Summary
Hier presenteren we een zeer toegankelijke protocol voor de evaluatie van de beweging van de cel in menselijke trofoblast cellen met behulp van drie in-vitrotests: de kras assay, de transwell invasie assay en de cel proliferatie assay.
Abstract
Cel verkeer is een essentiële eigenschap van trophoblasts tijdens de ontwikkeling van de placenta en vroege zwangerschap. Het belang van goede trofoblast migratie en invasie wordt aangetoond door zwangerschap aandoeningen zoals pre-eclampsie en uteriene groei beperking, die verband houden met ontoereikende trofoblast invasie van de maternale therapieën. Helaas, onze inzicht in de mechanismen die de placenta ontwikkelt zich uit het migreren trophoblasts is beperkt. In vitro analyse van cel migratie via de kras assay is een nuttig hulpmiddel bij het identificeren van factoren die trofoblast trekkende capaciteit regelen. Deze bepaling alleen geeft echter geen definitie van de cellulaire veranderingen die leiden een gewijzigde cel migratie tot kunnen. Dit protocol beschrijft drie verschillende in-vitrotests die gezamenlijk worden gebruikt voor het evalueren van de trofoblast cel verkeer: de kras assay, de bepaling van de invasie en de bepaling van de proliferatie. De protocollen die hier beschreven kunnen ook worden aangepast voor gebruik in andere cellijnen te kwantificeren van cel mutatie in reactie op stimuli. Deze methoden kunnen onderzoekers individuele factoren die bijdragen tot de beweging van de cel en zorgen voor een grondig onderzoek van mogelijke mechanismen die ten grondslag liggen aan de schijnbare wijzigingen in cel migratie te identificeren.
Introduction
Placenta ontwikkeling is een cruciale stap in de inrichting van de zwangerschap, zowel in moederlijke en foetale gezondheid beïnvloeden. De mechanistische basis waarmee dit gebeurt is echter niet volledig begrepen. Cel migratie is een belangrijke biologisch proces dat aan de totstandkoming en de functies van de placenta tijdens de zwangerschap bijdraagt. Na de implantatie van de blastocyst onderscheidt de trophectoderm in villous trophoblasts, die betrekking hebben op het oppervlak van de verdikte villi en zijn betrokken bij gas en nutriënten uitwisseling, en extravillous trophoblasts (EVTs), die migreren uit van de villi en de moeders decidua en therapieën1binnen te dringen. Migratie van de EVTs is essentieel voor het remodelleren van maternale spiraal slagaders en tot de oprichting van uteroplacental verkeer ter ondersteuning van de foetale groei2. Onvoldoende trofoblast invasie tijdens de zwangerschap leidt tot een abnormale ontwikkeling van de placenta en kan bijdragen aan zwangerschapscomplicaties zoals gestational hypertensie, pre-eclampsie, intra-uteriene groei beperking en vroeggeboorte3, 4. Inzicht in de factoren die invloed hebben op de beweeglijkheid van de trofoblast is daarom essentieel om het bepalen van de trajecten die nodig zijn voor normale placentation.
Trofoblast migratie wordt gecontroleerd door een complex netwerk van signalering van moleculen, met inbegrip van groeifactoren, cytokines, hormonen en angiogenic factoren5. Als gevolg van de beperkingen van het bestuderen van de placenta in vivo, vereeuwigd in-vitrotests gebruik te maken van menselijke trofoblast cel lijnen cruciaal zijn voor het identificeren van de factoren die aan de beweeglijkheid van de trofoblast bijdragen. Kras en invasie testen zijn uitgebreid gebruikt om de rol van individuele moleculen trofoblast cel migratie6,7,en8kwantitatief te evalueren. Echter, terwijl nuttig om te onderzoeken hoe veranderingen in migratie kunnen worden veroorzaakt door wijzigingen in cel invasiviteit parallel, deze twee testen geen rekening met aanvullende mechanismen die aan de gewijzigde tarieven van cel migratie bijdragen kunnen. Verlagingen van het tarief van celproliferatie kunnen bijvoorbeeld resulteren in minder cellen beschikbaar zijn om te migreren.
Hier beschrijven we kwantitatieve in-vitro methoden voor de beoordeling van de trofoblast migratie met behulp van kras, celproliferatie, en cel invasie testen. In de scratch assay, een uniforme wond wordt gemaakt in een cel enkelgelaagde en de migratie van de cellen om het gat te vullen wordt gemeten door geautomatiseerde, time-lapse beeldvorming van de grootte van de wond en dichtheid van de cellen binnen de wond. De cel proliferatie bepaling is gebaseerd op de berekening van de verhouding tussen cellen op elk punt van de tijd in vergelijking met een bekende startende hoeveelheid cellen. In de cel invasie assay, cellen worden overgeënt bovenop een extracellulaire matrix beklede cel cultuur invoegen kamer (bijvoorbeeld Transwell) en het aantal cellen die via de extracellulaire matrix in reactie op de chemo-lokstof binnenvallen worden geteld.
De kras assay is een eenvoudige en effectieve tool die kan worden gebruikt om te bepalen hoe de verschillende omgevingsfactoren invloed op cel migratie. De proliferatie en invasie testen kunnen vervolgens worden gebruikt om te bepalen van de bijdrage van celproliferatie en invasiviteit aan algemene veranderingen in cel migratie. Gezamenlijk bieden deze gehaltebepalingen robuuste metingen van biologische processen die tot de beweeglijkheid van de cel bijdragen kunnen. Twee vereeuwigd eerste-trimester trofoblast-cellijnen werden gebruikt in de beschreven tests, de Swan.71 (Sw.71) en de HTR-8/SVneo9,10. Deze tests kunnen echter ook worden geoptimaliseerd voor gebruik in andere celtypen te identificeren van de belangrijkste modulatoren van cel migratie en invasie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. cel voorbereiding
- Cellen in T-75 kolven in de media van de standaard groei bij 37 ° C, 5% CO2, en 95% vochtigheid te handhaven.
Opmerking: De cellen die worden gebruikt in deze experimenten werden de vereeuwigd eerste-trimester trofoblast cel lijnen Swan.71 (Sw.71) en HTR-8/SVneo9,10. De Sw.71 cellen werden onderhouden in DMEM/F-12 aangevuld met 10% warmte-geïnactiveerd foetale runderserum (FBS), 1,0 mM natrium pyruvaat 10 mM HEPES, 0.10 mM MEM niet-essentiële aminozuren, 100 eenheden/mL penicilline en 100 µg/mL streptomycine. De HTR-8/SVneo cellen werden onderhouden in RPMI-1640 aangevuld met 5% warmte-geïnactiveerd FBS. - De cellen om te repliceren, totdat ze 90-100% samenvloeiing toestaan. Met behulp van een steriele weefselkweek stroom capuchon, gecombineerd de media van de kolf en wassen cellen met 10 mL steriele 1 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- De PBS gecombineerd en voeg 5 mL 1 x (0,05%) trypsine-EDTA aan de kolf, ervoor te zorgen dat de cellen door trypsine worden gedekt. Plaats de kolf in de incubator van de laboratorium bij 37 ° C, 5% CO2, en 95% vochtigheid gehandhaafd totdat alle cellen hebben losgemaakt van de bodem van de kolf (ongeveer 5-10 min).
- Voeg 10 mL van voorverwarmde groei media aan op de maatkolf om te schakelen van de trypsine-EDTA.
2. Kras Assay
- Volgende stap 1.4, zaad het juiste aantal cellen in een 24-well plaat om 100% samenvloeiing in 48u.
Opmerking: Het is mogelijk om uit te voeren van de kras bepaling met een verscheidenheid van verschillende plaat lay-outs. Het maximum aantal wells toegestaan door de wond maker tool is een 96-Wells-indeling. - De volgende dag (dag vóór kras assay), media omzetten in fenol-rood mediagroep aangevuld zoals vereist, met inbegrip van warmte-geïnactiveerd, houtskool dextran-ontdaan FBS.
Opmerking: Andere studies hebben aanbevolen het gebruik van media met lage concentratie FBS (bijvoorbeeld, 1%) tot een minimum beperken celproliferatie, die kan worden gebruikt als een alternatief in dit protocol11. - Op de dag van de kras assay, voorbehandeling cellen gedurende 30 minuten door toevoeging van de gewenste behandeling aan de media in elk putje. De geschetste experimenten gebruikt voertuig (1 x PBS) en 100 nM dexamethason in 1 x PBS is verdund.
-
Plaats om te maken van uniforme wonden, steriele 10 µL Pipetteer tips over de pinnen van de wond maker tool. Lager de tips in de eerste rij van putten en de plaat langs het spoor van de maker van de wond te verplaatsen totdat de pipet tips bij de andere kant van de put.
- Verplaats de plaat terug naar de uitgangspositie, waardoor de pipet tips om voortdurend het aanraken van de onderkant van de plaat om een constante gewikkeld over de diameter van de put. Verwijderen en vervangen van de steriele 10 µL Pipetteer tips en lager de tips in de volgende rij van putten.
- Herhaal stap 2.4 totdat alle putjes worden gekrast.
Opmerking: Als een wond maker hulpprogramma niet beschikbaar is, kunnen wonden worden gemaakt door het midden van de putjes met een uiteinde van de pipet 10 µL handmatig te schrapen. - Zorgvuldig gecombineerd media en voorzichtig wassen cellen tweemaal met 1 x PBS. Na een laatste wassen, voeg aangevuld fenol-rood gratis, gestripte of lage-FBS media met gewenste behandeling of voertuig (zoals aangegeven in stap 2.3).
Opmerking: HTR-8/SVneo cellen moeten worden gewassen met aangevuld fenol-rood media, zoals cellen om los te wassen met 1 x PBS zal veroorzaken. - Plaats de plaat van de 24-well met krassen putten in de geautomatiseerde, time-lapse imager (Zie Tabel van materialen) gehuisvest in een laboratorium incubator onderhouden bij 37 ° C, 5% CO2, en 95% vochtigheid. Afbeelding wells met regelmatige tussenpozen zoals nodig om cellen te voltooien wondgenezing (bijvoorbeeld elke 2 h gedurende 72 uur).
- Berekenen van de dichtheid van de wond en de breedte van de software gekoppeld aan de geautomatiseerde, time-lapse imager (Zie Tabel van materialen). Voor het berekenen van de procentuele verandering in de wond omvang ten opzichte van de grootte van de startende wond, de wond breedte instellen op moment 0 gelijk aan 100%. Verdeel de grootte van de wond in elke latere timepoint door de grootte van de wond op moment 0 en vermenigvuldig met 100 om het percentage (Figuur 1).
3. invasie Assay
- Volgende stap 1.4, zaad het juiste aantal cellen in 6-Wells-platen om cellen te bereiken van 90% samenvloeiing in 48 h. behouden cellen in een laboratorium incubator ingesteld op 37 ° C, 5% CO2, en 95% vochtigheid.
- De volgende dag, media omzetten in fenol-rood mediagroep aangevuld zoals vereist, met inbegrip van warmte-geïnactiveerd, houtskool dextran-ontdaan FBS.
Opmerking: Cellen kunnen op dit moment afhankelijk van de proefopzet worden voorbehandeld. - Op dit moment, plaats de flacon van de extracellulaire matrix van 10 mg/mL (Zie Tabel van materialen) op ijs, en laat het ontdooien in de koelkast 's nachts.
- De volgende dag, vooraf cool invasie assay levert door het plaatsen van 24-Wells-platen, cultuur van de cel wordt ingevoegd, microcentrifuge buizen en Pipetteer tips in de koelkast (4 ° C) gedurende ten minste 2 uur voorafgaand aan het werken met de extracellulaire matrix.
- Met behulp van gekoeld leveringen in de weefselkweek kap, Verdun 10 mg/mL extracellulaire matrix 1:1 met fenol-rood-vrije, serumvrij media aan een definitieve concentratie van 5 mg/mL.
Opmerking: Houd altijd de voorraad en verdunde extracellulaire matrix op ijs. De verhouding van de extracellulaire matrix media kan worden aangepast op basis van de eigenschappen van de cellijn gebruikt in de test. - Met behulp van gekoeld leveringen in de weefselkweek kap, 100 μl van verdunde extracellulaire matrix aan de inserts (Zie Tabel van materialen) die zijn geplaatst in de 24-well plaat toevoegen. Zorg ervoor dat de matrix niveau zonder enige bubbels. Plaats de plaat van de 24-well met matrix beklede inzetstukken in de incubator bij 37 ° C om de matrix te verharden.
- Om prep voor invasie assay cellen, cellen met 1 mL 1 x PBS wassen, gecombineerd de PBS en 500 µL van 1 x trypsine-EDTA toevoegen aan elk putje. Plaats de 6-well plaat in de incubator van de laboratorium bij 37 ° C, 5% CO2, en 95% vochtigheid gehandhaafd totdat alle cellen hebben losgemaakt van de bodem van de plaat.
- Zodra de cellen hebben losgemaakt, voeg 500 µL van fenol-rood-vrije, serumvrij media aan elk putje van de trypsinized cellen.
- Overdracht van 1.000 µL van vrijstaande cellen microcentrifuge buis en spin down voor 5 min bij 400 x g bij 4 ° C.
- Gecombineerd media en resuspendeer de cellen in fenol-rood-vrije, serumvrij media (volume is afhankelijk van de concentratie van cellen). Cellen tellen met behulp van een geautomatiseerde cel counter (Zie Tabel van materialen) en het volume van de celsuspensie voor een eindconcentratie van 5 x 105 cellen per mL.
Opmerking: Een hemocytometer en Microscoop kunnen ook worden gebruikt om de cellen tellen. - 600 μL van de volledige groei media toevoegen aan de putjes van de plaat 24-well die zal worden gebruikt voor de bepaling van de invasie.
Opmerking: Extra chemoattractants of behandelingen kunnen worden toegevoegd aan het volledige groeimedium in de put (tweede kamer). De geschetste experimenten toegevoegd voertuig (1 x PBS) of 100 nM dexamethason verdund in 1 x PBS aan de tweede kamer. - Plaats de vooraf gecoate invoegen in elk putje met volledige groeimedium, die zal worden gebruikt voor de bepaling van de invasie. Voeg dan 200 μL van cellen op de top van elke vooraf gecoate cel invoegen (Hogerhuis) voor een totaal van 1 x 105 cellen.
Opmerking: Als een negatieve controle voor deze test, kan een gelijk volume van fenol-rood-vrije, serumvrij media (zonder cellen) worden toegevoegd aan het Hogerhuis. - Plaats 24-well plaat in het laboratorium incubator onderhouden bij 37 ° C, 5% CO2, en 95% vochtigheid gedurende 24 uur.
Opmerking: De incubatietijd van de 24 h is geoptimaliseerd voor de cellen van de trofoblast van vereeuwigd eerste-trimester en verdere tests kunnen worden verlangd dat het bepalen van de vereiste incubatietijd in andere cellijnen. - Na overnachting incubatie, zuig de overige media van de bovenste en onderste kamer zonder verstoring van de extracellulaire matrix. Verwijder daarna voorzichtig de extracellulaire matrix en de niet-binnengevallen cellen van het bovenste gedeelte van de insert met een wattenstaafje, zwabberen zo vaak als nodig is om het verwijderen van de extracellulaire matrix.
- Wassen, elke plaats 3 x met 1 x PBS, PBS toevoegen aan de bovenste en onderste kamers van de put. Gecombineerd PBS na elke wasbeurt.
- Repareren van cellen die zijn gekoppeld aan de inserts door het plaatsen van inzetstukken in 100% ijskoude methanol gedurende 30 minuten bij 4 ° C. Wash wordt 3 x met 1 x PBS en verwijderen PBS ingevoegd na de finale wassen. Vlek van de cellen die zijn gekoppeld aan de inzetstukken voor 10 min met 0,2% kristalviolet in 20% ethanol.
- 3 x met gedeïoniseerd water spoelen en gecombineerd gedeïoniseerd water na de laatste wasbeurt.
- Hiermee voegt u gedurende 1 uur bij kamertemperatuur drogen. Met behulp van Tang en een scheermesje, zorgvuldig knip het onderste membraan van het donormateriaal en monteren op een glasplaatje met de onderkant naar boven. Toestaan montage media te drogen bij kamertemperatuur.
- Het verkrijgen van ten minste 4 unieke beelden van binnengevallen cellen per monster met behulp van een lichte Microscoop met een doelstelling van 20 x. Het totale aantal cellen in elke afbeelding tellen en normaliseren van het aantal cellen te controleren van monsters en het uitzetten van gegevens (Figuur 2).
4. de proliferatie Assay
- Volgende stap 1.4, trypsinized cellen uit de kolf met behulp van een geautomatiseerde cel counter tellen en zaad in 6-Wells-platen op een bevolkingsdichtheid van 2 x 10,5 cellen per putje in standaard groei media.
- Plaats van cellen in een laboratorium incubator onderhouden bij 37 ° C, 5% CO2, en 95% vochtigheid gedurende 4 uur of totdat de cellen hebben gehouden.
- Verandering media fenol-rood gratis media aangevuld zoals vereist, met inbegrip van warmte-geïnactiveerd, houtskool dextran-ontdaan FBS en toevoegen van de gewenste behandeling. De geschetste experimenten voertuig (1 x PBS) of 100 nM dexamethason verdund in 1 x PBS toegevoegd. Plaats de 6-Wells-platen in een laboratorium incubator onderhouden bij 37 ° C, 5% CO2, en 95% vochtigheid.
- Media verwijderen en vervangen door nieuwe media en behandeling elke 48 uur.
- Na 24, 48 of 72 uur behandeling, wassen van cellen met 1 mL 1 x PBS en 500 µL trypsine-EDTA toevoegen aan elk putje. Plaats 6-well plaat in de incubator tot cellen hebben losgemaakt van de plaat.
- Nadat u cellen hebt losgekoppeld van de plaat, toevoegen 500 µL van het aangevuld fenol-rood mediagroep trypsine deactiveren.
- 5 µL van trypsinized cellen toevoegen aan 5 µL van Trypan blauw in een aparte buis en meng door pipetteren.
- Cellen van elk putje in tweevoud met behulp van een geautomatiseerde cel counter tellen.
- Het gemiddelde van het aantal cellen per putje op elk tijdstip en plot als een functie van de tijd (Figuur 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De cellijnen vereeuwigd menselijke eerste-trimester trofoblast Sw.71 en HTR-8/SVneo werden gebruikt in deze experimenten om de rol van glucocorticoïden in trofoblast cel migratie12. Glucocorticoïden werden gebruikt in deze experimenten, zoals zij onlangs is gebleken te wijzigen van de trofoblast functies, hoewel alternatieve behandelingen gebruikte12zou kunnen zijn. Beide cellijnen werden behandeld met voertuig (1 x PBS) of 100 nM van de synthetische glucocorticoide dexamethason (Dex) voor alle experimenten. Opgerolde dichtheid en grootte werden gemeten elke 2 h gedurende 72 uur met behulp van een geautomatiseerde, time-lapse imaging systeem. Figuur 1 toont een voorbeeld van beelden en de resultaten van de kras assay op verschillende tijdstippen. Voorbeeldafbeeldingen van 0, 8 en 18u timepoints voor beide behandelingen voorzien (figuur 1A). De dichtheid van de wond en de grootte van de wond zijn opgenomen in een grafiek na verloop van tijd voor degustaties neiging met controle van het voertuig (Veh) of 100 nM Dex (figuur 1B). Dex behandeling verlaagd de wond sluiting zoals bepaald door zowel de dichtheid van de wond en de grootte van de wond, die aangeeft dat glucocorticoïden cel migratie in eerste trimester trofoblast cellen remmen.
Figuur 2 toont een voorbeeld van foto's genomen van de cel cultuur invoegen na de bepaling van de invasie. Cellen werden behandeld gedurende 24 uur met de Veh of 100 nM Dex. Binnengevallen cellen werden geteld vanaf vier onafhankelijke replicatieonderzoeken per behandeling met behulp van vier unieke gezichtsveld per repliceren. Glucocorticoide behandeling verminderd cel invasiviteit, zoals blijkt uit een daling van 15% van het aantal binnengevallen cellen.
Figuur 3 toont een voorbeeld van de cel proliferatie assay. Cellen werden geteld op 24, 48 en 72 uur na behandeling met Veh of 100 nM Dex. Glucocorticoide behandeling verminderd celproliferatie, zoals aangegeven door minder cellen op elk tijdstip. Over het geheel genomen, deze tests aantonen dat glucocorticoide blootstelling cel beweeglijkheid vermindert door remming van celproliferatie zowel invasie.
Figuur 1: cel van kras Assay. (A) representatieve beelden van wonden voor Veh - en Dex-behandeld Sw.71 cellen op 0, 8 en 18 uur staan. Rode lijnen geven de grootte van de wond. (B) wond boomdichtheid en wond werden gemeten in cellen van het Sw.71 en HTR-8/SVneo behandeld met voertuig (Veh) of 100 nM Dex. Foto's werden genomen elke 2 h gedurende 72 uur met behulp van een geautomatiseerde, time-lapse Microscoop. Gegevens Hiermee geeft u het gemiddelde van de vier onafhankelijke replicatieonderzoeken ± SEM. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Cell Invasion Assay. Invasie tests werden uitgevoerd met Sw.71 en HTR-8/SVneo cellen behandeld gedurende 24 uur met voertuig (Veh) of 100 nM Dex. (A) representatieve beelden uit de invasie assay voor Veh - en Dex-testgroep cellen na 24 uur incuberen. Verzonken vlak beeld is negatieve controle met geen cellen toegevoegd aan het Hogerhuis. Foto's genomen op 200 x vergroting. Schaal balken zijn 120 µm. (B) Invaded cellen werden geteld en de staafdiagrammen vertegenwoordigen het genormaliseerd gemiddelde van vier onafhankelijke replicatieonderzoeken ± SEM. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: cel proliferatie Assay. SW.71 en HTR-8/SVneo cellen behandeld met voertuig (Veh) of 100 nM Dex telde elke 24 uur met behulp van een geautomatiseerde cel counter. Cellen zijn opgenomen in een grafiek als de gemiddelde ± SEM van ten minste 11 onafhankelijke repliceert. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze procedure is gebaseerd op het gebruik van migratie en invasie testen als u wilt opnemen van het tarief van celproliferatie als een potentiële bijdrage aan gemeten verschillen in trofoblast cel beweging. Samen gebruikt, zijn deze in-vitrotests eenvoudige en effectieve methoden die kunnen worden gebruikt voor het identificeren van de cellulaire routes die trofoblast migratie regelen. Zoals hierboven beschreven, kunnen cellen van de trofoblast worden behandeld met hormonen, cytokinen, groeifactoren of andere moleculen om hun impact op de trofoblast beweging. Als alternatief kunnen doel eiwitten uit cellen ophelderen van hun functionele rol in de beweeglijkheid van de trofoblast worden uitgeput. Identificeren van belangrijkste modulatoren van trofoblast migratie kunnen een beter begrip van de basismechanismen onderliggende complicaties van de zwangerschap placenta gebreken gerelateerde, met inbegrip van pre-eclampsie, beperking van de uteriene groei en vroeggeboorte.
Er zijn verschillende kritische stappen in dit protocol, die zijn vereist voor het verkrijgen van nauwkeurige resultaten. Omdat fenol-rood oestrogene activiteit bij concentraties gebruikt in cel voedingsbodems13 heeft, is het belangrijk dat fenol-rood-mediagroep voor experimentele eindpunten wordt gebruikt om te voorkomen dat ongewenste activering van de oestrogeen receptor in de cellen. Tijdens de transwell invasie assay is het belangrijk om ervoor te zorgen dat de extracellulaire matrix is homogeen, niveau en dat koude leveringen worden gebruikt ter voorkoming van vroegtijdige polymerisatie van de matrix. Bij het uitvoeren van de cel proliferatie en invasie testen, is het belangrijk om te tellen monsters onmiddellijk om te voorkomen dat re-hechting van de cellen weefselkweek platen. Het moet ook worden gehouden onder overweging dat celdood als gevolg van experimentele behandeling invloed op de resultaten van alle drie tests hebben kan. Daarom markers van celdood (bijvoorbeeld lactaat dehydrogenase release, fosfatidylserine externalization of aantasting van het DNA) in reactie op behandeling moeten worden geëvalueerd in de experimentele cellijn voorafgaand aan de evaluatie van de migratie, invasie, en proliferatie14. Sommige beperkingen bestaan voor deze tests, bijvoorbeeld het proces van het creëren van een wond in een cel enkelgelaagde induceert een cel letsel reactie dan de cel migratieproces kan verwarren. Bovendien, de handmatige schrapen, kan er interexperiment variabiliteit, invoeren hoewel met behulp van een wond-maker-hulpprogramma waarmee u uniforme wond breedtes gedeeltelijk deze beperking beperken kan. Het nadeel van de bepaling van de invasie is het is een eindpunt assay, waardoor de kinetiek van verkeer niet gemakkelijk bereikt worden. Ondanks deze beperkingen, de hier beschreven tests bieden reproduceerbare kwantitatieve gegevens op relatief lage kosten.
De hier beschreven testen kunnen ook worden gewijzigd voor het meten van cel migratie in andere celtypen, hoewel deze testen zou niet geschikt voor niet-aanhanger celtypes. In de scratch assay, kunnen de imaging intervallen voor time-lapse microscopie worden aangepast om voldoende vangen verschillen in de omvang van de migratie van de cel. Geautomatiseerde systemen voor beeldvorming van de levende cel kunnen vastleggen wond grootte beelden zo vaak als elke 15 min. beelden genomen ten minste elke 30 min kunnen worden gestikt samen om een film van wondgenezing te maken. Het totale aantal cellen zaadjes in de invasie assay, de concentratie van de extracellulaire matrix, en de duur van incubatie voorafgaand aan de vaststelling en telling van cellen kan worden aangepast aan de account voor het specifieke tarief van invasie in verschillende soorten cellen. In de cel proliferatie assay, kan het aantal cellen ontpit op de platen en de tijdstippen voor het tellen van de cel worden aangepast aan account voor verschillende tarieven voor celgroei. Deze tests zijn over het algemeen flexibel en zeer toegankelijk hulpmiddelen die in een groot aantal celtypes kunnen worden gebruikt voor het identificeren van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de cel migratie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedanken Dr Gil Mor voor het verstrekken van de Sw.71 cellen. Dit onderzoek werd gesteund door een Albert McKern Scholar Award naar S.W.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% Trypan blue stain | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| 1.0 M HEPES | AmericanBio | AB06021-00100 | |
| 10 mM MEM non-essential amino acids | Life Technologies | 11140-050 | |
| 100 mM sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| 24-well plate transwell inserts | Corning | 3422 | Contain polycarbonate filters with an 8 μm pore size |
| Charcoal dextran-stripped FBS | Gemini Bio-Products | 100-119 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Crystal Violet | Sigma Aldrich | C0775 | |
| Cytoseal 60 | Thermo Fisher Scientific | 8310-4 | |
| Dexamethasone (Dex; 1, 4-pregnadien-9α-fluoro-16α-methyl-11β, 17, 21-triol-3, 20-dione; ≥98% TLC) | Steraloids | P0500-000 | |
| DMEM/Ham’s F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F2442 | |
| IncuCyte 24-well ImageLock Plates | Essen BioScience | 4365 | If using the IncuCyte Zoom imaging system, seed cells onto IncuCyte ImageLock Plates. These plates have fiducial markers on the bottom of the plate that are used as a reference for repeat imaging in a constant field of view. |
| IncuCyte software | Essen BioScience | 2010A Rev2 | |
| IncuCyte ZOOM system | Essen BioScience | N/A | Scratch assay images were captured and analyzed using the preset “Scratch Wound” parameters on the IncuCyte ZOOM system. Other time-lapse microscopes may also be used. |
| Matrigel Membrane Matrix | Becton Dickinson | 356231 | Growth factor reduced, phenol-red free |
| Micro Slides | VWR International, LLC | 48311-7003 | |
| Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-545-E | |
| Olympus IX71 inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Penicillin (10,000 units/mL)/streptomycin (10,000 µg/mL) | Life Technologies | 151-40-122 | |
| Phenol-red free DMEM/Ham's F12 | Life Technologies | 11039-021 | |
| Semi-automatic wound maker tool | Essen BioScience | N/A |
References
- Ji, L., et al. Placental trophoblast cell differentiation: Physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia. Molecular Aspects of Medicine. 34 (5), 981-1023 (2013).
- Caniggia, I., Winter, J., Lye, S., Post, M. Oxygen and placental development during the first trimester: implications for the pathophysiology of pre-eclampsia. Placenta. 21, S25-S30 (2000).
- Norwitz, E. R. Defective implantation and placentation: laying the blueprint for pregnancy complications. Reproductive Biomedicine Online. 13 (4), 591-599 (2006).
- Ness, R. B., Sibai, B. M. Shared and disparate components of the pathophysiologies of fetal growth restriction and preeclampsia. American Journal of Obstetrics & Gynecology. 195 (1), 40-49 (2006).
- Knöfler, M. Critical growth factors and signalling pathways controlling human trophoblast invasion. The International Journal of Developmental Biology. 54 (2-3), 269-280 (2010).
- Huber, A. V., Saleh, L., Bauer, S., Husslein, P., Knöfler, M. TNFα-Mediated Induction of PAI-1 Restricts Invasion of HTR-8/SVneo Trophoblast Cells. Placenta. 27 (2), 127-136 (2006).
- Nadeem, L., et al. Nodal Signals through Activin Receptor-Like Kinase 7 to Inhibit Trophoblast Migration and Invasion. The American Journal of Pathology. 178 (3), 1177-1189 (2011).
- Onogi, A., et al. Hypoxia inhibits invasion of extravillous trophoblast cells through reduction of matrix metalloproteinase (MMP)-2 activation in the early first trimester of human pregnancy. Placenta. 32 (9), 665-670 (2011).
- Straszewski-Chavez, S. L., et al. The isolation and characterization of a novel telomerase immortalized first trimester trophoblast cell line, Swan 71. Placenta. 30 (11), 939-948 (2009).
- Graham, C. H., et al. Establishment and characterization of first trimester human trophoblast cells with extended lifespan. Experimental Cell Research. 206 (2), 204-211 (1993).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
- Kisanga, E. P., Tang, Z., Guller, S., Whirledge, S. Glucocorticoid signaling regulates cell invasion and migration in the human first-trimester trophoblast cell line Sw. 71. American Journal of Reproductive Immunology. , e12974 (2018).
- Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (8), 2496-2500 (1986).
- Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. Measurement of cell death in mammalian cells. Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 12, Unit 12 18 (2004).
