移行, 侵略, と不死化妊娠初期絨毛細胞の増殖を評価する生体外の試金

サマリー

ここでは、3 つの生体外の試金を使用して絨毛細胞における細胞運動を評価するため非常にアクセス プロトコルを提案: スクラッチ アッセイ、transwell 浸潤アッセイと細胞増殖アッセイ。

要約

細胞運動は胎盤発育、妊娠初期に絨毛トロホブ ラストの重要なプロパティです。適切な栄養の移行と侵略の意義が母体の血管の不十分な栄養膜浸潤と関連付けられる子癇前症と子宮内の成長の制限など妊娠障害によって実証します。残念ながら、メカニズムの理解、胎盤を移行するから開発されるトロホブは制限。スクラッチのアッセイによる細胞遊走の in vitro 解析は、絨毛渡り鳥容量を規制する要因を識別するに便利なツールです。ただし、本法だけでは変えられた細胞の移動につながる携帯電話の変更を定義しません。このプロトコルは、まとめて使用して絨毛細胞運動を評価する 3 つの異なる体外の試金を記述する: スクラッチ アッセイ、浸潤能の測定と拡散の試金。ここで説明されているプロトコルは、刺激に応じて細胞運動を定量化する他の細胞で使用するため修正されるかもしれません。これらのメソッドは、細胞運動に貢献し、潜在的なメカニズムで細胞変化の徹底的な検査を提供する個々 の要因を識別するために研究者を許可します。

概要

胎盤発育、妊娠、母体と胎児の健康に影響を与えるの確立の重要なステップです。ただし、このプロセスが発生するメカニズムの基礎は完全には理解されていません。細胞遊走は妊娠成立と胎盤の機能に貢献する重要な生物学的プロセスです。胚盤胞移植後, 栄養外胚葉は絨毛トロホブ、絨毛膜絨毛の表面をカバーし、ガスと栄養の交換に関与していると絨毛から移行を外トロホブ (EVTs) に区別します。母体の脱落膜と血管系¹に侵入します。EVTs の移行は母体らせん動脈を改造して胎児の成長²をサポートする子宮循環を確立するために不可欠です。妊娠中に不十分な栄養膜浸潤異常胎盤の発育結果し、子癇前症、妊娠高血圧症候群や子宮内の成長の制限、早産^{3などの妊娠合併症に貢献するかもしれない 4}。したがって、絨毛運動に影響を与える要因を理解することは、通常胎盤に必要な経路を決定するのに不可欠です。

胎盤絨毛細胞の移行は、細胞、成長因子、サイトカイン、ホルモン、血管新生因子⁵などの複雑なネットワークによって制御されます。体内の胎盤を勉強の制限のための in vitro アッセイを利用したラインは絨毛運動に寄与する要因を特定することが重要されている絨毛細胞を不死化。傷....

プロトコル

1. セル準備

1. 湿度 95%、5% CO₂、37 ° C で標準的な成長媒体に T-75 フラスコ細胞を維持します。
   注:これらの実験で使用される細胞が不死妊娠初期絨毛細胞線 Swan.71 (Sw.71) と HTR-8/SVneo^9,10。DMEM/F - 12 10% 熱不活化ウシ胎児血清 (FBS)、ピルビン酸ナトリウム 1.0 mM、10 mM HEPES、0.10 mM MEM 非必須アミノ酸、100 単位/ml ペニシリン、100 μ g/mL ストレプトマイシンを添加した Sw.71 細胞が維持されました。HTR-8/SVneo 細胞が 5% 添加 RPMI 1640 年に維持された熱は、FBS を不活化します。
2. 90-100% の合流点に到達するまでをレプリケートするセルを許可します。無菌培養流フードを使用すると、10 ml の滅菌 1 リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x のフラスコと洗浄の細胞からメディアを吸い出しなさい。
3. PBS の吸引し、1 x (0.05%) 5 mL を追加トリプシン-EDTA をフラスコに加えて、細胞がトリプシンによって覆われていることを確かめます。すべての細胞がフラスコ (約 5-10 分) の下から取り外すまで湿度 95%、5% CO_....

結果

不死化妊娠初期絨毛細胞株 Sw.71 および HTR-8/SVneo は、絨毛細胞移行¹²グルココルチコイドのロールを確認するこれらの実験で使用されました。グルココルチコイドは、彼ら最近示されている絨毛の機能を変更する代替治療に使用される¹²の場合がありますので、これらの実験で使用されました。両方の細胞が車両 (1 x PBS) または 100 と扱われたすべての実験のため合成糖質コルチコイド製剤デキサメタゾン (Dex) の nM。巻きの密度とサイズは、自動、タイムラプス イメージング システムを使用して 72 時間ごとの 2 h を測定しました。画像と異なる縦長でスクラッチの分析から得られた結果の例を図 1に示します。両方の処置のための 0、8、18 h の縦長サンプル画像 (図 1 a) を提供されています。傷密度と傷の大きさはサンプル車両制御 (Veh.......

ディスカッション

この手順は、絨毛細胞運動の計測違いに潜在的な貢献者として細胞増殖率を含めるアッセイ移行および侵略の使用に基づいています。一緒に使用すると、これらの生体外の試金は、絨毛の移行を調節する細胞の経路を識別するために使用することができますシンプルで効果的な方法です。前述のように、栄養膜細胞は、ホルモン、サイトカイン、成長因子、または絨毛運動に与える影響を決定する他の分子と扱われるかもしれません。また、絨毛運動の機能的役割を解明するための細胞から、ターゲット蛋白質が消耗されています。絨毛移行のキー変調器を識別する基になる妊娠合併症など妊娠中毒症、子宮内胎児発育制限と早産、胎盤の欠陥に関連する基本的なメカニズムの理解があります。

このプロトコルの正確な結果を取得するために必要ないくつかの重要なステップがあります。フェノール レッドは細胞培養媒体¹³で使用される濃度でエストロゲン様作用があるため細胞におけるエストロゲン受容体の好ましくない活性化を防ぐために実験的エンドポイントを用フェノールレッド無料メディアが重要です。Transwell 浸潤能の測.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.4% トリパン ブルー ステイン	サーモフィッシャー サイエンティフィック	15250-061
0.5% トリプシン-EDTA	ライフ テクノロジー	ズ 15400-054
1.0 M HEPES	AmericanBio	AB06021-00100
10 mM MEM 非必須アミノ酸	ライフ テクノロジー	11140-050
100 mM ピルビン酸ナトリウム	ライフ テクノロジー	ズ 11360-070
24ウェルプレートトランズウェルインサート	コーニング	3422	カーボネートフィルターを8 μm孔径
チャコール デキストランストリッピング FBS	ジェミニバイオプロダクツ	100-119
Countess II 自動セルカウンター	サーモフィッシャーサイエンティフィック	AMQAX1000
クリスタルバイオレット	シグマ アルドリッチ	C0775
サイトシール 60	サーモフィッシャーサイエンティフィック	8310-4
デキサメタゾン(Dex; 1, 4-プレグナジエン-9&α;-フルオロ-16&α;-メチル-11&β;, 17, 21-トリオール-3, 20-ジオン; ≥98% TLC)	ステラロイド	P0500-000
DMEM/ハム's F12	Life Technologies	11330-032
ウシ胎児血清	Sigma Aldrich	F2442
IncuCyte 24ウェルImageLockプレート	Essen BioScience	4365	IncuCyte Zoomイメージングシステムを使用する場合は、IncuCyte ImageLockプレートに細胞を播種します。これらのプレートには、プレートの底面に基準マーカーがあり、一定の視野で繰り返しイメージングするための基準として使用されます。
IncuCyteソフトウェア	Essen BioScience	2010A Rev2
IncuCyte ZOOMシステム	Essen BioScience	N/A	Scratch assay Imaging は、プリセット「傷の傷」IncuCyte ZOOMシステムのパラメーター。他のタイムラプス顕微鏡も使用できます。
マトリゲル膜マトリックス	ベクトン・ディキンソン	356231	成長因子の低減、フェノールレッドフリー
マイクロスライド	VWR International, LLC	48311-7003
顕微鏡カバーガラス	フィッシャーサイエンティフィック	12-545-E
オリンパス IX71 倒立顕微鏡	オリン	IX71
ペニシリン (10,000 units/mL)/ストレプトマイシン (10,000 µg/mL)	Life Technologies	151-40-122
フェノールレッドフリー DMEM/Ham's F12	Life Technologies	11039-021
半自動創傷メーカーツール	Essen BioScience	N/A

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