Summary
Mutagenèse dirigée est une technique utilisée pour introduire des mutations spécifiques dans l’acide désoxyribonucléique (ADN). Ce protocole décrit comment faire mutagénèse dirigée avec un 2-step et approche, qui s’applique à n’importe quel fragment d’ADN d’intérêt basée sur les 3 étapes amplification génique (PCR).
Abstract
Mutagenèse dirigée est une technique utilisée pour introduire des mutations spécifiques dans l’ADN d’étudier l’interaction entre les petites molécules d’acide ribonucléique (sRNA) non codantes et cibles ARN de messager (ARNm). En outre, mutagénèse dirigée est utilisé pour mapper des sites de liaison protéine spécifique à l’ARN. Une introduction de PCR basé étapes 2 et 3 étapes de mutations est décrite. L’approche est pertinente aux études sur les interactions ARN-ARN et protéine-ARN. En bref, la technique s’appuie sur la conception des amorces avec le mutation(s) désiré et 2 ou 3 étapes de la PCR synthétiser un produit PCR avec la mutation. Le produit PCR est ensuite utilisé pour le clonage. Nous décrivons ici comment effectuer la mutagenèse dirigée, avec les deux celle de 2 et 3 pas à introduire des mutations la sRNA, AMC et l’ARNm, Cdgs, d’enquêter sur les ARN-ARN et interactions ARN-protéine. Nous appliquons cette technique pour étudier les interactions de RNA ; Cependant, cette technique est applicable à toutes les études de mutagenèse (interactions ADN-protéines, acides aminés remplacement/suppression/ajout). Il est possible d’introduire n’importe quel genre de mutation à l’exception des bases non naturelle, mais la technique n’est applicable que si un produit PCR peut être utilisé pour une application en aval (par exemple, le clonage et le modèle pour plus de PCR).
Introduction
ADN est souvent appelée le plan d’action d’une cellule vivante puisque toutes les structures de la cellule sont encodés dans la séquence de son ADN. La réplication exacte et les mécanismes de réparation de l’ADN s’assurer que seules de très faibles taux de mutations se produisent, qui est essentiel pour maintenir les fonctions correctes des gènes codés. Modifications de la séquence d’ADN peuvent affecter les fonctions successives à différents niveaux de départ avec l’ADN (reconnaissance de facteurs de transcription et les enzymes de restriction), puis RNA (complémentarité des paires de bases et des altérations de la structure secondaire) ou autres protéines (amino substitutions de l’acides, destructions, additions ou cadre-déplacements). Nombreuses mutations n’affectent pas la fonction du gène considérablement, certaines mutations dans l’ADN peuvent avoir des conséquences considérables. Ainsi, la mutagenèse dirigée est un outil précieux pour l’étude de l’importance des sites spécifiques de l’ADN à tous les niveaux.
Ce protocole décrit une approche de mutagenèse ciblée utilisée pour introduire des mutations spécifiques. Le protocole s’appuie sur deux stratégies différentes de PCR : un 2-step ou un PCR de 3 étapes. La PCR 2 étapes s’applique si la mutation souhaitée se trouve à proximité de l’extrémité 5' ou de l’extrémité 3' de l’ADN d’intérêt (< 200 paires de bases (bp) de la fin) et la PCR 3 étapes s’applique dans tous les cas.
Dans l’approche PCR étapes 2, 3 amorces sont conçus, dans lequel une série d’amorces est conçue pour amplifier l’ADN d’intérêt (amorces 1 et 3, avance et retour, respectivement), et une amorce unique est conçue pour incorporer la mutation. La mutation introduction d’apprêt (primer 2) devrait avoir une orientation inverse, si la mutation se trouve à proximité de l’extrémité 5' et une orientation vers l’avant si la mutation se trouve à proximité de l’extrémité 3'. Dans la première étape de la PCR, primer 1 + 2 ou 2 + 3 amplifie un petit fragment à proximité de l’extrémité 5' ou 3' fin, respectivement. Le produit PCR qui en résulte sert ensuite comme une amorce dans la deuxième étape avec l’apprêt 1 ou 3, résultant ainsi en un produit PCR avec une mutation de l’ADN d’intérêt (Figure 1 a).
Pour l’ACP de 3 marches, 4 amorces sont conçus, dont une série d’amorces est conçue pour amplifier l’ADN d’intérêt (amorces 1 et 4, avant et arrière, respectivement) et une série d’amorces est conçue pour incorporer des mutations spécifiques qui se chevauchent de complémentarité (amorces 2 et 3, marche arrière et avant, respectivement). À l’étape un et deux, amorces 1 + 2 et 3 + 4 amplifient l’extrémité 5' et 3'. Dans la troisième étape, les produits PCR obtenus de l’étape 1 et deux sont utilisés comme modèles et amplifié avec des amorces 1 + 4. Ainsi, le produit PCR qui en résulte est l’ADN d’intérêt avec la mutation désirée (Figure 1 b).
Alors que l’ADN muté peut être utilisé pour n’importe quelle application en aval, ce protocole décrit comment re-combiner l’ADN dans un vecteur de clonage. L’utilisation de vecteurs de clonage présente plusieurs avantages comme la facilité du clonage et des applications expérimentales spécifiques selon les caractéristiques du vecteur. Cette fonctionnalité est souvent utilisée pour les études d’interactions RNA. Une autre technique pour les études d’interactions RNA est sonder structurelle de l’ARN en complexe avec un autre ARN1,2 ou protéine3,4. Cependant, sondant structurelle est uniquement effectuée in vitro tandis que mutagénèse dirigée et le clonage à des fins ultérieures permettent pour les études d’interactions in vivo.
Mutagenèse dirigée a été largement utilisé pour les études d’interactions RNA tel que présenté ici. Toutefois, la principale méthode PCR sur 2 ou 3 pas s’applique à n’importe quel fragment d’ADN et donc pas seulement limité à études d’interaction de l’ARN.
Pour illustrer la technique et ses utilisations possibles, caractérisation des régions importantes pour la régulation post-transcriptionnelle de l’ARNm, Cdgs, d' Escherichia coli (e. coli) est utilisée. Dans e. coli, Cdgs sont ciblés par le petits ARN non codants, McaS, en coopération avec une protéine, la Hfq, de réprimer l’expression de la protéine de Cdgs2,4,5. La technique est utilisée pour introduire des mutations dans la région d’appariement entre Cdgs et McaS et sur le site de liaison de Hfq de csgD. L’ADN obtenu est ensuite cloné dans un vecteur approprié pour les expériences ultérieures. Applications en aval de la technique comprennent des expériences in vivo et in vitro. À titre d’illustration, exemple 1 est caractérisée in vivo utilisant une analyse par transfert western et exemple 2 se caractérise in vitro en utilisant une analyse de décalage de mobilité électrophorétique (EMSA). Dans les deux cas, il est illustré de mutagénèse comment dirigée peut être utilisé en combinaison avec d’autres techniques de tirer des conclusions biologiques sur un gène d’intérêt.
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Protocol
1. sélection de vector
- Choisir un vecteur pour effectuer des expériences en aval avec. Tout vecteur est applicable pour cette méthode PCR-étapes 2 et 3.
- Basé sur le choix du vecteur, choisissez des enzymes de restriction appropriées pour le clonage.
2. amorces pour site de mutagénèse dirigée
- Choisir entre la stratégie PCR étape 2 ou 3 étapes (2-step est seulement pour les mutations < 200 bp des deux extrémités de l’ADN d’intérêt). Pour l’ACP 2-étape, passez à l’étape 2.2 et pour le PCR de 3 étapes, passez à l’étape 2.3.
- Conception amorces pour la PCR 2-step.
- Plan d’apprêt 1 et 3 pour amplifier l’ADN d’intérêt et avec un 5' surplombent qui comporte 4 nucléotides (p. ex., ATAT ou AGTC) suivis par le site de reconnaissance de restriction pertinente nécessaire pour cloner dans le vecteur choisi.
- Conception de primer 2 pour introduire mutation(s) dans l’ou les lieux désiré et flanquent la mutation avec 10-15 nucléotides complémentaires des deux côtés. Rendre l’amorce inverse si la mutation est introduite à l’extrémité 5' ou avant si la mutation est introduite à l’extrémité 3'.
- Conception amorces pour la PCR de 3 étapes.
- Plan d’apprêt 1 et 4 pour amplifier l’ADN d’intérêt et avec un 5' surplombent qui comporte 4 nucléotides (p. ex., ATAT ou AGTC) suivis par le site de reconnaissance de restriction pertinente nécessaire pour cloner dans le vecteur choisi.
- Concevoir l’apprêt 2 et 3 d’introduire mutation(s) aux installations désirées et la mutation de flanc de 10-15 nucléotides complémentaires des deux côtés. Apprêt 2 et 3 sont inverser complémentaires.
3. amplification de type sauvage ADN pour le clonage par PCR
Remarque : Pour plus de détails sur la PCR, voir6.
- Effectuer PCR6 en utilisant des amorces 1 + 2 (2-step PCR) ou 1 + 4 (3 étapes PCR) et ADN de type sauvage en tant que modèle pour obtenir PCR produit I. utilisation du programme PCR dans le tableau 1.
- Valider les PCR par électrophorèse sur gel d’agarose.
- Faire un gel d’agarose gel solution (2 %) en ajoutant 2 g d’agarose par 100 mL de 1 x Tris-acétate-tétraacétique acide (EDTA) (TAE) tampon. Dissoudre l’agarose en les faisant bouillir dans un four à micro-ondes. Ajouter le bromure d’éthidium coloration à l’ADN (à une concentration finale de ~ 0,5 µg/mL) solution pour la visualisation de gel de l’agarose.
- Monter le gel d’agarose, placez celle-ci dans un appareil d’électrophorèse et charger des échantillons PCR (mélangés avec de la teinture de chargement de l’ADN) et une échelle d’ADN de taille connue. Exécuter les échantillons à 75 W pendant 45 min ou jusqu'à ce que les bandes sont séparées de façon adéquate et visualiser les bandes au tableau des ultraviolets (UV) ou avec un gel, système d’imagerie.
- Purifier le produit PCR avec un kit d’extraction de gel (Table des matières) et mesurer la concentration d’ADN purifié avec un spectrophotomètre (Table des matières).
- Stocker l’ADN purifié à-20 ° C (dans un tampon Tris-EDTA (TE) – stockage de longue durée) ou à 4 ° C (en dH2O – stockage à court terme) jusqu'à l’étape utilisé dans 5.
4. la PCR d’introduire dirigée des mutations de l’ADN
- PCR PCR 2-step (voir l’étape 4.2 pour PCR 3 étapes)
- Effectuer des PCR6 en utilisant des amorces 1 + 2 si les mutations sont à l’extrémité 5' ou 2 + 3 si les mutations sont dans les 3' mettre fin et utiliser l’ADN de type sauvage comme modèle pour obtenir le produit de PCR II (voir tableau 1 pour programme PCR).
- Valider les PCR par électrophorèse sur gel d’agarose comme au point 3.2.1 et 3.2.2.
- Purifier le produit PCR avec un kit d’extraction de gel (Table des matières) et mesurer la concentration d’ADN purifié avec un spectrophotomètre (Table des matières).
- Magasin purifiée ADN à-20 ° C (dans un tampon TE) ou à 4 ° C (en dH2O) jusqu'à l’étape utilisé dans 5.
- Effectuer des PCR6 à l’aide de produit de PCR II comme l’amorce avec apprêt 3 si les mutations sont à l’extrémité 5' ou d’apprêt 1 si les mutations sont à l’extrémité 3' et utilisent l’ADN de type sauvage en tant que modèle pour obtenir le produit de PCR III (voir tableau 1 pour programme PCR).
- Valider les PCR par électrophorèse sur gel d’agarose comme au point 3.2.1 et 3.2.2.
- Purifier le produit de PCR avec un kit d’extraction de gel (Table des matières) et mesurer la concentration d’ADN purifié avec un spectrophotomètre (Table des matières).
- Magasin purifiée à l’ADN à-20 ° C (dans un tampon TE) ou à 4 ° C (en dH2O) jusqu'à l’étape 5.
- PCR PCR 3 étapes
- Effectuer PCR6 en utilisant des amorces 1 + 2 et 3 + 4 dans les réactions distinctes et ADN de type sauvage en tant que modèle pour obtenir le produit PCR II et III (voir le tableau 1 pour programme PCR).
- Valider les PCR par électrophorèse sur gel d’agarose comme au point 3.2.1 et 3.2.2.
- Purifier les produits PCR avec un kit d’extraction de gel (Table des matières) et mesurer la concentration d’ADN purifié avec un spectrophotomètre (Table des matières).
- Magasin purifiée à l’ADN à-20 ° C (dans un tampon TE) ou à 4 ° C (en dH2O).
- Effectuer des PCR6 en utilisant des amorces 1 + 4 et 2-5 ng de ces deux produits PCR, II et III comme le modèle (dans la même réaction) pour obtenir IV de produit PCR (voir le tableau 1 pour programme PCR).
- Valider les PCR par électrophorèse sur gel d’agarose comme au point 3.2.1 et 3.2.2.
Remarque : Il n’est pas rare d’obtenir plusieurs bandes incorrectes (peut parfois être réduite en utilisant moins de modèle). Toutefois, les produits PCR incorrectes peuvent être ignorées si la bande taille correctement est excisée et extraites à l’aide de gel. - Si elle est correcte, purifier le produit de PCR avec un kit d’extraction de gel (Table des matières) et mesurer la concentration d’ADN purifié avec un spectrophotomètre (Table des matières).
- Magasin purifiée à l’ADN à-20 ° C (dans un tampon TE) ou à 4 ° C (en dH2O) jusqu'à l’étape 5.
5. recombinaison de type sauvage et versions mutantes d’ADN dans le vecteur choisi
Remarque : Pour plus de détails sur la suite des étapes, voir7.
- Digest purifié des produits PCR I et III (à partir de 2 étapes PCR) ou IV (à partir de 3 étapes PCR) en utilisant les enzymes de restriction pertinentes.
- Dans 20 µL de 1 x tampon de digestion avec 1 µL de chaque enzyme de restriction, digest 200 ng du produit PCR à 37 ° C pendant 30-60 min.
- Purifier le produit de PCR digéré par gel-extraction en utilisant un gel extraction kit (Table des matières), mesurer la concentration d’ADN de l’ADN purifié avec un spectrophotomètre (Table des matières) et stocker à-20 ° C (dans un tampon TE) ou à 4 ° C (en dH2 O) jusqu'à ce qu’utilisé pour point 5.6.
- Digérer purifiée vector avec les enzymes de restriction et traiter à la phosphatase alcaline pour diminuer les événements re-ligature vecteur. Ne pas traiter les produits PCR à la phosphatase alcaline.
- Dans 30 µL de 1 x tampon de digestion avec 1 µL de chaque enzyme de restriction et de 1 µL de la phosphatase alcaline, digest 1 000 ng du vecteur à 37 ° C pendant 30-60 min.
- Séparé vecteur digérée de l’ADN des déchets (p. ex., vecteur non circonci et découpe ADN) à l’aide de gel d’agarose comme au point 3.2.1 et 3.2.2.
- Purifier le vecteur digérée par gel-extraction en utilisant un gel extraction kit (Table des matières), mesurer la concentration d’ADN de l’ADN purifié avec un spectrophotomètre (Table des matières) et stocker à-20 ° C (dans un tampon TE) ou à 4 ° C (en dH2O) jusqu'à pour point 5.6.
- Ligaturer les produits de PCR digérés dans vecteur digérée avec les réactions indiquées au tableau 2.
- Incuber à température ambiante pendant 2 h ou toute une nuit à 16 ° C.
- Transformer une souche réceptrice (p. ex. e. coli K12) avec des réactions de ligature.
- Cultiver la souche à OD600= 0,3-0,5 et transfert 1 mL d’une culture aux tubes de 1,5 mL autant comme des réactions de la ligase.
- Tournant à 3 500 g pendant 5 min et jeter le surnageant.
- Remettre en suspension les cellules dans 200 μl de tampon de transformation (10 mL de bouillon de lysogénie (LB) avec 0,1 g/mL polyéthylène glycol 3350, 5 % diméthyle sulfate et 20 mM MgCl2).
- Ajoutez la réaction de ligature et placer les tubes sur la glace pendant 30 min.
- Choc thermique pendant 2 min à 42 ° C.
- Ajouter 1 mL de la LB dans les tubes de 1,5 mL et permettre l’expression du phénotype de résistance aux antibiotique pendant au moins 45 min à 37 ° C.
- Faire tourner les cellules à 3 500 g pendant 5 min, jeter 1 mL du surnageant et remettre en suspension les cellules dans le surnageant restant.
- Plaque des cellules sur des plaques avec des antibiotiques appropriés et incuber une nuit à 37 ° C.
- Identifier les transformants hébergeant des vecteurs avec l’intégration réussie de l’insert d’ADN (par exemple, par PCR avec des amorces spécifiques à vecteur et insert).
- Valider la séquence d’ADN par sanger séquençage.
Attention : Ne pas utiliser les mêmes amorces pour le séquençage comme pour l’étape 5,9.
6. à l’aide de vecteurs construits pour des expériences in vitro ou in vivo
- Expérience in vivo
NOTE : Ceci est un exemple d’utilisation d’un vecteur d’exprimer le type sauvage/muté ARN pour caractériser post-transcriptionnelle. Pour plus de détails sur éponger occidental, voir8.- Cultiver des souches d’e. coli K12 avec vecteurs construits dans un milieu approprié et induire l’expression si nécessaire. Récolter des échantillons par centrifugation.
- Préparer les échantillons d’électrophorèse sodium dodecyl sulfate polyacrylamide (SDS-PAGE) en dissolvant les granules cellulaires dans 1 x tampon échantillon SDS (pH de 62,5 mM Tris-HCl 6,8, 2,5 % SDS, bleu de bromophénol 0,002 %, 5 % de β-mercaptoéthanol, 10 % de glycérol) et faire bouillir à 95 ° C pendant 5 min.
Remarque : Il est possible de monter un gel ou d’utiliser un gel préfabriqué disponible dans le commerce. Ce dernier a été utilisé dans les résultats présentés dans la Figure 3 (Table des matières). - Charge 107 cellules de chaque échantillon dans les puits séparés (inclure une échelle de protéine) et exécutez le gel à 200 V jusqu'à ce que les protéines sont séparées (environ 45 min).
- Épongez les protéines sur une membrane de cellulose par transfert semi-sec à 80 mA pendant 1 h.
- Bloquer la membrane avec un mélange de protéines (par exemple, 5 % lait en poudre dissout dans 1 x Tween 20-Tris-buffered saline (TTBS) tampon).
- Ajoutez l’anticorps primaire (dissoute dans 1 x TTBS tampon) qui ciblent la protéine d’intérêt (p. ex., GFP, drapeau ou protéine HIS-tag) et incuber pendant 1 heure avec agitation douce.
- Laver membrane dans 1 x TTBS pendant 10 min pour éliminer les anticorps non fixés. Répéter deux fois plus.
- Ajoutez l’anticorps secondaire (dissoute dans 1 x TTBS tampon) qui cible les anticorps primaires et permettre une détection (p. ex., la peroxydase de raifort (HRP)-conjugués anticorps secondaires. Incuber pendant 1 heure avec agitation douce.
- Laver la membrane dans 1 x TTBS pendant 10 min pour éliminer les anticorps non fixés. Répéter deux fois plus.
- Visualiser la membrane avec une technique compatible avec l’anticorps secondaires (par exemple l’imagerie après incubation avec une dérivé de luminol chimiluminescence, si un anticorps secondaire conjugué HRP a été utilisé).
- Expérience in vitro
NOTE : Ceci est un exemple d’utilisation le vecteur comme modèle pour la transcription in vitro de l’ARN pour caractériser les interactions ARN-protéine. Pour plus de détails sur l’AESM, voir9.- Faire la transcription in vitro utilisant un T7 dans le kit de transcription in vitro (Table des matières) et les vecteurs de l’étape 5 en tant que modèles.
- Séparer des ARN transcrits de PAGE sur une 7 M 4,5 % d’urée dénaturation gel et extrayez RNA directement depuis le gel par élution electro avec tubes de dialyse (Table des matières).
- Étiqueter les RNA (p. ex. radiomarquage avec γ -32P-ATP à l’aide de T4-polynucléotide kinase (Table des matières) et purifier à nouveau avec des colonnes (Table des matières).
Attention : Avant de travailler avec des matières radioactives, consulter le responsable de la radioprotection local. - Mélanger ARN marqué avec augmentation des concentrations de protéines dans les réactions distinctes en un 1 x tampon de liaison (20 mM Tris, pH 8, 100 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM le dithiothréitol (DTT)).
Remarque : dans les résultats présentés (Figure 4), 2 nM de radiomarquées Cdgs ARNm a été mélangé avec une pente de protéine de Hfq 0 à 2 µM (concentration de monomère). - Aux protéines et ARN pour hybrider avant de charger l’hybridation mix sur un gel de polyacrylamide non dénaturant et exécutez le gel pendant 1,5 h à 200 V.
- Visualiser le gel avec une technique compatible avec le marquage de l’étape 6.1.3. (par exemple phosphoimaging si radiomarquage a été appliqué).
- Quantifier l’intensité relative des bandes décalées avec un programme de traitement de l’imagerie et ajuster une courbe (sigmoïde) aux données à l’aide d’un graphique et le logiciel d’analyse de données (Table des matières). D’après la courbe ajustée, dissociation constante (Kd) valeurs peuvent être déterminées automatiquement avec le logiciel.
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Representative Results
Pour étudier les interactions de RNA concernant la régulation post-transcriptionnelle des Cdgs, une configuration de double vecteur a été choisie : d’exprimer la Cdgs ARNm et l’autre pour exprimer le petits ARN non codants, McaS. Cdgs a été clonée dans pBAD33, qui est un plasmide de milieu-copie inductible arabinose avec résistance de chloramphénicol et McaS a été clonée dans mini R1 pNDM220, qui est un plasmide inductible de faibles copies d’isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) avec résistance à l’ampicilline. Type sauvage Cdgs était PCR amplifié à l’aide des amorces 1 a et 4 a (4 a inclut une drapeau-séquence) pour donner IA de produit PCR, alors que wild type McaS était PCR amplifié à l’aide des amorces 1 b et 4 b produit PCR de l’IB. La stratégie PCR 3 étapes a été utilisée pour introduire des remplacements dans la région d’appariement prédite de Cdgs et McaS. Dans les deux premières étapes, des produits PCR IIA et IIIA ont été synthétisés à l’aide des amorces 1 a + 2 a et 3 a, 4 a, respectivement. Dans la troisième étape, produit de PCR IVA a été synthétisé en utilisant des produits PCR IIA et IIIA comme gabarit et 1 a, 4 a comme amorces (Figure 2 a). De même, les mutations complémentaires dirigée ont été introduites dans McaS, utilisant des amorces 1 b, 2 b, 3 b et 4 b pour déboucher sur des produits PCR IIB, III b, dans les deux premières étapes et IVB dans la troisième étape (Figure 2 a). pBAD33 et produits PCR IA et IVA ont été digérés avec BamHI et PstI et le digéré IA et IVA étaient ligué dans pBAD33 digérée. Les constructions qui en résulte sont nommaient pBAD-Cdgsdrapeau et pBAD-Cdgs63-66FLAG (muté au poste 63-66 par rapport au site d’initiation transcriptionnelle). pNDM220 et produits IB et IVB de la PCR ont été digérés avec AatII et BamHI et digérées IB et IVB étaient ligué dans pNDM220 digérée. Les constructions qui en résulte sont nommaient DNP-mcaS et DNP-mcaS42-45 (muté au poste 42 à 45 par rapport au site d’initiation transcriptionnelle).
Pour analyser l’effet des mutations, des souches d’e. coli hébergeant le pBAD-Cdgsdrapeau ou les pBAD-Cdgs63-66FLAG et les pNDM220, DNP-mcaS ou pNDM-McaS42-45 ont été cultivées dans un milieu minimal M9 additionné de 0,2 % de glycérol à OD 450 de 0,4. L’expression des DNP-vecteurs était alors induite pendant 10 min par addition de 1 mM IPTG suivie d’induction 5 min des pBAD-vecteurs par addition d’arabinose de 1 mM. À ce stade, les échantillons ont été récoltés et analyse par western blot a été réalisée avec les échantillons récoltés. Tandis que l’expression de type sauvage McaS empêche la traduction de type sauvage Cdgs, introduction de mutations dans Cdgs ou McaS atténue la répression observée. Toutefois, lorsque les mutations sont complétées dans les Cdgs et McaS répression traductionnelle de Cdgs sont restaurée (Figure 3; modifié par rapport à2). Ainsi, la démarche de mutation dirigée appuie l’hypothèse que McaS et Cdgs -paires de bases dans cette région.
Le vecteur de pBAD33 a été choisi pour l’expérience in vivo et a également été utilisé pour introduire la mutation dirigée pour enquêter sur la liaison Hfq à la Cdgs mRNA in vitro. Dirigée de mutations ont été introduites avec la stratégie PCR 2 étapes pour générer Cdgs mutant ARN avec des structures primaires et/ou secondaires altérés lorsque la transcription de l’acte. Amorces 1 + 2 C, 2D, 2E, 2F ou 2G ont été utilisées pour amplifier et introduire des mutations à l’extrémité 5' de csgD. Les produits PCR obtenus (IIC, IID, IIE, IIF et IIG) ont servi de modèles avec apprêt 3 à amplifier et à introduire des mutations à l' ensemble Cdgs ADN (Figure 2 b). Les produits PCR obtenus (IIIC, IIID, IIIE, IIIF et IIIG) ont été clonés dans pBAD33 comme décrit ci-dessus. La transcription in vitro ont été transcrits par l’ARN-polymérase T7 : tout d’abord, les produits de PCR ont été synthétisés avec amorces 5 a, 5C, 5D, 5E, 5F ou 5 + 6 en utilisant les vecteurs construits en tant que modèle. Les produits PCR obtenus ont servi de modèles pour l’ARN-polymérase T7. In vitro transcrit Cdgs sauvage et mutant ARN ont été purifiées, radioactives et mélangées avec des concentrations croissantes de Hfq purifiée. Les réactions d’hybridation ont été exécutées sur gels non dénaturants et visualisées. L’augmentation de Kd-valeurs des allèles mutants prouve que Hfq lie moins efficacement pour les mutants. Par ailleurs, Hfq a plusieurs sites de fixation sur Cdgs qui est indiqué par les 3 quarts de travail observées pour le type sauvage RNA. Cependant, seulement 2 sites de liaison sont observées pour le mutant différent ARN (Figure 4; modifié par rapport à4). Ainsi, la démarche de mutation dirigée identifie les structures primaires et/ou secondaires de la Cdgs ARNm qui sont importants pour la liaison complète de Hfq.
Pris ensemble, il est possible d’effectuer de mutagenèse dirigée, avec une approche PCR de 2 ou 3 pas en combinaison avec des dosages en aval de tirer des conclusions sur la régulation des gènes au niveau post-transcriptionnel, mais aussi les interactions de protéine-ARN biologiques .
| Étape | Température | Temps |
| Dénaturation initiale | 98° C | 2 min |
| Dénaturation | 98° C | 10 s |
| Recuit | 55° C | 10 s |
| Extension | 72° C | 15 s |
| (30 cycles) | ||
| Extension finale | 72° C | 5 min |
| Maintenez | 4 ° C |
Tableau 1 : Programme PCR
| Réactif | Réaction de contrôle | réaction de 20 fmol | réaction de 100 fmol |
| mémoire tampon ligase 10 x | 2 ΜL | 2 ΜL | 2 ΜL |
| Vecteur ADN digéré | 10 fmol | 10 fmol | 10 fmol |
| Produit de PCR digéré | 0 fmol | 20 fmol | 100 fmol |
| H2O | À 19 µL | À 19 µL | À 19 µL |
| Ligase | 1 ΜL | 1 ΜL | 1 ΜL |
Tableau 2 : Réactions de ligature
| Nom de l’apprêt | Séquence | Utilisé pour les mutations - | ||
| 2-1 a ou 3-1 a | TACCTGACGCTTTTTATCGCAACTCTCTACTGTTTCTCCATCAGAGGATCCGCGC TGTAATCCATTAGT |
2 - et 3-ronde PCR sur Cdgs | ||
| 2-3 a ou 3-4 a | CGCCCTGCAGAAAAAAACCCCGCAGCAGCGGGGTTTTTCTACCAGACGAGAAC | 2 - et 3-ronde PCR sur Cdgs | ||
| 3-2 A | CAGAAGTACTGACAGATGTTGGTGAGCTGTGTGTAGTAATAAATC | 3-ronde PCR sur Cdgs – remplace 4 nt | ||
| 3-3 A | GATTTATTACTACACACAGCTCACCAACATCTGTCAGTACTTCTG | 3-ronde PCR sur Cdgs – remplace 4 nt | ||
| 3-1 B | CGCCTGACGTCGGCAAAAAGAGTGTTGACTTGTGAGCGGATAACAATGATACTTA GATTCACCGGCGCAGAGGAGACAATGCC |
3-ronde PCR sur MCM | ||
| 3-4 B | AATTGGATCCAAAAAAATAGAGTCTGTCGACATC | 3-ronde PCR sur MCM | ||
| 3-2 B | CTCTACAGTACACACAGCTCACCATCCGCGTCTTAAATC | 3-ronde PCR sur MCM – remplace 4 nt | ||
| 3-3 B | GATTTAAGACGCGGATGGTGAGCTGTGTGTACTGTAGAG | 3-ronde PCR sur MCM – remplace 4 nt | ||
| 2-2C | CAGCCCTAAATGGGTCTAATGGATTACATCTG | 2-cycle PCR sur Cdgs – supprime 11 nt | ||
| 2-2D | CAGCCCTAAATGGGTAAAACCCCAAACTAATGGATTACATCTG | 2-cycle PCR sur Cdgs – remplace 4 nt | ||
| 2-2E | CTGTGTGTAGTAATAAATCAGTAAAATATAAAACTAATGGATTACATCTG | 2-cycle PCR sur Cdgs – supprime 11 nt | ||
| 2-2F | GTAATAAATCAGCCCTACTACTAGAACTAATGGATTACATCTG | 2-cycle PCR sur Cdgs – supprime 9 nt et substituts 7 nt | ||
| 2-2G | CTGCTGTGTGTAGTAATCCATCAGCCCTATGACTAAAACTAATGGATTACATCTG | 2-cycle PCR sur Cdgs – supprime 9 nt et substituts 7 nt | ||
| 5 A | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGTTTTATATTTTACCC | T7 PCR | ||
| 5C | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGACCCATTTAGG | T7 PCR | ||
| 5D | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGTTTGGGGTTTTAC | T7 PCR | ||
| 5E | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGTTTTATATTTTACTGATTTATTAC | T7 PCR | ||
| 5F | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGTTCTAGTAGTAG | T7 PCR | ||
| 5G | GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGATGTA ATCCATTAGTTTTAGTCATAGG | T7 PCR | ||
| 6 | GTATGACCATGAATACTATGG | T7 PCR | ||
Tableau 3 : Amorces utilisées pour la mutagénèse dirigée et T7 modèle synthèse
"BOLD" : sites de reconnaissance enzyme de restriction (BamHI, PstI et AatII)
Souligné : les mutations de nucléotides
Figure 1 : stratégie de la PCR pour la mutagénèse dirigée. A) trois amorces sont utilisés dans la méthode PCR de 2 étapes pour introduire dirigée des mutations d’un gène d’intérêt. Amorces 1 et 3 amplifie le gène (produit de PCR j’ai), tandis que l’apprêt 2 introduit des mutations spécifiques (*). 1 + 2 paires d’amorces amplifie un petit fragment aux deux extrémités de l’ADN d’intérêt de synthétiser des produits PCR II (étape 1). Le produit PCR qui en résulte sert ensuite comme une amorce avec apprêt 3 à synthétiser des produits PCR III avec la mutation du site réalisé incorporée (étape 2). B) quatre amorces sont utilisés dans la méthode PCR de 3 étapes pour introduire dirigée des mutations d’un gène d’intérêt. Amorces 1 et 4 amplifie le gène (produit de PCR j’ai), tandis que les amorces 2 et 3 introduit des mutations spécifiques (*). Paires d’amorces 1 + 2 et 3 + 4 sont utilisés dans les deux premières étapes de la PCR pour synthétiser des produits PCR II et III (étape 1 & 2). Dans la troisième étape, produits PCR II et III sont utilisés en tant que modèle avec paire d’amorces 1 + 4 pour synthétiser IV de produit PCR avec la mutation dirigée incorporée (étape 3). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : produits PCR de mutagenèse. PCR ont été effectuées avec les amorces et les modèles tel que décrit dans le texte. Produits PCR ont été exécutés sur un gel d’agarose de 2 % au bromure d’éthidium (~ 0,5 µg/mL) avec 1 µg d’échelle d’ADN mix (Table des matières). Bandes de taille correcte sont marquées d’un carré rouge. A) dans la plupart des réactions de PCR n’est visible qu’une bande de taille correcte. Cependant, la réaction PCR IVB possède deux bandes visibles dont la bande supérieure (juste au-dessus de 300 bp) a la bonne longueur. Comme prévu, la somme de la longueur des produits PCR II et III c égale à la longueur des produits PCR I et IV (produits PCR Cdgs A:, B: McaS PCR, I: type sauvage Cdgs/McaS amplifié à l’aide d’amorces 1 a/B + 4 a/B, II + III : PCR produits intermédiaires amplifié à l’aide des amorces 1 a/B + 2 a/B et 3 a/B + 4 a/B, respectivement, IV : produit de PCR muté amplifié à l’aide d’amorces 1 a/B + 4 a/B avec les produits PCR intermédiaires II et III en tant que modèles). Dans toutes les réactions de PCR n’est visible qu’une bande de taille correcte. Dans ce cas, presque toutes les molécules des produits PCR QU'II ajouté aux réactions de PCR III ont été utilisés pour synthétiser des produits PCR III. Seulement pour PCR IIIE est produit de PCR EII encore visible (IA : produit de PCR type sauvage Cdgs amplifié à l’aide 1 apprêt a + 3 a, IIC-G: produits PCR intermédiaires amplifiés à l’aide d’amorces 1 a + 2 C.-g., IIIC-G: muté PCR produits amplifiés à l’aide 3 a amorce avec des produits PCR IA et SII-G en tant que modèles). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : expérience In vivo avec Cdgs dirigée et mutants de McaS. Analyse par Western blot des souches hébergeant indiqué vecteurs. Souches ont été cultivées à la phase exponentielle et induites pendant 10 min avec 1 mM IPTG (McaS) suivi par induction 5 min avec l’arabinose 1 mM (Cdgs). Α-drapeau anticorps ont été utilisés pour cibler les Cdgs indicateur-étiquetées et α-GroEL anticorps ont été utilisés pour cibler la ménage protéine GroEL (dilué 10 000 et 50 000 fois, respectivement). Souris et le lapin anticorps conjugués HRP servaient d’anticorps secondaires (dilués 2 000 fois). Ce chiffre a été modifié par2. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : In vitro expérience avec dirigée Cdgs mutants. EMSA Cdgs transcrit in vitro sauvage (WT) et ARN mutant (panneau C-G) en ce qui concerne la liaison Hfq. Les allèles Cdgs (em et mutant C-G) ont été radioactif et mixés avec 0, 0,25, 0,5, 1 ou 2 µM monomère Hfq. hybridation des réactions ont été exécutées sur gel de polyacrylamide non dénaturant. L’intensité relative des bandes décalés a été quantifiée et une courbe sigmoïde a été ajustée aux données. Dissociation (Kd) constantes ont été déterminées à l’aide de SigmaPlot. Ce chiffre a été modifié par4. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Mutagenèse dirigée a un large éventail d’applications différentes, et ici, les résultats représentatifs d’un in-vivo et une expérience in vitro ont été inclus comme exemples de la façon de tirer des conclusions biologiques à l’aide de la technique. Mutagenèse dirigée a longtemps été la méthode de référence pour les études d’interactions RNA. La force de la technique réside dans la combinaison de l’introduction de mutations pertinentes avec des dosages en aval et expériences (p. ex., la tache occidentale ou EMSA) pour tirer des conclusions sur des sites spécifiques d’ADN et leur importance dans les fonctions des gènes-produits dans question. Lorsque vous décidez de faire de mutagenèse dirigée, le design des amorces doit être soigneusement planifié à gagner le plus de la technique (par exemple, quels sites à muter) ; n’oubliez pas d’inclure le porte-à-faux correcte et les sites de restriction et les caractéristiques du modèle primer/une attention.
La mutagenèse réel décrit dans le présent protocole s’appuie sur la PCR. La partie la plus cruciale du protocole est donc les conditions pour cela. Il y a plusieurs façons d’optimiser la PCR, y compris les gradients de concentration2 + Mg, la concentration de DMSO et températures de l’étape de recuit. Pour plus de détails, voir3. En plus de l’optimisation de la réaction PCR lui-même, deux choses valent faisant bien sûr quand vous faites mutagenèse dirigée : modèles de haute qualité et soigneusement conçu des amorces.
Avoir un modèle de haute qualité pour l’ACP souvent fait la différence entre un PCR ayant échoué et réussie. S’il est possible d’utiliser un lysat cellulaire pour fournir la matrice d’ADN, purifiée à l’ADN (génomique-, vecteur - ou PCR-ADN) est toujours préférable. En outre, lorsqu’il s’agit de la quantité de modèle, souvent moins est plus ; surtout dans la dernière étape de la PCR de 3 étapes (étape 4.2.5). Par exemple, essayer une série de dilutions de 10 x de modèle de trouver l’optimum si nécessaire.
Conception d’amorce optimale dépend des caractéristiques de l’ADN d’intérêt et de la polymérase. La mesure du possible, essayez toujours de concevoir des amorces en conséquence. Toutefois, dans de nombreux cas des amorces doivent être conçus dans un site spécifique et ne pourraient donc pas être conçus selon des critères spécifiques. Dans ces cas, il peut être nécessaire de faire plus optimisation du RP conditions plutôt (voir ci-dessus et protocole PCR6), mais avec les bonnes conditions même difficile RFT est généralement couronnée de succès.
Plusieurs méthodes alternatives pour dirigée mutagenèse sont disponibles, tels que méthode10 du Kunkel, plasmide entier mutagénèse11, cassette mutagénèse12, synthèse de gène de novo et CRISPR13,14.
Méthode de Kunkel et mutagenèse plasmide entier s’appuie sur l’ADN d’intérêt étant déjà dans un plasmide (vecteur) et utilise des amorces de synthétiser un simple brin ou double brin de l’ADN muté, respectivement. Dans les deux techniques, le plasmide entier est d’être synthétisée et utilisée pour la transformation, alors que 2 ou 3 pas PCR seulement synthétise le morceau d’ADN d’intérêt. Un inconvénient du 2 - ou 3-step PCR, est que l’ADN d’intérêt doit être synthétisée en deux fois, augmentant le risque de mutations qui y sont. En revanche, le plasmide n’a pas à être synthétisé, réduisant ainsi le risque de mutations ici au lieu de cela. En outre, en utilisant les 2 ou 3 pas PCR, une variante de type sauvage n’a pas à être cloné dans un vecteur au préalable, réduisant ainsi le temps de clonage de plusieurs jours.
Mutagenèse cassette ne s’appuie pas sur l’utilisation des amorces ou des polymérases. Au lieu de cela, un petit fragment d’ADN est de novo synthétisé et incorporé dans l’ADN d’intérêt avec l’utilisation d’enzymes de restriction. Cette méthode, cependant, repose sur la présence de sites de restriction appropriée près du site ciblé, ce qui n’est pas toujours présent. Cette approche exige aussi la variante de type sauvage à être cloné dans le vecteur au préalable, augmenter le temps de clonage par rapport à la méthode PCR de 2 ou 3 pas.
Avec la baisse du coût de la synthèse de novo des gènes (grands fragments d’ADN), il devient de plus en plus abordable à introduire des mutations en ordonnant la séquence souhaitée dans le commerce. Cependant, cette méthode est toujours coûteux par rapport les autres méthodes mentionnées. Au moment de la rédaction de novo de synthèse est environ 3 fois plus cher que la méthode présentée ici.
Une autre option émergente est la méthode CRISPR très attendue pour les altérations du génome. Cette méthode est très efficace et adaptable par rapport aux autres techniques utilisées pour les cellules eucaryotes. Cependant, avec la facilité et de nombreuses techniques disponibles pour le clonage dans l’organisme plus simple comme les bactéries, CRISPR convient rarement mieux que classiques de clonage. Ainsi, l’utilité de CRISPR dépend de l’organisme à l’étude.
Lorsque vous choisissez de faire la mutagenèse dirigée, il est important de le concevoir avec soin ; tant en ce qui concerne les applications en aval aussi bien la technique réelle utilisée. La méthode PCR 2 - et 3-étape décrite ici s’applique à presque toute étude de mutation et avec son faible coût, il convient à n’importe quel budget de laboratoire.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun intérêts opposés.
Acknowledgments
Les auteurs aimeraient remercier les subventions de la politique de libre accès University of Southern Denmark.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-GroEL antibody produced in rabbit | Merck | G6532 | Primary antibody |
| Azure c200 | Azure | NA | Gel imaging workstation |
| Custom DNA oligo | Merck | VC00021 | |
| DeNovix DS-11 | DeNovix | NA | Spectrophotometer for nucleic acid measurements |
| DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Scientific | R0611 | |
| Ethidium bromide solution 1 % | Carl Roth | 2218.1 | |
| GeneJET Gel Extraction Kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| GeneRuler DNA Ladder Mix | Fermentas | SM0333 | |
| Gerard GeBAflex-tube Midi | Gerard Biotech | TO12 | Dialysis tubes for electro elution |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1334 | |
| Mini-Sub Cell GT Cell | Bio-Rad | 1704406 | Horizontal electrophoresis system |
| Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse | Merck | F3165 | Primary antibody |
| Mouse Immunoglobulins | Dako Cytomation | P0447 | HRP conjucated secondary antibody |
| NucleoSpin miRNA | Macherey Nagel | 740971 | RNA purification |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Scientific | NP0323BOX | Bis-Tris gels for protein separation |
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs | M0531S | DNA polymerase |
| PowerPac HC High-Current Power Supply | Bio-Rad | 1645052 | |
| Rabbit Immunoglobulins | Dako Cytomation | P0448 | HRP conjucated secondary antibody |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| SigmaPlot | Systat Software Inc | NA | Graph and data analysis software tool |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | PCR machine |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202 | Ligase |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201S | |
| TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) (50X) | Thermo Scientific | B49 |
References
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