Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Två-foton avbildning av mikrogliala processerna attraktion mot ATP eller Serotonin i akut hjärnskada skivor

Published: January 31, 2019 doi: 10.3791/58788
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, *1,2,3, *1,2,3
1Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), UMR-S 1270 Paris, France, 2Sorbonne Université, Paris, France, 3Institut du Fer à Moulin, Paris, France
* These authors contributed equally

Summary

Mikroglia, bosatt immuncellerna i hjärnan, svara snabbt med morfologiska förändringar ändringar av deras miljö. Det här protokollet beskriver hur man använder två-foton mikroskopi för att studera attraktion av mikrogliala processer mot serotonin eller ATP i akut hjärnskada skivor av möss.

Abstract

Mikrogliaceller är bosatta innate immuna celler i hjärnan som ständigt skannar omgivningen med sin långa processer och, vid avbrott i homeostas, genomgå snabba morfologiska förändringar. Till exempel inducerar en laser-lesion på några minuter en orienterad tillväxt av mikrogliala processer, även kallad ”riktad motilitet”, mot platsen för skadan. En liknande effekt kan erhållas genom att leverera lokalt ATP eller serotonin (5-hydroxytryptamin [5-HT]). I den här artikeln beskriver vi ett protokoll att framkalla en riktad tillväxt av mikrogliala processer mot en lokal tillämpning av ATP eller 5-HT i akut hjärnskada skivor av unga och vuxna möss och att bilden denna attraktion över tiden av multiphoton mikroskopi. En enkel metod för kvantifiering med fri och öppen källkod bild analys programvara föreslås. En utmaning som fortfarande kännetecknar akut hjärnskada skivor är den begränsade tid, minskar med åldern, under vilka celler förblir i ett fysiologiskt tillstånd. Detta protokoll, således höjdpunkter några tekniska förbättringar (medium, luft-vätska gränssnitt avdelningen imaging kammare med en dubbel perfusion) som syftar till att optimera lönsamheten för mikrogliaceller över flera timmar, särskilt i skivor från vuxna möss.

Introduction

Mikrogliaceller är hjärnans bosatta makrofager och spela en roll i både fysiologiska och patologiska förhållanden1,2. De är har en starkt förgrenade morfologi ständigt utvidga och infällbara deras processer3,4. Problemet ”skanning” tros vara relaterade och nödvändigt att undersökningen av sin omgivning. Morfologiska plasticitet av mikroglia uttrycks i tre lägen. Först, vissa föreningar snabbt modulerar mikrogliala morfologi: tillägg av ATP5,6 eller NMDA5,7 medium bad akut hjärnskada skivor ökar komplexiteten i mikrogliala förgreningar, medan noradrenalin minskar det6. Dessa effekter antingen förmedlas direkt av mikrogliala receptorer (för ATP och noradrenalin) eller kräver en ATP-release från nervceller (för NMDA). Det andra kan mikrogliala processer, kallas motilitet eller ”övervakning”, tillväxt och upprullning hastighet påverkas av extracellulära faktorer8, homeostas störningar9,10eller mutationer9, 10,11. För det tredje, utöver dessa isotropiskt ändringar av morfologi och motilitet, mikroglia har kapacitet att utöka sina processer directionally mot en pipett som levererar ATP3,5,12, 13 , 14, i kulturen, i akut hjärnskada skivor eller in vivo, eller leverera 5-HT i akut hjärnskada skivor15. Sådan orienterad tillväxt av mikrogliala processer, även kallad riktad motilitet, beskrevs först som ett svar på en lokal laser lesion3,4. Således, fysiologiskt, det kan vara relaterade till svaret till skada eller krävs för att rikta mikrogliala processer mot synapser eller regioner i hjärnan som kräver beskärning under utveckling15,16, eller i fysiologiska17 ,18,19 eller patologiska situationer9,18,19,20 i vuxen ålder. De tre typerna av morfologiska förändringar lita på olika intracellulära mekanismer11,13,20, och en viss förening nödvändigtvis modulera inte dem (t.ex. NMDA, som verkar indirekt på alla mikroglia, har en effekt på Morfologi men inducerar inte riktad motilitet5,7). Därför, när syftar till att karakterisera effekten av en förening, en mutation eller en patologi på mikroglia, det är viktigt att karakterisera de tre komponenterna i deras morfologiska plasticitet. Här, beskriver vi en metod för att studera riktad tillväxten av mikrogliala processer mot en lokal källa av förening, som är, här, ATP eller 5-HT.

Det finns flera modeller att studera mikroglia processerna attraktion: primära kulturer i 3D-miljö6,18,19, akut hjärnskada skivor6,13,15, och i vivo Imaging3,13. Metoden i vivo är bäst att bevara det fysiologiska tillståndet av mikroglia. Dock intravital avbildning av djupa regioner kräver komplexa kirurgiska ingrepp, och därför är det ofta begränsade till ytliga kortikala lager. Användning av mikroglia primära kultur är den lättaste tekniken att testa ett stort antal villkor med ett begränsat antal djur. Dock är det omöjligt att få den samma cellmorfologi som i vivo och celler förlorar sin fysiologiska interaktioner med nervceller och astrocyter. Akut hjärnskada segment utgör en kompromiss mellan dessa två synsätt. Denna modell tillåter forskare att studera hjärnstrukturer som annars är svåra att nå bild med hög upplösning i vivo, och att undersöka skivor från neonatal stadier, medan transkraniell mikroskopi utförs mestadels vid vuxen ålder. Slutligen, det gör det möjligt att följa i realtid effekterna av lokal drog tillämpning, och upprepa experiment när du använder ett begränsat antal djur. Ett problem med akut hjärnskada skivor är dock begränsad tid (några timmar) under vilka celler förblir levande, särskilt för skivor från möss som är äldre än två veckor, och den eventuella ändringen av mikroglia morfologi över tid21,22 .

Här beskriver vi ett protokoll för att förbereda akut hjärnskada skivor av unga och vuxna Cx3cr1GFP / + möss upp till två månader gammal, med bevarandet av mikroglia morfologi och motilitet i flera timmar. Sedan beskriver vi, hur man använder dessa skivor för att studera attraktion av mikrogliala processer mot föreningar som ATP eller 5-HT.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla experiment godkändes av den lokala etiska kommittén (Darwin kommittén, avtal #1170 och #10921).

1. beredning av glas Mikropipetter för den lokala tillämpningen av föreningar

  1. Förbereda pipetter från Borsilikat tunnväggiga glas kapillärer med en elektrod avdragare. Justera parametrarna för att erhålla pipetter med en 4-5 µm diameter på deras extremiteter. Figur 2D visar en pipett i brightfield vid låg förstoring.

2. lösningar

  1. Se till att endast glas som har renats genom en autoklaveringscykeln, följt av sköljning 2 x - 3 x med ultrarent vatten, kommer att användas. Aldrig använda glas som har varit i kontakt med PARAFORMALDEHYD.
  2. Förbereda en 2 mol· L-1 CaCl2 stamlösning av upplösning 14,7 mg CaCl2·2H2O i 50 mL vatten av hög renhet (ultrarent vatten, motstånd 18,2 MΩ; tracesna av metall i destillerat vatten eller kranvatten kan leda till suboptimalt slice kvalitet beror på Pro-oxidativ effekter).
    1. Detta lager förvaras vid rumstemperatur i högst en månad.
  3. På dagen för experimentet, förbereda 1 L av kolin-aCSF (konstgjorda cerebrospinalvätska) lösning, vars sammansättning är 110 mmol· L-1 kolin Cl, 25 mmol· L-1 glukos, 25 mmol· L-1 NaHCO3, 7 mmol· L-1 MgCl2, 11,6 mmol· L-1 askorbinsyra, 3,1 mmol· L-1 natrium pyruvat, 2,5 mmol· L-1 KCl, 1,25 mmol· L-1 NaH2PO4och 0,5 mmol· L-1 CaCl2, 0,5.
    1. För att förbereda denna lösning, lägga till, i följande ordning, till en 1 L graderad kolv: 0.186 g KCl, 0,195 g av NaH2PO4, 2,04 g askorbinsyra, 2,1 g NaHCO3och 4,5 g glukos.
    2. Fyll ungefär hälften av den slutliga volymen med ultrarent vatten och röra tills fullständig upplösning.
    3. Lägg till 0,34 g natrium pyruvat och 15.36 g av kolin Cl.
      Obs: Det är bekvämt att första lös kolin Cl med 5-10 mL av den lösning som beretts i steg 2.3.2 innan den läggs till hela lösningen.
    4. Tillsätt 7 mL 1 mol· L-1 MgCl2 och 250 µL av 2 mol· L-1 CaCl2 (bereddes i steg 2.2) till lösningen.
    5. Fyll mätkolven upp till 1 L med ultrarent vatten.
    6. Med ett ångtryck osmometer, kontrollera att osmolaritet är mellan 300 och 310 mΩ. Om inte, justera den med glukos.
    7. Kontrollera pH-värdet efter carbogenation (dvs, bubblande med ”carbogen”, en blandning av 95% O2/5% CO2) och, vid behov justera, till 7,3-7.4 med 10 M NaOH.
    8. Överför lösningen till en glasflaska för lagring. Håll flaskan i kylen fram till användning (steg 3.1).
      Obs: Det rekommenderas att göra en ny lösning på dagen för experimentet. Dock om det behövs, kan kolin-aCSF lagras till två dagar vid 4 ° C.
  4. På dagen för experimentet, förbereda 1 L av en aCSF lösning, vars sammansättning är 124 mmol· L-1 NaCl, 26.2 mmol· L-1 NaHCO3, 25 mmol· L-1 glukos, 2,5 mmol· L-1 KCl, 2 mmol· L-1 CaCl2, 1 mmol· L-1 MgCl2och 1,25 mmol· L-1 NaH2PO4.
    1. För att förbereda denna lösning, lägga till, i följande ordning, till en mätkolv: 0,150 g av NaH2PO4, 0.186 g KCl, 2,2 g NaHCO3, 4,5 g glukos och 7,3 g NaCl. Lösningen till en volym av 1 L med ultrarent vatten och röra det kraftigt på en uppståndelse tallrik.
    2. Tillsätt 1 mL 1 mol· L-1 MgCl2 och 1 mL 2 mol· L-1 CaCl2 lösning och överföring aCSF lösningen till en glasflaska för lagring.
    3. Kontrollera om osmolaritet är 300-310 mΩ· L-1 och, om inte, justera den med glukos.
    4. Kontrollera pH-värdet efter carbogenation (dvs, bubblande med ”carbogen”) och, vid behov justera, till 7,3-7.4 med 10 M NaOH.
    5. Överför lösningen till en glasflaska för lagring. Håll flaskan i kylen fram till användning (steg 3.1).
      Obs: Det rekommenderas att göra en ny lösning på dagen för experimentet. Men är ett alternativ att förbereda en 10 x stamlösning innehållande NaCl, NaHCO3KCl och NaH2PO4 10 x den slutliga koncentration, som kan lagras i mer än en vecka vid 4 ° C. Gör den slutliga aCSF på dagen för experimentet genom att späda 10 x stamlösning med ultrarent vatten och lägga den glukos, CaCl2och MgCl2.
  5. Förbereda lösningarna som drog dagen i experimentet. Använda aCSF lösning för att föra dem till de slutliga koncentrationer, som här, 500 µmol· L-1 för ATP och 5 µmol· L-1 för 5-HT.
    Obs: För ATP, en stamlösning kan förberedas (t.ex. 50 mM ATP i vatten), lagras i aliquoted form vid-20 ° C och spädas med aCSF till slutliga koncentration på dagen för experimentet. Däremot måste 5-HT (serotonin-HCl) lösningen vara beredd från pulver på dagen för experimentet, på 1 mg·mL-1 i vatten, förvaras vid 4 ° C att undvika 5-HT oxidation och utspädd i aCSF vid tidpunkten för experimentet.

3. beredning av akut hjärnskada skivor

  1. Beredning av området dissektion
    1. Bereda 70 mL iskallt kolin-aCSF i en 80 mL bägare placeras på isen, att användas för hjärt perfusion, snabb nedkylning av hjärnan och skivning. Förbereda 150 mL kolin-aCSF i en 200 mL utkristalliseras maträtt, placeras i ett uppvärmt vattenbad hålls vid 32 ° C. Placera en nylon mesh SIL i crystallizing skålen att behålla skivor. Detta kommer att användas för att låta skivor återhämta sig i 10 min bara efter skivning.
    2. Minst 30 min innan start dissektion (avsnitt 3.2), starta bubblande dessa två lösningar (70 mL av kolin-aCSF på is) och 150 mL kolin-aCSF vid 32 ° C med carbogen. Upprätthålla konstant carbogenation under hela förfarandet.
    3. Förbereda gränssnitt kammare enheten (figur 1 c), som används för att hålla skivor fram till deras användning.
      1. Placera en 200 mL utkristalliseras skålen med en bar i en förseglad mat låda (10 x 10 cm eller 10 cm i diameter och 8 cm i höjd), installerad på en magnetomrörare, magnet.
      2. Tillsätt 200 mL aCSF i denna crystallizing maträtt och placera hållaren 3D-tryckt gränssnitt skiva ovanpå den (interface segment innehavaren är sammansatt av två perfekt passande delar, med en polyamid mesh sträckte sig mellan dem, figur 1A, B).
      3. Ta bort överskottet från crystallizing skålen att hålla bara en tunn film av lösning som omfattar gränssnittet slice innehavaren maskorna. Detta kommer att senare skapa en fin kant lösning kring skivor (men utan att täcka dem).
      4. Sätta några millimeter av aCSF längst ned i rutan mat och börja bubblar det av carbogen (vid första användningen, göra ett litet hål i förseglade mat låda väggen så att slangen kan ange rutan).
      5. Stäng rutan förseglade bibehållen konstant carbogenation. Detta kommer att skapa en befuktade 95% O2/5% CO2 rik miljö där skivor kommer att överföras efter deras återhämtning i kolin-aCSF och underhålls innan de är avbildade. Denna enhet är hädanefter ”gränssnitt avdelningen” (figur 1 c).
  2. Hjärnan dissektion och skivning
    1. Söva musen med en intraperitoneal injektion av 50 mg·mL-1 pentobarbital (0,15 mL/20 g mus kroppsvikt), immobilisera det, exponera hjärtat och utföra en hjärt perfusion med 10 mL av iskall, carbogenated, kolin-aCSF (se steg 3.1.1), med en Peristaltisk pump. Observera blekhet i levern som en indikator på en bra genomblödning. Perfusionen varar mindre än 5 min.
    2. Halshugga musen och skära huden för att exponera skallen. Med en stor sax, applicera två tvärgående snitten från stora foramen och en lång sagittala snitt och använder fin pincett, ta bort skallen plattorna.
    3. Snabbt och försiktigt extrahera hjärnan (i mindre än 1 min) och placera den för 1 min i 80 mL bägaren som innehåller den återstående (~ 60 mL) iskall kolin-aCSF (fortfarande under konstant carbogenation), för att kyla ner.
    4. Överföra hjärnan på ett filterpapper tidigare våt med aCSF.
    5. Klipp ut hjärnan enligt hjärnregionen sevärdheter och rekommenderad vinkel av skivning. Exempelvis för att bild thalamus eller hippocampus på koronalt skivor, skär ut med skalpell blad lillhjärnan och, därefter, om 2 mm från rostralt och stjärtfenan extremiteter i hjärnan.
      Obs: Det är viktigt att ta bort hjärnan delar som är alltför rostralt eller alltför kaudala eftersom ju mindre regionen att trimma innan den når området av intresse, desto snabbare skivning. En total tid för skivning (steg 3.2.7) mindre än 20 min. rekommenderas.
    6. För koronalt skivor, position och limma (med cyanoakrylat lim) kaudala ansiktet av hjärnan på en 10 cm petriskål, limmade på skära blocket av en vibrerande skivare och placera den i behållaren kammaren av utsnittet vibrerande, som är placerad i en större kammare fylld med is. Fyll sedan petriskål med alla de återstående iskall kolin-aCSF.
    7. Samtidigt hålla konstant 95% O2/5% CO2 bubblande av den iskalla kolin-aCSF, skära 300 µm tjocka koronalt skivor (hastighet: 0.08 mm·s-1, blad vibrationer: 60 Hz, vibrationer amplitud: 1 mm).
    8. Samla pipett hjärnan skivor med en bred mun (4 mm i diameter) disponibla överföring, en efter varje enskilt pass av bladet, att undvika ansamling av giftiga komponenter som släpptes av peripheryen av skivor. Var noga med att undvika luftbubblor under överföringen och placera varje skiva i den kolin-aCSF vid 32 ° C i ca 10 min för återvinning.
    9. Med överföring pipetten, placera skivor på bitar av rengöring papper toppad med en droppe av kolin-aCSF. Sug ut överskottet av kolin-aCSF och, med spateln placera skivor, lade på rengöring av lins vävnad, på maskorna gränssnitt kammaren som innehåller carbogenated aCSF vid rumstemperatur (se 3.1.3.5). Låt slice återhämta sig i denna miljö för minst 30 min.
      Obs: Efter detta skivor är redo och kan användas för mikroglia imaging för upp till 6 h efter hjärnan utvinning från young (mindre än en månad gamla) möss och upp till 4 h efter hjärnan utvinning från två månader gamla vuxna.

4. två-foton mikroskopi

  1. Parametrar inställning
    1. Slå på multiphoton systemet (hybrid detektorer, laser, scanner, Elektro-optisk modulator, Mikroskop).
    2. Ställ in lasern på 920 nm, kontrollera att lasern är läget-låsta, och ange makt på 5% - 15% och vinst på 10%. Detta motsvarar en effekt av 3-5 mW under målet. Säkerställa att nondescanned detektorerna är engagerade och lämpliga utsläpp och magnetisering filter installerat.
    3. Ställa in parametrar av avbildningsprogrammet till följande värden: för ramstorleken, 1024 x 1024 pixlar motsvarar en yta på 295.07 x 295.07 µm; för zoom, 2. Om signalen är mycket bullriga, tillämpa en rad genomsnitt 2. För den pixel dynamiken, ange avbildningsprogrammet på 12 bitar eller mer.
      Obs: Bilder med en högre bitvärdet tillåter forskare att skilja mindre skillnader i fluorescensintensitet än bilder med en lägre bitarsvärde: en förändring av en grå värdet i en 8-bitars bild skulle motsvara en förändring av 16 grå värden i en 12-bitars och 256 grå värden jag n ett 16-bitars bild. Därför högre-bitars bilder är mer lämpliga för kvantitativ analys, men eftersom deras storlek ökar med bitdjup, lagringskapacitet och computing power kan bli begränsande.
    4. Välj skanningsläge XYZT med en Z-intervall intervall på 2 µm och en T-intervall på 2 min.
      Obs: X, y och z upplösning bestäms av det Nyquist Samplingsteoremet. En Z-steg storlek runt 0,8 vore optimalt att lösa mikroglia processer (med en diameter på < 1 µm), men den optiska upplösningen av multiphoton mikroskopi begränsande (på 920 nm med 0,95 NA mål, axial resolutionen är runt 1 µm). På toppen av det fysiska hinder, i ett live-imaging experiment, känslighet eller signal-brus-förhållandet, upplösning, hastigheten och totala observation tid ärendet. Med hänsyn till alla dessa parametrar, en z-steg 2 µm (som i många studier3,11,14), en bildstorlek 1024 x 1024 pixlar och en höghastighets förvärvet en resonant skanner kopplat till HyD detektorer (det tar runt 15 s att förvärva 50 z-planer) valdes här. Frekvensen av förvärv är en XYZT serie varje 2 min och den totala längden är 30 min. Om inställningen inte är snabb eller tillräckligt känslig, det är möjligt att minska den laterala upplösningen (ner till 512 x 512) eller antalet z-skivor (av imaging uteslutande i z-djupet som uppvisar den starkaste fluorescensen [dvs inte djupaste z-skivor där fluorescens är svag]), eller minska hastigheten på skannern. Axiell resolutionen kan också minskas genom att öka det z-steget upp till 3 µm, men eftersom detta kan påverka kvantifieringen, alla experiment ska jämföras bör utföras med samma z-steg.
      Obs: Det är möjligt att utföra liknande experiment på skivor från CX3CR1creER-YFP möss18, en mus linje används för att framkalla genetiska borttagning i mikroglia endast och i vilka mikroglia konstitutivt express gul fluorescerande protein (YFP). Dock den uttryck YFP är mycket låg jämfört med grönt fluorescerande protein (GFP) i CX3CR1GFP / + möss; Således, imaging är möjligt men utmanande och kräver optimering av parametrarna förvärv. Det rekommenderas att justera dem enligt följande.
    5. Ställ in lasern på 970 nm (som är bättre anpassad till YFP excitation än 920 nm), kraften på 50% och vinsten på 50%, vilket motsvarar en lasereffekt enligt syftet med 5-6 mW.
    6. Ange en rad genomsnitt 4 (eller mer) att förbättra signal-brus-förhållandet.
  2. Positionering av segmentet och glas mikropipett, och den lokala tillämpningen av föreningen
    1. Anslut den peristaltiska pumpen till inspelning avdelningen i 30 min innan du startar inspelningen. Efter rengöring av hela perfusion systemet med 50 mL av ultrarent vatten, börja perfusionen i inspelning kammaren med aCSF (50 mL) som ingår i en glasbägare under konstant carbogenation. Hela experimentet, hålla den cirkulerande aCSF till 32 ° C med en inline microheater eller en Peltier värmare.
      Obs: En specifik perfusion kammare med övre och nedre perfusion är utformat för att optimera syresättning på båda sidor av segmentet. Perfusion kammaren består av två perfekt passande delar, med en polyamid mesh sträckte sig mellan dem (figur 2A, B). Jämfört med andra typer av kammare, slice är där direkt handpåläggning ett täckglas, denna kammare minskar nervcellernas död i nedre delen av segmentet, förbättrar lönsamheten och minskar slice rörelser induceras av dess svullnad.
    2. Med pipett bred mun disponibla överföring överföra hjärnan segmentet till avbildas till aCSF bägaren att ta bort objektivet papper, låt det sjunka (som ett bevis på att inga luftbubblor sitter) och överföra det till inspelning (perfusion) avdelningen.
    3. Placera en bit hållare (en hårnål tillverkad av platina med två grenar sällskap av parallella nylontrådar) på skiva att minimera slice rörelse på grund av perfusion flödet.
    4. Använd ljusa fält belysningen för att rikta hjärnregionen sevärdheter (exponeringstid: 50 till 80 ms) med en låg förstoring målsättningen (5 X eller 10 X). Växla till högre förstoring (25 x med en 0,35 x linsen) vatten nedsänkning målet och justera positionen.
      Obs: Undvika att bildfält nära slice innehavarens nylontrådar eftersom de kan blockera ljuset och lokalt deformera segmentet. Kontrollera att området av intresse är platt. Om det behövs ta bort hållaren slice för att flytta slice eller slice innehavaren.
    5. Använd fluorescens belysning för att lokalisera fluorescerande mikrogliaceller att avbildas i fältet (exponeringstid: 250-500 ms).
      Obs: Detta steg kan forskare att kontrollera förekomsten av celler i regionen av intresse och deras fluorescensintensitet och för att kontrollera för den cellulära skräp.
    6. Återfyllning pipetten med 10 µL aCSF med ATP, 5-HT, eller drogen av intresse vid dess slutliga koncentration. Rikta spetsen nedåt och skaka försiktigt drog-fyllda pipetten för att ta bort eventuella luftbubblor som fastnar i spetsen.
      Obs: Om lösningen injiceras tenderar att bilda bubblor, överväga att använda Borsilikat pipetter med en inre glödtråden. Läckage av ATP ur pipetten kan locka mikrogliala processer även före injektion (om detta inträffar kommer det vara synliga vid analys steg). Även om detta bör vara måttlig med ATP koncentrationen används (500 µmol· L-1), om det är ett problem, anser prefilling mikropipett med 2 mL aCSF innan du lägger till ATP (eller annan förening) lösning vid steg 4.2.6.
    7. Montera den fyllda pipetten i en pipett hållare, ansluten med transparent slang till en 5 mL spruta, med en kolv som placerad på 5 mL position. Pipett innehavaren själv är monterade på en treaxlig micromanipulator.
    8. Under ljusa fält belysning, Använd micromanipulator för att placera pipetten i mitten av fältet. En reproducerbar och optimal centrering, Visa och använda linjalerna på bilden.
    9. Lägre pipetten försiktigt mot segmentet, kontrollera och justera målet på samma gång, tills pipettspetsen lätt vidrör ytan av segmentet. Stoppa nedstigningen av pipetten så fort det syns att segmentet har berörts tillåter pipettspetsen penetrera 80-100 µm av segmentet yta (se figur 3B).
    10. Tune laser (se parametrarna ovan) och växla mikroskopet till multiphoton läge. Se till att kammaren är avskärmade från någon ljuskälla (t.ex. en datorskärm). Slå på nondescanned detektorerna och ställa in förstärkningen. Använd en uppslagstabell (LUT) med en färgkodad övre gräns för att undvika mättar pixlarna i bilden.
    11. Bestämma tjockleken på segmentet till avbildas (dvs., de övre och nedre z-positioner där fluorescens är detekterbar [vanligtvis mellan 220 och 290 µm totalt]).
      Obs: Ytan på biten finns det en ökad täthet av processer och eventuellt av mikroglia, ofta med en ovanlig morfologi, i jämförelse med insidan av segmentet. Denna ansamling blir mer slående med tiden (dvs., mer synliga i sist än i den första sektionens hjärnan att avbildas). Därför de z-plan först ~ 30 µm bör inte användas för analys och förs.cykeletapper även för förvärvet.
    12. Starta inspelning för sammanlagt 30 min (eller mer om så önskas) och efter 5 min originalplan, lokalt applicera föreningen som skall testas (utan att avbryta imaging). Detta gör långsamt tryck kolven i sprutan ansluten till mikropipett, från 5 mL till 1 mL position (i ungefär 5 s). Motstånd när du trycker på kolven måste märkas omedelbart. Om så inte är fallet, spetsen vara bruten.
      Obs: För en utbildad försöksledaren, injektionerna med denna metod är reproducerbara, men alternativt till manuell manipulering av en spruta, pipetten kunde kopplas till en automatiserad utmatning trycksystem att möjliggöra en bättre kontroll av volymen levereras. Injektionen skapar en fysisk snedvridning av segmentet på platsen för injektionen. Denna snedvridning är synlig efterhand i de första två eller tre bilder efter injektionen men bör inte vara synlig på den fjärde bilden, (dvs. 8 min efter injektionen). Om det kvarstår, överväga att ändra parametrarna för pipetten beredning.
    13. I slutet av förvärvet (30 min), kassera mikropipett och ta bort segmentet. Om du vill fixa segmentet för ytterligare immunolabeling. Till exempel metoden ögonblicksbild är optimerad för fixering och färgning av tjocka skivor23.
    14. Före start att bild en ny skiva, göra 2D filmen (avsnitt 5.1) för att kontrollera att mikroglia har en normal morfologi och flyttar och därmed att skivor är friska.

5. analys av dragningen av mikrogliala processer

  1. 2D projektion och drift korrigering
    1. Öppna filen (. LIF) med Fiji24.
    2. Om nödvändigt, göra en substack (Bild/travar/verktyg/Make Substack) med endast de z-plan av intresse. Till exempel utesluta de z-plan motsvarar ytan av segmentet om de har förvärvats, men är inte skall användas för analys (se anteckningen efter steg 4.2.11) och de djupaste z-plan med ingen fluorescens. Den slutliga stacken innehåller vanligen 90-110 z-skivor (180-220 µm).
    3. Starta funktionen Z project (Bild/travar/Z Project”) och välj Max intensitet projektionstypen att göra projektionerna av z-stacken förvärvat vid varje tidpunkt.
    4. Starta MultiStackReg plugin (Plugin/registrering/MultiStackReg), välja åtgärd 1: justera och Transformation: stel kropp att korrigera liten drivor som kan ha inträffat under förvärv. Spara denna 2D film som en ny fil (.tiff).
  2. Behandling av uppgifter
    1. Öppna den nya filen med isiga25.
    2. Rita en cirkulära R1 region av intresse (ROI) 35 µm i diameter, centrerad på injektionsstället (identifieras särskilt av skuggan av pipetten och den snedvridning som skapade vid tidpunkten för injektion).
    3. Använda plugin ROI intensitet evolution och mäta den genomsnittliga intensiteten över tid i R1.
    4. Spara resultat till en. XLS-fil.
  3. Kvantifiering och representation av resultaten
    1. För att kvantifiera mikrogliala svaret över tid, bestämma vid varje tidpunkt
      Equation
      Here,'R1(0) är medelvärdet av R1(t) värden före injektion. Sedan resultaten kan representeras som en kinetic mikrogliala svar, eller vid en viss tidpunkt punkt (se figur 7).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det här protokollet beskriver en metod för att framkalla, iaktta och kvantifiera orienterade tillväxten av mikrogliala processer mot ett lokalt tillämpade förening, exempelvis ATP eller 5-HT, i akut hjärnskada skivor från ung eller vuxen (minst upp till två månader gamla) möss. Bland de faktorer som bidrar till att upprätthålla hjärnan skivor från vuxna djur i felfritt tillstånd i flera timmar är användningen av två verktyg för att optimera cellöverlevnad två stegen i protokollet. Först, interface segment innehavaren i gränssnittet kammaren (figur 1) förbättrar bevarandet av skivor efter styckning. Andra har inspelning kammaren (figur 2) en perfusion system vilken tillåt aCSF att köra både längst upp och längst ned i segmentet under imaging. Inspelning kammare dimensionerna som används här ställs att passa standard Mikroskop som de är lika klassiskt bad avdelningen skär (med en 62 mm ytterdiameter), men eftersom deras modeller är nedladdningsbara från Kompletterande Material, design kan vara anpassad för att passa i slice innehavare av andra dimensioner. Att notera är att varje kammare är gjord av församlingen, utan lim, av två perfekt passande delar, med en polyamid mesh sträckte dem emellan.

För att leverera ATP eller 5-HT i ett litet område och framkalla en lokal reaktion av mikroglia, placeras en pipett som innehåller substansen (visas i figur 2 cD) med sin spets ovanpå segmentet. I de första experimenten, kan det vara bra att lägga till ett fluorescerande färgämne lösningen, för att visualisera ståndpunkten av pipettspetsen på bilderna som förvärvas med mikroskopet två-fotonen (figur 3A). I figur 3Bsyns det att trots experimenter upphörde pipett nedstigningen så snart dess spets berört och deformerade slice ytan på ljusa fält bilden på datorskärmen, dess tunna extremiteter ingått något vävnad, ner till 80- 100 µm från ytan. Det är viktigt att pipetten inte är alltför ytlig eftersom det inte kan leverera lösningen korrekt på cellerna, och inte heller har ange alltför djup eftersom den kan nå en region där fluorescens signalen är för låg. De parametrar som kan påverka djup nås pipettspetsen är vinkeln på pipetten, som kan justeras med de tre-axlig micromanipulator och pipett mun diameter.

Observera att, med projektionen längs y-axeln (figur 3B), det är möjligt att Observera att fluorescensen är starkare i övre än i den nedre delen av segmentet. Detta beror både på progressiv avtrubbning av signalen släpper skiva och det faktum att processer av mikroglia av de ytliga lagrarna av segmentet, och vissa cell organ, tenderar att migrera mot ytan. Som ett resultat, kan mikroglia i segmentet mest ytliga lager Visa en annan morfologi än de släpper skiva, som anger att de inte är i samma skick, och kan reagera annorlunda på stimulering. Således, ytliga mikrogliala aktiveringen kan maskera, i z-projektionen, svaret från mikroglia nedan. Dessutom ytan lutar ofta, och de första z-bilderna av stackar är fläckvis. Därför rekommenderar vi, för en bättre noggrannhet, för att utesluta de mest ytliga z-plan från z-projektion och analys. Dock som förändrat mikroglia morfologi och förekomst av skräp i de ytliga lagren är indikatorer på villkora av slice, kan det vara intressant att bild hela djup av en bit för att kontrollera dess status som efterhand. Detta kan vara särskilt användbar för att nya praktiker som inte kan enkelt identifiera onormala mikroglia eller skräp från enda z-plan. Z-plan tagit första 30 µm kommer sedan att uteslutas vid z-projektion steg (steg 5.1.2 i protokollet).

När segmentet har behandlats med sammansatta av intresse och registreras, avbildade serien av z-plan (förutom den första 30 µm, som diskuterats ovan) vid varje tidpunkt punkt projiceras längs z-axeln att göra en 2D film av z-projektion bilder. Att notera är att i protokollet presenteras här, Använd för max z-projektion tjocklek omfattar alla z-skivor där fluorescens syns (vanligtvis 180-220 µm, se steg 5.1.2 i protokollet). Därför påverkar variationer i det absoluta antalet z-skivor inte kvantifiering av svaret. Däremot använda vissa studier tunnare z-stackar (40-60 µm) för z-projektion6,7,11,27. Detta är ett annat alternativ, som kommer med risken att utesluta vissa z-slices som ställer ut ett svar, som vi observerade att lockmedel effekten var synligt så långt 70 µm (i z) från pipettspetsen i vissa experiment. Om alternativet tunnare är att föredra, det är således kritisk till center z-stacken på pipetten spets i z, och viktigast, bara z-projektionerna gjort på samma sätt (dvs.med hjälp av alla fluorescerande z-skivor eller en tunn z-stack) kan jämföras.

En R1-region av intresse definieras då för kvantitativ analys. Figur 4 visar en ROI på en z-projektion. De röda streckade linjerna representerar förmodad positionen för pipetten. Den gula cirkeln är R1, dras med Icy och centrerad på förmodad spetsen på pipetten. Ännu viktigare, konstaterade vi att en märkbar variabilitet uppstod under kvantifiering från localizationen av R1 ROI, vars felplacering leder till en underskattning av svaret. Vi rekommenderar för att positionering ROI på platsen för leverans, visar linjalerna i programvaran förvärvet när du placerar pipetten i brightfield, för att placera pipettspetsen alltid i samma centrala XY position i fältet att avbildas. Detta ger en fingervisning om var du ska placera, senare, ROI i Z-projektionen av fluorescens bilderna. Dock kommer sista tips ståndpunkt och således den faktiska platsen för leverans skiftas något från detta centrala läge, beroende på djupet nås pipettspetsen. Av denna anledning till position R1, vi beakta tre andra kriterier: a R1 måste vara på toppen av pipetten, vars läge är slutsatsen från den mörka bakgrunden i det nedre högra hörnet, (ii) Det bör motsvara området där en övergående snedvridning av vävnad uppstår när föreningen injiceras, och (ii) Det bör motsvara området där en lokal reaktion (om någon) observeras. Om detta inte är tillräckligt för att lokalisera med god noggrannhet leveransen, hjälper fylla pipetten med en fluorescerande förening. Efter att ha dragit R1, vi kör filmen igen för att kontrollera att det är väl positionerat för alla tidpunkter och att det finns inga avvikande drift, förvrängning eller artefakt fluorescens vid någon tidpunkt, kunde som bias kvantifiering. Filmen motsvarande figur 4, och som illustrerar effekten av ATP ansökan, kan hittas i det kompletterande materialet (Film S1).

Vi studerade inledningsvis dragningen av mikrogliala processer mot ATP- eller 5-HT i thalamus P11 möss15. Mer nyligen, dessa experiment upprepades i skivor från fyra dagar till två-månader gamla möss och i olika regioner (exempelvis figur 3 motsvarar en inspelning i hippocampus). Vi mest använt tre till fyra-vecka-gammal möss, som kombinerar fördelarna med en mogen hjärnan-med mogna och förgrenat mikroglia-med en bra bit livskraft. Ännu viktigare, representativa normal-state mikroglia kännetecknas av en liten soma, långa processer med små terminaler och ständigt rörliga processer på det ursprungliga tillståndet. Vanligtvis i skivor från 18 till 30 dagar gamla möss är mikroglia morfologi mestadels oförändrad för upp till 6 h efter slice beredning. För skivor från äldre möss (två månader) är förmågan att upprätthålla sektorerna i en fysiologiska tillstånd reducerad (~ 4 h). Exempel av mikrogliala riktning motilitet i thalamus, som svar på 5-HT i ett segment från en 20-dag-gammal mus och till ATP i ett segment från en två-månad-gammal mus, ges i figur 5. Filmen motsvarar programmet 5-HT i figur 5 kan hittas i det kompletterande materialet (Film S2).

Figur 6 presenterar två suboptimala experiment gjort på skivor höll längre än 6 h i aCSF innan de var avbildad (endast gånger 0 visas). I figur 6A, Observera förekomsten av mikroglia med flera korta processer eller utvidgade terminaler som påminner om neurite tillväxt kottar, och förekomsten av många fluorescerande cellfragment eller partiklar. Dessa mycket fluorescerande element bo orörliga eller flytta slumpmässigt under imaging, som anger att de inte tillhör ”levande” mikroglia (se Film S3 i kompletterande material). Att notera är att i detta exempel, mikroglia ständigt skannar omgivningen, men deras morfologi förändrades så att de inte kunde anses vara i ett fysiologiskt tillstånd. Dessutom skulle den stora mängden skräp ha gjort fluorescens analysen dåligt tillförlitlig. Figur 6B illustrerar närvaron av mikroglia med stor och platt cell organ eller utskjutande delar, som ibland kan hittas i de ytliga lagrarna av skivor som har hållits flera timmar innan de var avbildade. Endast har ytliga z-positioner använts för att göra denna z-projektion. Figur 6 c är en substack, vid djupare z-positioner, från samma hjärnan segment som visas i figur 6B. Även om de inte är placerade på ytan, dessa mikroglia har en onormal ”yvig” aspekt. På grund av aspekten av mikroglia användes de filmer som motsvarar dessa två skivor inte för kvantifiering.

Efter att extrahera data från 2D-filmer, kan resultaten representeras av plottning normaliserade R(t) fluorescens över tid. Ett diagram som summerar flera experiment presenteras i figur 7A, för att Visa variationen i svaren. Observera att fluorescensen minskar omedelbart men övergående (i de tre första bilderna) efter injektionen på grund av vävnad distorsion (dvs flytande injektion med pipetten tillfälligt skjuter vävnaden bort, och då ökar). Variabiliteten i svaret till ATP illustrerar det faktum att även när skivor ser likaså frisk, med rörliga och förgrenat mikroglia, de inte svarar på samma sätt (men alla av dem svarar). Ovanpå inneboende prov heterogenitet, det finns några glapp i R1 placeringen, som nämnts ovan, och vi också kan inte utesluta en inverkan, till exempel skillnader i volym av lösningen som levereras. Därför, för att upptäcka små effekter eller variationer, det kan vara intressant att använda en automatisk anordning för den sammansatta injektionen.

Figur 7B visar hur storleken på ROI påverkar också kvantifiering, här av tillväxten av ATP-inducerad processer. Ökande diameter från 35 (diameter används i figur 7A och för alla de analyser som presenteras här) till 50 eller 70 µm minskar variationen bland experiment (skivor) genom att undertrycka frågan om små R1 positionering. Det minskar dock även noggrannhet och omfattningen av de upptäckta svaren. Med större ROIs, det är ju mer bakgrund på grund av processer eller cellen organ inte påverkas av behandlingen, och en tillväxt om processer kan vara delvis trubbiga genom den samtidig indragning av mikrogliala grenar mer avlägsna från pipetten men ändå inuti ROI. Sammanfattningsvis kan det vara relevant att använda ROIs med en annan diameter cirkel än en som är 35 µm, men det är grundläggande att ROI alltid är densamma i alla datauppsättningar kan jämföras.

Figur 7 c visar den medelvärde ± SEM för flera experiment med aCSF, ATP eller 5-HT. Effekten av ATP är i samma storleksordning som de som uppnås genom andra grupper med en liknande metod i vivo (0,5 enligt Davalos et al.3 och 0,4 enligt Haynes et al.13) och i skivor (0,8 om normaliserade som görs här enligt Dissing-Olesen et al.5och 0,6 enligt Pagani et al.28). Dels, skillnaderna kan komma från biologiska parametrar, såsom den slice förberedelse metoden, mängden ATP injiceras, ålder musen eller hjärnregionen används, och å andra sidan från analysparametrar såsom diameter av ROI och tjocklek av z-stackar används för z-projektion (dvs. hela tjockleken där fluorescens upptäcks eller bara de 40-60 µm runt pipettspetsen, där den maximalt Svaren förväntas).

I figur 7 cär aCSF injektionen den negativa kontrollen, nödvändigt att kontrollera att den lokala injektionen och trycket av pipetten inte orsakar en skada som kan locka mikrogliala processer. Dessutom tillåter aCSF kontroll forskare att kontrollera att det finns ingen fotoblekning över tid. Faktiskt skulle fotoblekning, photon-inducerad förstörelsen av fluorescerande proteiner eller fluorophores, ha föranlett en progressiv minskning av fluorescens över tid. Som det kan bias mätningar, är det viktigt att noggrant kontrollera att det finns ingen fotoblekning under experimentella förhållanden. För att göra detta, det rekommenderas att förvärva en XYZT serie på en skiva med GFP-uttryckande mikroglia, 30 min (aCSF kan injiceras, men faktiskt, ingen stimulering behövs), med excitation och förvärv parametrarna som ställts i de experimentella förhållandena. Sedan kommer att ett kvantitativt mått av fluorescensen över tid i olika regioner av intresse, inklusive mikroglia cellen organ eller processer, avslöja om det finns en gradvis förlust i utsläpp intensitet, vanligtvis en exponentiell förfall, som anger fotoblekning. Om så är fallet, vissa justeringar kan utföras: en omgruppering av laser, en minskning av lasereffekten och en ökning av detektorn gain, en minskning av antalet z-flygplan, och en ökning av intervallet mellan dem att begränsa belysning. Fotoblekning gynnas av hög effekt eller lång (ex: upprepade belysning för linje genomsnitt) magnetisering; Således, forskare måste uppmärksamma det om en varaktig belysning används till bild celler med låg fluorescens.

Efter lokal injektion av ATP- eller 5-HT finns det en ökning med fluorescens i R1, som når en platå (figur 7 c). Utöver kinetik, kan det vara intressant att jämföra attraktionen på en stabil slutpunkt. Här, vi valde att representera mikrogliala reaktionen vid t = 26 min (dvs. 20 min efter injektion) i figur 7 d. Detta är användbart att statistiskt jämföra föreningar, eller för att testa effekten av antagonister som kan läggas i badet (dvs i perfusion lösningen, eller tillsammans med en förening i pipetten [visas inte]).

Figure 1
Figur 1: gränssnitt kammare Detaljer. (A) disposition för 3D utskrift av innehavaren av segment. Den yttre diametern av innehavaren är 7 cm. (B) gränssnitt slice hållare med nylon mesh (pil) som tillåter forskare att hålla skivor på gränssnittet vätska-luft. (C) gränssnitt kammare enhet som gör det möjligt att bibehålla skivor i en carbogenated (pilen anger slangen för bubblande) och fuktad miljö innan de är avbildade. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Perfusion kammare Detaljer. (A) disposition för 3D utskrift. Den yttre diametern av perfusion kammaren är 5,9 cm. (B), perfusion kammaren med nylon mesh (pil) som stöder slice, hindrar den från att röra bilden nedan, och tillåter aCSF flöda över och under den. (C) bild av församlingen på mikroskopet två-foton. Den mikropipett som kommer att leverera föreningen lokalt syns till höger (asterisk). (D) pipett avbildas i brightfield. Skalstapeln = 60 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: mikropipett Position i segmentet. Exempel på ett förvärv av en bunt med bilder (i hippocampus 30 dagar gamla djur) med en mikropipett fylld med fluorescein (1 µM). Fluorescein gör det möjligt att lokalisera pipetten (asterisk) i max prognoser längs (A), z-axeln eller (B), y-axeln. Observera i panelen B att, även om det är svagare i fluorescens, så finns det också mikroglia nedanför pipettspetsen. I denna illustrerade exempel, har hela bunten, inklusive bilder tagna i den ytligaste delen av segmentet, använts av prognoserna. Skalstapeln = 30 µm i panel A och som indikerade (varje examen = 50 µm) i panelen B. Z-tjockleken på stacken = 220 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: positionering av R1, ROI används för kvantifiering. Denna figur visar tre experimentella tidpunkter av ett experiment där ATP har tillämpats på en bit (från thalamus 20 dagar gamla djur), med teckningar av den förmodade platsen för pipetten (röd streckad linje på den första tidpunkten) och avgränsningen av R1 ROI. Skalstapeln = 30 µm. Notera området mörkare i det nedre högra hörnet, motsvarande skuggan av pipetten, som interfererar med belysning och imaging. Observera också, intensiv fluorescens på 25 min, vilket indikerar platsen för pipettspetsen små regionen. Z-tjockleken på stacken = 220 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: mikrogliala svaren. Svaren till den lokala tillämpningen av 5-HT (5 µM) på en hjärna skiva från en 20-dag-gammal mus (vänster; segment z-tjocklek = 220 µm) och av ATP (500 µM) på en skiva från en två-månad-gammal mus (höger; segment z-tjocklek = 220 µm). De röda streckade linjerna ståndpunkt pipett. Båda inspelningarna har gjorts i thalamus, och den övre 30 µm i skivor har uteslutits. Bilderna är tagna innan (övre raden) och 25 min efter (nedre raden) injektion. Skalstapeln = 30 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: exempel på suboptimala experiment. Dessa skivor har väntat på mer än 6 h innan imaging och har varit avbildad eftersom deras övre yta. (A) exempel på en z-stack med en massa skräp (ungefär runda, fluorescerande partiklar, men med oregelbundna gränser; asterisker) och ”yvig” mikroglia (pilar), det vill säga med många men korta processer. Observera de utvidgade processen terminaler (pilspetsar) som ser ut som axonal tillväxt kottar. Z-tjockleken på stacken = 220 µm. De andra två panelerna visar två sub högar av samma segment, med (B) 1-30 z-plan (z-tjocklek = 59 µm) och (C), 30-120 z-flygplan (z-tjocklek = 180 µm). På de övre planen (visas i panelen B), utöver den stora processen terminaler och skräp som i sidopanelen A, finns det mikroglia med ovanligt stora platta kroppar eller utskjutande delar (stjärnor). På de djupa plan (visas i panelen C), finns det inget skräp eller platt föremål, men cellerna är yvig (pilar) och densiteten är ovanligt hög. Sammantaget visar dessa observationer att mikroglia inte normalt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: kvantifiering av dragningen av mikrogliala processer. (A) exempel på en serie experiment med ATP att illustrera variabilitet. (B) inverkan av ROI storlek på kvantifiering. Varje experiment visas i panelen har en (ATP injektion) analyserats med en ROI på 35, 50 eller 70 µm diameter. För de olika ROIs visas det medelvärde ± SEM av thefluorescence vid varje tidpunkt. (C) Sammanfattning av experiment med aCSF, 5-HT och ATP. ACSF injektionen har ingen effekt på platsen för mikrogliala processer. ATP och 5-HT inducerar en lokaliserad tillväxt av mikrogliala processer mot pipetten, mätt med en lokal ökning av fluorescens. Det medelvärde ± SEM indikeras. (D) Sammanfattning av försök svaren vid t = 20 min postinjection (26 min från början av inspelningen). Det medelvärde ± SEM indikeras. Envägs ANOVA med Dunnett post hoc test används. p < 0,01, *** p < 0,001 jämfört aCSF injektionen. För aCSF, n = 7; för ATP, n = 8; för 5-HT, n = 6. Alla dessa experiment utfördes i thalamus, men liknande resultat kan erhållas från hippocampus eller cortex. Z-tjockleken på de stackarna som används för z-projektionerna och kvantifiering = 180-220 µm. Alla åtgärder utom de i panelen B har gjorts med en 35 µm diameter ROI. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Movie 1
Film S1: exempel på effekten av en lokal ATP (500 µM) applicering. Detta experiment har utförts i thalamus 20 dagar gamla djur. Bilder från denna film har använts i figur 4. Skalstapeln = 30 µm. vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)

Movie 2
Film S2: exempel på effekten av ett lokalt program 5-HT (5 µM). Detta experiment har utförts i thalamus 20 dagar gamla djur. Bilder från denna film har använts för figur 5 (vänster). Skalstapeln = 30 µm. vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)

Movie 3
Film S3: exempel på ett suboptimalt experiment i ett segment som efter att ha väntat för mer än 6 h innan imaging. Observera förekomsten av talrika skräp som rör sig slumpmässigt över tiden och ovanliga morfologi av mikroglia. En bild från denna film används som figur 6A. Skalstapeln = 30 µm. vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)

Kompletterande fil: Imaging kammare och gränssnitt innehav kammare. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Genom att bibehålla, till skillnad från i skiljas eller organotypic skiva kultur, en strukturell integritet med begränsat nätverk justeringar, akut hjärnskada skivor tillåter forskare att studera mikroglia i deras fysiologiska miljö. En av de stora begränsningarna är dock det faktum att förfarandet för skivning skapar skador som snabbt kan äventyra livskraften hos nervceller, särskilt i den vuxna hjärnan. Mikroglia är särskilt reaktiva till cellskador, är det viktigt att begränsa neuronal celldöd som möjligt att bevara mikroglia nära deras fysiologiska tillstånd. Detta bidrar i sin tur via en god cirkel till ett bättre allmäntillstånd av segmentet.

Protokollet beskrivs i denna artikel gäller flera förbättringar finns i litteraturen för elektrofysiologi experiment, som syftar till att erhålla en bättre lönsamhet i skivor över flera timmar, särskilt från vuxna möss. För att övervinna den åldersrelaterade skillnaden i slice livskraft, vi ersatt natrium med kolin och används detta kolin-aCSF medium under hjärt perfusion, skivning och återställning faserna. Detta ger den cell excitotoxicitet en minsta29,30. Det bör noteras att förutom kolin-aCSF, det finns många andra alternativa aCSF recept som är mycket effektiva för neuronal konservering, som N-metyl-D-glucamine (NMDG)-aCSF31, som också kan vara intressant för mikrogliala studier men har inte testats här. En annan avgörande steg i den här proceduren är kardiella perfusionen. Av startas djuret med en kall kolin-aCSF lösning, som innehåller låg Na+, låg Ca2 +och hög Mg2 +, en snabb minskning av kroppstemperaturen induceras och den metaboliska aktiviteten av cellerna i hjärnan sänks, vilket minskar den cellulär stress orsakad av styckning. Faktiskt, vi konstaterade att detta tillvägagångssätt erbjuds mer skydd än att bara ta bort hela hjärnan och dränka det i aCSF lösning. Inspirerad av ett protokoll som optimerats för patch-clamp och optogenetic studier29, vi använde också en ”skyddande” återhämtningsperiod omedelbart efter fysiska skivning, så att skivorna att återhämta sig från trauman som skivning i 10 min i kolin-aCSF vid 32 ° C. Efteråt, överfördes skivor in i gränssnittet håller kammaren att återvinna för ett ytterligare minsta tid 30 min. Varaktigheten av detta andra återhämtningsperioden kan optimeras enligt hjärnan området av intresse, det Na+ substitutet och ålder på djuret, och det ska pågå minst 1 h om elektrofysiologi måste utföras parallellt med imaging.

Underhåll av segmentet i felfritt tillstånd före användning och perfusionen under imaging är också viktiga parametrar. Både gränssnittet och dual-perfusion kammaren är allmänt etablerade verktyg i elektrofysiologi. Gränssnittsmetoden har exempelvis använts för att förbättra lönsamheten för Hippocampus skivor sedan 199526. Enheter liknar de kammare som används här är föreslagit flera företag men inte ännu vanligen används för mikroglia imaging. Vi utformade ett gränssnitt håller kammaren, där skivor låg på ett nät och är på gränssnittet med en stor reservoar av aCSF, fördröja cellulära försämringen av skivor under långvarig inkubationstider. I imaging kammaren använde vi en designade dubbelsidig perfusion kammare som tillåter ökad syresättning av akut slice preparat, att upprätthålla cellerna i felfritt tillstånd under multiphoton mikroskopi. I motsats till den enda perfusionen, dubbel perfusionen av nedsänkt skivor ökar lönsamheten för cellerna, eftersom syre, liksom andra material, kan fritt och effektivt diffusa med en hög flödeshastighet från båda sidor av betydligt tjocka skivor.

Detta protokoll syftar till att kvantifiera globala lockmedel effekten av ATP eller andra föreningar på mikrogliala processer och dess kvantifiering metod är baserad på den som används i Davalos et al.3. Det är möjligt att utföra andra typer av analyser. Till exempel är en alternativ metod, som inte beror på fluorescens nivån av mikrogliala processer men kräver fler åtgärder av experimenter för bildanalys, att mäta minskningen av det tomma utrymmet runt pipettspetsen efter förening ansökan11,32. Det är också möjligt att spåra rörelse av spetsen av enskilda mikrogliala processer15,28.

Dessutom kan den isotropiska motilitet eller övervakning av mikroglia också registreras i basal skick eller bad ansökan av föreningar av ränta på de skivor som tillagas med detta protokoll. Dock för att kvantifiera de snabb förlängning och upprullning priserna av mikrogliala processer och identifiera potentiella variationer, skulle det vara relevant att öka frekvensen förvärv. Till exempel Pagani et al. använder en frekvens av en bild varje 10 s28.

Slutligen, senaste publikationer beskrivs metoder för att kvantifiera morfologiska förändringar eller motiliteten av enskilda processer i tre dimensioner. För sådana analyser, även om ett z-step intervall 2 µm är nog för vissa program27, kräver andra en bättre axiella upplösning (dvs. en z-steg 0,4 µm enligt Heindl et al.33.

Här visade vi experiment på vildtyp möss med endogena uttryck för god Jordbrukarsed i mikroglia och med en mekanisk tillämpning av föreningar, men detta protokoll kan anpassas till andra fluorescerande reporter proteiner i mikroglia, som YFP18, eller att den exogena märkning av mikroglia med fluorescerande isolectin11,34. Slutligen har vi studerat utväxten av mikrogliala processer mot en lokal tillämpning av ATP eller 5-HT i en normal miljö med vildtyp, men detta protokoll kan användas för att testa andra föreningar, andra typer av stimulering (t.ex. bur föreningar), och testa hur directional motilitet påverkas av mutationer, farmakologiska agenter eller sjukliga sammanhang.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar Cell och vävnad Imaging anläggning av Institut du Fer à Moulin, där alla bild förvärv och analys har utförts. Detta arbete har stötts i del av den Centre National de la Recherche Scientifique, den Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Sorbonne Université vetenskaperna, och genom bidrag från Sorbonne Universités-Pierre et Marie Curie universitetar () Emergence-UPMC program 2011/2014), Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, Fondation de France, Fondation pour la Recherche Médicale ”Equipe FRM DEQ2014039529”, det franska ministeriet för forskning (Agence Nationale pour la Recherche ANR-17-CE16-0008 och den Investissements pris programmet ”Bio-Psy Labex” ANR-11-IDEX-0004-02) och en forskningssamverkan i Tillämpad neurovetenskap program, National Science Foundation/franska nationella byrån för forskning (nummer: 1515686). Alla författarna är anslutna för att forska i grupper som är medlemmar av den Paris skola för neurovetenskap (EGP) och de Bio-Psy Labex. F.E. är doktorand knuten till Sorbonne Université, Collège forskarnivå, F-75005 Paris, Frankrike, och finansieras av den Bio-Psy Labex. V.M. är en post-doc Karl som finansieras av den forskningssamverkan i Tillämpad neurovetenskap program, National Science Foundation/franska nationella byrån för forskning (nummer: 1515686). Författarna vill tacka Marta Kolodziejczak som deltog i inledningen av projektet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
for pipettes preparation
Clark Borosilicate Thin Wall Capillaries Harvard Apparatus 30-0065 Borosilicate Thin Wall without Filament, 1.5 mm OD, 1.17 mm ID, 75 mm L , Pkg. of 225
DMZ Universal Puller Zeitz Instrumente
Name Company Catalog Number Comments
for solutions
Calcium Chloride dihydrate (CaCl2) Sigma C5080
Choline Chloride Sigma C7527
D-(+)-Glucose Sigma G8270
L-Ascorbic acid Sigma A5960
Magnesium Chloride solution 1 M (MgCl2) Sigma 63020
Potassium chloride SigmaUltra >99.0% (KCl) Sigma P9333
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma S5761
Sodium Chloride (NaCl) Sigma S5886
Sodium phosphate monobasic Sigma S5011
Sodium pyruvate Sigma P2256
Ultrapure water MilliQ for all the solutions
Name Company Catalog Number Comments
for slice preparation
2x 200 mL crystalizing dishes
80 mL Pyrex beaker
Antlia-3C Digital Peristaltic pump DD Biolab 178961 For mice perfusion and 2-photon chamber perfusion (aCSF)
Carbogen 5% CO2/95% O2 Air Liquide France Industrie
Dolethal Vetoquinol Dolethal 50 mg/mL
Filter papers (Whatman) Sigma WHA1001042 Whatman qualitative filter paper, Grade 1 (Pore size: 11µM)
Fine Scissors - Sharp Fine Science Tools 14060-60
Food box 10 cm diameter, 8 cm Height
glue (ethyl cyanoacrylate) Loctite super glue 3 power flex
Hippocampal Tool (spatula) Fine Science Tools 10099-15 The largest extremity has to be angled at 90°
Ice
Iris Forceps (curved) Moria MC31
Lens cleaning tissue THOR LABS
Nylon mesh strainer diameter 7 cm
Razor blades Electron Microscopy Sciences 72000 For the slicer
scalpel blade
Slice interface holder home-made, the file for 3D printing is provided in Supplemental Material
Surgical Scissors - Sharp Fine Science Tools 14002-14
Vibrating slicer Thermo Scientific 720-2709 Model: HM 650V (Vibrating blade microtome)
Water bath Set at 32 °C (first recovery step)
Name Company Catalog Number Comments
for slice imaging
× 25 0.95 NA water-immersion objective Leica Microsystems (Germany) HCX Irapo
2-photon MP5 upright microscope with resonant scanners (8 kHz) and two HyD Hybrid detectors Leica Microsystems (Germany)
Antlia-3C Digital Peristaltic pump DD Biolab 178961 For 2-photon chamber perfusion with aCSF
Carbogen 5% CO2/95% O2 Air Liquide France Industrie I1501L50R2A001
Chameleon Ultra2 Ti:sapphire laser Coherent (Germany)
disposable transfer pipettes , wide mouth ThermoFischer scientific for example : 232-11 5.8 mL with fin tip, but we cut it (approx 7 cm) to have a 4 mm diameter mouth
emission filter SP680 Leica Microsystems (Germany)
fluorescent cube containing a 525/50 emission filter and a 560 dichroic filter (for fluorescence collection) Leica Microsystems (Germany)
glass beaker with 50 mL of ACSF to maintain constant perfusion of the slice
Heating system Warner Instrument Corporation Automatic Heater Controller TC-324B to maintain perfusion solution at 32 °C
perfusion chamber home-made, the file for 3D printing is provided in Supplemental Material
slice holder ("harp") home made : hairpin made of platinum with the two branches joined by parallel nylon threads
Name Company Catalog Number Comments
for slice stimulation
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) Sigma A-26209 to be prepared ex-temporaneously : 1 mg/mL (3 mM) stock solution prepared the day of the experiment, kept at 4 °C (a few hours) and diluted just before use
Fluorescein (optional) Sigma F-6377 use at 1 µM final
Micromanipulator Luigs and Neumann SM7 connected to the micropipette holde
Micropipette holder same as for eletrophysiology
Serotonin hydrochloride Sigma H-9523 aliquots of 50mM stock solution in H20 kept at -20 °C. 500 µM solution prepared the day of the experiment.
Syringe 5 mL (without needle) Terumo medical products SS+05S1
Transparent tubing Fischer Scientific 11750105 Saint Gobain Performance Plastics™ Tygon™ E-3603 Non-DEHP Tubing
Name Company Catalog Number Comments
for image analysis
Fiji https://fiji.sc Schindelin, J. et al Nat. Methods (2012) doi 10.1038
Icy Institut Pasteur http://icy.bioimageanalysis.org de Chaumont, F. et al. Nat. Methods (2012)
Name Company Catalog Number Comments
mice
CX3CR1-GFP mice Jung et al, 2000 male or females, P3 to 2 months-old ; we have backcrossed these mice on 129sv background.
CX3CR1creER-YFP mice Parkhurst et al 2013 male or females, P3 to 2 months-old ; we have backcrossed these mice on 129sv background.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Salter, M. W., Stevens, B. Microglia emerge as central players in brain disease. Nature Publishing Group. 23 (9), 1018-1027 (2017).
  2. Tay, T. L., Savage, J., Hui, C. W., Bisht, K., Tremblay, M. -È Microglia across the lifespan: from origin to function in brain development, plasticity and cognition. The Journal of Physiology. , (2016).
  3. Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nature Neuroscience. 8 (6), 752-758 (2005).
  4. Nimmerjahn, A. Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in Vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
  5. Dissing-Olesen, L., et al. Activation of neuronal NMDA receptors triggers transient ATP-mediated microglial process outgrowth. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (32), 10511-10527 (2014).
  6. Gyoneva, S., Traynelis, S. F. Norepinephrine modulates the motility of resting and activated microglia via different adrenergic receptors. Journal of Biological Chemistry. 288 (21), 15291-15302 (2013).
  7. Eyo, U. B., et al. Neuronal hyperactivity recruits microglial processes via neuronal NMDA receptors and microglial P2Y12 receptors after status epilepticus. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (32), 10528-10540 (2014).
  8. Hristovska, I., Pascual, O. Deciphering Resting Microglial Morphology and Process Motility from a Synaptic Prospect. Frontiers in Integrative Neuroscience. 9, 1231 (2016).
  9. Avignone, E., Lepleux, M., Angibaud, J., Nägerl, U. V. Altered morphological dynamics of activated microglia after induction of status epilepticus. Journal of Neuroinflammation. 12, 202 (2015).
  10. Abiega, O., et al. Neuronal Hyperactivity Disturbs ATP Microgradients, Impairs Microglial Motility, and Reduces Phagocytic Receptor Expression Triggering Apoptosis/Microglial Phagocytosis Uncoupling. PLoS Biology. 14 (5), e1002466 (2016).
  11. Madry, C., et al. Microglial Ramification, Surveillance, and Interleukin-1β Release Are Regulated by the Two-Pore Domain K+Channel THIK-1. Neuron. 97 (2), 299-312 (2018).
  12. Honda, S., et al. Extracellular ATP or ADP induce chemotaxis of cultured microglia through Gi/o-coupled P2Y receptors. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 21 (6), 1975-1982 (2001).
  13. Haynes, S. E., et al. The P2Y12 receptor regulates microglial activation by extracellular nucleotides. Nature Neuroscience. 9 (12), 1512-1519 (2006).
  14. Wu, L. -J., Vadakkan, K. I., Zhuo, M. ATP-induced chemotaxis of microglial processes requires P2Y receptor-activated initiation of outward potassium currents. Glia. 55 (8), 810-821 (2007).
  15. Kolodziejczak, M., et al. Serotonin Modulates Developmental Microglia via 5-HT 2BReceptors: Potential Implication during Synaptic Refinement of Retinogeniculate Projections. ACS Chemical Neuroscience. 6 (7), 1219-1230 (2015).
  16. Schafer, D. P., et al. Microglia Sculpt Postnatal Neural Circuits in an Activity and Complement-Dependent Manner. Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).
  17. Pfeiffer, T., Avignone, E., Nägerl, U. V. Induction of hippocampal long-term potentiation increases the morphological dynamics of microglial processes and prolongs their contacts with dendritic spines. Scientific Reports. 6, 32422 (2016).
  18. Parkhurst, C. N., et al. Microglia Promote Learning-Dependent Synapse Formation through Brain-Derived Neurotrophic Factor. Cell. 155 (7), 1596-1609 (2013).
  19. Wu, Y., Dissing-Olesen, L., Macvicar, B. A., Stevens, B. Microglia: Dynamic Mediators of Synapse Development and Plasticity. Trends in Immunology. 36 (10), 605-613 (2015).
  20. Ohsawa, K., et al. P2Y12 receptor-mediated integrin-beta1 activation regulates microglial process extension induced by ATP. Glia. 58 (7), 790-801 (2010).
  21. Kurpius, D., Wilson, N., Fuller, L., Hoffman, A., Dailey, M. E. Early activation, motility, and homing of neonatal microglia to injured neurons does not require protein synthesis. Glia. 54 (1), 58-70 (2006).
  22. Stence, N., Waite, M., Dailey, M. E. Dynamics of microglial activation: a confocal time-lapse analysis in hippocampal slices. Glia. 33 (3), 256-266 (2001).
  23. Dissing-Olesen, L., Macvicar, B. A. Fixation and Immunolabeling of Brain Slices: SNAPSHOT Method. Current Protocols in Neuroscience. 71, 1.23.1-12 (2015).
  24. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  25. de Chaumont, F., et al. Icy: an open bioimage informatics platform for extended reproducible research. Nature Methods. 9 (7), 690-696 (2012).
  26. Aitken, P. G., et al. Preparative methods for brain slices: a discussion. Journal of Neuroscience Methods. 59 (1), 139-149 (1995).
  27. Paris, I., et al. ProMoIJ: A new tool for automatic three-dimensional analysis of microglial process motility. Glia. 66 (4), 828-845 (2018).
  28. Pagani, F., et al. Defective microglial development in the hippocampus of Cx3cr1 deficient mice. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9 (229), 111 (2015).
  29. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in Molecular Biology. , Clifton, NJ. 221-242 (2014).
  30. Mainen, Z. F., et al. Two-photon imaging in living brain slices. Methods. 18 (2), San Diego, CA. 231-239 (1999).
  31. Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice. Journal of Neuroscience Methods. 171 (1), 118-125 (2008).
  32. Gyoneva, S., et al. Systemic inflammation regulates microglial responses to tissue damage in vivo. Glia. 62 (8), 1345-1360 (2014).
  33. Heindl, S., et al. Automated Morphological Analysis of Microglia After Stroke. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 106 (2018).
  34. Dailey, M. E., Eyo, U., Fuller, L., Hass, J., Kurpius, D. Imaging microglia in brain slices and slice cultures. Cold Spring Harbor Protocols. 12 (12), 1142-1148 (2013).

Tags

Neurovetenskap fråga 143 mikroglia flera foton mikroskopi akut hjärnskada skivor kemoattraktion motilitet morfologi serotonin ATP levande imaging time-lapse imaging
Två-foton avbildning av mikrogliala processerna attraktion mot ATP eller Serotonin i akut hjärnskada skivor
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Etienne, F., Mastrolia, V.,… More

Etienne, F., Mastrolia, V., Maroteaux, L., Girault, J. A., Gervasi, N., Roumier, A. Two-photon Imaging of Microglial Processes' Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices. J. Vis. Exp. (143), e58788, doi:10.3791/58788 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter