Summary
여기, 선물이 CD4를 식별 하는 흐름 cytometric 프로토콜+ 와 CD8+ T 세포, γ T 세포, B 세포, NK 세포와 7 대신만 두 형광을 사용 하 여 인간의 말 초 혈액에 monocytes. 이 방법을 5 추가 마커 대부분 교류 cytometers에 기록할 수 있습니다.
Abstract
면역 세포 특성화는 무 겁 게 차동 식 표면 표식에 따라 모집단을 식별 하기 위해 여러 가지 빛깔 cytometry에 의존 합니다. 클래식 멀티 컬러 패널의 설치에는 최고급 악기, 사용자 지정 레이블이 지정 된 항 체, 및 스펙트럼 중복을 최소화 하기 위해 주의 깊은 연구 디자인 필요 합니다. 우리 주요 면역 인구를 식별 하는 multiparametric 분석 개발 (CD4+ 와 CD8+ T 세포, γ T 세포, B 세포, NK 세포, monocytes) 두 형광을 사용 하 여 7 개의 혈통 마커를 결합 하 여 말 초 혈액에서. 우리의 전략은는 혈통 마커 독특한 조합에 각 세포 인구에 의해 표현 됩니다 끊임없이 관찰을 기반으로 합니다. 항 체의 주의 적정와 함께이 정보를 결합 하 여 대부분 교류 cytometers의 광학 제한 확대 5 추가 마커를 기록 하는 조사 수 있습니다. 머리 비교 시연 주변 혈액에서 면역 세포 인구의 대다수 우리의 방법과 고전적인 "한 형광 색소 1 마커 접근", 사이 대 등 한 정확도로 나타낼 수 있다 비록 후자는 여전히 NKT 세포 등 γ T 세포 인구를 식별 하는 데 더 정확 하다 두 형광을 사용 하 여 7 개의 마커를 결합 하 여 복잡 한 면역 세포 인구와 저렴 한 6-10 형광 색소 교류 cytometers, 그리고 한정 된 자원 가진 지역에서 2-3 형광 색소 필드 악기에도 임상 샘플의 분석에 대 한 수 있습니다. 최고급 악기도 깊은 교류 cytometry 분석을 달성 하기 위해 여분의 형광을 사용 하 여이 접근에서 활용할 수 있습니다. 이 접근은 또한 매우 잘 임상 샘플 셀의 제한 된 수의 경우 여러 세포 인구를 심사 적합 합니다.
Introduction
Cytometry 이벤트 두 번째1당 몇 천의 속도로 단일 입자에 여러 매개 변수를 분석 하에 개발 된 기술입니다. 표본 cytometry 분석의 예는 포함 되지만 셀, 구슬, 박테리아, 소포 및 염색체에 국한 되지 않습니다. 유체 시스템 어디 하나 이상의 레이저와 그것의 경로 교차 하는 각 입자 및 여러 매개 변수는 추가 분석을 위해 기록 됩니다 심문 지점에서 입자를 지시 합니다. 앞으로 및 측면 살포, 순수한 레이저 빛의 산란에 의해 생성 된 대상 인구를 식별 하 고 각각 상대적인 크기와 입자의 내부 복잡성/단위에 대 한 정보를 검색 하는 데 사용 됩니다. 모든 다른 매개 변수, 흐름 cytometric 분석에서 데이터의 대부분을 담당 하는 형광 색소 표시 된 조사는 인식 하 고 바인딩할 특정 대상의 입자에 의해 파생 됩니다.
Cytometry 면역학 연구 특성화 세포 인구를 식별 하는 기본 도구입니다. 면역 시스템의 복잡성을 해 부하 다 색 패널은 세포 인구1의 깊은 immunophenotyping 동시에 기록 하는 마커의 수를 확장할 끊임없이 진화 된다. 이것은 20 형광 매개 변수를 초과 하는 최근 하이 엔드 흐름 cytometers 형광, 및 더 많은 능력의 개발을 선도 합니다. 이 결과 형광 색소 스펙트럼 중복으로 인해 복잡 한 연구 디자인 및 사용자 지정 항 체 라벨 및 숙련 된 연산자와 관련 된 높은 비용. 여러 인스턴스, 복잡성 및 비용 다른 세포 인구에 대 한 마커의 별도 패널을 사용 하 여 감소 된다. 그러나이 방법은, 오류가 발생 하기 쉬우며, 각 패널에 정보를 감소 이며 세포의 제한 된 수의 샘플에 적용 하기 어려울 수 있습니다. 또한, 적은 형광 매개 변수를 가진 계기에 깊은 immunophenotyping을 걸로 하겠습니다 마커 수 증가. 우리는 이전 주요 면역 인구를 식별 하는 얼룩 프로토콜을 개발 (CD4+ 와 CD8+ T 세포, γ T 세포, B 세포, NK 세포, monocytes) 7 혈통 마커를 사용 하 여 결합 하 여 주변 혈액 단 세포 (PBMCs) 7 대신만 두 형광 전통적인 "한 형광 색소 1 마커" 접근 (www.hcdm.org)2,3를 사용 하 여 필요 합니다. 우리의 초기 보고서 탐색 하 고 깊은 immunophenotyping에 대 한 두 가지 형광에 7 개의 마커를 결합의 개념을 확인. 이 보고서에서 우리는 단계에 의해 단계 프로토콜을 분리 하 고 주변 혈액 세포, 얼룩를 제시 하는 실용적인 측면에 초점을 맞추고 및 성공적인 얼룩을 달성 하는 단계를 문제 해결.
이 프로토콜은 그 혈통 마커 상수 식 세포 표면에 있고 각 셀 인구는 혈통 마커의 독점 조합 관찰을 기반으로 합니다. PBMCs에서 CD3 식 다시 나눈다 면역 세포 두 가지 주요 범주로: CD3 양성 T 림프 톨 및 CD3-부정적인 세포. CD3 긍정적인 비율, CD4 내+, CD8+ γ T 세포 CD4, CD8 고 γ 수용 체를 대상으로 하는 항 체를 사용 하 여 분리 될 수 있습니다. 유사한 방법에서는, CD3 부정적인 비율, 내 B 세포, NK 세포, monocytes 식별할 수 있습니다 유일 하 게 각각 CD19, CD56, CD14에 대하여 항 체를 사용 하 여. 표준 한 형광 색소 1 마커 접근, 안티-CD3-CD4,-CD8,-CD14,-7 다른 형광 CD19-CD56, TCR-γ 항 체는 검출. 우리의 접근 방식, 결합 한 안티-CD3-CD56, 그리고 한 형광 색소 (형광 색소 편의 A에 대 한 분류) 및 안티-CD4-TCR γ 항 체-CD8,-CD14와-CD19 항 체에 다른 형광 색소 (형광 색소 B). 이 항 체 적정 및 차동 항 식의 조합에 의해 가능 하다. 두 CD4+ 와 CD8+ T 세포에 형광 색소, 안티-CD3 항 체에 대 한 긍정적인 하지만 형광 B는 CD8 사이 CD4 신호를 ad hoc 적정으로 배치 하면서 CD8 신호 표현의 극대화 색소에서 분리 될 수 있다 고 CD3 이중 부정 긍정적인-CD4/CD8 세포. Γ T 세포 표현 보다는 c d 4와 CD8, CD3의 높은 수준 그리고 그러므로 그들은 CD3 높은4로 식별할 수 있습니다. 이 신호는 라벨 γ 형광 색소 A CD3 낮은 T 세포와 CD3 높은 γ T 세포 구분 개선 한 안티 TCR γ 항 체와 T 세포에 의해 더 밀어 주었다. B 세포는 c d 3로 확인 될 수 있다- 형광 색소 A와 CD19+ 형광 색소 나에 CD3 부정적인 NK 세포 B 세포에서 분리, 안티 CD56 항 체는 형광 색소 A에에서 안티-CD3으로 사용 되었다. CD56 CD3 T 세포5보다 훨씬 낮은 수준에서 NK 세포에 표현 했기 때문에 이것이 가능 합니다. 마지막으로, monocytes는 앞으로 사이드 분산형 속성 및 형광 색소 B. CD14의 식의 조합을 통해 확인할 수 있습니다.
2 형광을 사용 하 여 최대 4 개의 마커를 결합의 아이디어6,7,8, 전에 이미 성공적으로 시도 하 고 악성 림프 인구9 식별 하는 임상 프로토콜에 사용 되었습니다. . 이전 보고서는 또한 7 개의 마커를 결합 (다른 특이성 표식에서와 우리가 우리의 프로토콜에서 사용 하는 보다) 다양 한 양의 형광 색소10각 항 체의 복잡 한 라벨에 의존 2 개의 형광, 하지만이 방법을 사용 하 여. 이 대조적으로 우리의 메서드는 상업적으로 사용할 수 있는 항 체를 사용 하 여 악기 구성에 적용할 수 있습니다 하 고 고분자 형광의 새로운 세대를 활용할 수 있습니다.
이 방법론의 전반적인 목표 대부분 교류 cytometers 복잡 한 세포 인구가 5 추가 마커의 녹음에 대 한 수의 광학 한계를 확장 하는 것입니다. 결과적으로, 저렴 한 6-10 형광 색소 교류 cytometers에 고급 면역학 분석을 수행할 수 있습니다 그리고 2-3 형광 색소 필드 악기 한정 된 자원 가진 지역에서 놀라운 결과 얻을 수 있습니다. 최고급 악기도 깊은 교류 cytometry 분석을 수행 하 고 동일한 시간11에서 여러 계보를 대상으로 하는 cytometric 패널 모듈형 흐름을 만들려면 추가 형광을 사용 하 여이 접근에서 활용할 수 있습니다. 이 잠재적으로 모듈형 immunophenotyping cytometry에 사용 되는 패널의 수를 감소 하 고 비용, 오류 및 처리 시간을 줄일 수 있습니다. 이 접근은 또한 매우 잘 임상 샘플 셀의 제한 된 수의 경우 적합 합니다.
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Protocol
인간의 물질의 모든 연구는 건강 보험 이동성 및 책임에 관한 법률에서 존스 홉킨스 기관 검토 위원회에 의해 승인 되었다. 환자 및 제어 샘플 드 확인 했다입니다. PBMCs와 건강 한 컨트롤에서 혈액은 동의 의해 얻은 했다.
참고: 이 프로토콜에 갓 테스트 되거나 고립 된 냉동 주변 혈액 세포와 전체 혈액.
1. 세포 준비
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전체 혈액에서 주변 혈액 세포 (PBMC)의 절연
- 포함 된 나트륨 덤플링을 10 mL 그린 탑 튜브에 혈액을 그립니다. 피와 튜브를 작성 후 즉시 반전 튜브 여러 번 응고를 방지 하기 위해.
참고: 튜브 ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 또는 나트륨 시트르산 등 다른 응고 제를 포함 하는 비교 결과 함께 사용할 수 있습니다. 혈액의 다른 금액을 수집 하는 경우 프로토콜에는 다음 단계 따라 조절 한다. - 신중 하 게 50 mL 원뿔 튜브로 그려진된 혈액 전송. 칼슘과 마그네슘 없이 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)의 동일한 금액으로 혈액을 희석.
- 새로운 50 mL 원뿔 튜브의 하단에 밀도 그라데이션 매체 (예: Ficoll)의 15 mL를 추가 하 고 신중 하 게 피하는 어떤 혼합 밀도 그라데이션 매체 위에 희석된 혈액 오버레이 밀도 그라데이션 매체와 희석된 혈액 사이.
참고: 이것은 적혈구에서 PBMCs의 적절 한 분리에 대 한 중요 한 단계 이다. - 인터페이스의 혼란을 피하기 위해 아무 브레이크 (RT), 실 온에서 30 분 400 x g 에서 원심.
- 원심, 후 신중 하 게는 피 펫을 사용 하 여 상위 계층을 발음 하 고 플라즈마 및 밀도 그라데이션 매체, PBMCs stratifies는 그 사이의 인터페이스에서 세포를 제거 하지 주목, 그것을 폐기. 50 mL 원뿔 튜브와 새로운 50 mL 원뿔 튜브에 하단에 레드 셀 펠 릿을 건드리지 않고 인터페이스에서 가능한 많은 세포 수집 합니다.
- 하 마지막 볼륨 25 ml를 섞어 여러 번 반전 PBS를 추가 합니다. 세포 현 탁 액에서 밀도 그라데이션 중간 오염을 제거 하에 브레이크 RT에서 10 분 동안 300 x g 에서 원심.
- 신중 하 게 방해 셀 펠 릿 없이 상쾌한 발음. 하 마지막 볼륨 25 ml를 섞어 여러 번 반전 PBS를 추가 합니다. 제거 혈소판에 브레이크와 RT에 10 분 동안 200 x g 에서 원심.
- 조심 스럽게 셀 펠 렛을 방해 하지 않고는 상쾌한 발음. PBS/0.1% 나트륨 아 지 드의 1 mL에 PBMCs를 resuspend. 나트륨 아 지 드 상한, 흘리기, 항 체, 및 증가 세포 복구, 국제화 줄어들지만 그 독성 세포 생존 능력을 손상 할 수 있다. 이러한 이유로, 나트륨 아 지 드 피해 야 한다 모든 단계에 경우 셀 후속 실험에 대 한 경작 될 것 이다. 셀 고립과 나트륨 아 지 드 없이 얼룩 착 나트륨 아 지 드의 수행에 비슷한 결과 주었다.
주의: 나트륨 아 지 드 중앙 신 경계에 영향을 미치는 죽음을 발생할 수 있습니다. 연락처는 피부와 눈에 화상을 일으킬 수 있습니다. - Microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 PBMCs의 30 µ L를 전송 하 여 계산에 대 한 셀을 희석. 그런 다음 추가 PBS의 120 µ L의 휴대폰 번호 및 생존 능력 결정 Trypan 블루 150 µ L (1시 10분 희석 셀). 신중 하 게 resuspend.
- 10 µ L hemocytometer, 수를 셀 따라 사용 계산을 챔버 가능한 셀의 수를 결정에 전송. 실행 가능한 세포 Trypan 블루 부정적인 세포 총 x 10 (이 프로토콜에 사용 되는 희석 요소)의 수 = x 104.
참고: 에 평균, 7-15 x 106 PBMCs의 혈액 10 mL에서 수집 한다. - PBS/0.1% 나트륨 아 지 드의 mL 당 10 x 106 셀 resuspend
참고: PBMC 냉동 고 시간의 연장된 기간에 대 한 액체 질소에 저장 될 수 있습니다. 그러나, 마커 chemokine 수용 체 등의 표현이이 절차에 의해 변경할 수 있습니다.
- 포함 된 나트륨 덤플링을 10 mL 그린 탑 튜브에 혈액을 그립니다. 피와 튜브를 작성 후 즉시 반전 튜브 여러 번 응고를 방지 하기 위해.
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냉동된 PBMC에서 셀의 준비
참고: 다른 동결 절차 셀 복구 및 생존12에 영향을 미칠 수. 이러한 실험에 대 한 PBMCs 미디어 또는 소 태아 혈 청 (FBS)/10% 디 메 틸 sulfoxide (DMSO) 비슷한 결과 특별히 공식화 냉동.
주의: DMSO는 흡입 (폐 자극)의 경우 약간 위험할 피부 접촉 (자극성, permeator), 섭취 (자극), 눈 접촉의 수 있습니다.- 액체 질소에서 냉동된 PBMC를 제거 하 고 얼음에. 37 ° C 물 욕조에 직접 얼음에서는 cryovial를 전송. 수 면에는 cryovial를 유지 하 고 작은 얼음 펠 릿 남아 때까지 부드럽게 튜브를 흔들. 얼음에는 cryovial를 전송 합니다.
- 70% 에탄올 스프레이 지우기 모든 물을 제거 합니다. 4 ° C에서 PBS/0.1% 나트륨 아 지 드의 1 mL를 천천히 추가 하 고 신중 하 게 15 mL 원뿔 튜브에 셀을 전송. 천천히 15 mL의 최종 볼륨에 도달을 4 ° C에서 찬 PBS/0.1% 나트륨 아 지 드를 추가 합니다.
- 10 분에 대 한 300 x g 에서 원심 분리기 조심 스럽게 제거 표면에 뜨는, resuspend 셀 PBS/0.1% 나트륨 아 지 드의 1 ml.
참고: 셀 RPMI에 resuspended도 수 10 %FBS 비슷한 결과 함께. - Microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 PBMCs의 30 µ L를 전송 하 여 계산에 대 한 셀을 희석. 그런 다음 추가 PBS의 120 µ L의 휴대폰 번호 및 생존 능력 결정 Trypan 블루 150 µ L (1시 10분 희석 셀). 신중 하 게 resuspend.
- 10 µ L hemocytometer, 수를 셀 따라 사용 계산을 챔버 가능한 셀의 수를 결정에 전송. 실행 가능한 세포 Trypan 블루 부정적인 세포 총 x 10 (이 프로토콜에 사용 되는 희석 요소)의 수 = x 104.
- PBS/0.1% 나트륨 아 지 드에 mL 당 10 x 106 셀 resuspend
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전체 혈액에서 세포의 준비
- 포함 된 나트륨 덤플링을 10 mL 그린 탑 튜브에 혈액을 그립니다. 피와 튜브를 작성 후 즉시 반전 튜브 여러 번 응고를 방지 하기 위해.
참고: 나트륨 구 연산 염 또는 EDTA 비교 결과 함께 사용할 수 있습니다와 같은 다른 응고 제를 포함 하는 튜브. 혈액의 다른 금액을 수집 하는 경우 프로토콜에는 다음 단계 따라 조절 한다. - 12 x 75mm 출장 관에, 나트륨 아 지 드와 부드럽게 2에 대 한 소용돌이의 2 µ L을 추가 전체 혈액의 200 µ L s.
- 포함 된 나트륨 덤플링을 10 mL 그린 탑 튜브에 혈액을 그립니다. 피와 튜브를 작성 후 즉시 반전 튜브 여러 번 응고를 방지 하기 위해.
2. 세포 얼룩
참고: 사실상 더 스펙트럼 중복 형광의 쌍을 선택 하는 것이 다른 형광 색소 검출기에 형광 색소의 높은 파급으로 인해 데이터의 확산을 줄이기 위해 중요 합니다. 위해 알의 최적의 식별 셀 하위 집합, 높은 양자 수율과 형광 항 체 쌍 PE BV421와 PE APC 사용 되어야 한다.
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신선 하 고 냉동 PBMC의 얼룩
- 96-잘 V-하단 플레이트에 PBMC (1 x 106 셀)의 100 µ L를 전송 합니다.
참고: 비슷한 결과2셀 1 x 106 보다 낮은 수를 사용할 수 있습니다. - RT에 3 분 동안 350 x g 에서 centrifuge 하 고 신중 하 게는 상쾌한 셀 펠 렛을 방해 하지 않고 발음. 죽은 세포를 10 분 동안 단백질에 자유로운 아민과 반응 하는 라이브/죽은 고칠 수 염료를 포함 하는 PBS의 각 잘 100 µ L를 추가 합니다.
- 모든 항 체를 포함 하는 혼합의 각 샘플 30 µ L에 대 한 준비 (안티-CD3.-CD56, fluorchrome A, 및 안티-CD4, CD8, CD19, fluorchrome B에에서 CD14 TCRγδ). 항 체의 농도 표 1 과 테이블 2에 표시 됩니다. 이 단계에서 다른 표적 분자와 다른 형광에 적정 한 항 체도 추가 될 수 있다 (예를 들어, 표 3).
참고: 항 체 농도 및 로트 번호에 따라 달라질 수 있습니다. 따라서, 예비 테스트 최적의 신호를 달성 하기 위해 수행 되어야 합니다. PBS, PBS/0.5% BSA, PBS/0.2% 나트륨 아 지 드 또는 PBS/0.5% BSA/0.1% 나트륨 아 지 드 항 체2희석 비슷한 결과 함께 사용 되었다. 셀도 쉽게 통합이 방법론에 이미 30 µ L에서 다른 볼륨에 얼룩이 질 수 있다 얼룩 프로토콜. - RT에 3 분 동안 350 x g 에서 centrifuge 하 고 신중 하 게는 상쾌한 셀 펠 렛을 방해 하지 않고 발음. 각 잘 하 항 체 칵테일을 추가 하 고 거품을 생성 하지 않고 신중 하 게 resuspend. 어둠 속에서 RT에서 30 분 동안 품 어.
참고: 그것은 비슷한 결과와 4 ° C에서 샘플 얼룩 수 있습니다. - RT에 3 분 동안 350 x g 에서 얼룩 버퍼 및 원심 분리기의 150 µ L을 추가 하 고 신중 하 게는 상쾌한 셀 펠 렛을 방해 하지 않고 발음. PBS의 200 µ L에서 세포를 resuspend 하 고 데이터 흐름 cytometer에. 얼룩 볼륨 변경 되 면 항 체의 과잉을 세척 하는 데 사용 하는 원래 항 체 혼합의 적어도 20-fold 희석을 확인 하십시오.
참고: 스테인드 세포는 PBS/2% paraformaldehyde에 고정, 4 ° C에서 냉장고에 하룻밤 보관 고 교류 cytometer에 취득 다음 날 될 수 있습니다.
주의: Paraformaldehyde가 이다 삼 하 고 피부 자극을 일으킬 수 있는 유해
- 96-잘 V-하단 플레이트에 PBMC (1 x 106 셀)의 100 µ L를 전송 합니다.
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전체 혈액의 얼룩
- 각 12 x 75mm 출장 관 추가 항 체의 칵테일 (안티-CD3.-CD56, 형광 색소 A, 및 안티-CD4, CD8, CD19, 형광 색소에 CD14 TCRγδ B)와 RT에 RT에 어둠 속에서 30 분 동안 품 어. 항 체의 농도 표 4에 표시 됩니다. 이 단계에서 다른 표적 분자에 대하여 항 체를 적정 하 고 다른 형광에 추가할 수 있습니다 뿐만 아니라. 항 체 농도 및 로트 번호에 따라 달라질 수 있습니다. 따라서, 예비 테스트 최적의 신호를 달성 하기 위해 수행 되어야 합니다.
참고: 그것은 비슷한 결과와 4 ° C에서 샘플 얼룩 수 있습니다. - RT에 3 분 동안 350 x g 에서 centrifuge 하 고 신중 하 게는 상쾌한 셀 펠 렛을 방해 하지 않고 발음. 제조업체의 지침에 따라 붉은 혈액 세포 세포의 용 해 버퍼의 1 x 솔루션을 확인 합니다.
참고: 세포의 용 해 솔루션 RT 사용 하기 전에 해야 합니다. - 각 관에 붉은 혈액 세포 세포의 용 해 버퍼 x 1의 2.0 mL를 추가 하 고 잘 모자를 섞어 여러 번 반전. 호 일 커버 하 고 15 분 동안 앉아 보자.
- 5 분은 신중 하 게 셀 펠 렛을 방해 하지 않고는 상쾌한을 발음에 대 한 300 x g 에 아래로 회전 합니다.
- 5 분에 대 한 300 x g 에서 PBS 및 원심 분리기의 2 개 mL를 추가 합니다.
참고:이 시점에서, 셀 펠 릿 있어야 성공적인 적혈구 세포를 나타내는 창백한 백색 채색 합니다. 조심 스럽게 셀 펠 렛을 방해 하지를 상쾌한 발음 하 고 부드럽게 PBS의 200 µ L에서 세포를 resuspend. - 40 µ m 필터 캡 셀 집계를 제거 하 고 데이터 흐름 cytometer에 12 m m x 75 m m 튜브를 통해 세포를 변형.
- 각 12 x 75mm 출장 관 추가 항 체의 칵테일 (안티-CD3.-CD56, 형광 색소 A, 및 안티-CD4, CD8, CD19, 형광 색소에 CD14 TCRγδ B)와 RT에 RT에 어둠 속에서 30 분 동안 품 어. 항 체의 농도 표 4에 표시 됩니다. 이 단계에서 다른 표적 분자에 대하여 항 체를 적정 하 고 다른 형광에 추가할 수 있습니다 뿐만 아니라. 항 체 농도 및 로트 번호에 따라 달라질 수 있습니다. 따라서, 예비 테스트 최적의 신호를 달성 하기 위해 수행 되어야 합니다.
3. 항 체 적정
참고: 항 체 적정 높은-품질, 재현할 수 데이터를 얻기 위해 가장 중요 한 단계입니다. 안티-CD3의 적정-CD8,-CD14-CD19, TCR-γ는 최적으로 긍정적이 고 부정적인 봉우리를 별도의 항 체의 농도 최대 인덱스13,14얼룩에 의해 파생 된 표준 절차를 따릅니다. 피크 또는 얼룩 인덱스 곡선의 상승에 피크에 가까이에 희석 되어야 합니다 (그림 1A-C)을 선택. 안티-CD4 항 CD3 단일 긍정적인 인구와 CD3 CD4 긍정적인 인구의 피크를 적정 + CD8 + T 세포, 더 가까이 더 나은 CD8dim 인구 (CD8 + γ T 세포와 NK T 세포)를 차별 CD3 단일 긍정적인 신호. 같은 라인을 따라 위치 NK CD56 CD56 적정 목표+ 는 CD3 사이 세포+ 그리고에서 CD3- 인구.
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최대 얼룩 인덱스 곡선
참고: 안티-CD3의 적정-CD8,-CD14-CD19, TCR-γ는 최적으로 긍정적이 고 부정적인 봉우리를 별도의 항 체의 농도 최대 인덱스 곡선15얼룩에 의해 파생 된 표준 절차를 따릅니다. 다른 표식에 대 한 항 체는 패널에 추가 하는 경우 그들은 또한 최대 얼룩 인덱스 곡선으로 적정 해야 합니다.- 2-fold 항 체 희석 버퍼 얼룩의 40 µ L로 96 잘 접시의 10 웰 스를 작성 하 여 준비 합니다. 첫 번째 잘에서 얼룩 버퍼의 80 µ L 최종 볼륨을 증가 하 고 농도 4 회 집중 제조 업체에 의해 제안에 관심의 항 체를 추가 합니다.
- 잘 혼합 하 고 두 번째 40 µ L을 잘 전송. 잘 혼합 하 고는 모든 다른 우물에 대 한이 단계를 반복 합니다.
- 10 샘플 PBMC 또는 전체 혈액의 항 체 전에 설명 하는 프로토콜을 다음의 10 가지 2-fold 희석의 30 µ L 얼룩.
- 교류 cytometer와 데이터를 수집 하 고 각 희석 (그림 1A)에서 신호 플롯.
- 각 항 체 농도 대 한 부정적이 고 긍정적인 인구에 게이트. 항 체의 농도 증가 하는 것은 높은 배경 귀 이어질 수 있습니다. 따라서, 그에 따라 부정적인 게이트를 크기 조정 합니다.
- 각 항 체 농도 대 한 중간 및 부정적인 인구의 형광 강도 대 한 표준 편차 및 긍정적인 인구의 형광 강도 대 한 중간에 대 한 정보를 추출 합니다. 이 수식 사용 하 여 얼룩 인덱스 각 항 체 농도 대 한 계산: (긍정적인 인구의 중간 형광 강도-부정적인 인구의 중간 형광 강도) ÷ (2 x 표준 편차의 형광 강도 네거티브 인구) (그림 1B).
- 얼룩 인덱스 vs. 항 체 희석의 분수로 표현 하는 항 체 농도 플롯 (예, 1시 10분 희석 = 0.1), 최대 얼룩 인덱스 값 (그림 1C)와 항 체의 농도 확인 하 고.
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안티-c d 4와-CD56 항 체 적정
참고: 이전 적정 2 형광 색소 패널에 다른 마커 의존 안티-c d 4와-CD56 항 체 적정. 적정 배치 안티-CD4 목표로 안티 CD4 항 체에 대 한 이중 CD8 사이 신호+/CD3+ 신호와 CD3 단일 긍정적인 인구 (그림 1D).- 적정 안티 CD4 및 이전에 설명한 대로 2-fold 희석 전략 CD56 항 체 CD4 분리를 허용 하는 가늘게 농도의 범위를 식별 하는 사이 추가적인 농도 추가+ T 세포 및 NK 세포는 다른 세포에서 인구입니다.
- 이중 CD8 사이 안티 CD4 신호를 배치 하 여 안티-CD4 항 체를 적정+/CD3+ 신호와 CD3 단일 긍정적인 인구 (그림 1D).
참고: 특별 한 주의 CD4 명확 하 게 분리 할 수+ T부터 CD8 세포+ 인구를 흐리게. - 다음 전략 비슷합니다-안티-CD4 항 체 적정, CD3-부정과 CD3 양성 인구 사이 NK 세포를 배치 하 여 안티 CD56 항 체 적정
4. 제어 전략
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림프 및 monocytic 세포 인구를 식별 하 고 분석에서 죽은 세포 및 잔여 적혈구의 대부분을 제거 합니다.
- 림프 톨, monocytes 앞으로 대 면 산포 지역에 기반을 포함 하는 전체 인구를 선택 (FSC-A vs SSC-A). 앞으로 살포 높이 대 앞으로 분산형 폭 (FSC-H 대 FSC-W)를 통해 분석 및 측면 분산형 높이 대 측 분산형 폭 (SSC-H 대 SSC W)에서 셀 집계를 제거 합니다.
- 라이브/죽은 차별 마커를 사용 하 여 밝은 긍정적인 죽은 세포 및 잔여 적혈구는 분석에서 제외. 림프 톨, monocytes 다른 FSC-A와 SSC-A 프로 파일에 따라에 게이트.
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2 형광 색소 7-마커 림프모구 인구의 제어 전략.
참고: CD3 긍정적인 비율, CD4 내+, CD8+ γ T 세포 CD4, CD8 고 γ 수용 체를 대상으로 하는 항 체를 사용 하 여 분리 될 수 있습니다. 유사한 방법에서는, CD3 부정적인 비율, 내 B 세포, NK 세포, monocytes 식별할 수 있습니다 유일 하 게 각각 CD19, CD56, CD14에 대하여 항 체를 사용 하 여.- 림프 구 게이트를 선택 하 고이 프로토콜 (그림 2B)에 사용 되는 두 개의 형광 중 각 축에 점이 음모를 만들.
- 게이트에 CD8+ T CD3 됨으로 셀+/CD8+ 더블 도트-줄거리 (그림 2B)의 오른쪽 상단 모서리에 긍정적인 세포. Dim CD8 인구 NKT 세포 포함 될 수를 제외 합니다. CD4에 게이트+ T 세포 CD8 사이 인구로 식별+ T 세포와는 CD3 단일 긍정적인 인구. Γ T 세포 높은 CD3 셀으로 식별에 게이트. Γ CD8 긍정적인 부정적인 CD8 T 세포를 분할 합니다.
- CD3 양성 사이 인구로 식별 하는 NK 세포와 CD3-부정적인 셀에 게이트. CD8 긍정적인 및 부정적인 CD8 NK 세포를 분할 합니다. 문 CD3 음수가 CD19로 식별 하는 B 세포에+ 점 플롯의 오른쪽 하단 모서리에 인구.
- Monocyte 게이츠를 선택 하 고이 프로토콜 (그림 2C)에 사용 되는 두 개의 형광 중 각 축에 점이 음모를 만들. 게이트는 c d 3에-/CD14+ 인구.
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Representative Results
설정 및 인간 주변 혈액 세포의 흐름 cytometry 실험의 분석 물 7 혈통 마커 (안티-CD3-CD4,-CD8,-CD14,-CD19-CD56, TCR-γ 항 체)만 두를 사용 하 여 형광 표시 됩니다.
한 안티 CD8-CD56 항 체 적정 대표적인 결과 설명 합니다. 각 항 체에 대 한 (이 예제에서는 안티-CD8), 10 연속 2-fold 희석에서 데이터 얼룩 인덱스 곡선 (그림 1A-C)을 계산 하기 위해 기록 되었다. 최적의 항 체 농도 최대 얼룩 인덱스 신호13,14에 의해 결정 되었다. 희석 피크 또는 얼룩 인덱스 곡선의 상승에 피크를 가까이에서 선택 되어야 합니다. 안티-c d 4와-CD56 항 체 (적정 이전) 2-형광 색소 패널에서 다른 표식 함께 주변 혈액 세포를 얼룩이 지기에 의해 적정 했다. 안티-CD4 항 체에 대 한 적정 배치 이중 CD8 사이 안티 CD4 신호 목표로 한다+/CD3+ 신호와 CD3 단일 긍정적인 인구 (그림 1D). 특별 한 주의 CD4 명확 하 게 분리 할 수+ T부터 CD8 세포+ 인구를 흐리게. PBMCs 표시 된 마커의 최적 농도와 안티-CD4의 다른 농도 얼룩이 있었다. 농도의 코드 색상: 그린 나타냅니다 CD4의 최적 분리에는 농도+ T 세포에서 다른 CD3+인구; 오렌지가 나타냅니다 농도 허용 하지만 좋지 않은 분리; 레드 나타냅니다 CD4 가난한 분리에서 결과 농도 dim CD8 세포 나 CD4/CD8 이중 부정 인구에서+ T 세포. 안티 CD56 적정 이루어졌다 비슷한 방식으로 안티-CD4 항 체로는 CD3 사이 NK 세포를 배치 하 여-부정과 CD3 양성 인구.
대표 전략 게이팅 림프 및 monocytic 세포 인구를 식별 하 고 분석 죽은 세포와 대부분의 잔여 적혈구 (그림 2A)에서 제거 하는 방법을 보여 줍니다. 모든 후속 분석이 제어 전략에 근거 했다. 대표 전략 게이팅 CD4를 식별 하는 데는+ 와 CD8+ T 세포, γ T 세포, B 세포, NK 세포, monocytes (그림 2B-C) 두 개의 형광 색소 7 마커 얼룩에.
대표 부정적인 결과 부적절 한 샘플 준비 및 안티-c d 4와-CD56 항 체의 적정에서 파생 됩니다. CD8에서+ T 세포 CD4 가난한 분리에서 CD4 결과 적절 한 적정 실패+ T 세포 (그림 3A), 반면 가난한 CD56 적정 B 세포에서 NK의 가난한 분리 발생할 수 있습니다 및 셀 얼룩 패널 (에서 모든 표식에 대 한 부정적인 그림 3B)입니다. 불 쌍 한 RBC 세포 전체 혈액 얼룩이 발생할 수 있습니다. 프로토콜의 기본 목표는 다른 세포의 백분율을 계산 하는 경우 (CD4의 예를 들어, %+ T 세포), 이중 부정 인구로 점 플롯에 나타납니다, RBC 이중 부정 세포 오염에서 제외 해야 분석 (그림 3C). 이 프로토콜에 대 한 우리의 경험을 바탕으로, 우리는 그 정확한 구분 B 세포와 NK CD8 발견 했습니다+ 세포 다른 마커를 사용 하 여 확인할 수 있습니다. 예를 들어, NK 세포는 HLA-DR 및 CCR6, 이중 부정 B 세포는 이중 긍정 (그림 3D).
이 원고에 프로토콜 셀의 제한 된 수의 샘플에서 여러 면역 인구가 다 색 얼룩 패널의 일부가 될 의미입니다. 이 접근을 사용 하 여 우리는 줄기 세포 이식 (Clinicaltrials.gov NCT0056609816)를 받는 여러 myeloma로 경도 샘플을 기증자에서의 면역 인구 역학 조사. 냉동된 PBMC 수집 되었고 하루 0, cytometry에 의해 분석 14, 28, 60, 180, 360 이식 후. 이 방법을 사용 하 여 여러 림프 구 인구 (CD45RA, CCR7), 그들의 순 진/메모리 프로 파일 활성화 및 셀 고갈 상태에 초점을 심문 수 있었습니다 (HLA-DR, CD57 CD45RA + 이펙터 메모리, CD16), 그리고 T 이펙터 표현 형 (CCR4, CCR6, CXCR3) 단일 패널17,18,19,20,21,22,23,,2425 얼룩에서 , 26.이 특히 유용한 환자와 시간 포인트의 일부에 대 한 수집 된 셀의 수는 겨우만 하나의 얼룩 패널에 대 한 충분 한 고려 되었습니다. 대표적인 전략 (그림 4)와 인구의 선택한 셀 (그림 5) 재발 환자의 역학 시간이 지남에 게이팅. 여러 myeloma B에서에서 세포 NK 마커 CD56 표현할 수 있습니다. 이 가능성을 제외 하려면 HLA-DR 그리고 CCR6 더 NK 세포 (그림 4B)에서 B 세포를 차별화 하는 데 사용 우리. CD8+ 메모리 및 naïve T 세포 CD45RA 및 CCR7의 식에 의해 확인 되었다: 순진한 (CD45RA+/CCR7+), 중앙 메모리 (CM, CD45RA-/CCR7+), 이펙터 메모리 (EM, CD45RA-/CCR7- )와 이펙터 메모리 CD45RA+ (EMRA, CD45RA+/CCR7+) (그림 4C). HLA-DR 및 CD8에 CD57 표현의+ 순, 총 메모리 T 세포 (CM, EM 및 구성 EMRA), CM, EM 및 EMRA (그림 4D). CD4+ 메모리 및 naïve T 세포 CD45RA 및 CCR7의 식에 의해 확인 되었다: 순진한 (CD45RA+/CCR7+), 중앙 메모리 (CM, CD45RA-/CCR7+), 이펙터 메모리 (EM, CD45RA-/CCR7- )와 이펙터 메모리 CD45RA+ (EMRA, CD45RA+/CCR7+) (그림 4E). CD4에 HLA-DR 및 CD57 식+ (CM, EM 및 구성 EMRA)는 순 및 메모리 인구, CM, EM 및 EMRA (그림 4 층). CCR4와 CCR6 메모리 인구 Th9 CD4 내에서 식별 하기 위해 마커로 사용 되었다+ T 세포 (그림 4G). Th1, Th1/17, Th2 Th17 CD4+ T 도우미 모집단 CCR4, CCR6 및 CXCR3의 표현에 의해 확인 되었다 (그림 4 H). CD16 및 CD57 식 NK 세포 (그림 4I). 줄기 세포 이식 결과 지속적인된 CD4+ 와 CD8+ T 세포 활성화에 의해 표시 된 대로 증가 식 HLA-DR 및 CD57, 그리고 T 도우미 Th1 표현 형을 기울입니다. 하루 60에서 B 세포의 비율 (그림 5) 환자의 재발을 예측를 극적으로 확장.
그림 1: 대표적인 항 체 적정. (A) 점 플롯 신선한 PBMC에 CD8 식 항 체의 표시 농도와 스테인드 보여줍니다. (B) 테이블 대표 중앙값 및 표준 편차는 CD8의 형광 강도의+, 중간 형광 강도 CD8- 인구, 그리고 테스트 하는 각 농도 대 한 파생된 얼룩 인덱스. (C) 어떻게 표시 하는 그래프를 미분 얼룩 인덱스의 기능으로는 항 체의 최적 농도. (D) CD4 항 체의 대표적인 적정. 패널 D 보인 외. 20172에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 전략 및 부분 모집단 차별의 결과 게이팅 대표. (A) 더블 릿 제외, 라이브 셀 차별 및 림프 톨, monocytes의 게이팅 크기 기반의 도식 적인 표현입니다. (B) 두 형광 색소 방식으로 식별 하는 림프 구 부분 모집단. (C) Monocytes 두 형광 색소 접근 방식을 식별합니다. 그림은 보인 외. 20172에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 대표적인 결과 얻은 부적 절 한 샘플 분리 및 잘못 된 항 체 적정에서. (A) 잘못 된 적정 CD4 사이 빈약한 해상도 CD4 항 체 결과의+ 와 CD8+ 인구. (B) 가난한 CD56 적정 B 세포에서 NK의 나쁜 분리를 이어질 수 있습니다. (C) 모집단 차별에 RBC 불완전 한 세포의 효과. B 세포와 NK 세포의 정확한 구분을 확인 하려면 다른 마커의 사용의 (D) 예: B 세포는 HLA-DR 및 CCR6 이중 긍정, NK 세포는 이중 부정. 패널 D 보인 외. 20172에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 다중 골 수 종 환자에서 샘플을 분석 하는 전략을 게이팅. (A) 림프 톨 그들의 FSC-A에 근거 하 여 문이 했다와 SSC-지역 및 그들의 흐름 cytometric 프로 파일 2-형광 색소 면역 세포 얼룩과 표시 됩니다. (B) NK 분리 및 B 세포 CD8 식별 하 CCR6 및 HLA-박사 (C) 게이팅 전략을 사용 하 여+ 메모리 및 naïve T 세포. (D) 식의 HLA-DR 및 CD57 CD8에+ 순진한 및 메모리 T 세포. (E) CD4 식별 전략 게이팅+ 메모리 및 naïve T 세포. CD4 (F) HLA-DR 및 CD57 식+ 순진한 및 메모리 T 세포. (G) 식별 Th9 CD4+ T (H) 식별의 Thelper CD4+ T 세포 (나) 모집단 CD16 및 CD57 식 NK 세포에 세포. 그림에서 보인 외. 20172적응 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 다중 골 수 종 환자에서 세포 인구의 역학. (A) 동적 PBMC 절연 및 줄기 세포 이식 (SCT) 후 지정 된 날에 cryopreserved에 있는 주요 림프 구 인구의. 시간이 지남에 CD8 모집단의 (B) 특성 시간이 지나면서 CD4 모집단의 (C) 특성화 (D) NK 하위 집합의 분석. 데이터는 GraphPad Prism으로 구성 되어 있다. 그림에서 보인 외. 20172적응 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 대상 | 클론 | 형광 색소 | 공급 업체 | 농도 | 목적 |
| CD3 | UCHT1 | BV421 | BD | 1/20 | 계보 |
| CD56 | NCAM16.2 | BV421 | BD | 1/900 | |
| TCRΓΔ | B1 | BV421 | 바이오 | 1/30 | |
| CD4 | RPA T4 | PE | BD | 1/450 | |
| CD8 | RPA T8 | PE | BD | 1/20 | |
| CD14 | M5E2 | PE | BD | 1/15 | |
| CD19 | HIB19 | PE | BD | 1/300 | |
| 죽은 세포 | L/D 블루 | LT | 1/300 | 라이브/죽은 차별 | |
| BD BD Biosciences, 바이오 = BioLegend, LT = = 생활 기술 | |||||
표 1: 항 체 패널 PBMC (BV421-PE 조합)의 2-형광 색소 면역 세포 얼룩 사용.
| 대상 | 클론 | 형광 색소 | 공급 업체 | 농도 | 목적 |
| CD3 | UCHT1 | APC | BD | 1/20 | 계보 |
| CD56 | NCAM16.2 | APC | BD | 1/60 | |
| TCRΓΔ | B1 | APC | 바이오 | 1/30 | |
| CD4 | RPA T4 | PE | BD | 1/450 | |
| CD8 | RPA T8 | PE | BD | 1/20 | |
| CD14 | M5E2 | PE | BD | 1/15 | |
| CD19 | HIB19 | PE | BD | 1/300 | |
| 죽은 세포 | L/D 블루 | LT | 1/300 | 라이브/죽은 차별 | |
| BD BD Biosciences, 바이오 = BioLegend, LT = = 생활 기술 | |||||
표 2: 항 체 패널 2-형광 색소 면역 세포 얼룩 PBMC (APC PE 조합)의 사용.
| 대상 | 클론 | 형광 색소 | 카탈로그 | 공급 업체 | 농도 | 목적 |
| CD3 | UCHT1 | BV421 | 562426 | BD | 1/20 | 계보 |
| CD56 | NCAM16.2 | BV421 | 562751 | BD | 1/900 | |
| TCRΓΔ | B1 | BV421 | 331217 | 바이오 | 1/30 | |
| CD4 | RPA T4 | PE | 555347 | BD | 1/450 | |
| CD8 | RPA T8 | PE | 555367 | BD | 1/20 | |
| CD14 | M5E2 | PE | 555398 | BD | 1/15 | |
| CD19 | HIB19 | PE | 555413 | BD | 1/300 | |
| CCR7 | G043H7 | AF647 | 353217 | 바이오 | 1/30 | 차별화 |
| CD45RA | HI100 | APC H7 | 560674 | BD | 1/60 | |
| CCR4 | 1G 1 | PE-Cy7 | 561034 | BD | 1/60 | 번째 하위 집합 |
| CCR6 | G034-E3 | BV605 | 353419 | 바이오 | 1/30 | |
| CXCR3 | 1 C 6/CXCR3 | AF488 | 561730 | BD | 1/30 | |
| CD57 | NK-1 | PE-CF594 | 562488 | BD | 1/900 | 활성화/피로 |
| HLA-DR | G46-6 | BV510 | 563083 | BD | 1/30 | |
| CD16 | 3G 8 | BUV395 | 563784 | BD | 1/30 | NK, Monocyte 활성화 |
| 죽은 세포 | L/D 블루 | L-23105 | LT | 1/300 | 라이브/죽은 차별 | |
| BD BD Biosciences, 바이오 = BioLegend, LT = = 생활 기술 | ||||||
표 3: 항 체 패널 얼룩 사용 다중 골 수 종 환자에서 PBMC를 동결.
| 대상 | 클론 | 형광 색소 | 공급 업체 | 농도 | 목적 |
| CD3 | UCHT1 | BV421 | BD | 1/80 | 계보 |
| CD56 | NCAM16.2 | BV421 | BD | 1/400 | |
| TCRΓΔ | B1 | BV421 | 바이오 | 1/200 | |
| CD4 | RPA T4 | PE | BD | 1/1200 | |
| CD8 | RPA T8 | PE | BD | 1/100 | |
| CD14 | M5E2 | PE | BD | 1/80 | |
| CD19 | HIB19 | PE | BD | 1/300 | |
| 죽은 세포 | L/D 블루 | LT | 1/300 | 라이브/죽은 차별 | |
| BD BD Biosciences, 바이오 = BioLegend, LT = = 생활 기술 | |||||
표 4: 항 체 패널 전체 혈액 (BV421-PE 조합)의 2-형광 색소 면역 세포 얼룩에 사용 합니다.
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Discussion
여기에 제시 된 프로토콜 매우 유연 하 고 변화 버퍼, 온도 및 셀 표면에 혈통 마커의 높은 표현으로 인해 주변 혈액 세포 준비 얼룩에 구분 표시 되었습니다. 높은-품질, 재현할 수 데이터를 얻기 위해 가장 중요 한 단계는 항 체 적정. 주의 때문에 항 체의 적정 흐름 cytometric 패널의 설치 하는 동안 항상 수행 해야이 단계 추가 하지 않습니다 여분 벤치 타임 우리의 2-형광 색소 접근. 안티-CD3의 적정-CD8,-CD14-CD19, TCR-γ는 최적으로 긍정적이 고 부정적인 봉우리를 별도의 항 체의 농도 최대 인덱스13,14얼룩에 의해 파생 된 표준 절차를 따릅니다. 피크 또는 얼룩 인덱스 곡선의 상승에 피크에 가까이에 희석 되어야 합니다 (그림 1A-C)을 선택. 다른 한편으로, 안티-c d 4와 안티 CD56 항 체의 ad hoc 적정 수행 될 필요가 있다. 안티-CD4 항 CD3 단일 긍정적인 인구와 CD3 CD4 긍정적인 인구의 피크를 적정+/CD8+ T 세포, CD8희미 한 인구 (더 차별 CD3 단일 긍정적인 신호 가까이 CD8+ γ T 세포와 NK T 세포). 같은 라인을 따라 위치 NK CD56 CD56 적정 목표+ 는 CD3 사이 세포+ 와 CD3 인구. 자연스럽 게 낮은 표현의 CD56 쉽게이 항 체의 적정 농도 포화 곡선에서 얻은 값에 가까운 사용 하. 높은 양자 수율 형광을 사용 하 여 동일한 검출기에 여러 마커/인구의 최적 분리에 대 한 또 다른 중요 한 요소 이다. APC, BV421와 PE, 성공적인 결과 얻은 우리 하지만 폴리머 염료의 새로운 세대 등 다른 형광 비교 결과 제공 한다. 보상으로 인해 유물의 가능성을 줄이려면, 그것도 거의 형광의 쌍 선택 하는 것이 중요 PE, APC, 또는 PE 및 BV421 같은 스펙트럼 오버랩. 사실상 보상으로 형광의 쌍을 선택 하는 것이 다른 형광 색소 검출기에 형광 색소의 높은 파급으로 인해 데이터의 확산을 줄이기 위해 중요 합니다. 감소를 확산 신호 왜곡을 최소화 하 여 면역 부분 모집단을 게이팅 용이 및 보상 컨트롤의 필요 없이 두 개의 형광을 제한 하는 경우이 방법을 사용 하 여 수 있습니다.
우리가 제안 하는 마커의 조합 조사 요구 사항에 따라 고도로 사용자 정의 이다. 사실, 일부는 마커의 제외할 수 있습니다 분석에서 관심의 인구를 참조 하지 않도록 하는 경우. 예를 들어 안티 CD19 항 체, B 세포를 제외 하는 CD8에만 초점을 안티 CD4 항 체를 제거 하는+ T 세포. 노트, 안티-CD8 항 체는 CD8 식별 하는 중요 한+ NK 세포와 γ T 세포, 따라서 패널에서 제거 하지 합니다. 희귀 세포 인구의 분리, 개선 하기 위해 다른 형광/탐지기 2-형광 색소 얼룩의 표식 중 일부에 대 한 사용할 수 있습니다. 예를 들어, CD56 2 형광 색소 패널 불가능 되는 NKT 세포를 감지 하는 다른 검출기로 이동할 수 있습니다. 패널에서 마커의 수를 줄일 수 있지만 주의 추가, 변경 또는 마커를 스위칭에 발휘 한다.
제공에 필요한 계측, 항 체 및 기술 세트 표준 형광 색소 한 표식 방법은 여전히 여러 면역 인구를 식별 하 고 희귀 한 부분 모집단, NKT 또는 γ T 세포 등을 차별 하는 가장 정확한 방법입니다. 그러나,이 방법의 주요 목표는 기존의 방식에 대 한 대체 아니라 오히려 복잡성을 줄이면서 탐지기의 낮은 수를 가진 악기 또는 세포의 제한 된 숫자와 함께 작업할 때 깊은 immunophenotyping 달성 그리고 실험 시스템 설정에서 비용. 우리는 다중 골 수 종, 전신 경화 증, dermatomyositis와 얼룩 이렇게 여러 인구와의 동시 심문을 향상 시킬 수 있는 보여주는 Lyme 질병 환자에서 임상 샘플의 광범위 한 심사 했 셀의 수입니다. 우리의 결과 지금까지 나타났습니다이 절차는 만성 면역 활성화 또는 전염 성 질병에 민감 하지만 예비 테스트 다른 질병 상태에서이 프로토콜의 정확도 평가 하기 위해 실시 한다.
이 프로토콜의 잠재력 강화를 미래 방향 임상 견본에서 기본 조직에 침투 한 세포의 특성 연구를 포함 합니다. 이것은이 접근의 제한 된 자료와 표본 분석에 대 한 귀중 한 정보를 제공할 수 있는 종양 및 자가 면역 질환 면역학 관련. 우리는 cytokine 식 감지 하 잠재력을 확장 하는 permeabilized 세포에이 패널 테스트를 계획 하 고 신호 분자 같은 임상 견본에. 마지막으로, 그것은 유사한 접근, 기록 가능한 감 적의 수를 확대 하기 위한 또한 표시의 다른 세트를 사용 하 여 개발 될 수 있습니다 및 개발된 fordifferent 동물 모델에는 영향을 수도 있습니다 주목 되어야 한다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 연구는 국립 연구소의 관절염과 Musculoskeletal와 피부 질환에 의해 지원 되었다 < https://www.niams.nih.gov/>, 보너스 번호 P30-AR053503; 스 테 블러 재단, www.stablerfoundation.org; 국립 연구소의 알레르기와 전염병, www.niaid.nih.gov, T32AI007247; 니 나 아일랜드 프로그램 폐 건강 (NIPLH)에 대 한 https://pulmonary.ucsf.edu/ireland/.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD3 | BD Biosciences | 562426 | Antibody for staining RRID: AB_11152082 |
| CD56 | BD Biosciences | 562751 | Antibody for staining RRID: AB_2732054 |
| TCRgd | BD Biosciences | 331217 | Antibody for staining RRID: AB_2562316 |
| CD4 | BD Biosciences | 555347 | Antibody for staining RRID: AB_395752 |
| CD8 | BD Biosciences | 555367 | Antibody for staining RRID: AB_395770 |
| CD14 | BD Biosciences | 555398 | Antibody for staining RRID: AB_395799 |
| CD19 | BD Biosciences | 555413 | Antibody for staining RRID: AB_395813 |
| CD3 | BD Biosciences | 555335 | Antibody for staining RRID: AB_398591 |
| CD56 | BD Biosciences | 555518 | Antibody for staining RRID: AB_398601 |
| TCRgd | BD Biosciences | 331211 | Antibody for staining RRID: AB_1089215 |
| CCR7 | Biolegend | 353217 | Antibody for staining RRID: AB_10913812 |
| CD45RA | BD Biosciences | 560674 | Antibody for staining RRID: AB_1727497 |
| CCR4 | BD Biosciences | 561034 | Antibody for staining RRID: AB_10563066 |
| CCR6 | BD Biosciences | 353419 | Antibody for staining RRID: AB_11124539 |
| CXCR3 | BD Biosciences | 561730 | Antibody for staining RRID: AB_10894207 |
| CD57 | BD Biosciences | 562488 | Antibody for staining RRID: AB_2737625 |
| HLA-DR | BD Biosciences | 563083 | Antibody for staining RRID: AB_2737994 |
| CD16 | BD Biosciences | 563784 | Antibody for staining RRID: AB_2744293 |
| Dead cells | Life technologies | L-23105 | Live/dead discrimination |
| Falcon 5 mL round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap | BD Bioscience | 352235 | to filter cell suspension before passing though the flow cytometer |
| Falcon 5 mL round-bottom polystyrene test tube | BD Bioscience | 352001 | to stain whole blood |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Thermo fisher | 12648010 | Freezing cells |
| 96-well V-bottom plate | Thermo fisher | 249570 | plate for staining |
| FACSAria IIu Cell Sorter | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| FCS Express 6 | De Novo Software | FACS analysis | |
| Graphpad Prism | GraphPad software | Data analysis |
References
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