 microglial 세포의 생존 능력을 최적화 겨냥 한 몇 가지 기술적인 개선 (중간, 공기-액체 인터페이스 챔버, 이중 관류와 챔버 이미징) 하이라이트.
Introduction
Microglial 세포 두뇌의 주민 대 식 세포는 고 두 생리 및 병 적인 조건1,2에 역할. 그들은 높게 분기 형태와는 끊임없이 확장 있고 그들의 프로세스3,4를 제거. 이 "스캔" 문제가 관련 되며 그들의 주위에의 조사에 필요한 여겨진다. Microglia의 형태소가 소성 세 가지 모드에 표시 됩니다. 첫째, 일부 화합물 빠르게 microglial 형태학을 조절: ATP5,6 또는 급성 뇌 조각 입욕 하는 매체에 NMDA5,7 microglial 파급 효과의 복잡성 증가 반면 norepinephrine 그것6감소 한다. 이러한 효과 직접 (대 한 ATP 및 norepinephrine) microglial 수용 체에 의해 중재 하거나 신경 세포에서 ATP 릴리스 (NMDA)에 대 한 필요 합니다. 둘째, 운동 성 또는 "감시", microglial 프로세스의 성장과 수축 속도 extracellular 요인8, 항상성 중단9,10또는 돌연변이9에 의해 영향을 받을 수합니다 있습니다. 10,11. 셋째, 있을 뿐만 아니라 이러한 등방성의 형태와 운동 성 microglia ATP3,5,12, 를 제공 하는 피 펫으로 향해 그들의 프로세스를 확장 하는 수 용량이 있다 13 , 14, 급성 뇌 조각 또는 vivo에서, 또는 제공 5-HT 급성 뇌 조각15문화입니다. 방향 운동 성, 라고도 하는 microglial 프로세스의 이러한 지향된 성장 처음 로컬 레이저 병 변3,4에 대 한 응답으로 설명 했다. 따라서, 순수, 그것은 상해에 대 한 응답을 관련 되거나 시 냅 스를 향해 microglial 프로세스를 타겟팅에 필요한 또는 두뇌 지역 개발15,16, 동안 또는 생리17 가지 치기를 요구 ,,1819 또는 성인 기에 병 적인 상황9,18,,1920 . 세 가지 유형의 형태학 변화 다른 세포내 메커니즘11,,1320에 의존 하 고 한 주어진된 화합물 반드시 그들 (예를 들어, NMDA에 직접 역할을 하는 모두 변조 하지 않습니다. microglia, 형태에 영향을 하지만 방향 운동 성5,7을 유도 하지 않습니다). 따라서 때 microglia에 화합물, 돌연변이 또는 한 병 리의 효과 특성화를 목표로, 그들의 형태학 소성의 세 가지 구성 요소 특성 중요 하다. 여기, 우리는, 여기의 화합물, 로컬 소스, ATP 또는 5-HT microglial 프로세스의 방향 성장 연구 하는 방법을 설명 합니다.
일부의 모델이 microglia 프로세스 매력 공부: 3D 환경6,,1819, 급성 뇌 조각6,,1315, 그리고 vivo에서 주 문화 3,13이미지입니다. Vivo에서 접근 microglia의 생리 상태를 보존 하는 최고입니다. 그러나, 깊은 지역 intravital 이미징 필요 복잡 한 수술 과정 그리고, 그러므로, 그것은 종종 피상적 대뇌 피 질의 층으로 제한. Microglia 기본 문화권을 사용 하는 많은 동물의 제한 된 수를 가진 조건 테스트를 쉬운 기술입니다. 그럼에도 불구 하 고, 비보, 에서처럼 같은 셀 형태를 얻을 수는 없습니다 그리고 셀 손실 신경와 이다 그들의 생리 적인 상호 작용. 급성 뇌 조각이 두 가지 방법 사이 타협을 대표 한다. 이 모델 transcranial 현미경 검사 법은 주로 성인에서 수행 하는 반면 어려운 도달 vivo에서, 높은 해상도 이미지 하 고 신생아 단계에서 분할 영역을 조사 하는 뇌 구조를 연구 하는 연구자를 수 있습니다. 마지막으로, 그것은 지역 마약 응용 프로그램의 효과 실시간으로 관찰 하 고 실험 동물의 제한 된 수를 사용 하 여 반복 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 급성 뇌 조각 문제는 제한 된 시간 (몇 시간) 동안 셀21,22에 2 주, 그리고 microglia 형태학의 잠재적인 변화 보다 더 오래 된 쥐에서 조각을 위해 특히 살아 남아 .
여기, 우리는 젊은이 성인 Cx3cr1의 급성 뇌 슬라이스를 준비 하는 프로토콜을 설명GFP / + 마우스를 2 개월, 몇 시간 동안 microglia 형태 및 운동 성의 보존. 우리, 그럼, ATP 또는 5-HT 같은 화합물으로 microglial 프로세스의 매력을이 분할 영역을 사용 하는 방법을 설명 합니다.
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Protocol
모든 실험 지역 윤리 위원회에 의해 승인 되었다 (다윈 위원회, 계약 # 1170와 #10921).
1. 유리 Micropipettes 화합물의 로컬 응용 프로그램에 대 한 준비
- 준비 붕에서 펫 전극 끌어당기는 사람와 얇은 유리 모 세관. 그들의 말단에 4-5 µ m 직경을 가진 펫을 얻기 위해 매개 변수를 조정 합니다. 그림 2D 낮은 확대율에서 대물에 한 피 펫을 보여줍니다.
2입니다. 솔루션
- 압력솥 사이클에 의해 청소 하는 유일한 유리를 확인 하십시오, 뒤에 헹 구는 2 x-초순, 3 x 사용 됩니다. 절대 사용 유리 paraformaldehyde 접촉 되었습니다.
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2 mol·를 준비 L-1 14.7 mg CaCl2·2H2O 고 순도의 물 50 mL에 용 해 하 여 CaCl2 재고 솔루션 (초순, 저항 18.2 m ω, 증류수 또는 수돗물에 금속의 흔적 차선 슬라이스 품질 때문에 발생할 수 있습니다 프로 산화 효과)입니다.
- 한 달의 최대 실내 온도에이 재고 솔루션을 저장 합니다.
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실험 당일, 그 조성은 110 mmol· 콜린-실제 (인공 척수) 솔루션의 1 리터를 준비 L-1 콜린 Cl, 25 mmol· L-1 포도 당, 25 mmol· L-1 NaHCO3, 7 mmol· L-1 MgCl2, 11.6 mmol· L-1 의약품, 3.1 mmol· L-1 나트륨 pyruvate, 2.5 mmol· L-1 KCl, 1.25 mmol· L-1 NaH2포4및 0.5 mmol· L-1 CaCl2, 0.5.
- 이 솔루션을 준비 하려면 추가, 다음 순서 대로, 졸업 1 L 플라스 크: KCl의 0.186 g, NaH2포40.195 g, ascorbic acid의 2.04 g, NaHCO3, 2.1 g 및 포도 당 4.5 g.
- 마지막 볼륨의 절반을 채워 초순 고 완전 한 해체까지 저 어.
- 0.34 g 나트륨 pyruvate와 콜린 Cl의 15.36 g를 추가 합니다.
참고: 첫 번째 디졸브 단계 2.3.2에서에서 전체 솔루션에 그것을 추가 하기 전에 준비 하는 솔루션의 5 ~ 10 mL와 콜린 Cl에 편리 하다. - 1 mol·의 7 mL을 추가 L-1 MgCl2 와 2 mol·의 250 µ L L-1 CaCl2 (준비 단계 2.2에서에서) 솔루션.
- 초순에 졸업된 플라스 크 1 L 채우십시오.
- 증기 압력 osmometer와는 osmolarity 300과 310 m ω 사이 인지 확인 합니다. 그렇지 않은 경우에 포도 당으로 조정.
- Carbogenation (즉,: "carbogen"와 버블링, 95% O2/5% CO2의 혼합) 후 pH를 확인 하 고, 필요에 따라 7.3-7.4 10 M NaOH로 조정.
- 저장용 유리 병에 솔루션을 전송 합니다. 사용 (3.1 단계)까지 냉장고에 있는 병을 유지.
참고: 실험 당일 신선한 솔루션을 확인 하는 것이 좋습니다. 그러나, 필요한 경우, 콜린-실제 저장 될 수 4 ° c.에 2 일에
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실험 당일, 그 조성은 124 mmol·는 실제 솔루션의 1 리터를 준비 L-1 NaCl, 26.2 mmol· L-1 NaHCO3, 25 mmol· L-1 포도 당, 2.5 mmol· L-1 KCl, 2 mmol· L-1 CaCl2, 1 mmol· L-1 MgCl2및 1.25 mmol· L-1 NaH2포4.
- 이 솔루션을 준비 하려면 추가, 다음 순서 대로, 졸업된 플라스 크: NaH2포40.150 g, KCl의 0.186 g, NaHCO3의 2.2 g, 포도 당의 4.5 g, NaCl의 7.3 g. 초순 물 1 L의 볼륨에는 솔루션을가지고 고 저 어 접시에 적극적으로 그것을 저 어.
- 1 mol·의 1 mL을 추가 L-1 MgCl2 와 2 mol·의 1 mL L-1 CaCl2 솔루션 및 스토리지에 대 한 유리 병에 전송 실제 솔루션.
- osmolarity 300-310 mΩ· 인지 확인 L-1 경우, 포도 당으로 그것을 조정 하는 고.
- Carbogenation 후 pH를 확인 (즉, "carbogen"와 버블링) 7.3-7.4 10 M NaOH와 함께 필요한 경우, 그것을 조정 하 고.
- 저장용 유리 병에 솔루션을 전송 합니다. 사용 (3.1 단계)까지 냉장고에 있는 병을 유지.
참고: 실험 당일 신선한 솔루션을 확인 하는 것이 좋습니다. 그러나, 4 ° c.에 더 이상 1 주일 동안 저장 될 수 있다 최종 농도 x 10에 NaCl, NaHCO3, KCl, 및 NaH2PO4 를 포함 하는 재고 솔루션 x 10을 준비 하는 대신 초순 물으로 10 배 재고 솔루션을 희석 하 고 포도 당, CaCl2, MgCl2를 추가 하 여 실험의 날짜에 마지막 실제를 확인 합니다.
- 실험 당일 마약 솔루션을 준비 합니다. 실제 솔루션을 사용 하 여 최종 농도, 여기, 500 µmol·에 그들을 L-1 ATP와 5 µmol· 5-HT에 대 한 L-1
참고: ATP, 재고 솔루션 준비 하실 수 있습니다 (예를 들어, 50 m m 물에서 ATP),-20 ° C에 aliquoted 형태로 저장 하 고 실제 실험 당일 최종 농도에 희석. 반면, 5-HT (세로토닌-HCl) 솔루션 1 mg·mL-1 물에서 실험의 하루에 분말에서 준비, 5-HT 산화를 피하기 위해 4 ° C에서 보관이 고 실험의 때에 실제에 희석 있습니다.
3입니다. 급성 뇌 조각의 준비
-
절 개 면의 준비
- 얼음 심장 관류, 급속 한 뇌의 냉각 및 자르는 데에 80 mL 비이 커에 얼음 처럼 차가운 콜린-실제의 70 mL를 준비 합니다. 150 mL 200 ml 접시, 32 ° c.에 유지 온수 물 욕조에 배치를 crystallizing 콜린-실제의 준비 슬라이스를 유지 하는 장소 crystallizing 접시에 나일론 메쉬 스 트레이너. 이 조각 슬라이스 후 10 분 동안 복구할 수 있도록 사용 됩니다.
- (3.2 단원), 해 부를 시작 하기 전에 적어도 30 분 시작 이러한 두 가지 솔루션 (얼음에 콜린-실제의 70 mL)와 콜린-실제 32 ° C에서의 150 mL carbogen와 버블링. 전체 절차 동안 상수 carbogenation를 유지 합니다.
- 그들의 사용까지 분할 영역을 유지 하는 데 사용 됩니다 인터페이스 챔버 장치 (그림 1C)을 준비 합니다.
- 봉인 된 음식 상자에 (10 x 10 cm 또는 10 cm 직경, 높이 8cm)는 자력에 설치 장소 바 접시 crystallizing 200 mL 자석.
- Crystallizing 접시에 실제의 200 mL를 추가 하 고 3D 인쇄 인터페이스 슬라이스 홀더 (인터페이스 슬라이스 홀더는 서로 그림 1A, B뻗어 폴 리아 미드 메쉬 부분의 두 완벽 하 게 피팅, 구성) 위에 놓습니다.
- 인터페이스 조각 소유자의 메쉬를 포함 하는 솔루션의 얇은 필름만 계속 crystallizing 접시에서 초과 볼륨을 제거 합니다. 이것은 나중 좋은 변죽 슬라이스를 둘러싼 솔루션의 (하지만) 그들을 취재 하지 않고 만듭니다.
- 실제의 몇 밀리미터 음식 상자 아래쪽에 넣고 carbogen와 버블링 시작 (처음 사용 시 확인 작은 구멍 봉인된 음식 상자 벽 튜브 박스를 입력할 수 있는지 확인).
- 상수 carbogenation를 유지 하면서 봉인 된 상자를 닫습니다. 습도 95% O2/5% CO2 풍부한 환경을 있는 조각 콜린-실제에 그들의 회복 후 전송 되며 그들은 군데는 전에 유지 만들어집니다. 이 장치는 라 함 "인터페이스 챔버" (그림 1C).
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뇌 해 부 및 슬라이스
- Anesthetize 50 mg·mL-1 pentobarbital (0.15 mL/20 g 마우스 몸 무게)의 복 주사와 마우스, 그것을 고정, 마음, 노출 및 수행의 얼음 처럼 차가운, 10 mL와 함께 심장 관류 carbogenated, 콜린-실제 (단계를 참조 하십시오 3.1.1), 연동 펌프. 좋은 관류의 지표로 서 간 증상을 관찰 합니다. 관류 5 분 미만 지속 한다.
- 목을 벨 마우스와 두개골을 폭로 하는 피부를 잘라. 큰가 위, 큰 구멍 및 1 개의 긴 화살 컷에서 두 횡단 상처를 적용 하 고 두개골 플레이트를 제거 미세 집게를 사용 하 여.
- 신속 하 고 부드럽게 (1 분 미만)에 두뇌를 추출 하 고 그것을 진정 위하여는 나머지 (~ 60 mL) 얼음 처럼 차가운 콜린-실제 (여전히 아래 상수 carbogenation)를 포함 하는 80 mL 비 커에 1 분 동안 그것을 배치.
- 전송 이전 실제와 젖은 필터 종이에 두뇌.
- 두뇌의 뇌 영역 및 슬 라이 싱의 기본 각도 잘라. 예를 들어 시상 또는 코로나 조각에 해 마 이미지를 잘라 메스 칼 날 소 뇌 그리고, 두뇌의 rostral와 꼬리 말단에서 m m 2에 대 한.
참고: 너무 rostral 또는 꼬리 너무 뇌 부분을 제거 하는 것이 중요 하다 때문에 관심의 영역에 도달 하기 전에 트림을 작은 지역 빨리 자르는. 단계에 대 한 조각화 (3.2.7) 미만 20 분의 총 시간 것이 좋습니다. - 코로나 슬라이스 및 진동 슬라이서의 커팅 블록에 붙어 10 cm 배양 접시에 두뇌의 꼬리 얼굴 (cyanoacrylate 접착제)와 접착제 놓고 큰 약 실에서 진동 슬라이서의 저수지 상공에 위치 얼음으로 가득합니다. 그런 다음 페 트리 접시 채울 모든는 나머지 얼음 콜린-실제.
- 95% O2/5% CO2 일정 유지 하면서 300 µ m 두께 코로나 조각 잘라 차가운 콜린-실제의 버블링 (속도: 0.08 mm·s-1, 블레이드 진동: 60 Hz, 진동 진폭: 1mm).
- 넓은 입 (지름 4 mm) 일회용와 뇌 조각 플라스틱 수집 블레이드, 독성 구성 요소 조각 주변에 의해 발표의 축적을 피하기 위하여의 모든 단일 패스 후 하나 하나. 복구에 대 한 약 10 분 동안 32 ° C에서 콜린 실제에 각 분할 영역을 전송 하는 동안 공기 거품을 피하기 위해 주의.
- 전송 피 펫과 함께 자리를 렌즈 청소의 조각에는 조각 종이 콜린-실제의 한 방울으로 장식. 콜린-실제의 초과 발음 하 고, 주걱, 조각, 실 온에서 carbogenated 실제를 포함 하는 인터페이스 챔버의 메쉬에 렌즈 청소 조직에 배치할 (3.1.3.5 참조). 적어도 30 분 동안이 환경에서 복구 하는 분할 하자.
참고: 이 후, 슬라이스 준비 하며 2 개월 오래 된 성인에서 뇌 추출 후 microglia 영에서 뇌 추출 후 최대 6 h에 대 한 이미징 (미만 1 개월) 마우스 및 최대 4 h 사용할 수 있습니다.
4. 2-광자 현미경
- 매개 변수 설정
- Multiphoton 시스템 (하이브리드 탐지기, 레이저 스캐너, 전기 광학 변조기, 현미경)에 전환.
- 920에서 레이저 조정 nm, 레이저 모드 고정 고 5%-15%와 10%에서 이득에 전원을 설정 확인. 이 목표 아래 3-5 mW의 파워에 해당합니다. Nondescanned 감지기는 종사 하는 적절 한 방출 및 여기 필터 설치 확인 합니다.
- 이미징 소프트웨어의 매개 변수는 다음 값으로 설정: 프레임 크기, 295.07 µ m; x 295.07의 지역에 해당 하는 1024 x 1024 픽셀에 대 한 확대, 2에 대 한. 신호가 아주 시끄러운 경우에, 2의 선 평균을 적용 합니다. 픽셀 역학에 대 한 이미징 소프트웨어 12 비트 이상으로 설정 합니다.
참고: 높은 비트 값으로 이미지 낮은 비트 값으로 이미지 보다 형광 강도에 작은 차이 구별 하는 연구자 수: 8 비트 이미지에 회색 값 256 회색 및 12 비트에서 16 회색 값의 변화에 대응할 것입니다 하나의 변화 나 값 n 16 비트 이미지를. 따라서, 더 높은 비트 이미지는 정량 분석에 더 적합 하지만 그들의 크기가 증가 비트 깊이, 저장 용량, 그리고 컴퓨팅 파워 제한 될 수 있습니다. - 스캔 모드 XYZT Z 간격 범위 2 µ m와 T-2 분의 간격을 선택 합니다.
참고: X, y 및 z 해상도 나이 키스 트 샘플링 정리에 의해 결정 됩니다. Microglia 프로세스를 해결 하기 위해 최적의 것입니다 0.8 주위 Z 스텝 크기 (직경의 < 1 µ m), multiphoton 현미경의 광학 해상도 제한 하지만 (920에서 0.95 나 목적으로 nm, 축 분해능은 1 µ m 주위). 그 위에 물리적 장벽, 라이브 이미징 실험, 감도 또는 신호 대 잡음 비율, 해상도, 속도, 그리고 총 관찰 시간 문제에서 했다. 이러한 모든 매개이 변수, 2 µ m (수많은 연구3,,1114)로, 1024 x 1024 픽셀의 이미지 크기와 유압 감지기 (그것에 결합 된 공명 스캐너를 사용 하 여 고속 수집의 z 단계를 고려 15 정도 소요 50 z-계획을 취득 하는 s) 여기에 선정 됐다. 취득의 주파수 1 XYZT 시리즈 마다 2 분 이며 총 기간은 30 분. 설정 하지 않으면 빠른 또는 충분히 민감한, 그것 (512 x 512) 아래로 측면 해상도 또는 z 조각의 수를 줄이기 위해 가능 하다 (강한 형광을 전시 하는 z 깊이에서 독점적으로 이미징 하 여 [즉, 아니라 깊은 z-조각 어디 형광은 희미 한]), 또는 스캐너의 속도 감소. 축 해상도 또한 3 µ m, 최대 z 단계 증가 의해 감소 될 수 있습니다 하지만이 정량화에 영향을 미칠 수, 비교할 모든 실험 같은 z-단계와 수행 되어야 한다.
참고: 그것은 CX3CR1creER YFP 쥐18, microglia만, 유전 삭제를 유도 하 고 어떤 microglia constitutively 노란 형광 성 단백질 (YFP) 표현 하는 데 사용 하는 마우스 선 조각에 비슷한 실험을 수행할 수 있습니다. 그러나, YFP 식 수준은 매우 낮은 CX3CR1에 녹색 형광 단백질 (GFP)에 비해GFP / + 쥐; 따라서, 이미징 가능 하지만 도전 하며 인수 매개 변수의 최적화. 다음과 같이 그들을 조정 하는 것이 좋습니다. - 970에서 레이저 조정 nm (920 보다 YFP 여기에 맞게 더 나은 nm), 50%, 그리고 50%, 5-6 mW의 목표 아래 레이저 파워에 해당에서 이득에 전원.
- 신호 대 잡음 비율을 개선 하기 위해 4 (또는 이상)의 선 평균을 설정 합니다.
- 위치는 슬라이스 및 유리 제 micropipette 및 화합물의 로컬 응용 프로그램의
- 녹음 실, 녹음을 시작 하기 전에 30 분을 연동 펌프를 연결 합니다. 초순의 50 mL와 함께 전체 관류 시스템을 청소 후 실제 (50 mL) 상수 carbogenation 아래 유리 비 커에 포함 된 녹음 실의 관류를 시작 합니다. 실험을 통해 순환 실제 인라인 microheater 또는 Peltier 히터와 32 ° C를 유지.
참고: 위쪽 및 아래쪽 관류와 특정 관류 챔버는 조각의 양쪽에 산소를 최적화 하기 위해 설계 되었습니다. 관류 챔버 두 완벽 하 게 피팅 부품, 폴 리아 미드 메쉬 (그림 2A, B)을 서로 뻗어 구성 됩니다. 챔버, 어디 조각 유리 coverslip에 직접 누워 있다의 다른 종류에 비해이 챔버 조각의 하단 부분에 있는 신경 죽음을 감소, 생존, 향상과 팽창에 의해 유도 된 조각 움직임을 감소. - 넓은 입 일회용 전송 피 펫과 뇌 조각 렌즈 종이 제거, 싱크 (증거로 아무 공기 방울이 연결 되어), 및 녹음 (관류) 약 실에 그것을 전송 실제 비 커에 이미지를 전송 합니다.
- 관류 흐름 때문 슬라이스 움직임을 최소화 하기 위해 조각에 조각 홀더 (플래티넘의 병렬 나일론 스레드 합류 하는 두 가지로 만든 헤어핀)를 배치 합니다.
- 밝은 분야 조명을 사용 하 여 관심 뇌 영역을 대상 (노출 시간: 50 ~ 80 ms) (5 X 또는 10 X) 낮은 배율 목표를 사용 하 여. 높은 배율 (25 x 0.35 x 렌즈) 물 침수 목적을 전환 하 고 위치를 조정 합니다.
참고: 그들은 빛을 차단 하 고 로컬로 슬라이스를 변형 수 조각 보유자의 나일론 스레드 가까운 이미지 필드를 피하십시오. 관심 영역 평면 있는지 확인 합니다. 필요한 경우 분할 위치를 조정 하려면 분할 영역 홀더 또는 슬라이스 홀더를 제거 합니다. - 필드에 이미지를 형광 microglial 세포를 사용 하는 형광 조명 (노출 시간: 250-500 ms).
참고: 이 단계 연구자를 관심과 그들의 형광 강도의 지역에 있는 세포의 존재를 확인 하 고 세포질 파편의 양을 제어할 수 있습니다. - 백필 실제의 10 µ L 피펫으로 ATP, 함께 5-HT, 또는 그것의 최종 농도에 대 한 관심의 마약. 포인트 팁 아래와 부드럽게 흔들어 약물 가득 피 펫 팁에 갇혀 모든 기포를 제거 하.
참고: 주입을 솔루션 폼 거품 경향이, 내부 필 라 멘 트와 함께 붕 규 산 펫을 사용 하십시오. 피펫으로에서 ATP의 누설도 주사 하기 전에 microglial 프로세스를 유치 할 수 있습니다 (이 경우, 그것은 볼 수 분석 단계에서). 이 ATP 농도와 적당 한 있어야 지만 사용 (500 µmol· L-1), 문제 라면, 고려는 micropipette ATP (또는 다른 화합물)를 추가 하기 전에 실제의 2 mL와 함께 prefilling 단계 4.2.6 솔루션. - 5 mL 위치에 위치 하는 플런저와 함께 투명 한 튜브 5 mL 주사기를 연결 하는 피 펫 홀더에서 채워진된 피 펫을 탑재 합니다. 자체 피 펫 홀더 3 축 micromanipulator에 거치 된다.
- 필드 밝은 조명 아래는 micromanipulator 피펫으로 필드의 중앙에 위치를 사용 합니다. 재현성 및 최적의 중심, 표시 및 눈금자를 사용 하 여 이미지에.
- 낮은 조각으로 부드럽게 피 펫, 제어 하 고 가볍게 피 펫 팁까지 동시에 목표를 조정 접촉 조각의 표면. 그것은 조각을 만져 볼 수는 피 펫의 강하를 막을 수 80-100 µ m의 조각의 표면 침투 피 펫 팁 ( 그림 3B참조).
- 레이저 튜닝 (위의 매개 변수 참조) 현미경 multiphoton 모드로 전환. 모든 광원 (예를 들어, 컴퓨터 화면)에서 챔버 상영은 다는 것을 확인 하십시오. Nondescanned 감지기에 전환 하 고 이득을 설정 합니다. 색으로 구분 된 상한 룩 업 테이블 (LUT)를 사용 하 여 이미지의 픽셀을 포화를 피하기 위해.
- 이미지 수를 슬라이스의 두께 결정 (즉, 상위 및 하위 z-위치 형광은 [총에서 220와 290 µ m] 사이 보통 감지).
참고: 조각의 표면에 조각의 내부에 비해 특이 한 형태와 종종 microglia 가능성이 프로세스의 증가 밀도가 있다. 이 축적 시간 (즉,., 이미지 수를 첫 번째 뇌 조각에 보다 마지막에 눈에 보이는) 더 눈에 띄는 것입니다. 따라서, 처음 ~ 30 µ m에서 z-비행기 분석을 위해 사용 하지 않아야 하 고 인수에도 건너뛸 수 있습니다. - 30 분 (또는 원하는 경우 더)의 전체 기간 동안 기록 시작 하 고 5 분 기준 후 로컬로 적용 (방해는 이미징) 없이 테스트할 화합물. 이렇게 하려면 1 mL 위치에 5 mL에서 micropipette에 연결 하는 주사기의 플런저를 눌러 천천히 (약 5에서 s). 플런저를 눌러 때 즉시 느낄 수 있어야 합니다. 그렇지 않은 경우에 팁 깨진 수 있습니다.
참고: 훈련 된 실험에 대 한이 방법으로 주사 재현할 수, 있지만 또는 주사기의 수동 조작에 피펫으로 수 연결할 배달 볼륨의 더 나은 제어를 허용 하는 자동된 압력 배출 시스템. 주사는 주사의 사이트에서 조각의 물리적 왜곡을 만듭니다. 이 왜곡 표시 됩니다 첫 번째 두 개 또는 세에서 귀납적 주입 후 이미지 하지만 4 번째 이미지 (즉, 주입 후 8 분)에 표시 해서는 안됩니다. 그것은 지속 되 면, 피 펫 준비에 대 한 매개 변수를 변경 하는 것이 좋습니다. - 수집 (30 분)의 끝에는 micropipette 삭제 하 고 분할을 제거 합니다. 원하는 경우 조각을 더 immunolabeling에 대 한 수정. 예를 들어 스냅숏 메서드는 고정에 대 한 최적화 하 고23조각 두께의 얼룩.
- 새 분할 영역을 이미지, 2D 영화 (섹션 5.1) 해당 microglia를 확인 하기 위해 확인을 시작 하기 전에 정상적인 형태 하 고는 이동 하 고, 따라서, 슬라이스는 건강 한.
- 녹음 실, 녹음을 시작 하기 전에 30 분을 연동 펌프를 연결 합니다. 초순의 50 mL와 함께 전체 관류 시스템을 청소 후 실제 (50 mL) 상수 carbogenation 아래 유리 비 커에 포함 된 녹음 실의 관류를 시작 합니다. 실험을 통해 순환 실제 인라인 microheater 또는 Peltier 히터와 32 ° C를 유지.
5. Microglial 프로세스의 매력 분석
-
2D 투영 및 드리프트 보정
- 파일 (. LIF) 피지24.
- 필요한 경우만 z-비행기 관심의와 substack (이미지/스택/도구/확인 Substack)을 확인 합니다. 예를 들어 z-비행기 획득 되지만 분석에 사용할 수 없습니다 하는 경우에 해당 하는 조각의 표면 제외 (단계 4.2.11 후 메모 참조)와 아무 형광과 깊은 z 비행기. 최종 스택 90-110 z-조각 (180-220 µ m)에 일반적으로 포함 되어 있습니다.
- Z 프로젝트 기능 실행 (이미지/스택/Z 프로젝트") 고 z 스택의 각 시간 지점에서 인수 계획을 최대 강도 프로젝션 유형을 선택 합니다.
- MultiStackReg 플러그인 (플러그인/등록/MultiStackReg), 실행 선택 작업 1: 정렬 및 변환: 강 체 인수 하는 동안 발생 한 수 있습니다 약간의 드리프트를 해결 하기 위해. 새 파일 (.tiff)로이 2D 영화를 저장 합니다.
-
데이터 처리
- 얼음25를 가진이 새 파일을 엽니다.
- 35 µ m 직경, 사출 사이트 (특히 피펫으로 주입의 때에 만든 왜곡의 그림자에 의해 식별 됨)에 중심에 관심 (ROI)의 원형 R1 영역을 그립니다.
- 투자 수익 강도 진화 플러그인을 사용 하 고 r 1에서 시간이 지남에 평균 강도 측정.
- 결과를 저장 한. XLS 파일입니다.
-
정량화 및 결과의 표현
- 시간이 지남에 따라 microglial 응답을 계량 하려면 각 시간 지점에서 결정
Here,'R1(0) 주사 하기 전에 R1(t) 값의 평균입니다. 그런 다음, 결과 microglial 응답의 운동으로 대표 될 수 있다 또는 특정 시간에 포인트 ( 그림 7참조).
- 시간이 지남에 따라 microglial 응답을 계량 하려면 각 시간 지점에서 결정
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Representative Results
이 프로토콜 유도, 관찰, 및 로컬로 적용된 화합물 향해 microglial 프로세스의 중심된 성장 계량 하는 방법에 설명 합니다, 예를 들어 ATP 또는 5-HT, 급성 뇌에 영 또는 성인에서 조각 (적어도 까지의 2 개월) 쥐. 몇 시간 동안 건강 한 상태에서 성인 동물에서 뇌 조각을 유지에 기여 하는 요인 들 중 프로토콜의 2 단계에서 세포 생존을 최적화 하도록 설계 된 두 개의 도구를 사용 하 여가 이다. 첫째, 인터페이스 조각 소유자 인터페이스 챔버 (그림 1)에서 절단 후 조각의 보존을 향상 시킵니다. 둘째, 녹음 실 (그림 2) 제도가 관류 이미징 동안 맨 한 조각의 하단에 실행 실제 수 있습니다. 여기 사용 녹음 실 치수 (62 m m 외부 직경으로), 클래식 목욕 챔버 삽입 비슷합니다 하지만 그들의 모델은 보충 자료다운로드, 디자인 될 수 있다 표준 현미경에 맞게 설정 됩니다. 다른 크기의 조각 소유자에 맞게 적응. 주의 하는 그들 사이 기지개 하는 폴 리아 미드 메쉬 각 챔버 두 완벽 하 게 피팅 부품, 접착제 없이 어셈블리에서 만든입니다.
ATP 또는 작은 지역에서 5-HT microglia의 로컬 응답을 유도 하는 화합물 ( 그림 2CD에표시)를 포함 하는 피 펫 조각 위에 팁으로 배치 됩니다. 첫 번째 실험에서 2 광자 현미경 (그림 3A)와 인수는 이미지에서 피 펫 팁의 위치를 시각화 하기 위해 솔루션에 형광 염료를 추가 하려면 유용할 수 있습니다. 그림 3B에 실험 중지 피 펫 강의 팁 감동 하 고 컴퓨터 스크린의 밝은 필드 이미지에 슬라이스 표면 변형, 비록 그것의 얇은 말단 80-아래 조직으로 약간 입력 표시 됩니다. 표면에서 µ 하 m 100 이다 피펫으로 너무 피상적인 셀에 제대로 솔루션을 제공 하거나 입력 하지 수 있기 때문에 중요 하다 때문에 그것은 형광 신호 너무 낮은 지역에 도달할 수 있습니다 너무 깊이. 피 펫 팁에 의해 도달 깊이 영향을 미칠 수 있는 매개 변수는 3 축 micromanipulator와 피 펫 입 직경 조정 될 수 있는 피 펫의 각도.
(그림 3B) y 축 따라 투영 가능 하다 형광 조각의 아래 부분에서 보다 상위에 강하다 관찰 note. 이 모두 사실 프로세스 microglia 조각과 일부 셀 시체의 표면 층의 표면으로 이동 하는 경향이 하 고 조각의 내부 신호의 진보적인 blunting 예정 이다. 그 결과, 조각의 가장 표면 층에서 microglia 조각, 그들은 동일한 상태에서 하 고 자극에 다르게 반응할 수 있습니다 나타내는 내부 보다 다른 형태를 표시할 수 있습니다. 따라서, 표면 microglial 활성화 수 있습니다 마스크, z-프로젝션, 아래 microglia의 응답. 또한, 표면 기울이면 자주 고는 스택의 첫 번째 z 이미지는 누 덕 누 덕. 따라서, 좋습니다, 더 나은 정확도, z-투영과 분석에서 가장 천박한 z-비행기를 제외에 대 한. 그러나,로 microglia 형태와 피상적에서 파편의 존재를 변경 레이어는 조각의 상태 표시기, posteriori 상태를 확인 하는 조각의 전체 깊이 이미지를 재미 있을 수 있다. 이것은 쉽게 비정상적인 microglia 또는 단일 z-비행기에서 파편을 인식 하지 못할 수 있습니다 새로운 경험에 특히 유용할 수 있습니다. 처음 30 µ m에서 z-비행기 다음 z 프로젝션 단계 (단계 5.1.2 프로토콜의)에서 제외 됩니다.
일단 분할 관심의 화합물으로 치료 되었으며, 기록, z-비행기 (위에서 설명한 대로 처음 30 µ m를 제외)의 시리즈 때마다 포인트는 z-프로젝션 이미지의 2D 영화를 만들려고 z 축을 따라 예상에서 몇 군데. 메모는 여기에 제시 된 프로토콜에서 최대 z 프로젝션에 사용 하는 두께 포함 모든 z 슬라이스 형광 표시 됩니다 (일반적으로 180-220 µ m, 5.1.2 프로토콜의 단계 참조). 따라서, z 조각의 절대 수에 있는 변이 응답의 정량화를 영향을 하지 않습니다. 반면, 일부 연구는 z 투영6,7,,1127얇은 z-스택 (40-60 µ m)를 사용합니다. 이것은 우리가 관찰 하는 유인 효과 일부 실험에 피 펫 팁에서 (z)에서 70 μ m까지 볼 수 있다고 응답, 전시 하는 일부 z 슬라이스를 제외 하는 모험 오는 다른 옵션 이다. 얇은 옵션을 선호 하는 경우 그것은, 따라서, 센터는 피 펫에 z 스택 팁 z, 그리고 중요 한 것은,만 z 계획에 동일한 방식으로 수행 하는 중요 한 (즉, 모든 형광 z 슬라이스를 사용 하 여 또는 얇은 z 스택을 사용 하 여) 비교 될 수 있다.
관심의 R1 지역 다음 정량 분석을 위해 정의 됩니다. 그림 4 는 z 프로젝션에 ROI를 보여준다. 빨간색 파선 피펫으로의 putative 위치를 나타냅니다. 노란색 원은 R1, 얼음,으로 그려지고는 피 펫의 상 상속 끝에 중심입니다. 중요 한 것은, 우리 눈에 띄는 변화 응답의 과소 이끌어 그 방치 R1 투자 수익의 지역화에서는 정량화 중 발생 관찰. 배달의 사이트에 투자 수익을 포지셔닝 하기 위해, 동일한 중앙 XY 위치 이미지 수를 필드에 항상 피 펫 팁을 두기 위하여 명시에 피 펫을 배치할 때 수집 소프트웨어에 눈금자를 표시 하는 것이 좋습니다. 이 어디에 위치, 나중에, Z-형광 이미지 프로젝션에 투자 수익의 표시를 제공 합니다. 그러나, 마지막 팁 위치와, 따라서, 납품의 실제 사이트는 피 펫 팁에 의해 도달 깊이 따라이 중앙 위치에서 약간 이동 것입니다. 이러한 이유로 위치로 R1, 우리 고려 다른 세 가지 조건: (i) r 1의 위치 (ii) 그것은 어디는 과도 지역에 해당 오른쪽 아래에 어두운 배경에서 유추 하는 피 펫의 끝에 있어야 직물의 왜곡 화합물을 주입 하 고 (ii) 어디 로컬 응답 (있을 경우) 지역에 해당 한다 관찰 될 때 발생 합니다. 이 충분 한 좋은 정확도와 배달의 포인트를 찾을 수 없으면, 형광 화합물을 피펫으로 작성 도움이 됩니다. R1, 다시 모든 시간 포인트 잘 배치 하 고 아무 탈 드리프트, 왜곡, 또는 유물 형광 시간 언제 든 지 확인을 실행 우리를 그려 데 후는 정량화 편견 수 있는. 해당 그림 4, 하 고 ATP 응용 프로그램의 효과 보여주는 영화는 보충 자료 (영화 S1)에서 찾을 수 있습니다.
우리는 처음 ATP 또는 5-HT P11 쥐15의 시상에 microglial 프로세스의 매력을 공부 했다. 더 최근에, 이러한 실험 했다 반복 4-하루-2 개월 쥐에서 분할 영역에 다양 한 지역에서 (예를 들어 그림 3 에 해당 하는 해 마에서 녹음). 우리가 주로 하는 성숙한 뇌와 성숙 하 고 없는 microglia를가지고의 장점을 결합을 4 주-세 쥐 사용-좋은 슬라이스 생존 능력으로. 중요 한 것은, 대표 정상 상태 microglia 작은 소마, 작은 터미널, 긴 프로세스 및 초기 상태에서 끊임없이 이동 프로세스 특징입니다. 일반적으로, 30 일 된 쥐 18에서 조각, microglia 형태 그대로 였다 주로 최대 6 h에 대 한 슬라이스 준비 후에. 이전 마우스 (2 개월)에서 조각, 생리 적 상태에서 분할 영역을 유지할 수 있는 능력 감소 (~ 4 h)입니다. 응답 5-ht 조각에서 ATP와 20 일 된 마우스에서 조각에 2 개월 된 마우스에서 시상에서 microglial 방향 운동 성의 예는 그림 5에서 제공 됩니다. 그림 5 에서 5-HT 응용 프로그램에 해당 하는 영화는 보충 자료 (영화 S2)에서 찾을 수 있습니다.
그림 6 두 차선 실험 전에 그들은 했다 군데 실제 6 h 보다 더 오래 보관 하는 조각에 만든 (0 표시 됩니다만 시간)을 제공 합니다. 그림 6A에서 note microglia 짧은 여러 프로세스 또는 확대 터미널 neurite 성장 콘, 연상의 존재와 많은 형광 세포 파편 또는 입자의 존재. 이러한 매우 형광 요소 움직이기 힘 드는 유지 또는 영상, 그들은 "생활" microglia에 속하지 않는 나타내는 동안 무작위로 이동 ( 영화 S3 보충 자료 참조). 주의 하는,이 특정 예제에서 microglia 그들의 환경을 검사 끊임없이 했다 하지만 그들은 생리 적 상태에 있는 것으로 간주 될 수 있는 그들의 형태 변경 너무 했다. 또한, 많은 양의 파편 만들었을 것입니다 형광 분석 제대로 믿을 수 있는. 그림 6B microglia 크고 평평한 세포 기관 또는 돌출, 때로는 몇 시간 전에 그들은 했다 군데 보관 된 조각의 표면 층에서 찾을 수 있습니다와 존재를 보여 줍니다. 단지 피상적인 z-위치가 z-투영 수 있도록 사용 되었습니다. 그림 6 c 깊이 z-위치에서 같은 두뇌 조각에서 그림 6B와 같이 substack 이다. 그들은 표면에 배치 되지 않은, 있지만 해당이 microglia 비정상적인 "부시" 측면이 있다. Microglia 측면 때문이 두 조각에 해당 하는 영화 했다 정량화 사용 되지 않습니다.
2D 영화에서 데이터를 추출, 후 시간이 지남에 따라 정규화 R(t) 형광 그려서 결과 나타낼 수 있습니다. 몇 가지 실험 요약 그래프 그림 7A, 반응의 다양성을 보여 제공. 형광 감소 즉시 하지만 정도 (처음 세 개의 이미지) 조직 왜곡 때문에 주입 후 참고 (즉,: 피펫으로와 액체 주입 정도 되겠습니다, 조직 그리고 다음 증가). ATP에 응답에서 가변성 보여줍니다 사실 그도 슬라이스 볼 때 운동 하 고 없는 microglia과 마찬가지로 건강, 그들은 응답 하지 않습니다 동일한 방식으로 (하지만 그들 모두 응답). 내장 샘플이 위에 일부 설사 R1 위치에, 위에서 언급 한 대로 그리고 우리 또한 전달 되는 솔루션의 차이 등의 영향을 제외 없습니다. 따라서, 작은 효과 또는 변형을 감지, 그것 자동 장치를 사용 하 여 복합 주입에 대 한 흥미로운 수 있습니다.
그림 7B 투자 수익의 크기 또한 미치는 부 량, ATP 유도 프로세스의 성장의 여기 보여줍니다. 35 ( 그림 7A 에 여기에 제시 된 모든 분석에 대 한 사용 직경)에서 50 또는 70 µ m 직경을 증가 작은 R1 포지셔닝의 문제를 억제 하 여 실험 (조각) 사이 가변성을 감소 시킨다. 그러나, 그것은 또한 정확도 검색 된 응답의 크기 감소. 실제로, 큰 ROIs, 거기 프로세스 또는 셀 시체는 치료에 의해 영향을 받지 않습니다 더 많은 배경와 과정의 성장 수 될 부분적으로 무딘 microglial 분기 피펫으로에서 더 먼의 부 대 철회에 의해 하지만 그럼에도 불구 하 고 투자 수익 내. 결론적으로, 하나는 35 µ m 보다 다른 직경 원이 ROIs를 사용 하 여 관련 될 수 있지만 기본적 ROI는 항상 비교 하는 모든 데이터 세트에 동일 이다.
그림 ℃ 평균 ± sem의 실제, ATP, 또는 5-HT와 몇 가지 실험에 대 한 보여줍니다. ATP의 효과 vivo에서 비슷한 방법으로 다른 그룹에 의해 얻은 그와 같은 범위에 (0.5 Davalos에 따르면 외.3 와 헤 인 즈 외.13에 따라 0.4)와 조각 (0.8 여기로 정규화 하는 경우에 Dissing Olesen 외5, 및 Pagani에 따라 0.6 외28). 한편으로, 차이에서 올 수 있다 슬라이스 준비 방법 등 생물학적 매개 변수 ATP 주입, 마우스, 또는 사용, 두뇌 지역 그리고 투자 수익의 직경 등의 분석 매개 변수에서 다른 한편으로 나이의 금액 및 z-스택 (즉, 형광 탐지는 전체 두께 또는 피 펫 팁, 극대 응답으로 예상 된다 주변 40-60 µ m) z 프로젝션 사용의 두께입니다.
그림 ℃에서 실제 주입은 부정적인 컨트롤, 로컬 주입 및 피펫으로의 압력 microglial 프로세스를 유치 할 수 있습니다 부상 발생 하지 않습니다 확인 하는 데 필요한. 또한, 실제 제어 시간이 지남에 아무 photobleaching 인지 확인 하는 연구자를 수 있습니다. 실제로, photobleaching, 형광 단백질 또는 fluorophores, 광자 유도 파괴 시간이 지남에 형광의 진보적인 감소를 유도 것입니다. 그것은 측정 편견 수 있습니다, 그것이 엄격 하 게 확인 하는 아무 photobleaching 실험 조건에서 중요 합니다. 이렇게 하려면 것이 좋습니다 30 분 GFP 표현 microglia와 조각에 XYZT 시리즈를 얻으려고 (실제 주입 될 수 있습니다 하지만, 실제로, 아무 자극은 필요), 실험 조건에서 설정 하는 여기 및 수집 매개 변수. 그럼, 관심, microglia 셀 시체 또는 프로세스를 포함 하 여 다른 영역에서 시간이 지남에 형광의 정량적 측정 방출 강도, 일반적으로 지 수 감퇴, photobleaching을 나타내는 점차적인 손실 인지 발표할 예정 이다. 이 경우 일부 조정을 수행할 수 있습니다: 레이저의 재배치, 레이저 전력의 감소와 검출기의 증가 이득, z-비행기의 수 및 조명 제한에 그들 사이 간격의 증가의 감소. Photobleaching 고 출력 또는 긴 선호 됩니다 (예: 조명 선 평균에 대 한 반복) 여기; 따라서, 지속적인된 조명 낮은 형광으로 셀을 이미지를 사용 하는 경우 연구원은 그것에 관심을 지불 해야 합니다.
ATP 또는 5-HT의 지방 주입 후 R1 고원 (그림 ℃)에 도달에서 형광의 증가 이다. 속도 론, 뿐만 아니라 안정적인 끝점에서 매력을 비교 하는 흥미로운 수 있습니다. 여기, 우리는 선택 했다 t microglial 응답을 나타내는 그림 7D에 26 분 (즉, 주사 후 20 분) =. 이것은 화합물, 통계적으로 비교 하거나 목욕 (즉, 관류 솔루션 또는 [표시 되지 않음] 피 펫에서 화합물 함께)에 추가 될 수 있는 길 항 근의 효과 테스트에 유용 합니다.
그림 1: 챔버 세부 인터페이스. (A) 슬라이스 소유자의 3D 프린팅에 대 한 개요. 소유자의 외부 직경 나일론 메쉬 (화살표) 액체 공기 인터페이스에 슬라이스를 유지 하는 연구자 수 있도록 7 cm. (B) 인터페이스 슬라이스 홀더 이다. (C) 인터페이스 챔버 전에 그들은 군데는 carbogenated (화살표 나타냅니다 버블링에 대 한 튜브) 및 습도 환경에서 슬라이스를 유지 하기 위해 가능 하 게 하는 장치. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 관류 챔버 정보. 3D 인쇄에 대 한 개요를 (A). 관류 챔버의 외부 직경은 5.9 cm. (B) 나일론 메쉬 (화살표)와 관류 챔버를 슬라이스를 지 원하는 아래의 슬라이드를 만지기에서 그것을 방지 하 고 위와 아래 흐름을 실제 수 두 광자 현미경에서 어셈블리의 (C) 그림. 로컬 화합물을 제공할 것입니다 micropipette (별표) 오른쪽에 표시 됩니다. (D) 피 펫 명시에 몇 군데. 눈금 막대 = 60 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 위치는 micropipette의 조각에. 예는 micropipette (30 일 된 동물의 해 마)에서 이미지의 스택의 인수 fluorescein (1 µ M)으로 가득합니다. Fluorescein (A)는 z 축에 따라 최대 예측 또는 (B)는 y 축에 피 펫 (별표)를 찾을 수 있습니다. 비록 형광에 약해요, 거기는 또한 피 펫 팁 아래 microglia 패널 B 에 note. 이 그림 예에서는 슬라이스의 가장 피상적인 부분에 이미지를 포함 한 전체 스택, 예측에 대 한 사용 되었습니다. 눈금 막대 패널 A 에 표시 된 30 µ m = (각 졸업 = 50 µ m) 패널 B에. 스택의 z 두께 = 220 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: r 1의 위치, 투자 수익 사용 정량화. 이 그림 ATP (빨간색 파선 처음 시간 지점에) 피 펫의 putative 위치와는 r 1의 묘사의 도면 (에서 20 일 된 동물의 시상), 조각에 적용 된 실험의 세 가지 실험 시간 지점을 보여 줍니다. 투자 수익입니다. 눈금 막대 = 30 µ m. 참고 오른쪽 하단 모서리에 어두운 영역 조명 및 영상 방해 피 펫의 그늘에 해당. 참고, 또한, 작은 지역에서 25 분, 피 펫 팁의 위치를 나타내는 강렬한 형광의. 스택의 z 두께 = 220 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: Microglial 응답. 20 일 된 마우스에서 슬라이스 5-HT (5 µ M)는 뇌에서의 로컬 응용 프로그램에 대 한 응답 (왼쪽; 슬라이스 z 두께 = 220 µ m)와 ATP의 (500 µ M) 2 개월 마우스에서 조각에 (오른쪽; 슬라이스 z 두께 = 220 µ m). 빨간색 파선 피 펫 위치를 나타냅니다. 두 기록, 시상에 할 그리고 조각의 상단 30 µ m 제외 되었습니다. 이미지 (위쪽 행) 하기 전에 촬영 (아래쪽 행) 후 25 분 주사. 눈금 막대 = 30 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 차선 실험의 예. 이러한 조각 이미징 하기 전에 6 시간 이상 기 다 렸 고 그들의 위 표면부터 몇 군데 있다. Z-스택 파편의 많은 (A) 예 (약 라운드, 형광 입자, 그러나 불규칙 한 테두리; 별표)와 "부시" microglia (화살표), 즉, 수많은 하지만 짧은 프로세스. 확대 과정 터미널 (화살촉) axonal 성장 콘 처럼 보이는 note 스택의 z 두께 = 220 µ m. 다른 두 패널 표시 (B)와 같은 조각의 두 하위 스택 1-30 z-비행기 (z 두께 = 59 µ m)와 (C) 30-120 z-비행기 (z 두께 = 180 µ m). 에 가기 (패널 B에 표시), 큰 프로세스 단말기와 패널 A처럼 파편, microglia 특이 한 대형 평면 시체 또는 돌출 (별)이 있다. 에 깊은 ( C패널에 표시), 거기 아무 파편도 플랫 개체, 하지만 셀은 덥 수 룩 한 (화살표) 이며 밀도 비정상적으로 높은. 모두,이 관측은 microglia 정상적인 상태로 되지 않습니다 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7: microglial 프로세스의 매력의 정량화. (A) 예 실험의 일련의 변화를 설명 하기 위해 ATP. (B)는 정량화에 ROI 크기의 영향. 패널에 표시 된 각 실험 (ATP 주입) 35, 50, 또는 70 µ m 직경의 투자 수익 분석 되었습니다. 각 시간 지점에서 thefluorescence의 평균 ± sem의 다른 ROIs 표시 됩니다. (C) 실제, 5-HT, ATP와 실험의 요약. 실제 사출이 있다 microglial 프로세스의 위치에 영향을 주지 않습니다. ATP와 5-HT 형광의 지방 증가 함께 측정 피 펫으로 microglial 프로세스의 지역화 된 성장을 유도. 평균 ± SEM 표시 됩니다. T microglial 응답 (D) 요약 = 20 분 postinjection 녹음의 시작 부분에서 (26 분). 평균 ± SEM 표시 됩니다. 일방통행 ANOVA Dunnett 특별 게시물 테스트와 함께 사용 됩니다. p < 0.01, * * * p < 0.001 실제 주입에 비해. 실제, n 에 대 한 = 7; ATP, n 에 대 한 = 8; 5-HT, n 에 대 한 = 6. 이 모든 실험은 시상에서 수행 하지만 마 나 피에서 비슷한 결과 얻을 수 있습니다. Z 계획 및 정량화에 사용 되는 스택 중 z 두께 = 180-220 µ m. 35 µ m 직경 수익 패널 B 에 제외한 모든 조치 수행 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
영화 S1: 로컬 ATP (500 µ M) 응용 프로그램의 효과의 예. 이 실험 20-하루-오래 된 동물의 시상에서 수행 되었습니다. 이 영화에서 이미지 그림 4에 대 한 사용 되었습니다. 눈금 막대 = 30 µ m. 하시기 바랍니다 여기를 클릭이이 비디오를 볼. (다운로드 오른쪽 클릭.)
영화 S2: 로컬 5-HT (5 µ M) 응용 프로그램의 효과의 예. 이 실험 20-하루-오래 된 동물의 시상에서 수행 되었습니다. 이 영화에서 이미지 그림 5 (왼쪽)에 대 한 사용 되었습니다. 눈금 막대 = 30 µ m. 하시기 바랍니다 여기를 클릭이이 비디오를 볼. (다운로드 오른쪽 클릭.)
영화 S3: 이미징 하기 전에 6 시간 이상 기다렸다가 데 조각에서 차선 실험의 예. Note는 microglia의 특이 한 형태와 시간이 지남에 무작위로 이동 하는 수많은 파편의 존재. 이 영화에서 이미지 그림 6A로 사용 됩니다. 눈금 막대 = 30 µ m. 하시기 바랍니다 여기를 클릭이이 비디오를 볼. (다운로드 오른쪽 클릭.)
보조 파일: 챔버 및 인터페이스 지주 챔버 이미징. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
유지, 달리에서 해리 또는 organotypic 슬라이스 문화, 구조적 무결성 제한 된 네트워크 조정, 급성 뇌 조각 허용 microglia 그들의 생리 적인 환경에서 공부 하는 연구자. 그러나, 주요 한계 중 하나는 조각화 절차 빠르게 특히 성인 두뇌에서에서 뉴런의 생존 능력을 손상 시킬 수 있는 부상 만듭니다 사실 이다. Microglia 특히 세포 손상에 반응으로, 그것은 가능한 그들의 생리 적인 상태에 가까운 microglia를 유지 하기 위해 신경 세포 죽음을 제한 하는 것이 중요. 이, 차례로, 통해 조각의 더 일반적인 조건에 덕 원 기여 한다.
이 문서에서 설명 하는 프로토콜 적용 전기 생리학 실험, 특히 성인 쥐에서에서 몇 시간 동안 조각의 더 나은 생존을 얻기 위한 문학에서 발견 하는 몇 가지 개선 됩니다. 슬라이스 생존 나이 관련 된 차이 극복 하기 위해 우리는 콜린과 나트륨을 대체 하 고 심장 관류, 슬라이스, 및 복구 단계이 콜린 실제 매체를 사용. 이것은 최소29,30으로 셀 excitotoxicity. 콜린-실제, 이외에 N-메 틸-D-glucamine (NMDG) 같은 신경 보존에 대 한 매우 효과적인 다른 많은 대체 실제 조리법에 주목 한다-실제31, microglial 연구에 대 한 흥미로운 수 있습니다 하지만 여기 테스트 되지 않았습니다. 이 절차에서 또 다른 중요 한 단계는 심장 관류. 차가운 콜린-실제 솔루션으로 동물을 perfusing, 포함 하는 낮은 나+, 낮은 캘리포니아2 +, 높은 마그네슘2 +, 체온의 급격 한 감소는 유도 하 고 뇌에서 세포의 대사 활동은 낮 췄 다, 줄일 여 세포질 긴장 절단으로 인 한입니다. 실제로, 우리는이 방법은 단순히 전체 두뇌를 제거 하 고 실제 솔루션에 물속 보다 더 많은 보호 기능을 제공 하는 것을 관찰 했다. 패치 클램프 및 optogenetic 연구29에 대 한 최적화 된 프로토콜에 의해 영감을, 우리 또한 사용 직후 물리적 조각화 "보호 복구" 기간 콜린-실제 32에서 10 분 슬라이스의 외상에서 회복 분할을 허용 ° C. 그 후, 조각 30 분의 추가 최소 시간 복구 하는 챔버를 들고 인터페이스도 옮겨 졌다. 이 두 번째 복구 기간 기간 없음+ 대체 관심과 동물의 나이의 두뇌 지역에 따라 최적화할 수 그리고 그것은 전기 생리학 영상과 동시에 수행 하는 경우 최소 1 시간 마지막으로 해야 합니다.
사용 하기 전에 건강 한 상태 및 이미징 동안 관류의 조각의 유지 보수 또한 중요 한 매개 변수가 있습니다. 인터페이스와 듀얼 관류 챔버는 전기 생리학에 널리 설립된 도구. 예를 들어 인터페이스 메서드 199526이후 hippocampal 조각의 가능성을 개선 하기 위해 사용 되었습니다. 여기에서 사용 하는 챔버와 비슷한 장치 여러 회사에 의해 제안 하지만 microglia 이미징 아직 일반적으로 사용. 우리는 장기간된 보육 시대 조각의 셀룰러 저하를 지연 챔버, 어디 조각 그물을 실제의 큰 저수지와 인터페이스에는, 들고 인터페이스 설계. 영상 실에서 우리 multiphoton 현미경 중 정상 상태에서 셀을 유지 급성 슬라이스 준비의 증가 산소 수 있도록 설계 된 이중 면 관류 챔버를 사용 합니다. 단일 관류와 물속에 잠긴된 조각 증가의 이중 관류 이후 산소, 뿐만 아니라 다른 재료, 세포의 생존 수 자유롭게 하 고 효과적으로 무마 상당히 두꺼운 조각의 양쪽에서 높은 흐름 속도.
이 프로토콜은 microglial 프로세스에 ATP 또는 다른 화합물의 글로벌 유인 효과 측정 목적 및 그 정량화 방법 Davalos에 사용 되는 것에 따라 외.3. 그것은 다른 유형의 분석을 수행할 수 있습니다. 예를 들어 microglial 프로세스의 형광 수준에 의존 하지 않는 있지만 이미지 분석에 대 한는 실험의 더 많은 작업을 요구, 다른 방법, 화합물 후 피 펫 팁 주위의 빈 공간 감소를 측정 하는 응용 프로그램의11,32. 그것은 또한 개인 microglial 프로세스15,28의 끝의 움직임을 추적 가능.
또한, 등방성 운동 성 또는 microglia의 감시도 등록할 수 있습니다이 프로토콜을 사용 하 여 준비 하는 조각에 대 한 관심의 화합물의 목욕 응용 프로그램 또는 기저 상태에서. 그러나, microglial 프로세스의 빠른 확장 및 수 축력 속도 계량 하 고 잠재적인 변화를 감지, 그것은 수집 빈도를 늘릴 관련성이 있을 것 이다. 예를 들어 Pagani 외 모든 10 s28하나의 이미지의 주파수를 사용.
마지막으로, 최근 간행물 형태학 변경 또는 3 차원에서 개별 프로세스의 운동 성 측정 하는 방법을 설명 합니다. 이러한 분석에 대 한 충분히 일부 프로그램27, 2 µ m의 z 단계 간격 이지만 다른 요구 더 나은 축 해상도 (즉, 한 z-단계 Heindl 외.33에 따라 0.4 µ m의.
여기, 우리 실험 야생-타입 마우스 microglia에 GFP의 내 생 적인 식와 화합물의 기계적 응용에 보여주지만,이 프로토콜 microglia, YFP18또는에 있는 다른 형광 기자 단백질 적용할 수는 외 인 형광 isolectin11,34와 microglia의 라벨. 마지막으로, 우리는 ATP 또는 5-HT 야생-타입 정상 환경에서의 로컬 응용 프로그램으로 microglial 프로세스의 파생물 공부 하지만이 프로토콜 다른 화합물, 다른 종류의 자극 (예를 들어, 갇힌된 화합물), 테스트 하 고 테스트를 사용할 수 방법 방향 운동 성 돌연변이, 약리학 대리인, 또는 병 적인 상황에 의해 영향을 받습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는 세포와 조직의 이미징 시설 인 뒤 Fer à 무 랑, 어디 모든 이미지 수집 및 분석 수행 되었습니다 감사 합니다. 이 작품 일부는 센터 국립 드 라 검색 사이언스 인 국립 드 라 건강에 의해 지원 되었습니다 동부 표준시 드 라 공 들인 Médicale, 소 르 본 대학교 과학 그리고 소 르 본 Universités-피에르에서 교부 금에 의해 외 마리 퀴리 대학 ( Emergence-UPMC 프로그램 2011/2014)는 Fondation 부 la Recherche 쉬르 르 Cerveau, Fondation 드 프랑스에서 Fondation 라 검색 Médicale "Equipe FRM DEQ2014039529", 연구 (직원 회 부 라 Recherche 프랑스 정부, ANR-17-CE16-0008 및 Investissements d'Avenir 프로그램 "바이오 싸이 Labex" ANR-11-IDEX-0004-02) 및 전산 신경 과학 프로그램, 연구를 위한 국립 과학 재단/프랑스 국가 기관에서에서 공동 연구 (번호: 1515686). 모든 저자는 연구 제휴는 파리 학교 신경 (ENP) 바이오 싸이 Labex의 구성원을 그룹화 합니다. F.E. 소 르 본 대학교, Collège 박사, F-75005 파리, 프랑스, 제휴 박사 학생 이며 바이오 싸이 Labex에 의해 자금이 다. V.M.은 박사 후 연구원 전산 신경 과학 프로그램, 국립 과학 재단/프랑스 국립 기관 연구에 대 한 공동 연구에 의해 투자 (번호: 1515686). 저자는 프로젝트의 개시에 참가 마르타 Kolodziejczak 감사 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for pipettes preparation | |||
| Clark Borosilicate Thin Wall Capillaries | Harvard Apparatus | 30-0065 | Borosilicate Thin Wall without Filament, 1.5 mm OD, 1.17 mm ID, 75 mm L , Pkg. of 225 |
| DMZ Universal Puller | Zeitz Instrumente | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for solutions | |||
| Calcium Chloride dihydrate (CaCl2) | Sigma | C5080 | |
| Choline Chloride | Sigma | C7527 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma | A5960 | |
| Magnesium Chloride solution 1 M (MgCl2) | Sigma | 63020 | |
| Potassium chloride SigmaUltra >99.0% (KCl) | Sigma | P9333 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | S5886 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S5011 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Ultrapure water | MilliQ | for all the solutions | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for slice preparation | |||
| 2x 200 mL crystalizing dishes | |||
| 80 mL Pyrex beaker | |||
| Antlia-3C Digital Peristaltic pump | DD Biolab | 178961 | For mice perfusion and 2-photon chamber perfusion (aCSF) |
| Carbogen 5% CO2/95% O2 | Air Liquide France Industrie | ||
| Dolethal | Vetoquinol | Dolethal 50 mg/mL | |
| Filter papers (Whatman) | Sigma | WHA1001042 | Whatman qualitative filter paper, Grade 1 (Pore size: 11µM) |
| Fine Scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14060-60 | |
| Food box 10 cm diameter, 8 cm Height | |||
| glue (ethyl cyanoacrylate) | Loctite | super glue 3 power flex | |
| Hippocampal Tool (spatula) | Fine Science Tools | 10099-15 | The largest extremity has to be angled at 90° |
| Ice | |||
| Iris Forceps (curved) | Moria | MC31 | |
| Lens cleaning tissue | THOR LABS | ||
| Nylon mesh strainer | diameter 7 cm | ||
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | For the slicer |
| scalpel blade | |||
| Slice interface holder | home-made, the file for 3D printing is provided in Supplemental Material | ||
| Surgical Scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Vibrating slicer | Thermo Scientific | 720-2709 | Model: HM 650V (Vibrating blade microtome) |
| Water bath | Set at 32 °C (first recovery step) | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for slice imaging | |||
| × 25 0.95 NA water-immersion objective | Leica Microsystems (Germany) | HCX Irapo | |
| 2-photon MP5 upright microscope with resonant scanners (8 kHz) and two HyD Hybrid detectors | Leica Microsystems (Germany) | ||
| Antlia-3C Digital Peristaltic pump | DD Biolab | 178961 | For 2-photon chamber perfusion with aCSF |
| Carbogen 5% CO2/95% O2 | Air Liquide France Industrie | I1501L50R2A001 | |
| Chameleon Ultra2 Ti:sapphire laser | Coherent (Germany) | ||
| disposable transfer pipettes , wide mouth | ThermoFischer scientific | for example : 232-11 | 5.8 mL with fin tip, but we cut it (approx 7 cm) to have a 4 mm diameter mouth |
| emission filter SP680 | Leica Microsystems (Germany) | ||
| fluorescent cube containing a 525/50 emission filter and a 560 dichroic filter (for fluorescence collection) | Leica Microsystems (Germany) | ||
| glass beaker with 50 mL of ACSF to maintain constant perfusion of the slice | |||
| Heating system | Warner Instrument Corporation | Automatic Heater Controller TC-324B | to maintain perfusion solution at 32 °C |
| perfusion chamber | home-made, the file for 3D printing is provided in Supplemental Material | ||
| slice holder ("harp") | home made : hairpin made of platinum with the two branches joined by parallel nylon threads | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for slice stimulation | |||
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma | A-26209 | to be prepared ex-temporaneously : 1 mg/mL (3 mM) stock solution prepared the day of the experiment, kept at 4 °C (a few hours) and diluted just before use |
| Fluorescein (optional) | Sigma | F-6377 | use at 1 µM final |
| Micromanipulator | Luigs and Neumann | SM7 | connected to the micropipette holde |
| Micropipette holder | same as for eletrophysiology | ||
| Serotonin hydrochloride | Sigma | H-9523 | aliquots of 50mM stock solution in H20 kept at -20 °C. 500 µM solution prepared the day of the experiment. |
| Syringe 5 mL (without needle) | Terumo medical products | SS+05S1 | |
| Transparent tubing | Fischer Scientific | 11750105 | Saint Gobain Performance Plastics™ Tygon™ E-3603 Non-DEHP Tubing |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for image analysis | |||
| Fiji | https://fiji.sc | Schindelin, J. et al Nat. Methods (2012) doi 10.1038 | |
| Icy | Institut Pasteur | http://icy.bioimageanalysis.org | de Chaumont, F. et al. Nat. Methods (2012) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mice | |||
| CX3CR1-GFP mice | Jung et al, 2000 | male or females, P3 to 2 months-old ; we have backcrossed these mice on 129sv background. | |
| CX3CR1creER-YFP mice | Parkhurst et al 2013 | male or females, P3 to 2 months-old ; we have backcrossed these mice on 129sv background. |
References
- Salter, M. W., Stevens, B. Microglia emerge as central players in brain disease. Nature Publishing Group. 23 (9), 1018-1027 (2017).
- Tay, T. L., Savage, J., Hui, C. W., Bisht, K., Tremblay, M. -È Microglia across the lifespan: from origin to function in brain development, plasticity and cognition. The Journal of Physiology. , (2016).
- Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nature Neuroscience. 8 (6), 752-758 (2005).
- Nimmerjahn, A. Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in Vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Dissing-Olesen, L., et al. Activation of neuronal NMDA receptors triggers transient ATP-mediated microglial process outgrowth. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (32), 10511-10527 (2014).
- Gyoneva, S., Traynelis, S. F. Norepinephrine modulates the motility of resting and activated microglia via different adrenergic receptors. Journal of Biological Chemistry. 288 (21), 15291-15302 (2013).
- Eyo, U. B., et al. Neuronal hyperactivity recruits microglial processes via neuronal NMDA receptors and microglial P2Y12 receptors after status epilepticus. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (32), 10528-10540 (2014).
- Hristovska, I., Pascual, O. Deciphering Resting Microglial Morphology and Process Motility from a Synaptic Prospect. Frontiers in Integrative Neuroscience. 9, 1231 (2016).
- Avignone, E., Lepleux, M., Angibaud, J., Nägerl, U. V. Altered morphological dynamics of activated microglia after induction of status epilepticus. Journal of Neuroinflammation. 12, 202 (2015).
- Abiega, O., et al. Neuronal Hyperactivity Disturbs ATP Microgradients, Impairs Microglial Motility, and Reduces Phagocytic Receptor Expression Triggering Apoptosis/Microglial Phagocytosis Uncoupling. PLoS Biology. 14 (5), e1002466 (2016).
- Madry, C., et al. Microglial Ramification, Surveillance, and Interleukin-1β Release Are Regulated by the Two-Pore Domain K+Channel THIK-1. Neuron. 97 (2), 299-312 (2018).
- Honda, S., et al. Extracellular ATP or ADP induce chemotaxis of cultured microglia through Gi/o-coupled P2Y receptors. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 21 (6), 1975-1982 (2001).
- Haynes, S. E., et al. The P2Y12 receptor regulates microglial activation by extracellular nucleotides. Nature Neuroscience. 9 (12), 1512-1519 (2006).
- Wu, L. -J., Vadakkan, K. I., Zhuo, M. ATP-induced chemotaxis of microglial processes requires P2Y receptor-activated initiation of outward potassium currents. Glia. 55 (8), 810-821 (2007).
- Kolodziejczak, M., et al. Serotonin Modulates Developmental Microglia via 5-HT 2BReceptors: Potential Implication during Synaptic Refinement of Retinogeniculate Projections. ACS Chemical Neuroscience. 6 (7), 1219-1230 (2015).
- Schafer, D. P., et al. Microglia Sculpt Postnatal Neural Circuits in an Activity and Complement-Dependent Manner. Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).
- Pfeiffer, T., Avignone, E., Nägerl, U. V. Induction of hippocampal long-term potentiation increases the morphological dynamics of microglial processes and prolongs their contacts with dendritic spines. Scientific Reports. 6, 32422 (2016).
- Parkhurst, C. N., et al. Microglia Promote Learning-Dependent Synapse Formation through Brain-Derived Neurotrophic Factor. Cell. 155 (7), 1596-1609 (2013).
- Wu, Y., Dissing-Olesen, L., Macvicar, B. A., Stevens, B. Microglia: Dynamic Mediators of Synapse Development and Plasticity. Trends in Immunology. 36 (10), 605-613 (2015).
- Ohsawa, K., et al. P2Y12 receptor-mediated integrin-beta1 activation regulates microglial process extension induced by ATP. Glia. 58 (7), 790-801 (2010).
- Kurpius, D., Wilson, N., Fuller, L., Hoffman, A., Dailey, M. E. Early activation, motility, and homing of neonatal microglia to injured neurons does not require protein synthesis. Glia. 54 (1), 58-70 (2006).
- Stence, N., Waite, M., Dailey, M. E. Dynamics of microglial activation: a confocal time-lapse analysis in hippocampal slices. Glia. 33 (3), 256-266 (2001).
- Dissing-Olesen, L., Macvicar, B. A. Fixation and Immunolabeling of Brain Slices: SNAPSHOT Method. Current Protocols in Neuroscience. 71, 1.23.1-12 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- de Chaumont, F., et al. Icy: an open bioimage informatics platform for extended reproducible research. Nature Methods. 9 (7), 690-696 (2012).
- Aitken, P. G., et al. Preparative methods for brain slices: a discussion. Journal of Neuroscience Methods. 59 (1), 139-149 (1995).
- Paris, I., et al. ProMoIJ: A new tool for automatic three-dimensional analysis of microglial process motility. Glia. 66 (4), 828-845 (2018).
- Pagani, F., et al. Defective microglial development in the hippocampus of Cx3cr1 deficient mice. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9 (229), 111 (2015).
- Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in Molecular Biology. , Clifton, NJ. 221-242 (2014).
- Mainen, Z. F., et al.
- Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice. Journal of Neuroscience Methods. 171 (1), 118-125 (2008).
- Gyoneva, S., et al. Systemic inflammation regulates microglial responses to tissue damage in vivo. Glia. 62 (8), 1345-1360 (2014).
- Heindl, S., et al. Automated Morphological Analysis of Microglia After Stroke. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 106 (2018).
- Dailey, M. E., Eyo, U., Fuller, L., Hass, J., Kurpius, D. Imaging microglia in brain slices and slice cultures. Cold Spring Harbor Protocols. 12 (12), 1142-1148 (2013).
