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Neuroscience

तीव्र मस्तिष्क स्लाइस में एटीपी या सेरोटोनिन की ओर Microglial प्रक्रियाओं ' आकर्षण के दो-फोटॉन इमेजिंग

Published: January 31, 2019 doi: 10.3791/58788
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, *1,2,3, *1,2,3
1Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), UMR-S 1270 Paris, France, 2Sorbonne Université, Paris, France, 3Institut du Fer à Moulin, Paris, France
* These authors contributed equally

Summary

Microglia, मस्तिष्क के निवासी प्रतिरक्षा कोशिकाओं, अपने पर्यावरण के संशोधनों के लिए रूपात्मक परिवर्तन के साथ जल्दी से जवाब । इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के लिए चूहों की तीव्र मस्तिष्क स्लाइस में सेरोटोनिन या एटीपी की ओर microglial प्रक्रियाओं के आकर्षण का अध्ययन.

Abstract

Microglial कोशिकाओं के निवासी जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं मस्तिष्क कि लगातार उनकी लंबी प्रक्रियाओं के साथ अपने पर्यावरण को स्कैन और, homeostasis के विघटन पर, तेजी से रूपात्मक परिवर्तन से गुजरना कर रहे हैं । उदाहरण के लिए, एक लेजर घाव कुछ ही मिनटों में microglial प्रक्रियाओं की एक उंमुख वृद्धि, भी "दिशात्मक गतिशीलता" कहा जाता है, चोट की साइट की ओर लाती है । एक समान प्रभाव स्थानीय रूप से एटीपी या सेरोटोनिन (5-hydroxytryptamine [5-एचटी]) प्रदान करके प्राप्त किया जा सकता है । इस अनुच्छेद में, हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए एक स्थानीय आवेदन की ओर microglial प्रक्रियाओं के दिशात्मक विकास प्रेरित करने के लिए एटीपी या 5-युवा और वयस्क चूहों के तीव्र मस्तिष्क स्लाइस में एचटी और multiphoton माइक्रोस्कोपी द्वारा समय के साथ इस आकर्षण छवि. स्वतंत्र और खुले स्रोत छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ ठहराव का एक सरल तरीका प्रस्तावित है । एक चुनौती है कि अभी भी तीव्र मस्तिष्क स्लाइस की विशेषता सीमित समय है, उंर के साथ कम है, जिसके दौरान कोशिकाओं को एक शारीरिक स्थिति में रहते हैं । इस प्रोटोकॉल, इस प्रकार, कुछ तकनीकी सुधार (मध्यम, वायु तरल अंतरफलक कक्ष, एक डबल छिड़काव के साथ इमेजिंग चैंबर) पर प्रकाश डाला गया कई घंटे से अधिक microglial कोशिकाओं की व्यवहार्यता के अनुकूलन के उद्देश्य से, विशेष रूप से स्लाइस में वयस्क चूहों से ।

Introduction

Microglial कोशिकाओं मस्तिष्क के निवासी मैक्रोफेज और दोनों शारीरिक और रोग की स्थिति में एक भूमिका निभा रहे हैं1,2. वे एक उच्च बंटी आकृति विज्ञान है और लगातार विस्तार कर रहे है और उनकी प्रक्रियाओं3,4मुकर । इस "स्कैनिंग" व्यवहार से संबंधित है और उनके आसपास के सर्वेक्षण के लिए आवश्यक माना जा रहा है । microglia की रूपात्मक प्लास्टिक तीन मोड में व्यक्त की जाती है । सबसे पहले, कुछ यौगिकों तेजी से microglial आकृति मिलाना: एटीपी5,6 या मोर्फिन5,मध्यम स्नान तीव्र मस्तिष्क स्लाइस में7 के अलावा microglial असर की जटिलता बढ़ जाती है, जबकि norepinephrine घट जाती है यह6. इन प्रभावों को या तो सीधे microglial रिसेप्टर्स द्वारा मध्यस्थता कर रहे हैं (एटीपी और norepinephrine के लिए) या न्यूरॉन्स से एक एटीपी रिहाई की आवश्यकता (मोर्फिन के लिए). दूसरा, विकास और microglial प्रक्रियाओं के कर्षण गति, बुलाया गतिशीलता या "निगरानी", extracellular कारकों से प्रभावित किया जा सकता है8, homeostasis व्यवधान9,10, या परिवर्तन9, 10,11. तृतीया, आकृति विज्ञान और गतिशीलता के इन आइसोट्रोपिक परिवर्तन के अलावा, microglia एक पिपेट देने एटीपी3,5,12की ओर अपनी प्रक्रियाओं को दिशाहीन विस्तार करने की क्षमता है, 13 , 14, संस्कृति में, तीव्र मस्तिष्क स्लाइस में या vivo में, या तीव्र मस्तिष्क स्लाइस में 5-एचटी देने15. microglial प्रक्रियाओं की ऐसी उंमुख वृद्धि, भी दिशात्मक गतिशीलता कहा जाता है, पहले एक स्थानीय लेजर घाव3,4के लिए एक प्रतिक्रिया के रूप में वर्णित किया गया था । इस प्रकार, शारीरिक, यह चोट या synapses या मस्तिष्क के विकास के दौरान छंटाई की आवश्यकता क्षेत्रों की ओर microglial प्रक्रियाओं को लक्षित करने के लिए आवश्यक प्रतिक्रिया से संबंधित हो सकता है15,16, या शारीरिक17 में ,18,19 या रोग स्थितियों9,18,19,20 वयस्कता में । रूपात्मक परिवर्तन के तीन प्रकार के विभिंन intracellular तंत्र पर निर्भर11,13,20, और एक दिया यौगिक जरूरी उन सभी को नहीं मिलाना (जैसे, मोर्फिन, जो अप्रत्यक्ष रूप पर कार्य करता है microglia, आकृति विज्ञान पर एक प्रभाव है, लेकिन दिशात्मक गतिशीलता5,7) प्रेरित नहीं करता है । इसलिए, जब एक यौगिक, एक उत्परिवर्तन या microglia पर एक विकृति के प्रभाव को चिह्नित करने के लिए लक्ष्य, यह उनके रूपात्मक प्लास्टिक के तीन घटकों को चिह्नित करने के लिए महत्वपूर्ण है । यहां, हम यौगिक के एक स्थानीय स्रोत की ओर microglial प्रक्रियाओं के दिशात्मक विकास का अध्ययन करने के लिए एक विधि का वर्णन है, जो है, यहां, एटीपी या 5-एचटी.

microglia प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए कई मॉडल हैं ' आकर्षण: 3 डी वातावरण में प्राथमिक संस्कृतियों6,18,19, तीव्र मस्तिष्क स्लाइस6,13,15, और vivo में इमेजिंग3,13. vivo में दृष्टिकोण microglia की शारीरिक स्थिति को बनाए रखने के लिए सबसे अच्छा है । हालांकि, intravital इमेजिंग गहरी क्षेत्रों जटिल शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं की आवश्यकता है और, इसलिए, यह अक्सर सतही cortical परतों तक ही सीमित है । microglia प्राथमिक संस्कृति का उपयोग करने के लिए जानवरों की एक सीमित संख्या के साथ शर्तों की एक बड़ी संख्या का परीक्षण करने के लिए सबसे आसान तकनीक है । फिर भी, यह vivo में के रूप में एक ही सेल आकृति विज्ञान प्राप्त करने के लिए असंभव है, और कोशिकाओं ंयूरॉंस और astrocytes के साथ अपने शारीरिक बातचीत खो देते हैं । तीव्र मस्तिष्क स्लाइसें इन दो तरीकों के बीच एक समझौता प्रतिनिधित्व करते हैं । इस मॉडल शोधकर्ताओं मस्तिष्क संरचनाओं जो अंयथा तक पहुंचने के लिए और vivo में उच्च संकल्प के साथ छवि के लिए मुश्किल हो अध्ययन करने की अनुमति देता है, और नवजात चरणों से स्लाइस की जांच, जबकि transcranial माइक्रोस्कोपी ज्यादातर वयस्कता में प्रदर्शन किया है । अंत में, यह स्थानीय दवा आवेदन के प्रभाव वास्तविक समय में निरीक्षण करने के लिए, और जानवरों की एक सीमित संख्या का उपयोग करते हुए प्रयोगों को दोहराने के लिए संभव बनाता है. बहरहाल, तीव्र मस्तिष्क स्लाइस के साथ एक मुद्दा सीमित समय (कुछ घंटे) के दौरान कोशिकाओं को जीवित रहते हैं, विशेष रूप से दो सप्ताह से अधिक पुराने चूहों से स्लाइस के लिए, और microglia आकृति विज्ञान के संभावित परिवर्तन के समय21,22 .

यहां, हम दो महीने पुराने करने के लिए युवा और वयस्क Cx3cr1GFP/+ चूहों के तीव्र मस्तिष्क स्लाइसें तैयार करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन microglia आकृति विज्ञान और गतिशीलता के संरक्षण के साथ कई घंटे के लिए । हम तो, का वर्णन कैसे इन स्लाइस का उपयोग करने के लिए एटीपी या 5-एचटी जैसे यौगिकों की ओर microglial प्रक्रियाओं के आकर्षण का अध्ययन ।

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Protocol

सभी प्रयोगों को स्थानीय नैतिक समिति (डार्विन की समिति, समझौतों #1170 और #10921) द्वारा अनुमोदित किया गया.

1. यौगिकों के स्थानीय अनुप्रयोग के लिए ग्लास Micropipettes की तैयारी

  1. एक इलेक्ट्रोड खींचने के साथ borosilicate पतली दीवार कांच केशिकाओं से पिपेट तैयार करें । अपने चरम पर एक 4-5 µm व्यास के साथ पिपेट प्राप्त करने के लिए मापदंडों को समायोजित करें । चित्रा 2d कम आवर्धन पर brightfield में एक पिपेट से पता चलता है ।

2. समाधान

  1. सुनिश्चित करें कि केवल कांच के एक आटोक्लेव चक्र द्वारा साफ किया गया है कि, ultrapure पानी के साथ 2x-3x धोने के बाद, इस्तेमाल किया जाएगा । paraformaldehyde के साथ संपर्क में किया गया है कि कांच के साथ प्रयोग कभी नहीं ।
  2. तैयार एक 2 मोल · एल-1 CaCl2 शेयर समाधान भंग करके १४.७ मिलीग्राम की CaCl2· 2H2O में ५० मिलीलीटर उच्च शुद्धता के पानी की (ultrapure जल, प्रतिरोध १८.२ MΩ; आसुत जल में धातु के निशान या नल का पानी के लिए नेतृत्व कर सकते है इष्टतम स्लाइस गुणवत्ता के कारण प्रो-ऑक्सीडेटिव इफेक्ट).
    1. एक महीने की अधिकतम के लिए कमरे के तापमान पर इस शेयर समाधान की दुकान ।
  3. प्रयोग के दिन, तैयार choline के 1 L-aCSF (कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव) समाधान, जिसकी रचना है ११० mmol · एल-1 choline सीएल, 25 mmol · एल-1 ग्लूकोज, 25 mmol · L-1 NaHCO3, 7 mmol · L-1 MgCl2, ११.६ mmol · एल-1 ascorbic एसिड की, ३.१ mmol · एल-1 सोडियम पाइरूवेट, २.५ mmol · L-1 KCl, १.२५ mmol · L-1 णः2पो4, व ०.५ mmol · एल-1 CaCl2, ०.५.
    1. इस समाधान को तैयार करने के लिए, निम्न क्रम में, एक 1 L के लिए स्नातक की कुप्पी: ०.१८६ g of KCl, ०.१९५ g of णः2पीओ4, २.०४ g of acid ascorbic, २.१ g ऑफ़ NaHCO3, and ४.५ g ऑफ़ ग्लूकोज.
    2. ultrapure पानी के साथ अंतिम मात्रा के बारे में आधा भरें और पूरा विघटन जब तक हलचल ।
    3. choline सीएल के सोडियम पाइरूवेट और १५.३६ ग्राम के ०.३४ ग्राम जोड़ें ।
      नोट: यह पूरी समाधान करने के लिए जोड़ने से पहले चरण 2.3.2 में तैयार समाधान के 5 से 10 मिलीलीटर के साथ choline सीएल पहले भंग करने के लिए सुविधाजनक है ।
    4. 1 के 7 मिलीलीटर जोड़ें · एल-1 MgCl2 और २५० µ l के 2 मोल · L-1 CaCl2 (चरण २.२ में तैयार) समाधान करने के लिए ।
    5. एेसे कुप्पी को ultrapure पानी के साथ 1 L तक भरें ।
    6. एक भाप दबाव osmometer के साथ, जांच करें कि osmolarity ३०० और ३१० mΩ के बीच है । यदि नहीं, तो इसे ग्लूकोज के साथ समायोजित करें ।
    7. carbogenation के बाद पीएच की जांच करें (यानी, "carbogen" के साथ bubbling, ९५% ओ2/5% सह2का मिश्रण) और इसे समायोजित करें, यदि आवश्यक हो, ७.३-७.४ के साथ 10 मीटर NaOH के लिए ।
    8. भंडारण के लिए एक गिलास बोतल के लिए समाधान स्थानांतरण । बोतल को फ्रिज में रखकर इस्तेमाल करने तक रखें (स्टेप ३.१).
      नोट: इसके लिए प्रयोग के दिन नए सिरे से समाधान करने की सिफारिश की गई है । हालांकि, यदि आवश्यक हो, choline-aCSF को 4 डिग्री सेल्सियस पर दो दिनों तक संग्रहित किया जा सकता है ।
  4. प्रयोग के दिन, एक aCSF समाधान के 1 L तैयार, जिसकी रचना है १२४ mmol · L-1 NaCl, २६.२ mmol · L-1 NaHCO3, 25 mmol · एल-1 ग्लूकोज, २.५ mmol · L-1 KCl, 2 mmol · L-1 CaCl2, 1 mmol · L-1 MgCl2, व १.२५ mmol · L-1 णः2पो4.
    1. इस समाधान को तैयार करने के लिए, निम्न क्रम में, एक स्नातक की कुप्पी के लिए: ०.१५० g णः के2पीओ4, ०.१८६ g of KCl, २.२ g of NaHCO3, ४.५ g of ग्लूकोज, और ७.३ g of NaCl. ultrapure पानी के साथ 1 L के एक खंड के समाधान लाओ और यह एक हलचल प्लेट पर जोरदार हलचल ।
    2. 1 का 1 मिलीलीटर जोड़ें · एल-1 MgCl2 और 1 एमएल के 2 मोल · एल-1 CaCl2 समाधान करने के लिए और भंडारण के लिए एक गिलास बोतल के लिए aCSF समाधान हस्तांतरण ।
    3. जांच करें कि क्या osmolarity है ३००-३१० mΩ · एल-1 और, अगर नहीं, यह ग्लूकोज के साथ समायोजित करें ।
    4. carbogenation के बाद पीएच की जांच करें (यानी, "carbogen" के साथ bubbling) और इसे समायोजित करें, यदि आवश्यक हो, ७.३-७.४ के साथ 10 मीटर NaOH के लिए ।
    5. भंडारण के लिए एक गिलास बोतल के लिए समाधान स्थानांतरण । बोतल को फ्रिज में रखकर इस्तेमाल करने तक रखें (स्टेप ३.१).
      नोट: इसके लिए प्रयोग के दिन नए सिरे से समाधान करने की सिफारिश की गई है । हालांकि, एक वैकल्पिक NaCl, NaHCO3, KCl युक्त एक 10x स्टॉक समाधान तैयार करने के लिए है, और2पीओ4 में 10x अंतिम एकाग्रता है, जो 4 डिग्री सेल्सियस से कम नहीं एक सप्ताह के लिए संग्रहीत किया जा सकता है । ultrapure पानी के साथ 10x शेयर समाधान कमजोर और ग्लूकोज, CaCl2, और MgCl2जोड़ने के द्वारा प्रयोग के दिन पर अंतिम aCSF बनाओ ।
  5. प्रयोग के दिन दवा समाधान तैयार करें । aCSF समाधान का उपयोग करने के लिए उंहें अंतिम सांद्रता जो कर रहे हैं, यहां लाने के लिए, ५०० µmol · एल-1 के लिए एटीपी और 5 µmol · एल-1 के लिए 5-एचटी.
    नोट: एटीपी के लिए, एक शेयर समाधान तैयार किया जा सकता है (जैसे, पानी में ५० मिमी एटीपी), aliquoted फार्म में संग्रहित-20 ° c, और प्रयोग के दिन पर अंतिम एकाग्रता के लिए aCSF के साथ पतला । इसके विपरीत, 5-एचटी (सेरोटोनिन-HCl) समाधान प्रयोग के दिन पर पाउडर से तैयार किया जाना चाहिए, 1 मिलीग्राम · एमएल-1 पानी में, 5-एचटी ऑक्सीकरण से बचने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा, और प्रयोग के समय aCSF में पतला ।

3. तीव्र मस्तिष्क स्लाइस की तैयारी

  1. विच्छेदन क्षेत्र की तैयारी
    1. एक ८० मिलीलीटर बर्फ पर रखा चोंच में बर्फ ठंडा choline-aCSF के ७० मिलीलीटर तैयार, हृदय छिड़काव के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए, मस्तिष्क के नीचे तेजी से ठंडा, और टुकड़ा करने की क्रिया । ३२ डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा एक गर्म पानी स्नान में रखा एक २०० मिलीलीटर सघन पकवान में choline-aCSF के १५० मिलीलीटर तैयार करें । सघन पकवान में एक नायलॉन जाल छलनी प्लेस स्लाइस बनाए रखने के लिए । यह जाने के लिए स्लाइसें सिर्फ टुकड़ा करने के बाद 10 मिनट के लिए ठीक किया जाएगा ।
    2. विच्छेदन (धारा ३.२) शुरू करने से पहले कम से कम 30 मिनट, bubbling इन दो समाधान (choline के ७० मिलीलीटर बर्फ पर aCSF और choline के १५० मिलीलीटर-३२ डिग्री सेल्सियस पर aCSF) carbogen के साथ शुरू करते हैं । पूरी प्रक्रिया के दौरान निरंतर carbogenation बनाए रखें ।
    3. इंटरफेस चैंबर डिवाइस (चित्रा 1C), जो उनके उपयोग तक स्लाइस रखने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा तैयार करते हैं ।
      1. एक सील भोजन बॉक्स में (10 x 10 सेमी या व्यास में 10 सेमी, ऊंचाई में 8 सेमी), एक चुंबकीय सरगर्मी पर स्थापित, एक बार चुंबक के साथ एक २०० मिलीलीटर सघन पकवान जगह है ।
      2. इस सघन पकवान में aCSF के २०० मिलीलीटर जोड़ें और यह के शीर्ष पर 3 डी-मुद्रित इंटरफेस टुकड़ा धारक जगह (अंतरफलक टुकड़ा धारक दो पूरी तरह से फिटिंग भागों से बना है, एक पॉलियामाइड के बीच फैला जाल के साथ, आंकड़ा 1a, बी) ।
      3. सघन पकवान से अतिरिक्त मात्रा निकालें समाधान की केवल एक पतली फिल्म इंटरफेस टुकड़ा धारक के जाल को कवर रखने के लिए । यह बाद में स्लाइस आसपास के समाधान का एक अच्छा रिम बनाने के लिए होगा (लेकिन उन्हें कवर के बिना).
      4. खाना बॉक्स के तल पर aCSF के कुछ मिलीमीटर रखो और carbogen के साथ bubbling शुरू (पहली बार उपयोग में, सील खाना बॉक्स दीवार में एक छोटा सा छेद बनाने के लिए यकीन है कि टयूबिंग बॉक्स में प्रवेश कर सकते हैं) ।
      5. लगातार carbogenation बनाए रखते हुए सील बॉक्स को बंद करें । यह एक humidified ९५% O2/5% सह2 अमीर वातावरण में स्लाइसें choline-aCSF में उनकी वसूली के बाद स्थानांतरित कर दिया जाएगा और बनाए रखने से पहले वे छवि बनाई है बनाया जाएगा । इस उपकरण के बाद "इंटरफेस चैंबर" (चित्रा 1C) के रूप में जाना जाता है ।
  2. मस्तिष्क विच्छेदन और टुकड़ा करने की क्रिया
    1. Anesthetize माउस के एक intraperitoneal इंजेक्शन के साथ ५० मिलीग्राम · एमएल-1 pentobarbital (०.१५ मिलीलीटर/माउस शरीर के वजन के 20 ग्राम), यह स्थिर, दिल बेनकाब, और बर्फ के 10 मिलीलीटर के साथ एक हृदय छिड़काव प्रदर्शन ठंडा, carbogenated, choline-aCSF (देखें कदम 3.1.1), एक सिकुड़नेवाला पंप के साथ । एक अच्छा छिड़काव के एक संकेतक के रूप में जिगर का पीलापन निरीक्षण । छिड़काव 5 मिनट से भी कम समय तक रहता है ।
    2. माउस को Decapitate और खोपड़ी को बेनकाब करने के लिए त्वचा में कटौती । बड़ी कैंची के साथ, बड़े फोरमेन और एक लंबे sagittal कटौती से दो आड़ा कटौती लागू करते हैं और, ठीक संदंश का उपयोग कर, खोपड़ी प्लेटों को हटा दें ।
    3. जल्दी और धीरे मस्तिष्क निकालने (1 मिनट से कम में) और यह ८० मिलीलीटर शेष (~ ६० मिलीलीटर) बर्फ ठंड choline-aCSF (अभी भी निरंतर carbogenation के तहत) युक्त चोंच में 1 मिनट के लिए जगह है, ताकि इसे शांत करने के लिए नीचे ।
    4. एक फिल्टर पहले aCSF के साथ गीला कागज पर मस्तिष्क स्थानांतरण ।
    5. ब्याज और टुकड़ा करने की क्रिया के पसंदीदा कोण के मस्तिष्क क्षेत्र के अनुसार बाहर कट मस्तिष्क । उदाहरण के लिए, thalamus या कोरोनरी स्लाइस पर हिप्पोकैम्पस छवि के लिए, एक स्केलपेल ब्लेड सेरिबैलम के साथ बाहर कट और, फिर, के बारे में 2 मिमी rostral और caudal मस्तिष्क के उग्रवाद से.
      नोट: यह मस्तिष्क भागों है कि बहुत rostral या बहुत caudal है दूर करने के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि छोटे क्षेत्र ब्याज के क्षेत्र तक पहुंचने से पहले ट्रिम करने के लिए, तेजी से टुकड़ा करने की क्रिया । टुकड़ा करने की क्रिया के लिए एक कुल समय (चरण 3.2.7) से कम 20 मिनट की सिफारिश की है ।
    6. राज्याभिषेक के लिए स्लाइस, स्थिति और गोंद (cyanoacrylate गोंद के साथ) एक 10 सेमी पेट्री डिश पर मस्तिष्क का caudal चेहरा, एक हिल स्लाइसर के काटने के ब्लॉक पर चिपके हुए और यह हिल स्लाइसर के जलाशय चैंबर में स्थिति है, जो एक बड़े चैंबर में तैनात है बर्फ से भर गया । फिर, पेट्री डिश को सभी बचे हुए आइस-कोल्ड choline-aCSF के साथ भरें ।
    7. जबकि लगातार ९५% ओ2/5% कं बर्फ के2 bubbling-शीत choline-aCSF, कट ३०० µm-मोटी राज्याभिषेक स्लाइसें (गति: ०.०८ mm · s-1, ब्लेड कंपन: ६० हर्ट्ज, कंपन आयाम: 1 मिमी) ।
    8. एक चौड़े मुंह के साथ मस्तिष्क स्लाइसें ले लीजिए (व्यास में 4 मिमी) डिस्पोजेबल स्थानांतरण पिपेट, ब्लेड के हर एक पास के बाद एक के बाद एक, स्लाइस की परिधि द्वारा जारी विषाक्त घटकों के संचय से बचने के लिए. स्थानांतरण के दौरान हवा के बुलबुले से बचने और वसूली के लिए लगभग 10 मिनट के लिए ३२ डिग्री सेल्सियस पर choline-aCSF में प्रत्येक टुकड़ा जगह देखभाल करने के लिए ले लो ।
    9. स्थानांतरण पिपेट के साथ, लेंस के टुकड़ों पर स्लाइस जगह-कागज सफाई choline-aCSF की एक बूंद के साथ अव्वल रहा । महाप्राण choline के अतिरिक्त-aCSF और, रंग के साथ, स्लाइस जगह, लेंस सफाई ऊतक पर रखी, इंटरफेस कक्ष तापमान पर carbogenated aCSF युक्त कक्ष के जाल पर (3.1.3.5 देखें) । चलो इस वातावरण में टुकड़ा ठीक से कम 30 मिनट के लिए ।
      नोट: इस के बाद, स्लाइसें तैयार हैं और microglia इमेजिंग के लिए 6 ज तक के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है युवा से मस्तिष्क निष्कर्षण के बाद (एक महीने से कम पुराने) चूहों और दो महीने पुराने वयस्कों से मस्तिष्क निष्कर्षण के बाद 4 ज तक.

4. दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी

  1. पैरामीटर्स सेटिंग
    1. multiphoton प्रणाली पर स्विच (हाइब्रिड डिटेक्टरों, लेजर, स्कैनर, इलेक्ट्रो ऑप्टिक मॉडुलन, माइक्रोस्कोप).
    2. ९२० एनएम पर लेजर ट्यून, जांच करें कि लेजर मोड है, बंद, और 5% पर बिजली सेट-15% और लाभ पर 10% । यह उद्देश्य के तहत 3-5 मेगावाट की एक शक्ति के अनुरूप है । सुनिश्चित करें कि nondescanned डिटेक्टरों और लगे उचित उत्सर्जन और उत्तेजना फिल्टर स्थापित कर रहे हैं ।
    3. निम्न मान के लिए इमेजिंग सॉफ़्टवेयर के पैरामीटर सेट करें: फ़्रेम आकार के लिए, १०२४ x १०२४ पिक्सेल २९५.०७ x २९५.०७ µm के किसी क्षेत्र के लिए संगत; ज़ूम, 2 के लिए । यदि संकेत बहुत शोर है, 2 की एक पंक्ति औसत लागू होते हैं । पिक्सेल गतिशीलता के लिए, 12 बिट्स या अधिक पर इमेजिंग सॉफ़्टवेयर सेट करें ।
      नोट: एक उच्च बिट मूल्य के साथ छवियां शोधकर्ताओं ने एक कम बिट मूल्य के साथ छवियों से प्रतिदीप्ति तीव्रता में छोटे मतभेदों को अलग करने की अनुमति: एक 8-bit छवि में एक ग्रे मूल्य के परिवर्तन के लिए 16 ग्रे मूल्यों के एक 12-bit में परिवर्तन के अनुरूप होगा और २५६ ग्रे मूल्यों मैं एक 16-bit छवि n । इसलिए, उच्च बिट छवियों मात्रात्मक विश्लेषण के लिए और अधिक उपयुक्त हैं, लेकिन के रूप में बिट गहराई, भंडारण क्षमता के साथ उनके आकार बढ़ जाती है, और कंप्यूटिंग शक्ति सीमित हो सकता है ।
    4. 2 µm और एक T-अंतराल के 2 मिनट पर एक Z-अंतराल श्रेणी के साथ स्कैन मोड XYZT चयन करें ।
      नोट: x, y और z संकल्प Nyquist नमूना प्रमेय द्वारा निर्धारित कर रहे हैं । ०.८ के आसपास एक जेड कदम आकार microglia प्रक्रियाओं को हल करने के लिए इष्टतम होगा (< 1 µm के व्यास के साथ), लेकिन multiphoton माइक्रोस्कोपी के ऑप्टिकल संकल्प (एक ०.९५ ना उद्देश्य के साथ ९२० एनएम पर सीमित है, अक्षीय संकल्प के आसपास है 1 µm). उस शारीरिक बाधा के शीर्ष पर, एक जीवित इमेजिंग प्रयोग में, संवेदनशीलता या संकेत करने वाली शोर अनुपात, संकल्प, गति, और कुल अवलोकन समय मामला है । खाते में इन सभी मापदंडों ले, एक z-2 µm के कदम (के रूप में कई अध्ययनों में3,11,14), १०२४ x १०२४ पिक्सल के एक छवि आकार, और एक उच्च गति अधिग्रहण एक गुंजयमान HyD डिटेक्टरों को युग्मित स्कैनर का उपयोग कर (यह लगभग 15 एस ५० जेड योजनाओं को प्राप्त करने के लिए लेता है) यहां का चयन किया गया । अधिग्रहण की आवृत्ति एक XYZT श्रृंखला हर 2 मिनट और कुल अवधि है 30 मिनट है । यदि सेट-अप तेज या संवेदनशील पर्याप्त नहीं है, यह पार्श्व संकल्प को कम करने के लिए संभव है (नीचे ५१२ x ५१२) या z-स्लाइस की संख्या (विशेष रूप से z में इमेजिंग द्वारा-गहराई जो सबसे मजबूत प्रतिदीप्ति प्रदर्श [यानी, नहीं गहरे z-स्लाइस जहां प्रतिदीप्ति बेहोश है]), या स्कैनर की गति कम करने के लिए । 3 µm तक z-step बढ़ाने के सलए ताव को भी कम किया जा सकता है, लेकिन जैसे-जैसे यह ठहराव को प्रभावित कर सकता है, सभी प्रयोगों की तुलना उसी जेड-स्टेप के साथ की जानी चाहिए ।
      नोट: यह CX3CR1creER से स्लाइस पर समान प्रयोग करने के लिए संभव है-YFP18चूहों, एक माउस लाइन microglia में आनुवंशिक विलोपन प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया ही है, और जिसमें microglia constitutively एक्सप्रेस पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP) । हालांकि, YFP के अभिव्यक्ति स्तर CX3CR1GFP/+ चूहों में ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) की तुलना में बहुत कम है; इस प्रकार, इमेजिंग संभव है, लेकिन चुनौतीपूर्ण है और अधिग्रहण मापदंडों के अनुकूलन की आवश्यकता है । यह उन्हें निम्नानुसार समायोजित करने के लिए सिफारिश की है.
    5. ९७० एनएम पर लेजर ट्यून (जो बेहतर ९२० एनएम से YFP उत्तेजना के लिए अनुकूलित है), ५०% से कम बिजली, और ५०% है, जो 5-6 मेगावाट के उद्देश्य के तहत एक लेजर शक्ति से मेल खाती है पर लाभ ।
    6. सिग्नल-टू-शोर अनुपात में सुधार करने के लिए 4 (या अधिक) की एक पंक्ति औसत सेट करें ।
  2. टुकड़ा की स्थिति और कांच micropipette के, और यौगिक के स्थानीय अनुप्रयोग
    1. रिकॉर्डिंग शुरू करने से पहले रिकॉर्डिंग चैंबर, 30 मिनट के लिए सिकुड़नेवाला पंप कनेक्ट । ultrapure पानी की ५० मिलीलीटर के साथ पूरे छिड़काव प्रणाली की सफाई के बाद, लगातार carbogenation के तहत एक ग्लास चोंच में निहित aCSF (५० एमएल) के साथ रिकॉर्डिंग चैंबर के छिड़काव शुरू करते हैं । प्रयोग के दौरान, एक इनलाइन microheater या एक Peltier हीटर के साथ ३२ डिग्री सेल्सियस के लिए परिचालित aCSF रखें ।
      नोट: ऊपर और नीचे छिड़काव के साथ एक विशिष्ट छिड़काव कक्ष स्लाइस के दोनों किनारों पर ऑक्सीजन का अनुकूलन करने के लिए डिज़ाइन किया गया है । छिड़काव चैंबर दो पूरी तरह से फिटिंग भागों से बना है, एक पॉलियामाइड उन दोनों के बीच फैला जाल के साथ (चित्रा 2a, ख). चैंबर के अंय प्रकार, जहां टुकड़ा सीधे एक गिलास coverslip पर बिछाने के साथ तुलना में, इस कक्ष टुकड़ा के नीचे भाग में न्यूरॉन मौत कम कर देता है, व्यवहार्यता में सुधार, और टुकड़ा अपनी सूजन से प्रेरित आंदोलनों कम कर देता है ।
    2. एक चौड़े मुंह डिस्पोजेबल हस्तांतरण पिपेट के साथ, मस्तिष्क टुकड़ा स्थानांतरण aCSF चोंच को imaged करने के लिए लेंस कागज हटाने के लिए, इसे सिंक (एक सबूत के रूप में है कि कोई हवा बुलबुला जुड़ा हुआ है), और यह रिकॉर्डिंग (छिड़काव) चैंबर के लिए स्थानांतरण ।
    3. एक स्लाइस धारक की स्थिति (एक hairpin दो शाखाओं समानांतर नायलॉन धागे से जुड़े हुए के साथ प्लैटिनम का बना) स्लाइस पर छिड़काव प्रवाह के कारण टुकड़ा आंदोलन को कम करने के लिए ।
    4. एक कम आवर्धन उद्देश्य (5x या 10x) का उपयोग कर (जोखिम समय: ५० से ८० ms) ब्याज की मस्तिष्क क्षेत्र को लक्षित करने के लिए उज्ज्वल क्षेत्र रोशनी का प्रयोग करें । उच्च आवर्धन के लिए स्विच (एक 0.35 x लेंस के साथ 25x) जल विसर्जन उद्देश्य और स्थिति को समायोजित करें ।
      नोट: वे प्रकाश ब्लॉक और स्थानीय रूप से टुकड़ा ख़राब कर सकते हैं के रूप में स्लाइस धारक के नायलॉन धागे के लिए करीब छवि क्षेत्रों से बचें । सुनिश्चित करें कि ब्याज का क्षेत्र सपाट है । यदि आवश्यक हो, टुकड़ा धारक को हटाने के क्रम में स्लाइस और/या टुकड़ा धारक का स्थान है ।
    5. प्रतिदीप्ति रोशनी का प्रयोग करने के लिए फ्लोरोसेंट microglial कोशिकाओं क्षेत्र में imaged हो (जोखिम समय: २५०-५०० ms) का पता लगाने के लिए ।
      नोट: यह कदम शोधकर्ताओं के हित के क्षेत्र में कोशिकाओं की उपस्थिति और उनके प्रतिदीप्ति तीव्रता की जांच करने के लिए अनुमति देता है, और सेलुलर मलबे की मात्रा के लिए नियंत्रित करने के लिए ।
    6. Backfill एटीपी, 5-एचटी, या अपनी अंतिम एकाग्रता पर ब्याज की दवा के साथ aCSF के 10 µ एल के साथ पिपेट । टिप नीचे बिंदु और धीरे से दवा भरी पिपेट हिला किसी भी हवा टिप में फंस बुलबुले को दूर करने के लिए ।
      नोट: यदि समाधान इंजेक्शन के लिए बुलबुले के रूप में हो जाता है, एक आंतरिक रेशा के साथ borosilicate पिपेट का उपयोग करने पर विचार करें । पिपेट से बाहर एटीपी के रिसाव इंजेक्शन से पहले भी microglial प्रक्रियाओं को आकर्षित कर सकते हैं (यदि ऐसा होता है, यह विश्लेषण कदम पर दिखाई जाएगी). हालांकि इस एटीपी इस्तेमाल किया एकाग्रता के साथ उदार होना चाहिए (५०० µmol · L-1), यदि यह एक मुद्दा है, aCSF के 2 मिलीलीटर के साथ micropipette भरने पर विचार पहले एटीपी (या अन्य यौगिक) कदम 4.2.6 पर समाधान जोड़ने के लिए.
    7. एक पिपेट धारक में भरा पिपेट माउंट, एक 5 मिलीलीटर सिरिंज के लिए पारदर्शी टयूबिंग के साथ जुड़े, एक गोताख़ोर 5 मिलीलीटर की स्थिति में तैनात के साथ । पिपेट धारक ही एक तीन धुरी micromanipulator पर मुहिम शुरू की है ।
    8. उज्ज्वल क्षेत्र रोशनी के तहत, क्षेत्र के केंद्र में पिपेट स्थिति के लिए micromanipulator का उपयोग करें । एक reproducible और इष्टतम केंद्र के लिए, प्रदर्शन और छवि पर शासकों का उपयोग करें ।
    9. टुकड़ा की ओर धीरे पिपेट कम, नियंत्रण और एक ही समय में उद्देश्य को समायोजित, जब तक पिपेट टिप हल्के से टुकड़ा की सतह को छू लेती है । पिपेट के वंश को रोकने के रूप में जल्द ही के रूप में यह दिख रहा है कि टुकड़ा छुआ गया है पिपेट टिप ८०-टुकड़ा की सतह के १०० µm घुसना करने के लिए अनुमति देता है ( चित्र बी) देखें ।
    10. ट्यून लेजर (ऊपर मापदंडों को देखें) और multiphoton मोड के लिए माइक्रोस्कोप स्विच । सुनिश्चित करें कि कक्ष किसी भी प्रकाश स्रोत से दिखलाई पड़ता है (उदा., कंप्यूटर स्क्रीन) । nondescanned डिटेक्टरों पर स्विच और लाभ निर्धारित किया है । छवि में पिक्सेल संतृप्त करने से बचने के लिए एक रंग-कोडेड ऊपरी सीमा के साथ एक लुकअप तालिका (LUT) का उपयोग करें ।
    11. स्लाइस की मोटाई निर्धारित करने के लिए imaged हो (यानी, ऊपरी और निचले z पदों जहां प्रतिदीप्ति detectable है [आमतौर पर २२० और २९० µm के बीच कुल में]) ।
      नोट: स्लाइस की सतह पर, वहां प्रक्रियाओं की एक वृद्धि हुई घनत्व और संभवतः microglia की, एक असामांय आकृति विज्ञान के साथ, टुकड़ा के अंदर की तुलना में अक्सर है । इस संचय और अधिक समय के साथ हड़ताली हो जाएगा (यानी, पहले मस्तिष्क टुकड़ा में से पिछले में अधिक दिखाई छवि बनने के लिए) । इसलिए, z-विमानों पहले ~ 30 µm में विश्लेषण के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए और भी अधिग्रहण के लिए छोड़ दिया जा सकता है ।
    12. 30 मिनट की कुल अवधि के लिए रिकॉर्डिंग शुरू (या अधिक अगर वांछित) और एक 5 मिनट आधार रेखा के बाद, स्थानीय रूप से (इमेजिंग दखल के बिना) परीक्षण किया जा करने के लिए यौगिक लागू होते हैं. ऐसा करने के लिए धीरे से micropipette से जुड़े सिरिंज के गोताख़ोर को दबाते हुए, 5 एमएल से लेकर 1 एमएल पोजिशन (लगभग 5 एस) में दबाएं । गोताख़ोर दबाने जब प्रतिरोध तुरंत महसूस किया जाना चाहिए । यदि नहीं, तो टिप टूट सकता है ।
      नोट: एक प्रशिक्षित प्रयोगकर्ता के लिए, इस विधि के साथ इंजेक्शन reproducible हैं, लेकिन वैकल्पिक रूप से एक सिरिंज के मैनुअल हेरफेर करने के लिए, पिपेट दिया मात्रा का एक बेहतर नियंत्रण की अनुमति के लिए एक स्वचालित दबाव इंजेक्शन प्रणाली से जोड़ा जा सकता है. इंजेक्शन इंजेक्शन की साइट पर टुकड़ा की एक शारीरिक विकृति पैदा करता है । इस विकृति इंजेक्शन के बाद पहले दो या तीन छवियों में एक posteriori दिखाई है, लेकिन चौथी छवि पर दिखाई नहीं होना चाहिए, (यानी, इंजेक्शन के बाद 8 मिनट). यदि यह बनी रहती है, पिपेट तैयारी के लिए पैरामीटर्स बदलने पर विचार करें ।
    13. अधिग्रहण के अंत में (30 मिनट), micropipette त्यागें और टुकड़ा हटा दें । यदि वांछित, आगे immunolabeling के लिए टुकड़ा ठीक । उदाहरण के लिए, स्नैपशॉट विधि निर्धारण और मोटा स्लाइस23के धुंधला होने के लिए ऑप्टिमाइज़ किया गया है ।
    14. छवि के लिए एक नया टुकड़ा शुरू करने से पहले, 2 डी फिल्म (धारा ५.१) बनाने के क्रम में जांच करने के लिए कि microglia एक सामांय आकृति विज्ञान है और आगे बढ़ रहे है और, इस प्रकार, कि स्लाइस स्वस्थ हैं ।

5. Microglial प्रक्रियाओं के आकर्षण का विश्लेषण

  1. 2d प्रक्षेपण और बहाव सुधार
    1. फ़ाइल खोलें (. लिफ) के साथ फिजी24.
    2. यदि आवश्यक हो, तो केवल z-ब्याज के विमानों के साथ एक उपस्टैक (छवि/स्टैक्स/ उदाहरण के लिए, z-टुकड़ा की सतह के अनुरूप विमानों को बाहर अगर वे प्राप्त कर लिया गया है, लेकिन विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा नहीं कर रहे है (कदम 4.2.11 के बाद नोट देखें) और गहरी z-नहीं प्रतिदीप्ति के साथ विमानों । अंतिम स्टैक सामांयत: ९०-११० z-स्लाइस (१८०-२२० µm) होते हैं ।
    3. z परियोजना समारोह (छवि/स्टैक्स/z परियोजना") लॉंच और प्रत्येक समय बिंदु पर प्राप्त z-स्टैक के अनुमानों को बनाने के लिए अधिकतम तीव्रता प्रोजेक्शन प्रकार का चयन करें ।
    4. प्रक्षेपण MultiStackReg प्लगइन (प्लगइन/पंजीकरण/MultiStackReg), 1 कार्रवाई का चयन: संरेखित करें और परिवर्तन: कठोर शरीर के लिए थोड़ा सा है कि अधिग्रहण के दौरान हुई हो सकता है सही बहाव । इस 2d चलचित्र को नई फ़ाइल (. tiff) के रूप में सहेजें ।
  2. डेटा प्रोसेसिंग
    1. बर्फीली25के साथ इस नई फ़ाइल को खोलें ।
    2. व्यास में ३५ µm के ब्याज (ROI) के एक परिपत्र R1 क्षेत्र ड्रा, इंजेक्शन साइट पर केंद्रित (पिपेट की छाया द्वारा विशेष रूप से पहचान की और इंजेक्शन के समय बनाया विकृति).
    3. प्लगइन रॉय तीव्रता विकास का प्रयोग करें और R1 में समय के साथ मतलब तीव्रता को मापने ।
    4. परिणामों को एक पर सहेजें । XLS फ़ाइल ।
  3. ठहराव और परिणामों का प्रतिनिधित्व
    1. समय के साथ microglial प्रतिक्रिया को बढ़ाता है, प्रत्येक समय बिंदु पर निर्धारित करें
      Equation
      यहां, ' r1 (0) इंजेक्शन से पहले r1 (टी) मूल्यों का मतलब है । फिर, परिणाम microglial प्रतिक्रिया के एक काइनेटिक के रूप में प्रतिनिधित्व किया जा सकता है, या एक विशिष्ट समय बिंदु पर ( चित्रा 7देखें) ।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल के लिए प्रेरित करने के लिए एक विधि का वर्णन, निरीक्षण, और एक स्थानीय रूप से लागू यौगिक की ओर microglial प्रक्रियाओं की उंमुख वृद्धि, उदाहरण के लिए, एटीपी या 5-एचटी, युवा या वयस्क से तीव्र मस्तिष्क स्लाइस में (कम से कम दो महीने तक पुराने) चूहों । कारकों है कि कई घंटे के लिए एक स्वस्थ राज्य में वयस्क जानवरों से मस्तिष्क स्लाइसें बनाए रखने के लिए योगदान के अलावा दो प्रोटोकॉल के दो चरणों में सेल अस्तित्व का अनुकूलन करने के लिए डिज़ाइन उपकरणों का उपयोग है । सबसे पहले, इंटरफेस कक्ष में इंटरफेस टुकड़ा धारक (चित्रा 1) काटने के बाद स्लाइस के संरक्षण में सुधार । दूसरा, रिकॉर्डिंग चैंबर (चित्रा 2) एक छिड़काव प्रणाली है जो aCSF दोनों शीर्ष पर और स्लाइस के नीचे इमेजिंग के दौरान चलाने के लिए अनुमति देता है । रिकॉर्डिंग चैंबर यहां इस्तेमाल आयामों मानक सूक्ष्मदर्शी फिट के रूप में वे शास्त्रीय स्नान कक्ष आवेषण के समान है सेट कर रहे है (एक ६२ mm बाहरी व्यास के साथ), लेकिन के रूप में अपने मॉडल पूरक सामग्रीसे डाउनलोड कर रहे हैं, डिजाइन किया जा सकता है अनुकूलित करने के लिए अंय आयामों के स्लाइस धारकों में फिट । नोट करने के लिए है कि प्रत्येक चैंबर विधानसभा द्वारा किया जाता है, गोंद के बिना, दो पूरी तरह से फिटिंग भागों की, उन दोनों के बीच फैला एक पॉलियामाइड जाल के साथ.

एक छोटे से क्षेत्र में एटीपी या 5-एचटी उद्धार और microglia के एक स्थानीय प्रतिक्रिया प्रेरित करने के लिए, एक यौगिक युक्त पिपेट ( चित्रा 2cमें दिखाई, घ) टुकड़ा के शीर्ष पर अपनी टिप के साथ रखा गया है. पहले प्रयोगों में, यह समाधान के लिए एक फ्लोरोसेंट डाई जोड़ने के लिए उपयोगी हो सकता है, ताकि दो फोटॉन माइक्रोस्कोप (चित्रा 3ए) के साथ अधिग्रहीत कर रहे हैं कि छवियों पर पिपेट टिप की स्थिति कल्पना करने के लिए. चित्र बीमें, यह दिख रहा है कि हालांकि प्रयोगकर्ता पिपेट वंश बंद के रूप में अपनी टिप को छुआ और उज्ज्वल-कंप्यूटर स्क्रीन के क्षेत्र की छवि पर टुकड़ा सतह विकृत, अपने पतले उग्रवाद ऊतक में थोड़ा प्रवेश किया, नीचे ८० के लिए-- सतह से १०० µm । यह महत्वपूर्ण है कि पिपेट भी सतही नहीं है क्योंकि यह समाधान सही ढंग से कोशिकाओं पर वितरित नहीं हो सकता है, और न ही बहुत गहरी दर्ज करें क्योंकि यह एक ऐसे क्षेत्र तक पहुंच सकता है जहां प्रतिदीप्ति संकेत बहुत कम है । पिपेट टिप तक पहुंच गहराई को प्रभावित कर सकते है जो पैरामीटर पिपेट के कोण हैं, जो तीन अक्ष micromanipulator, और पिपेट मुंह व्यास के साथ समायोजित किया जा सकता है ।

ध्यान दें कि, Y-अक्ष के साथ प्रक्षेपण के साथ (चित्र बी), यह संभव है कि प्रतिदीप्ति का निरीक्षण करने के लिए ऊपरी हिस्से में टुकड़ा के निचले भाग की तुलना में मजबूत है । यह दोनों टुकड़ा के अंदर संकेत के प्रगतिशील कुंद करने के लिए और तथ्य यह है कि टुकड़ा की सतही परतों के microglia की प्रक्रिया के कारण है, और कुछ कोशिका निकायों, सतह की ओर पलायन करते हैं । नतीजतन, स्लाइस के सबसे सतही परतों में microglia स्लाइस के अंदर उन से एक अलग आकृति विज्ञान दिखा सकता है, यह दर्शाता है कि वे एक ही राज्य में नहीं हैं, और उत्तेजना के लिए अलग तरह से प्रतिक्रिया कर सकते हैं । इस प्रकार, सतही microglial सक्रियकरण मुखौटा सकता है, z-प्रक्षेपण में, नीचे microglia की प्रतिक्रिया । इसके अलावा, सतह अक्सर झुका है, और सबसे पहले z-स्टैक्स की छवियों बद कर रहे हैं । इसलिए, हम अनुशंसा करते हैं, एक बेहतर सटीकता के लिए, z-प्रक्षेपण और विश्लेषण से सबसे सतही जेड विमानों को बाहर करने के लिए । हालांकि, के रूप में बदल microglia आकृति विज्ञान और सतही परतों में मलबे की उपस्थिति स्लाइस की स्थिति के संकेतक हैं, यह छवि के लिए एक टुकड़ा की पूरी गहराई अपनी स्थिति एक posteriori की जांच करने के लिए दिलचस्प हो सकता है । यह विशेष रूप से उन नए प्रयोगकों के लिए उपयोगी हो सकता है जो एकल जेड-विमानों से असामान्य microglia या मलबे को आसानी से पहचान न सकें. इसके बाद पहले 30 µm में ली गई जेड-विमानों को जेड-प्रक्षेपण कदम (प्रोटोकॉल का स्टेप 5.1.2) में शामिल नहीं किया जाएगा ।

एक बार टुकड़ा ब्याज के यौगिक के साथ इलाज किया गया है और दर्ज की गई, जेड की श्रृंखला-विमानों (पहले 30 µm को छोड़कर, के रूप में ऊपर चर्चा) हर समय बिंदु पर imaged z-अक्ष के साथ पेश कर रहे है z के एक 2d फिल्म प्रक्षेपण छवियां । नोट करने के लिए है कि यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल में, अधिकतम z-प्रक्षेपण के लिए इस्तेमाल मोटाई सभी z-स्लाइस शामिल जहां प्रतिदीप्ति दिखाई दे रहा है (आमतौर पर १८०-२२० µm, प्रोटोकॉल के कदम 5.1.2 देखें) । इसलिए, z-स्लाइस की निरपेक्ष संख्या में भिन्नता प्रतिसाद की ठहराव प्रभाव नहीं है । इसके विपरीत, कुछ अध्ययनों से z-प्रक्षेपण6,7,11,27के लिए पतले z-पोट (४०-६० µm) का उपयोग करें । यह एक और विकल्प है, जो जोखिम के साथ आता है के लिए कुछ z-स्लाइस जो एक प्रतिक्रिया दर्शाते हैं, जैसा कि हमने देखा है कि आकर्षित प्रभाव के रूप में दूर ७० µm के रूप में दिखाई थी (जेड में) कुछ प्रयोगों में पिपेट टिप से दूर । यदि पतले विकल्प पसंद है, यह है, इस प्रकार, z केंद्र के लिए महत्वपूर्ण z में पिपेट टिप पर ढेर, और महत्वपूर्ण बात, केवल z-एक ही तरीके से किया अनुमानों (यानी, सभी फ्लोरोसेंट z-स्लाइस का उपयोग कर या एक पतली z-ढेर का प्रयोग) की तुलना में किया जा सकता है ।

ब्याज की एक R1 क्षेत्र तो मात्रात्मक विश्लेषण के लिए परिभाषित किया गया है । चित्रा 4 एक z-प्रक्षेपण पर रॉय से पता चलता है । लाल डैश्ड रेखाएं पिपेट की ख्यात स्थिति का प्रतिनिधित्व करती हैं । पीला वृत्त R1, बर्फीले के साथ तैयार की है, और पिपेट के ख्यात टिप पर केंद्रित है । महत्वपूर्ण बात, हमने देखा है कि एक नजर परिवर्तनशीलता R1 रॉय के स्थानीयकरण से ठहराव के दौरान उठी, जिसकी प्रतिक्रिया के एक अनुमान को विस्थापन की ओर जाता है । प्रसव के साइट पर रॉय स्थिति में मदद करने के लिए, हम अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में शासकों को प्रदर्शित करने की सिफारिश जब brightfield में पिपेट स्थिति, क्रम में पिपेट टिप हमेशा क्षेत्र में एक ही केंद्रीय XY स्थिति में जगह के लिए छवि हो सकता है । यह जहां की स्थिति के लिए एक संकेत प्रदान करता है, बाद में, प्रतिदीप्ति छवियों के Z-प्रक्षेपण में रॉय । हालांकि, अंतिम टिप स्थिति और, इस प्रकार, प्रसव के वास्तविक साइट थोड़ा इस केंद्रीय स्थिति से स्थानांतरित कर दिया जाएगा, पिपेट टिप द्वारा पहुंच गहराई पर निर्भर करता है । इस कारण से, r1 की स्थिति के लिए, हम तीन अन्य मानदंडों को ध्यान में रखना: (i) R1 पिपेट की नोक पर होना चाहिए, जो की स्थिति निचले दाएँ कोने में अंधेरे पृष्ठभूमि से आस्थगित है, (ii) यह क्षेत्र के अनुरूप होना चाहिए, जहां एक क्षणिक ऊतक विकृति तब होता है जब यौगिक इंजेक्शन है, और (ii) यह क्षेत्र के अनुरूप होना चाहिए, जहां एक स्थानीय प्रतिक्रिया (यदि कोई हो) मनाया जाता है । यदि यह अच्छा सटीकता के साथ प्रसव के बिंदु का पता लगाने के लिए पर्याप्त नहीं है, एक फ्लोरोसेंट यौगिक के साथ पिपेट भरने में मदद मिलेगी । R1 तैयार होने के बाद, हम फिल्म फिर से चलाने की जांच करने के लिए कि यह अच्छी तरह से सभी समय अंक के लिए तैनात है और है कि कोई ंयायपालिका बहाव, विरूपण, या विरूपण साक्ष्य किसी भी समय बिंदु पर प्रतिदीप्ति, जो ठहराव पूर्वाग्रह सकता है । 4 चित्राको इसी फिल्म, और एटीपी आवेदन के प्रभाव illustrating, पूरक सामग्री में पाया जा सकता है (फिल्म एस1) ।

हम शुरू में एटीपी या 5 P11 चूहों15के thalamus में एचटी की ओर microglial प्रक्रियाओं के आकर्षण का अध्ययन किया । हाल ही में, इन प्रयोगों चार दिन से दो महीने पुराने चूहों से स्लाइस में दोहराया गया था, और विभिन्न क्षेत्रों में (उदाहरण के लिए, चित्रा 3 हिप्पोकैम्पस में एक रिकॉर्डिंग करने के लिए संगत). हम ज्यादातर तीन से चार सप्ताह पुराने चूहों, जो एक परिपक्व मस्तिष्क के साथ परिपक्व और ramified microglia-एक अच्छा टुकड़ा व्यवहार्यता के साथ होने के लाभों को जोड़ती थी । महत्वपूर्ण बात, प्रतिनिधि सामांय राज्य microglia एक छोटे सोमा द्वारा विशेषता है, छोटे टर्मिनलों के साथ लंबी प्रक्रियाओं, और लगातार आधारभूत हालत पर प्रक्रियाओं चलती । आमतौर पर, स्लाइस तैयार करने के बाद 18 से 30 दिन पुराने चूहों, microglia आकृति विज्ञान के लिए ज्यादातर अपरिवर्तित रहता है । पुराने चूहों से स्लाइस के लिए (दो महीने पुराने), एक शारीरिक स्थिति में स्लाइस बनाए रखने की क्षमता कम है (~ 4 एच). thalamus में microglial दिशा गतिशीलता के उदाहरण, एक 20 दिन पुराने माउस से एक स्लाइस में 5-एचटी के जवाब में और एक दो महीने पुराने माउस से एक टुकड़ा में एटीपी, चित्रा 5में प्रदान की जाती हैं । चित्रा 5 में 5-एचटी आवेदन करने के लिए इसी फिल्म पूरक सामग्री (फिल्म S2) में पाया जा सकता है ।

चित्रा 6 aCSF में 6 से अधिक लंबे समय के लिए रखा स्लाइस पर किए गए दो उपइष्टतम प्रयोगों प्रस्तुत करता है इससे पहले कि वे imaged थे (केवल बार 0 दिखाया गया है). चित्रा 6Aमें, एकाधिक लघु प्रक्रियाओं के साथ या neurite विकास शंकु की याद ताजा टर्मिनलों के साथ microglia की उपस्थिति नोट, और कई फ्लोरोसेंट सेल मलबे या कणों की उपस्थिति । ये बहुत फ्लोरोसेंट तत्वों मोबाइल या इमेजिंग के दौरान बेतरतीब ढंग से चलते रहते हैं, यह दर्शाता है कि वे "रहने वाले" microglia का संबंध नहीं है (पूरक सामग्री में फिल्म S3 देखें) । नोट करने के लिए यह है कि, इस विशेष उदाहरण में, microglia लगातार अपने पर्यावरण स्कैनिंग थे, लेकिन उनकी आकृति विज्ञान इतना बदल गया है कि वे एक शारीरिक अवस्था में होने के रूप में नहीं माना जा सकता था । इसके अलावा, मलबे की बड़ी मात्रा प्रतिदीप्ति विश्लेषण खराब विश्वसनीय बनाया होता । चित्रा घमण्ड बड़े और सपाट कोशिका निकायों या दखलंदाजी के साथ microglia की उपस्थिति को दर्शाता है, जो कभी स्लाइस की सतही परतों पर पाया जा सकता है जिसे कई घंटे पहले ही imaged कर लिया गया है । इस z-प्रक्षेपण को करने के लिए केवल सतही z-पदों का उपयोग किया गया है । चित्रा 6C एक उपस्टैक है, गहरे z-पदों पर, चित्र घमण्डमें दिखाए गए के रूप में एक ही मस्तिष्क टुकड़ा से । हालांकि वे सतह पर तैनात नहीं कर रहे हैं, इन microglia एक असामांय "जंगली पहलू" है । microglia के पहलू के कारण, इन दो स्लाइस करने के लिए इसी फिल्म ठहराव के लिए इस्तेमाल नहीं किया गया ।

2d फिल्मों से डेटा निकालने के बाद, परिणाम समय के साथ सामान्यीकृत आर (टी) प्रतिदीप्ति की साजिश रचने के द्वारा प्रतिनिधित्व किया जा सकता है । कई प्रयोगों का सारांश ग्राफ चित्रा 7Aमें प्रस्तुत किया गया है, प्रतिक्रियाओं की परिवर्तनशीलता को दिखाने के लिए. ध्यान दें कि प्रतिदीप्ति तुरंत कम हो जाती है लेकिन क्षणिक (पहले तीन छवियों में) ऊतक विरूपण के कारण इंजेक्शन के बाद (यानी, पिपेट के साथ तरल इंजेक्शन क्षणिक ऊतक दूर धक्का, और फिर बढ़ जाती है). एटीपी के जवाब में परिवर्तनशीलता तथ्य यह है कि जब भी स्लाइस इसी तरह स्वस्थ देखो, गतिशील और ramified microglia के साथ, वे एक ही तरीके से जवाब नहीं है (लेकिन उन सभी का जवाब) । आंतरिक नमूना विविधता के शीर्ष पर, R1 स्थिति में कुछ शिथिलता है, जैसा कि ऊपर उल्लेख किया है, और हम भी के प्रभाव को बाहर नहीं कर सकते, उदाहरण के लिए, समाधान की मात्रा में अंतर जो दिया है । इसलिए, छोटे प्रभाव या भिन्नता का पता लगाने के लिए, यह यौगिक इंजेक्शन के लिए एक स्वचालित डिवाइस का उपयोग करने के लिए दिलचस्प हो सकता है ।

चित्रा 7B दिखाता है कि कैसे रॉय के आकार भी ठहराव प्रभावों, एटीपी प्रेरित प्रक्रियाओं के विकास के यहां । ३५ से व्यास में वृद्धि ( चित्रा 7A में इस्तेमाल किया और सभी विश्लेषणों के लिए यहां प्रस्तुत) ५० या ७० µm करने के लिए छोटे R1 स्थिति के मुद्दे को दबा कर (स्लाइस) प्रयोगों के बीच परिवर्तनशीलता कम कर देता है. हालांकि, यह भी सटीकता और पता चला प्रतिक्रिया की भयावहता कम हो जाती है । वास्तव में, बड़े ROIs के साथ, वहां अधिक प्रक्रियाओं या कोशिका के उपचार से प्रभावित नहीं निकायों के कारण पृष्ठभूमि है, और प्रक्रियाओं की वृद्धि आंशिक रूप से microglial शाखाओं पिपेट से अधिक दूर के सहवर्ती पुनर्कर्षण द्वारा कुंद कर सकते हैं, लेकिन फिर भी रॉय के अंदर । अंत में, यह ३५ µm है कि एक से एक अलग व्यास चक्र के साथ ROIs का उपयोग करने के लिए प्रासंगिक हो सकता है, लेकिन यह रॉय हमेशा की तुलना में किया जा करने के लिए सभी डेटा सेट में एक ही है कि मौलिक है ।

चित्रा 7C aCSF, एटीपी, या 5-एचटी के साथ कई प्रयोगों के लिए मतलब ± SEM से पता चलता है । एटीपी का प्रभाव vivo में एक समान विधि के साथ अंय समूहों द्वारा प्राप्त उन के रूप में एक ही श्रेणी में है (०.५ के अनुसार Davalos एट अल.3 और ०.४ हेन्स एट अल.13के अनुसार) और स्लाइस में (०.८ अगर सामान्यीकृत के रूप में यहां किया जाता है , के अनुसार गाते-Olesen एट अल.5, और ०.६ के अनुसार Pagani एट अल.28) । एक तरफ, मतभेद जैविक मापदंडों से आ सकते हैं, जैसे स्लाइस तैयारी विधि, एटीपी इंजेक्शन की मात्रा, माउस की उम्र, या मस्तिष्क क्षेत्र का इस्तेमाल किया, और विश्लेषण मापदंडों से दूसरी ओर, जैसे कि रॉय के व्यास और के रूप में z-z-प्रक्षेपण के लिए इस्तेमाल किया ढेर की मोटाई (यानी, पूरी मोटाई जहां प्रतिदीप्ति का पता चला है, या केवल ४०-६० पिपेट टिप, जहां अधिक से अधिक प्रतिक्रिया की उंमीद है चारों ओर µm) ।

चित्रा 7Cमें, aCSF इंजेक्शन नकारात्मक नियंत्रण है, जांच करने के लिए आवश्यक है कि स्थानीय इंजेक्शन और पिपेट के दबाव microglial प्रक्रियाओं को आकर्षित कर सकते हैं कि एक चोट का कारण नहीं है. इसके अलावा, aCSF नियंत्रण शोधकर्ताओं की जाँच करने के लिए कि वहाँ समय के साथ कोई photobleaching है की अनुमति देता है । दरअसल, photobleaching, फोटॉन-फ्लोरोसेंट प्रोटीन या fluorophores के प्रेरित विनाश, समय के साथ प्रतिदीप्ति की एक प्रगतिशील कमी प्रेरित होता । यह माप पूर्वाग्रह कर सकते हैं, यह कड़ाई से जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है कि प्रयोगात्मक स्थितियों में कोई photobleaching है । ऐसा करने के लिए, यह GFP-व्यक्त microglia के साथ एक स्लाइस पर एक XYZT श्रृंखला प्राप्त करने के लिए सिफारिश की है, 30 मिनट के लिए (aCSF इंजेक्शन किया जा सकता है, लेकिन वास्तव में, कोई उत्तेजना की जरूरत है), के साथ उत्तेजना और अधिग्रहण मापदंडों प्रयोगात्मक स्थितियों में के रूप में सेट. फिर, microglia सेल निकायों या प्रक्रियाओं सहित ब्याज के विभिंन क्षेत्रों में समय के साथ प्रतिदीप्ति का एक मात्रात्मक उपाय, प्रकट होगा अगर वहां उत्सर्जन तीव्रता में एक क्रमिक नुकसान है, आमतौर पर एक घातीय क्षय, photobleaching का संकेत है । यदि यह मामला है, कुछ समायोजन किया जा सकता है: लेजर, लेजर शक्ति की कमी और डिटेक्टर लाभ की वृद्धि, जेड विमानों की संख्या में कमी की एक realignment, और उन दोनों के बीच अंतराल की वृद्धि रोशनी को सीमित करने के लिए । Photobleaching उच्च शक्ति या लंबे समय से इष्ट है (उदा: लाइन औसत के लिए दोहराया रोशनी) उत्तेजना; इस प्रकार, शोधकर्ताओं के लिए यह ध्यान देना चाहिए अगर एक निरंतर रोशनी कम प्रतिदीप्ति के साथ छवि कोशिकाओं के लिए प्रयोग किया जाता है ।

एटीपी या 5-एचटी के स्थानीय इंजेक्शन के बाद, R1 में प्रतिदीप्ति की वृद्धि हुई है, जो एक पठार (चित्रा 7C) तक पहुंचता है । कैनेटीक्स के अलावा, यह एक स्थिर समापन बिंदु पर आकर्षण की तुलना करने के लिए दिलचस्प हो सकता है । यहां, हम टी = 26 मिनट में microglial प्रतिक्रिया का प्रतिनिधित्व करने के लिए चुना (यानी, 20 मिनट के इंजेक्शन के बाद) चित्रा 7dमें । यह सांख्यिकीय यौगिकों की तुलना करने के लिए उपयोगी है, या विरोधी के प्रभाव जो स्नान में जोड़ा जा सकता है परीक्षण करने के लिए (यानी, छिड़काव समाधान में, या एक साथ पिपेट में यौगिक के साथ [नहीं दिखाया गया]).

Figure 1
चित्रा 1: इंटरफ़ेस चैंबर विवरण । (क) स्लाइस धारक के 3डी प्रिंटिंग के लिए रूपरेखा । धारक के बाहरी व्यास 7 सेमी है । (ख) नायलॉन जाल (तीर) है कि शोधकर्ताओं तरल हवा अंतरफलक में स्लाइस रखने के लिए अनुमति देता है के साथ इंटरफेस टुकड़ा धारक । (ग) इंटरफेस चैंबर उपकरण है कि यह एक carbogenated में स्लाइसें बनाए रखने के लिए संभव बनाता है (तीर bubbling के लिए टयूबिंग इंगित करता है) और humidified पर्यावरण इससे पहले कि वे छवि बना रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: छिड़काव चैंबर विवरण । (क) 3डी प्रिंटिंग के लिए रूपरेखा । छिड़काव चैंबर के बाहरी व्यास ५.९ सेमी है । (ख) जो टुकड़ा का समर्थन करता है नायलॉन जाल (तीर) के साथ छिड़काव चैंबर, यह नीचे स्लाइड को छूने से रोकता है, और aCSF के ऊपर और इसके तहत प्रवाह करने के लिए अनुमति देता है । (ग) दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी पर विधानसभा का चित्र. micropipette जो यौगिक स्थानीय रूप से वितरित करेगा सही (तारांकन) पर दिखाई देता है । (घ) पिपेट imageed in brightfield. स्केल बार = ६० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: स्लाइस में micropipette की स्थिति । (1 µ एम) fluorescein से भरे micropipette के साथ छवियों के ढेर (एक 30 दिन पुराने जानवर के हिप्पोकैम्पस में) के एक अधिग्रहण का उदाहरण । Fluorescein यह संभव के साथ अधिकतम अनुमानों में पिपेट (तारांकन) का पता लगाने के लिए बनाता है (A) z-अक्ष या (B) y-अक्ष । पैनल बी में नोट है कि, हालांकि प्रतिदीप्ति में बेहोशी, वहां भी पिपेट टिप नीचे microglia हैं । इस सचित्र उदाहरण में, पूर्ण स्टैक, स्लाइस के सबसे सतही भाग में लिए गए छवियों सहित, अनुमानों के लिए उपयोग किया गया है । स्केल बार = 30 µm पैनल में एक और के रूप में संकेत (प्रत्येक स्नातक = ५० µm) पैनल बीमें z-मोटाई की स्टैक = २२० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: R1 की स्थिति, ठहराव के लिए इस्तेमाल किया रॉय । यह आंकड़ा एक प्रयोग के तीन प्रयोगात्मक समय अंक जहां एटीपी एक स्लाइस पर लागू किया गया है दिखाता है (एक 20 दिन पुराने जानवर के thalamus से), पिपेट के ख्यात स्थान के चित्र के साथ (पहली बार बिंदु पर लाल डैश्ड रेखा) और R1 के विरूपण रॉय. स्केल बार = 30 µm । नीचे सही कोने में गहरे रंग का क्षेत्र नोट, पिपेट की छाया है, जो रोशनी और इमेजिंग के साथ हस्तक्षेप के लिए इसी । ध्यान दें, इसके अलावा, 25 मिनट में तीव्र प्रतिदीप्ति के छोटे क्षेत्र है, जो पिपेट टिप के स्थान को इंगित करता है । z-मोटाई की स्टैक = २२० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: Microglial प्रतिक्रियाएं । 5-एचटी (5 µ एम) के स्थानीय आवेदन करने के लिए एक 20 दिन पुराने माउस से एक मस्तिष्क टुकड़ा पर प्रतिक्रियाएं (बाएं; टुकड़ा z-मोटाई = २२० µM) और एटीपी (५०० µ एम) से एक स्लाइस पर एक दो महीने पुराने माउस (सही; स्लाइस z-मोटाई = २२० µM) । लाल डैश्ड रेखाएं पिपेट स्थिति का प्रतिनिधित्व करती हैं । दोनों रिकॉर्डिंग thalamus में किया गया है, और स्लाइस के ऊपरी 30 µm बाहर रखा गया है । छवियों से पहले (ऊपरी पंक्ति) और 25 मिनट (निचली पंक्ति) इंजेक्शन के बाद लिया जाता है । स्केल बार = 30 µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्र 6: उपइष्टतम प्रयोगों के उदाहरण । ये स्लाइस इमेजिंग से पहले 6 से अधिक एच के लिए इंतजार किया है और उनके ऊपरी सतह के बाद से imaged किया गया है । (एक) एक z के उदाहरण के मलबे का एक बहुत (मोटे तौर पर दौर, फ्लोरोसेंट कणों के साथ ढेर, लेकिन अनियमित सीमाओं के साथ, तारक) और "जंगली" microglia (तीर), कि है, कई लेकिन कम प्रक्रियाओं के साथ । बढ़े हुए प्रोसेस टर्मिनलों (ऐरोहेड) को नोट करें जो axonal ग्रोथ कोन की तरह दिखते हैं । z-मोटाई की स्टैक = २२० µm । अंय दो पैनलों दिखाने के दो उप एक ही स्लाइस के ढेर, के साथ (ख) 1-30 z-विमानों (z-मोटाई = ५९ µm) और (ग) 30-120 z-विमानों (z-मोटाई = १८० µm) । शीर्ष विमानों पर (पैनल बीमें दिखाया गया है), बड़ी प्रक्रिया टर्मिनलों और मलबे के अलावा एकपैनल में की तरह, वहां असामांय बड़े फ्लैट निकायों या दखलंदाजी (तारे) के साथ microglia हैं । गहरे विमानों पर (पैनल सीमें दिखाया गया है), वहां कोई मलबा और न ही सपाट वस्तुओं है, लेकिन कोशिकाओं जंगली (तीर) और घनत्व असामांय रूप से उच्च है । कुल मिलाकर, इन टिप्पणियों से संकेत मिलता है कि microglia एक सामांय स्थिति में नहीं हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा 7: microglial प्रक्रियाओं के आकर्षण का ठहराव । (एक) एटीपी के साथ प्रयोगों की एक श्रृंखला का उदाहरण परिवर्तनशीलता को वर्णन करने के लिए । (ख) ठहराव पर ROI के आकार का प्रभाव. प्रत्येक पैनल एक (एटीपी इंजेक्शन) में दिखाया प्रयोग ३५, ५०, या ७० µm व्यास के एक रॉय के साथ विश्लेषण किया गया है । हर समय बिंदु पर thefluorescence का मतलब ± SEM अलग ROIs के लिए दिखाया गया है । (ग) aCSF, 5-एचटी, और एटीपी के साथ प्रयोगों का सारांश । aCSF इंजेक्शन microglial प्रक्रियाओं के स्थान पर कोई प्रभाव नहीं है । एटीपी और 5-एचटी पिपेट की ओर microglial प्रक्रियाओं की एक स्थानीयकृत वृद्धि प्रेरित, प्रतिदीप्ति के स्थानीय वृद्धि के साथ मापा. मतलब ± SEM संकेत कर रहे हैं । (घ) टी पर microglial प्रतिक्रियाओं का सारांश = 20 मिनट postinjection (रिकॉर्डिंग की शुरुआत से 26 मिनट) । मतलब ± SEM संकेत कर रहे हैं । Dunnett पोस्ट हॉक टेस्ट के साथ एक तरफा ANOVA का प्रयोग किया जाता है । * * पी < ०.०१, * * * पी < ०.००१ aCSF इंजेक्शन की तुलना में । aCSF के लिए, n = 7; एटीपी के लिए, n = 8; 5-एचटी, एन = 6 के लिए । इन सभी प्रयोगों का thalamus में प्रदर्शन किया गया, लेकिन इसी तरह के परिणाम हिप्पोकैम्पस या प्रांतस्था से प्राप्त किए जा सकते हैं. z-की मोटाई z-अनुमानों और ठहराव = १८०-२२० µm के लिए उपयोग किए गए स्टैक की । पैनल बी में उन को छोड़कर सभी उपाय एक ३५ µm-व्यास रॉय के साथ किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Movie 1
फिल्म s: एक स्थानीय एटीपी (५०० µ एम) आवेदन के प्रभाव का उदाहरण । यह प्रयोग 20 दिन पूर्व पशु के thalamus में किया गया है । इस फिल्म से चित्र 4 चित्राके लिए इस्तेमाल किया गया है । स्केल बार = 30 µm. कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Movie 2
फिल्म S2: एक स्थानीय 5-एचटी (5 µ एम) आवेदन के प्रभाव का उदाहरण । यह प्रयोग 20 दिन पूर्व पशु के thalamus में किया गया है । इस फिल्म से चित्र चित्रा 5 (बाएं) के लिए इस्तेमाल किया गया है । स्केल बार = 30 µm. कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Movie 3
चलचित्र S3: एक स्लाइस में एक इष्टतम प्रयोग के उदाहरण इमेजिंग से पहले 6 से अधिक घंटे के लिए इंतजार कर रहे थे । कई मलबे की उपस्थिति जो समय के साथ बेतरतीब ढंग से चलता है और microglia की असामान्य आकृति विज्ञान ध्यान दें । इस चलचित्र से एक छवि का उपयोग चित्रा 6Aके रूप में किया जाता है । स्केल बार = 30 µm. कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

अनुपूरक फ़ाइल: इमेजिंग चैंबर और इंटरफेस होल्डिंग चैंबर । कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

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Discussion

बनाए रखने के द्वारा, असंबद्ध या organotypic स्लाइस संस्कृति, सीमित नेटवर्क समायोजन के साथ एक संरचनात्मक अखंडता में विपरीत, तीव्र मस्तिष्क स्लाइस शोधकर्ताओं को अपने शारीरिक वातावरण में microglia अध्ययन करने के लिए अनुमति देते हैं । हालांकि, प्रमुख सीमाओं में से एक तथ्य यह है कि टुकड़ा करने की क्रिया प्रक्रिया चोटों कि तेजी से न्यूरॉन्स की व्यवहार्यता समझौता कर सकते हैं बनाता है, विशेष रूप से वयस्क मस्तिष्क में. microglia कोशिका क्षति के लिए विशेष रूप से प्रतिक्रियाशील हैं, यह अपने शारीरिक राज्य के लिए करीब microglia को संरक्षित करने के लिए जितना संभव हो के रूप में न्यूरॉन सेल मौत की सीमा के लिए महत्वपूर्ण है. यह, बारी में, स्लाइस की एक बेहतर सामांय स्थिति के लिए एक गुणी सर्कल के माध्यम से योगदान देता है ।

इस आलेख में वर्णित प्रोटोकॉल कई घंटों में स्लाइस की बेहतर व्यवहार्यता प्राप्त करने के उद्देश्य से, विशेष रूप से वयस्क चूहों से, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रयोगों के लिए साहित्य में पाए जाने वाले कई सुधार लागू करता है. स्लाइस व्यवहार्यता में उंर से संबंधित असमानता को दूर करने के लिए, हम choline के साथ सोडियम प्रतिस्थापित और हृदय छिड़काव, टुकड़ा करने की क्रिया के दौरान इस choline-aCSF माध्यम का इस्तेमाल किया, और वसूली चरणों । यह सेल excitotoxicity को न्यूनतम29,30तक लाती है । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि, choline-aCSF के अलावा, कई अन्य वैकल्पिक aCSF व्यंजन हैं जो न्यूरॉन संरक्षण के लिए अत्यधिक प्रभावी हैं, जैसे N-मिथाइल-D-glucamine (NMDG)-aCSF31, जो कि microglial अध्ययन के लिए भी दिलचस्प हो सकता है लेकिन यहां परीक्षण नहीं किया गया है । इस प्रक्रिया में एक और महत्वपूर्ण कदम कार्डियक छिड़काव है । एक ठंडी choline-aCSF समाधान के साथ पशु perfusing से, कम एनए+, कम सीए2 +, और उच्च मिलीग्राम2 +, शरीर के तापमान में तेजी से कमी प्रेरित है और मस्तिष्क में कोशिकाओं की चयापचय गतिविधि को कम किया जाता है, जिससे सेलुलर तनाव काटने की वजह से । दरअसल, हमने देखा है कि इस दृष्टिकोण बस पूरे मस्तिष्क को हटाने और aCSF समाधान में यह विलय से अधिक संरक्षण की पेशकश की । एक पैच के लिए अनुकूलित प्रोटोकॉल से प्रेरित-क्लैंप और optogenetic अध्ययन29, हम भी एक "सुरक्षात्मक वसूली" तुरंत शारीरिक टुकड़ा करने की क्रिया के बाद की अवधि का इस्तेमाल किया, स्लाइस choline में 10 मिनट के लिए टुकड़ा करने की क्रिया के आघात से उबरने की अनुमति-aCSF में ३२ ° c. इसके बाद, स्लाइस को 30 मिनट के एक अतिरिक्त ंयूनतम समय के लिए ठीक करने के लिए इंटरफेस होल्डिंग चैंबर में स्थानांतरित किया गया । इस दूसरी वसूली अवधि की अवधि ब्याज के मस्तिष्क क्षेत्र के अनुसार अनुकूलित किया जा सकता है, ना+ विकल्प, और पशु की उंर, और यह कम से 1 पिछले चाहिए अगर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के समानांतर इमेजिंग के साथ प्रदर्शन किया है ज ।

उपयोग करने से पहले एक स्वस्थ राज्य में टुकड़ा के रखरखाव और इमेजिंग के दौरान छिड़काव भी महत्वपूर्ण पैरामीटर हैं । दोनों अंतरफलक और दोहरे छिड़काव चैंबर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी में व्यापक रूप से स्थापित उपकरण हैं । उदाहरण के लिए, इंटरफ़ेस विधि १९९५26के बाद से हिप्पोकैम्पस स्लाइस की व्यवहार्यता में सुधार करने के लिए उपयोग किया गया है । यहां इस्तेमाल किया कक्षों के समान उपकरणों कई कंपनियों द्वारा प्रस्तावित लेकिन अभी तक आमतौर पर microglia इमेजिंग के लिए इस्तेमाल नहीं कर रहे हैं । हम एक इंटरफेस होल्डिंग चैंबर, जहां स्लाइसें एक शुद्ध पर रखना और aCSF के एक बड़े जलाशय के साथ इंटरफेस पर हैं, लंबे समय तक गर्मी के समय के दौरान स्लाइस की सेलुलर गिरावट देरी डिजाइन तैयार की । इमेजिंग चैंबर में, हम multiphoton माइक्रोस्कोपी के दौरान एक स्वस्थ राज्य में कोशिकाओं को बनाए रखने, तीव्र टुकड़ा की तैयारी की वृद्धि हुई ऑक्सीजन की अनुमति देता है जो एक डिजाइन डबल पक्षीय छिड़काव चैंबर का इस्तेमाल किया । एकल छिड़काव के साथ इसके विपरीत, जलमग्न स्लाइस के दोहरे छिड़काव कोशिकाओं की व्यवहार्यता बढ़ जाती है, ऑक्सीजन के बाद से, साथ ही अंय सामग्री, स्वतंत्र रूप से और प्रभावी रूप से काफी मोटी स्लाइस के दोनों पक्षों से एक उच्च प्रवाह दर के साथ फैलाना कर सकते हैं ।

इस प्रोटोकॉल microglial प्रक्रियाओं पर एटीपी या अन्य यौगिकों के वैश्विक आकर्षित प्रभाव को बढ़ाता है के उद्देश्य से है, और इसके ठहराव विधि Davalos एट अल.3में इस्तेमाल एक पर आधारित है । यह अंय प्रकार के विश्लेषण करने के लिए संभव है । उदाहरण के लिए, एक वैकल्पिक तरीका है, जो microglial प्रक्रियाओं के प्रतिदीप्ति स्तर पर निर्भर नहीं करता है, लेकिन छवि विश्लेषण के लिए प्रयोगकर्ता के अधिक कार्यों की आवश्यकता होती है, यौगिक के बाद पिपेट टिप के आसपास खाली जगह की कमी को मापने के लिए है आवेदन11,३२. यह भी व्यक्तिगत microglial प्रक्रियाओं के टिप के आंदोलन को ट्रैक करने के लिए संभव है15,28.

इसके अलावा, आइसोट्रोपिक गतिशीलता या microglia की निगरानी भी बेसल हालत में या इस प्रोटोकॉल के साथ तैयार स्लाइस पर ब्याज की यौगिकों के स्नान आवेदन पर पंजीकृत किया जा सकता है । हालांकि, तेजी से विस्तार और microglial प्रक्रियाओं के कर्षण दर यों तो और संभावित विविधताओं का पता लगाने, यह अधिग्रहण आवृत्ति को बढ़ाने के लिए प्रासंगिक होगा । उदाहरण के लिए, Pagani एट अल. एक छवि की एक आवृत्ति हर 10 एस28का प्रयोग करें ।

अंत में, हाल के प्रकाशनों के तरीके वर्णित रूपात्मक परिवर्तन या तीन आयामों में व्यक्तिगत प्रक्रियाओं के गतिशीलता यों तो । इस तरह के विश्लेषण के लिए, हालांकि एक z-चरण 2 µm के अंतराल के लिए पर्याप्त है कुछ कार्यक्रमों27, दूसरों को एक बेहतर अक्षीय संकल्प की आवश्यकता है (यानी, एक z-कदम ०.४ µm के अनुसार Heindl एट अल.३३।

यहां, हम microglia में GFP की एक अंतर्जात अभिव्यक्ति के साथ और यौगिकों के एक यांत्रिक आवेदन के साथ जंगली प्रकार चूहों पर प्रयोग दिखाया गया है, लेकिन इस प्रोटोकॉल YFP18की तरह, microglia में अंय फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, या फ्लोरोसेंट isolectin के साथ microglia के exogenous लेबलिंग11,३४. अंत में, हम एक जंगली प्रकार के सामान्य वातावरण में एटीपी या 5-एचटी के एक स्थानीय आवेदन की ओर microglial प्रक्रियाओं की वृद्धि का अध्ययन किया है, लेकिन इस प्रोटोकॉल अन्य यौगिकों, उत्तेजना के अन्य प्रकार का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (जैसे, बंदी यौगिकों), और परीक्षण करने के लिए कैसे दिशात्मक गतिशीलता उत्परिवर्तनों, औषधीय एजेंटों, या रोग संदर्भों से प्रभावित है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम Institut du Fer à Moulin, जहां सभी छवि अधिग्रहण और विश्लेषण किया गया है की सेल और ऊतक इमेजिंग सुविधा का धंयवाद । यह काम केंद्र नेशनल डे ला सभ्य Scientifique, Institut नेशनल डे ला Santé एट डे ला सभ्य Médicale, सोरबोन विश्विद्यालय विज्ञान, और अनुदान द्वारा सोरबोन Universités से-पियरे एट मैरी क्यूरी विश्वविद्यालय के भाग में समर्थित किया गया है ( उद्भव-UPMC कार्यक्रम 2011/2014), स्नेहा डालो ला सभ्य सुर ले Cerveau, द शौकीन्स डी फ्रांस, स्नेहा डालो ला सभ्य Médicale "लैस FRM DEQ2014039529", फ्रांसीसी अनुसंधान मंत्रालय (Agence राष्ट्रीयकरण डालो ला सभ्य ANR-17-CE16-0008 और Investissements d'Avenir कार्यक्रम "बायो-मनोचिकित्सक Labex" ANR-11-IDEX-0004-02) और अभिकलनी तंत्रिका विज्ञान कार्यक्रम में एक सहयोगी अनुसंधान, राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन/फ्रांसीसी राष्ट्रीय अनुसंधान के लिए एजेंसी (संख्या: १५१५६८६) । सभी लेखक अनुसंधान समूहों के लिए संबद्ध हैं जो पेरिस स्कूल ऑफ न्यूरोन (ENP) के सदस्य हैं और जैव-मनोचिकित्सक Labex के. F.E. एक पीएच. डी. सोरबोन विश्विद्यालय, Collège डॉक्टरेट, एफ-७५००५ पेरिस, फ्रांस, के साथ संबद्ध छात्र है और जैव मनोचिकित्सक Labex द्वारा वित्त पोषित है । V.M. एक के बाद डॉक्टरी गणना तंत्रिका विज्ञान कार्यक्रम में सहयोगी अनुसंधान द्वारा वित्त पोषित साथी है, राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन/फ्रांसीसी राष्ट्रीय अनुसंधान के लिए एजेंसी (संख्या: १५१५६८६) । लेखक मार्ता Kolodziejczak जो परियोजना की दीक्षा में भाग लिया धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
for pipettes preparation
Clark Borosilicate Thin Wall Capillaries Harvard Apparatus 30-0065 Borosilicate Thin Wall without Filament, 1.5 mm OD, 1.17 mm ID, 75 mm L , Pkg. of 225
DMZ Universal Puller Zeitz Instrumente
Name Company Catalog Number Comments
for solutions
Calcium Chloride dihydrate (CaCl2) Sigma C5080
Choline Chloride Sigma C7527
D-(+)-Glucose Sigma G8270
L-Ascorbic acid Sigma A5960
Magnesium Chloride solution 1 M (MgCl2) Sigma 63020
Potassium chloride SigmaUltra >99.0% (KCl) Sigma P9333
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma S5761
Sodium Chloride (NaCl) Sigma S5886
Sodium phosphate monobasic Sigma S5011
Sodium pyruvate Sigma P2256
Ultrapure water MilliQ for all the solutions
Name Company Catalog Number Comments
for slice preparation
2x 200 mL crystalizing dishes
80 mL Pyrex beaker
Antlia-3C Digital Peristaltic pump DD Biolab 178961 For mice perfusion and 2-photon chamber perfusion (aCSF)
Carbogen 5% CO2/95% O2 Air Liquide France Industrie
Dolethal Vetoquinol Dolethal 50 mg/mL
Filter papers (Whatman) Sigma WHA1001042 Whatman qualitative filter paper, Grade 1 (Pore size: 11µM)
Fine Scissors - Sharp Fine Science Tools 14060-60
Food box 10 cm diameter, 8 cm Height
glue (ethyl cyanoacrylate) Loctite super glue 3 power flex
Hippocampal Tool (spatula) Fine Science Tools 10099-15 The largest extremity has to be angled at 90°
Ice
Iris Forceps (curved) Moria MC31
Lens cleaning tissue THOR LABS
Nylon mesh strainer diameter 7 cm
Razor blades Electron Microscopy Sciences 72000 For the slicer
scalpel blade
Slice interface holder home-made, the file for 3D printing is provided in Supplemental Material
Surgical Scissors - Sharp Fine Science Tools 14002-14
Vibrating slicer Thermo Scientific 720-2709 Model: HM 650V (Vibrating blade microtome)
Water bath Set at 32 °C (first recovery step)
Name Company Catalog Number Comments
for slice imaging
× 25 0.95 NA water-immersion objective Leica Microsystems (Germany) HCX Irapo
2-photon MP5 upright microscope with resonant scanners (8 kHz) and two HyD Hybrid detectors Leica Microsystems (Germany)
Antlia-3C Digital Peristaltic pump DD Biolab 178961 For 2-photon chamber perfusion with aCSF
Carbogen 5% CO2/95% O2 Air Liquide France Industrie I1501L50R2A001
Chameleon Ultra2 Ti:sapphire laser Coherent (Germany)
disposable transfer pipettes , wide mouth ThermoFischer scientific for example : 232-11 5.8 mL with fin tip, but we cut it (approx 7 cm) to have a 4 mm diameter mouth
emission filter SP680 Leica Microsystems (Germany)
fluorescent cube containing a 525/50 emission filter and a 560 dichroic filter (for fluorescence collection) Leica Microsystems (Germany)
glass beaker with 50 mL of ACSF to maintain constant perfusion of the slice
Heating system Warner Instrument Corporation Automatic Heater Controller TC-324B to maintain perfusion solution at 32 °C
perfusion chamber home-made, the file for 3D printing is provided in Supplemental Material
slice holder ("harp") home made : hairpin made of platinum with the two branches joined by parallel nylon threads
Name Company Catalog Number Comments
for slice stimulation
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) Sigma A-26209 to be prepared ex-temporaneously : 1 mg/mL (3 mM) stock solution prepared the day of the experiment, kept at 4 °C (a few hours) and diluted just before use
Fluorescein (optional) Sigma F-6377 use at 1 µM final
Micromanipulator Luigs and Neumann SM7 connected to the micropipette holde
Micropipette holder same as for eletrophysiology
Serotonin hydrochloride Sigma H-9523 aliquots of 50mM stock solution in H20 kept at -20 °C. 500 µM solution prepared the day of the experiment.
Syringe 5 mL (without needle) Terumo medical products SS+05S1
Transparent tubing Fischer Scientific 11750105 Saint Gobain Performance Plastics™ Tygon™ E-3603 Non-DEHP Tubing
Name Company Catalog Number Comments
for image analysis
Fiji https://fiji.sc Schindelin, J. et al Nat. Methods (2012) doi 10.1038
Icy Institut Pasteur http://icy.bioimageanalysis.org de Chaumont, F. et al. Nat. Methods (2012)
Name Company Catalog Number Comments
mice
CX3CR1-GFP mice Jung et al, 2000 male or females, P3 to 2 months-old ; we have backcrossed these mice on 129sv background.
CX3CR1creER-YFP mice Parkhurst et al 2013 male or females, P3 to 2 months-old ; we have backcrossed these mice on 129sv background.

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक १४३ Microglia मल्टी फोटॉन माइक्रोस्कोपी तीव्र मस्तिष्क स्लाइस chemoattraction गतिशीलता आकृति विज्ञान सेरोटोनिन एटीपी लाइव इमेजिंग समय चूक इमेजिंग
तीव्र मस्तिष्क स्लाइस में एटीपी या सेरोटोनिन की ओर Microglial प्रक्रियाओं ' आकर्षण के दो-फोटॉन इमेजिंग
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Etienne, F., Mastrolia, V.,… More

Etienne, F., Mastrolia, V., Maroteaux, L., Girault, J. A., Gervasi, N., Roumier, A. Two-photon Imaging of Microglial Processes' Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices. J. Vis. Exp. (143), e58788, doi:10.3791/58788 (2019).

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