Summary
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur in-vivo Validierung der Hydrogel-basierte Zelltherapie, zeigt das Beispiel der Inselversetzung. h-omentalis Matrix Inselchen füllen (hOMING) Implantation ermöglicht die Implantation einer Zelle-Hydrogel-Mischung zwischen den omentalis Schichten, in der Nähe von Blutgefäßen Engraftment in eine richtige metabolische Umgebung zu maximieren.
Abstract
Regenerativer Medizin basierend auf Zell-Therapie stellt eine neue Hoffnung für die Heilung von Krankheiten. Aktuelle Hindernisse sind richtige in Vivo Validierung von der Wirksamkeit der Therapie. Für die Übertragung an den Empfänger Körper Zellen oft mit Biomaterialien, vor allem Hydrogele kombiniert werden müssen. Überprüfung der Wirksamkeit von solch einem Transplantat erfordert jedoch das richtige Umfeld, die richtige Hydrogel und rechts Empfängerstelle. Das Omentum möglicherweise eine solche Site. Basierend auf dem Beispiel der Inselversetzung, entwickelten wir das hOMING (h-omentalis Matrix Islet) Abfülltechnik, bestehend aus der Injektion des Transplantats innerhalb des Gewebes zwischen den omentalis Schichten Inselchen Implantation und das Überleben verbessern. Um dies zu erreichen, haben kleine Inseln in einem Hydrogel mit einer Viskosität eingebettet werden, die eine Injektion mit einer atraumatischen Nadel ermöglicht. Spritzen werden mit einer Kombination von Hydrogel und Inselchen geladen. Mehrere Injektionen erfolgen innerhalb des omentalis Gewebes an verschiedenen Einstiegspunkten und die Ablagerung von der Insel/Hydrogel-Mischung erfolgt entlang einer Linie. Wir testeten die Machbarkeit dieser innovative Ansatz mit Dextran-Perlen. Die Perlen waren die omentalis Gewebe, in unmittelbarer Nähe zu den Blutgefäßen gut verteilen. Um die Wirksamkeit des Transplantats zu testen, wir Inselchen in diabetischen Ratten verpflanzt und führen eine metabolische Follow-up über zwei Monate. Die verpflanzten kleinen Inseln stellte eine hohe Rate von Re Vaskularisierung rund um und im Inneren der Inseln und umgekehrt Diabetes. Die zielsuchende Technik könnte für andere Arten von Hydrogel oder Zelle Therapie für Zellen mit hoher Stoffwechselaktivität anwendbar.
Introduction
Zelltherapie ist ein heißes Thema, da es darum geht, Krankheiten anhand der regenerativen Medizin zu heilen. Biologisches Material-gestützte Zelltherapien sind zunehmend in den letzten Jahren untersucht worden, vor allem, weil Zelle Implantation häufig einen Träger für die Übertragung der Zellen aus der Kulturschale an den Empfänger erfordert. Biomaterial Gerüste sind potentiell wertvolle Zellträger, die mehrere Rollen1erfüllen. Zuständigen Träger sollten schützen Zellen vor mechanischen Belastungen und bieten günstige Wachstumsbedingungen, wie wesentliche Wachstumsfaktoren, metabolische Abfall Ausscheidung, Austausch von Nährsubstanzen und Sauerstoff2.
Unter den verschiedenen Arten von Biomaterialien für die Zelltherapie haben Hydrogele viele Vorteile. Sie sind biokompatibel, biologisch abbaubar, einfach zu handhaben, und Sauerstoff Diffusion3erleichtern. Darüber hinaus ermöglicht Stand der Technik den Einsatz von Hydrogele, um Zellen überleben und mit z. B. Supplementierung mit Wachstumsfaktoren oder extrazellulären Matrix Proteine4weiterhin zu helfen.
Hydrogel-Träger mit Stammzellen können injiziert werden, wie Behandlungen, z. B. Knochen Regeneration5 und Nervensystem Krankheit6. Die Implantation von metabolisch aktiven Zellen ist notwendig. In-vitro-Validierung des Ansatzes ist, zwar möglich bleiben Werkzeuge und Techniken zur in-vivo Validierung um verfeinert werden.
Zelle und Hydrogel-Transplantation kann leicht durch subkutane Injektion erfolgen, wenn Biokompatibilität Tests durchgeführt werden. Bei transplantierten Zellen systemische Faktoren regulieren durch ihre metabolische Wirkung sollen, ist jedoch dieser subkutanen Lokalisierung nicht optimal, im Wesentlichen in Bezug auf die venösen Abfluss7. Daher gibt es keine aktuellen Tools, schnell, sicher und effizient die wohltuende Wirkung von einem Hydrogel zu bewerten. Am Beispiel der Inselversetzung, die erfordert, dass Hormone in den Blutstrom aus dem Transplantat als Reaktion auf den Blutzuckerspiegel freigesetzt werden, haben wir eine neue Methode zur in-vivo Zelle/Hydrogel-Implantation entwickelt.
Der erste Schritt war eine Akzeptor-Transplantation-Website identifizieren, die ein Hydrogel mit Zellen annehmen kann. Das Omentum bietet einen großen Raum für die Implantation ist sehr plastisch, und seine Dichte Vaskularisierung, kombiniert mit der intraperitonealen Einstellung ist interessant für die Untersuchung von Zellen mit hoher Stoffwechselaktivität8. Als nächstes mussten wir eine chirurgische Technik ermöglicht die Übertragung der Zellen und die Hydrogel in das Omentum zu etablieren. Inspiriert durch das Lipofilling, plastische Chirurgie9verwendet, entwickelten wir die h-omentalis Matrix-Insel (hOMING) Ansatz zu füllen. Inselchen in Hydrogel eingebettet sind im Inneren die omentalis Gewebe injiziert. Auch soll die Technik bieten maximale Engraftment durch die Verwendung mehrere Ablagerungen von der Zelle und Hydrogel-Gemisch in die omentalis Gewebe, wo die große Zahl der Blutgefäße verbessert auch die Sauerstoffversorgung der Graft.
In der vorliegenden Studie beschreiben wir eine einfache und innovative Technik für die Inselchen Implantation zwischen omentalis Laken, in das Fettgewebe am nächsten an den Blutgefäßen. Dieser besteht aus Mikro-invasive Chirurgie, die unter Laparoskopie abgeschlossen werden konnte, mit der Injektion von Inseln in einem Hydrogel in das Fettgewebe enthalten. Diese Technik ist leicht anwendbar, alle Kombinationen von Hydrogel und Zelle, die getestet werden müssen ein in eine metabolisch funktionsfähige Umgebung.
Protocol
Alle Tierversuche wurden nach den Richtlinien der National Institutes of Health, die Autorisierungsnummer durchgeführt: AL/60/67/02/13.
1. Empfänger Vorbereitung
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Diabetes im Empfänger Ratten chemisch zu induzieren.
- 75 mg/kg Streptozocin (STZ, in sterilen 0,1 M Citrat-Puffer, pH 4) intraperitoneal auf Ratten10zu injizieren.
Hinweis: Für die Transplantation Studien wurden 6 Wochen altes Baby Lewis Sorte Ratten mit einem Gewicht von 150-190 g verwendet. - Überprüfen Sie den Status von Diabetes durch tägliche Blut-Glukose-Messungen während der ersten vier Tage. Injizieren von langwirksamen Insulin 6 U/Tag subkutan, wenn Ratten zeigen Glycemia über 2 g/L zur Vorbeugung von Diabetes-Komplikationen und Gewichtsverlust bis Insulin Pellet Implantation.
- Ratten in der Kohorte gehören, wenn zwei Maßnahmen der Schweif Vene Blutglukose > 4 – 5 g/L für 2 aufeinander folgende Tage und C-Peptid ist < 200 pM. Messen Sie mit einem Blutzuckermessgerät und C-Peptidemia durch ein Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA) Glycemia.
- Implantat-Pellets Insulin unter die Haut (siehe 1.2).
Hinweis: Chronische Insulintherapie ermöglicht bessere Glycemia Rechtsetzung und vermeidet diabetische Komplikationen (die oxidativen Stress am Standort Transplantation verschlimmern)11. Darüber hinaus schont die Therapie der diabetischen Zustand zusammen mit einer normalen Wachstumskurve (ohne übliche Gewichtsverlust in ein diabetisches Tier beobachtet). Dies führt zu einer größeren omentalis Fettlappen ist ideal für die Durchführung der Transplantation.
- 75 mg/kg Streptozocin (STZ, in sterilen 0,1 M Citrat-Puffer, pH 4) intraperitoneal auf Ratten10zu injizieren.
-
Implantation von Insulin pellets
- Betäuben Sie die Ratte mit Gas Anästhesie (3 % Isofluran in 500 mL/min O2) zu und die Ratte in Bauchlage.
- Überprüfen Sie Anästhesie Status durch das Fehlen von Reflex (Pfote kneifen) überprüfen. Reinigen Sie den Hals mit Povidon-Jod und Rasieren Sie den Bereich mit einer Rasierklinge zu. Povidon-Jod erneut anwenden und 3 min. stehen lassen.
- Statt 1,5 Insulin Pellets (3 Einheiten (U) / 200 g Ratte) in einer 1:5 verdünnt Povidon-Jod-Lösung um die Pellets zu sterilisieren. Durchbohren Sie die Haut des Halses mit einer 16 G-Trokar und legen Sie die Pellets mit dem eingerichteten Führer und Mandrin. Rufen Sie der Führer und Mandrin ab und Nähen Sie eine zentrale Anlaufstelle. Verwenden Sie Povidon-Jod, um die Masche zu reinigen.
Hinweis: Keine Schmerzen nach der Operation-Management war notwendig, da die Intervention einer einzigen subkutanen Injektion der (SC) vergleichbar war. - Lassen Sie die Ratte aus der Narkose zu erholen und sicherzustellen, dass Ratten Zugang zu Nahrungsmitteln zu Unterzuckerung zu vermeiden.
- Messen Sie die Effizienz der Pellets durch Messung-Biologie Abnahme nach der Implantation.
- Überprüfen Sie die Pellet-Effizienz durch Glycemia Beobachtungsebene jede Woche für 1 Monat.
- Ratten in der Kohorte enthalten, wenn eine Maßnahme der Schweif Vene Blut C-Peptid-Ebene unter 200 beibehalten wird pM 1 Monat nach der Insulin-Pellet-Implantation.
Hinweis: Prüfung C-Peptid Ebenen ist zwingend erforderlich, Tiere zu Studienbeginn vor der Transplantation zu bewerten und zu ihrem diabetischen Zustand bestätigen. Niedrigen C-Peptid-Regeneration immer tritt während der Follow-up. Die niedrigste C-Peptidemia ist bezeichnend für die niedrigsten Regeneration.
(2) hOMING: Intra-omentalis Matrix Inselchen füllen
-
Insel-Matrix Gemischbildung.
- Vorbereiten des viskosen Inselchen Trägers in einem Laminar-Flow-Haube. Alginat-Pulver in sterilen PBS in einer Konzentration von 1,5 % zu lösen. Sterilisieren Sie die Vorbereitung durch Passage durch einen 0,22 µm-Filter. Bereiten Sie 400 µL pro Empfänger.
Hinweis: Jede Art von Hydrogel mit einer Viskosität geeignet für Injektion durch eine Nadel 21 G einsetzbar. - Insel von gesunden Lewis Ratten (200-250 g) als zuvor beschriebenen12zu isolieren.
- Anzahl der Insel Insel-Äquivalente (IEQ) (eine IEQ gleichwertig mit einem Pankreas Inselchen mit einem Durchmesser von 150 µm als ist)13.
- Bereiten Sie in einem Laminar-Flow-Haube Aliquote 7660-Inselchen Äquivalent (IEQ) in einer 1,5 mL Tube.
- Waschen Sie Inselchen Aliquote mit 500 µL CMRL (Connaught medizinische Forschungslabors) Medium frei von fetalen Rinderserum.
- Pellet-Inseln durch Zentrifugieren (2 min bei 500 x g und 4 ° C). Verwerfen Sie den überstand.
- Fügen Sie 150 µL Alginat Hydrogel Träger über die Inseln, mischen Sie sorgfältig, indem Sie auf und ab pipettieren und die Mischung auf Eis.
- Bereiten Sie eine atraumatische 21 G Nadel und eine 1 mL Spritze ohne Totvolumen laden 150 µL des leeren Alginat in die Spritze.
- Füllen Sie die Spritze mit der Mischung von kleinen Inseln und Alginat (150 µL, Gesamtvolumen 300 µL). Halten Sie die Spritze auf Eis.
- Vorbereiten des viskosen Inselchen Trägers in einem Laminar-Flow-Haube. Alginat-Pulver in sterilen PBS in einer Konzentration von 1,5 % zu lösen. Sterilisieren Sie die Vorbereitung durch Passage durch einen 0,22 µm-Filter. Bereiten Sie 400 µL pro Empfänger.
-
Chirurgischer Eingriff
- Chirurgische Instrumente mit Kaltentkeimung sterilisieren (2 % Steranios für 20 min).
- Betäuben Sie die Ratte mit Isoflurane Narkose zu und die Ratte in Bauchlage.
- Rasieren Sie den Hals-Bereich mit einer Rasierklinge zu und sterilisieren Sie die Fläche mit Povidon-Jod. Lassen Sie das Jod für 3 min. stehen.
- Machen Sie einen Schnitt mit einem Skalpell und entfernen Sie 1,5 Insulin Pellets mit Pinzette. Schließen Sie die Haut mit ein oder zwei einzelne Stichpunkte. Entfernen Sie nicht die Ratte aus der Narkose.
Hinweis: Nach 1 Monat kann das Pellet bröckelig sein, da einige fibrotische Gewebe kann als Pellets wickeln; mit einer Schere um richtig zu sezieren. - Legen Sie die Ratte in der Rückenlage. Rasieren Sie und desinfizieren Sie (mit Povidon-Jod) die peritonealen Raum. Lassen Sie das Jod für 3 min. stehen.
- Erstellen Sie eine 1,5 cm Laparotomie direkt unter dem Brustbein mit einem Skalpell. Positionieren Sie nass-steriler Gaze um den eingeschnittenen Bereich.
- Identifizieren Sie das Omentum, das Fettpolster neben Bauch lokalisiert ist. Verwenden Sie Zange vorsichtig fangen das Omentum, ziehen es vorsichtig aus der Bauchhöhle und breitete es auf die Gaze.
Hinweis: Das omentalis Gewebe aus der Milz erstreckt sich auf den Zwölffingerdarm und legt in die Mitte auf den Magen. Die normalen Omentum von diabetischen Ratten, die Insulintherapie ist ungefähr 2 cm ², wenn auf die Gaze zu verbreiten. - Hydrat omentalis Gewebe nun mit 2 mL vorgewärmten 37 ° C sterile Kochsalzlösung. Verwenden Sie kleine gebogene Pinzetten zu manipulieren das Gewebe und die omentalis Kante mit der Nadel zwischen den omentalis Schichten zu durchdringen. Stechen Sie die Nadel ganz.
- Beginnen Sie die Injektion von der kleinen Insel Vorbereitung langsam und bewegen Sie vorsichtig die Nadel nach hinten, um die kleinen Inseln an mehreren Stellen (als Linien) zu injizieren. Vor dem Zurückziehen der Nadelöhrs, sicherzustellen Sie, dass das Hydrogel verlassen die Nadel beendet hat um den Verlust der verstreuten Inselchen zu vermeiden.
- Wiederholen Sie diese Manipulation, wie notwendig, um den gesamten Inhalt der Spritze verwenden verschiedene Einstiegspunkte zum Verteilen von der kleinen Inseln durch das omentalis Gewebe injizieren.
Hinweis: In Ratten sind in der Regel vier bis fünf Injektionen erforderlich. - Überprüfen Sie, dass Inselchen in der Spritze am Ende der Injektion nicht gruppiert sind.
Hinweis: Wenn einige Inselchen noch sichtbar sind, ist es möglich, ziehen Sie die Nadel heraus aus der Spritze, füllen die Spritze direkt mit 100 µL leer Hydrogel und schließen Sie wieder die Nadel. Eine zweite Runde der Injektion kann getan werden, um die restlichen Inseln spülen. - Verwenden Sie sterile Kochsalzlösung um Hydrat omentalis Gewebe und der Wand der Laparotomie wieder. Verwenden Sie Zange, um Omentum in der Bauchhöhle sorgfältig zu ersetzen.
- Injizieren Sie 2 mL vorgewärmten sterilen Kochsalzlösung in die Bauchhöhle die Ratte zu rehydrieren.
- Schließen Sie die Muskelwand mit kontinuierlicher Faden Naht. Dann nähen Sie die kutane Schicht mit einzelnen Stichpunkt (Punkt).
- Spritzen Sie Meloxicam (1,5 mg/kg) subkutan als Analgetikum für 5 Tage einmal am Tag.
- Legen Sie die Ratte in einem Käfig auf ein Heizkissen bis zur Genesung aus der Narkose. Wiederholen Sie den Vorgang für alle Empfänger Ratten.
- Messen Sie den Blutzucker nach der Transplantation jeden Tag. Wenn Glycemia ist > 2 g/L, 6 U von langwirksamen Insulin Spritzen subkutan einmal täglich.
- Organfunktion durch Glycemia und c-Peptidemia Überwachung in 1 oder 2 Monaten zu beurteilen.
Hinweis: Im Falle einer erfolgreichen Transplantation Glycemia sollte innerhalb von 2-5 Tagen nach der Transplantation stabilisieren, und Ratten können Insulin abgenommen werden.
(3) omentalis Graft Explantation
Hinweis: Dieses Verfahren ermöglicht die Bestätigung der guten Organfunktion. Nach der Entnahme eine funktionale Prothese sollte Ratten zu einem diabetischen Zustand zurückzukehren. Dieser Schritt wird nach 1 oder 2 Monate der metabolischen Follow-up durchgeführt.
- Betäuben Sie die Ratte mit Gas Narkose zu und legen Sie sie in die Rückenlage.
- Rasieren Sie der peritonealen Raum und sterilisieren Sie mit Povidon-Jod für 3 min zu.
- Erstellen Sie eine 1,5 cm Laparotomie knapp Brustbein mit einem Skalpell. Nass-steriler Gaze in der eingeschnittenen Umgebung zu platzieren.
- Identifizieren Sie das Omentum, die neben den Magen ist. Verwenden Sie Zange zu sorgfältig auf die Gaze verbreiten.
- Mit einer Schere die Omentum Verbrauchssteuern. Starten Sie aus dem Teil, das auf die Bauchspeicheldrüse Rute (neben der Milz) haftet. Wenn Blutungen auftreten, verwenden Sie trockene sterilen Gaze um zu stoppen.
- Weiter Exzision entlang des Teils an den Magen befestigt und das Omentum abrufen.
Hinweis: An dieser Stelle können Gastroepiploic Arterien (Abbildung 1) dazu führen, dass eine große Menge von Blutungen, wenn sie versehentlich geschnitten werden. Arterie Einschnitte sind unumgänglich, um das Transplantat abrufen, aber Blutungen kann mit Hilfe einer Pinzette und Gaze verwaltet werden. Wenn ein versehentliche Schnitt passiert, fest mit trockenen Gaze zu komprimieren und die Kompression für mindestens 1 min pflegen. Sollte die Blutung zu stoppen. Ist dies nicht der Fall, verwenden Sie Clips oder verwenden Sie eine elektrische Operationsmesser, um die Schiffe zu Kauterisieren.
Abbildung 1: Verteilung der omentalis Arterie. Für Omentum Transplantat Explantation wird der kritische Bereich, bestehend aus Gastroepiploic Arterien in blau dargestellt. Während der Resektion dieses Teils des omentalis Gewebes muss Aufmerksamkeit der richtigen Gastroepiploic Arterie Abschnitt gewidmet werden. Kompression, Ligatur oder Kauterisation kann verwendet werden, um Blutungen zu begrenzen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
- Überprüfen Sie, ob eine Blutung anhält. Ist dies nicht der Fall, injizieren Sie 2 mL vorgewärmte Kochsalzlösung zu, schließen Sie die Ratte und verarbeiten Sie wie zuvor beschrieben.
Explantierten Tiere zurück zu einem diabetischen Zustand. Insulininjektion (6 U/SC/Tag) ist dann zwingend erforderlich, um das Wohlergehen der Tiere zu gewährleisten. - Einschläfern der Ratte 10 bis 12 Tage nach Explantation mit einer Überdosis von Pentobarbital (182,2 mg/kg).
4. histologische Analyse: Hämatoxylin und Eosin Färbung
- Beheben Sie die abgerufenen Omenta mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) und in Paraffin einbetten.
- Schneiden Sie Abschnitte 4 µm Dicke aus und Hämatoxylin und Eosin Fleck für die morphologische Bewertung der Transplantation.
5. statistische Analyse
- Statistischen Signifikanz mit statistischen Analysesoftware und Messwiederholungen Varianzanalyse (ANOVA) mit Tukey ehrlich Bedeutung Unterschied Test als post-hoc-Test zu bestimmen. P -Werte als dar: *p < 0,05; p < 0,01; p < 0,001.
Representative Results
Die hOMING-Methode erlaubt die Vermeidung der intravaskulären Implantation und der Einschluss des Inselchen in einem Organ. Eine maximale Zeit von 8-10 min ist erforderlich für die gesamte Insel Implantationsverfahren, einschließlich Anästhesie, die vergleichbar mit klassischen Lebertransplantation eine Zeitleiste.
Um die Art und Weise untersuchen die Inselchen innerhalb des omentalis Gewebes verteilt sind, wurden Dextran Perlen transplantiert das hOMING-Methode (Abbildung 2). Einen Tag nach der Implantation Ratten wurden geopfert und omentalis Gewebe für die histologische Analyse abgerufen wurden. Hämatoxylin und Eosin Färbung zeigte eine gleichmäßige Verteilung der Kugeln durch das Gewebe (Abbildung 2rechts unten). Sehr oft Perlen wurden in der Nähe von Blutgefäßen und wurden gut im Fettgewebe implantiert. Sofort nach der Implantation tritt eine entzündliche Reaktion um die Perlen, wodurch Gewebe Neuordnung, die kleinen Inseln im Gewebe zu Schachteln.
Abbildung 2: Beschreibung der hOMING Technik und Perle Verteilung durch das omentalis Gewebe einen Tag nach der Implantation. (A) Abbildung der hOMING-Technik. Nach der Orgel Exposition (, links) wurde die Insel-Hydrogel-Mischung (hier ersetzt durch blau gefärbten Dextran Perlen zur besseren Visualisierung) sorgfältig in das Gewebe mit einer atraumatischen Nadel (A, Mitte) injiziert. Perlen im Gewebe implantiert sind sichtbar (A, rechts). (B) Hämatoxylin und Eosin Färbung des Omentum explantiert 1 Tag nach der Injektion der Perle. Perlen sind in das Gewebe mit einer gleichmäßigen Verteilung gefunden. Maßstabsleiste = 100 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Um diese Technik zu überprüfen, führten wir isogene Studien mit Lewis-Ratten (n = 8). Diabetische Ratten Inselchen Transplantationen (7660 Insel entspricht, IEQ) pro kg Körpergewicht Ratte mit hOMING empfangen wurden Glycemia und C-Peptidemia zwei Monate lang beobachtet. Glycemia wurde durch Implantation von Insulin Pellet (als Nachweis der erste Tropfen in Glycemia beobachtet in der Abbildung 3A) gesteuert. Organfunktion spiegelte sich durch Glycemia von ca. 2 g/L und C-Peptidemia > 500 pM. Vor der Transplantation, Ratten waren Diabetiker (-Biologie > 5 g/L und C-Peptidemia < 200 pM). Nach der Transplantation und Insulin Pellet abrufen Glycemia Wartung und Normalisierung war nur 3 Tage Post-hOMING Transplantation beobachtet und bis Transplantat Abruf (p < 0,05 im Vergleich zu den Niveaus Pre-transplant) beibehalten. Nach omentalis Explantation Glycemia stieg wieder auf das Niveau von vor Transplantation, bescheinigt die Funktionalität der Inseln, die durch hOMING transplantiert wurden (Abb. 3A). Das C-Peptidemia-Muster wurde genau das Gegenteil, mit niedrigen bis nicht nachweisbar Ebenen vor der Transplantation, gefolgt von einer Erhöhung und Wartung auf diesem erhöhten Niveau im Laufe der Studie (p < 0,05), und nach omentalis Explantation eines Rückgang um Ebenen (Abb. 3 b) vorab zu verpflanzen. Analyse der explantierten Omentum durch Histologie ergab hoch Re vaskularisierte Inselchen, wahrscheinlich aufgrund der Nähe zu den Blutgefäßen (Abbildung 3).
Abbildung 3: zweimonatige metabolische Follow-up von Ratten hOMING und Transplantat Bewertung empfangen. (A) Glycemia Messung und (B) C-Peptid-Bewertung nach hOMING mit Alginat als Insel-Träger (Tx: Transplantation und Insulin Pellet Retrieval; Explantation: Explantation der das Omentum). Transplantate sind funktional, dargestellt durch die Aufrechterhaltung der Normoglycemia nach der Insulin-Pellet-Entnahme ist und in C-Peptidemia nach der Insel Implantation zu erhöhen. Grau schattierte Bereiche repräsentieren die minimalen und maximalen aufgezeichneten Werte zu jedem Zeitpunkt. (C) Hämatoxylin und Eosin Färbung eines omentalis Abschnitts nach Inselversetzung mit der hOMING-Methode. Inseln sind gut in das Gewebe integriert zwei Monate nach der Implantation ohne jede fibrotischen Gewebes. Schiffe ranken um und im Inneren der Inseln, wie durch die Pfeile dargestellt und somit völlig Inselchen Funktion wiederherzustellen. Morphologie der Inseln scheint auch gut erhaltene. Skalieren von Balken = 50 µm. (n = 8) (*p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001 bestimmt mit Messwiederholungen Varianzanalyse (ANOVA) mit Tukey ehrlich Bedeutung Unterschied Test als post-hoc-Test). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Discussion
Einige wichtige Schritte können in diesem Protokoll hervorgehoben werden. Erstens muss die Person, die Durchführung der Operation und die Gewebe zu manipulieren zart mit dem Fettgewebe sein, wie zerbrechlich ist. Zerkleinerung oder eine Beschädigung der Omentum muss vermieden werden. Omentum, wird als eine defensive Gewebe Makrophagen und andere Leukozyten angereichert. Diese Immunzellen durch übermäßige Manipulation aktiviert werden können und könnte sich negativ auf das Transplantat. Zweitens ist Transplantat (Insel-Hydrogel Mischung) laden auch kritisch. Die Person, die Durchführung des Verfahrens muss Totvolumina vermeiden und laden Sie alle das Hydrogel-Insel-Gemisch muss in der Injektionsvorrichtung. Unmittelbar nach diesem Schritt ist ein weiterer kritischer Punkt die Injektion selbst. Injektion muss langsam, sorgfältig und vorsichtig durchgeführt werden. Die Spritze muss durch die leeren Hydrogel zunächst geladen, um alle verbleibenden Inselchen abrufen gespült werden. Drittens muss Nähen sorgfältig und in zwei Schritten erfolgen. Der muskulöse Plan sollte sein vernäht zuerst kümmert sich nicht um das Omentum mit den Muskel, Naht und die Haut sollte separat vernäht. Bezüglich der Explantation-Verfahrens für die omentalis Graft sollte besondere Aufmerksamkeit im Moment genommen werden, wenn die Arterien in der Nähe des Magens (Gastroepiploic Arterien) eingeschnitten sind. Es ist wichtig, Blutungen achten, die auftreten, und beenden Sie sie vor dem Nähen des Tieres da zu tierischen Tod innerhalb einiger Tage anhaltende Blutungen führt.
Fehlersuche kann über das Medium notwendig für den Transport von kleinen Inseln; die Wahl von Hydrogel liegt der Experimentator, solange das Hydrogel injizierbare ist. Die Verwendung unterschiedlicher Materialien kann in Variablen führen Transplantat Funktion (mit oder ohne Supplementierung, zum Beispiel). Die hier beschriebene Methode hat ihre Effizienz für Co verpflanzend Inertmaterial mit einem Insel-Verhältnis von 7660 IEQ/kg nachgewiesen.
Das vorliegende Verfahren kann durch die omentalis Größe und Hydrogel Eigenschaften beschränkt werden. Um eine diabetische Nagetier Modell zu verwenden, ist Insulin-Therapie vor der Insel Implantation ausreichend Pfropfen Bereich obligatorisch. Diabetische Nagetiere verlieren viel Gewicht und Fettmasse aufgrund von STZ-induzierte Diabetes. In Anbetracht des geringen Gewichts der Tiere in diese Studie aufgenommen ist es nicht möglich, in einem noch kleineren Bereich Pfropfen.
Erhaltung der richtigen Glycemia Management (vor Transplantation mit Pellets und danach mit langwirksamen Insulin) ist obligatorisch. Hier haben wir das Insulin Pellet bis zu dem Tag der Transplantation aus mehreren Gründen zu sparen. Erstens reduziert die Wartung von einem richtigen glykämischen Kontrolle oxidativen Stress induziert durch Diabetes in den Empfänger Organen, die schädlich für Islet Transplantation11 und ermöglicht die Fortsetzung der intensiven Insulintherapie und Empfänger Vorbereitung in der Klinik12beobachtet. Zweitens wollten wir die maximale Anzahl der Anästhesieverfahren für die Ratten. Hinsichtlich der Durchführung der Insulintherapie während der metabolische Follow-up mit langwirksamen Insulin vermieden das Schema verwendet massive Komplikationen aufgrund von Glucotoxicity (die Transplantate zerstören kann) und einen "echten" Glycemia Wert zu erhalten.
Um Transplantat Effizienz zu überwachen, ist Glycemia nicht relevanten Parameter in den ersten Tagen, wenn Ratten Insulintherapie mit Pellets erhalten. Deshalb überprüfen, dass das C-Peptid-Niveau mehrmals vor Transplantation obligatorisch ist. Diese Zeiten gehören zu Beginn der Studie, Tiere nach STZ Injektion auswählen und dann nur vor Transplantation, um sicherzustellen, dass Ratten Diabetiker bleiben und Regeneration minimal ist.
Hydrogel Eigenschaften sind ebenfalls wichtig. Flüssige Hydrogel wird aus omentalis Gewebe auslaufen und hochviskosen Hydrogel werden nicht injizierbare. Hydrogel Viskosität und Injectability muss vor der Anwendung getestet werden, aber es scheint wichtig, auch das Material direkt durch Auswertung der Insel oder eine andere Zellen überleben in-vitro-test. Hier, wie Inseln sehr empfindlich gegen Hypoxie und die Verwendung von hochviskosen Träger sind können Sauerstoffdiffusion beeinflussen.
In Bezug auf die Bedeutung der Methode hier in Bezug auf bestehende Methoden beschrieben hat dieser Intra-Gewebe Transplantation Technik Vorteile in Bezug auf die Reproduzierbarkeit. Es ist auch atraumatisch für das Gewebe und wegen seiner extra vaskulären Lage vermeidet Risiken Blutung und Thrombose. Auch bei der Inselversetzung ist sofort Blut-vermittelte Entzündungsreaktion vermieden14. Darüber hinaus ermöglicht hOMING Umpflanzen Inselchen in ein nicht-lebenswichtiges Organ, im Gegensatz zu Transplantation in die Leber, die Risiken in Bezug auf die Leberfunktion15mit sich bringt.
Um optimale Leistung zu erzielen, muss ein Hydrogel Zellen angepasst werden, die es tragen wird. Einsatz von Wachstumsfaktoren oder spezifische Proteine haben eine positive Wirkung auf die transplantierten Zellen16,17.
Abschließend möchte ich sagen, kann diese Technik zur in-vivo Validierung ein Hydrogel auf verschiedenen Zelltypen, verwendet werden, vor allem, wenn eine aktive metabolische Umgebung, wie bei kleinen Inseln benötigt wird. Darüber hinaus diese Operationstechnik gilt für mehrere Anwendungen und könnte in Zukunft schnell übertragbar auf den Menschen, wie es mit Laparoskopie leicht durchgeführt werden kann.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von Région Alsace, BioArtMAtrix-Pôle Alsace Biovalley-CQDM finanziert; 53/14/C1. Die Autoren sind dankbar für das Team von Pr. Bruant-Rodier von Hôpitaux Universitaires de Strasbourg für Hilfe bei der Entwicklung dieser innovativen Technik.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alginate (PRONOVA UP LMV) | Novamatrix | 4200206 | Hydrogel carrier |
| Atraumatic needle (Blunt) | B.Braun | 9180109 | |
| CMRL without FBS | Gibco | 11500576 | |
| C-peptide ELISA kit | Mercodia | 10-1172-01 | |
| Eosin | Leica Microsystems | 3801592E | |
| Ethilon 4/0 | Ethicon | F2414 | Surgical suture |
| Hematoxylin | Leica Microsystems | 3801562E | |
| Insulin pellets | Linshin | INS-B14 | |
| Isofluorane | Centravet | ISO007 | |
| Lantus (Insulin-Glargin) | Sanofi Adventis | Lantus SoloStar | Long acting insulin |
| Metacam | Boehringer Ingelheim | MET019 | Anti-inflammatory drug |
| NaCl (for saline 0.9%) | Sigma | 10112640 | |
| Needle 26 G | TERUMO | 050101B | |
| Oxygen | Linde | 2010152 | For isoflurane use |
| Sodium pentobarbital | Vetoquinol | Dolethal | For euthanasia |
| Steranios 2% | Anios | 11764046 | |
| Streptozotocin | Santa-Cruz | SC-200719A | |
| Syringe – Injekt-F | B.Braun | 9166017V | |
| Trocar & stylet (linshin) | Linshin | G12-SS | For pellet insertion |
References
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