Summary
Dieses Protokoll soll veranschaulichen, wie zu verwenden Maus neonatale Kardiomyozyten als Modellsystem um zu untersuchen, wie verschiedene Faktoren Sauerstoffverbrauch im Herzen ändern können.
Abstract
Mitochondrien und oxidativen Stoffwechsel sind entscheidend für die Aufrechterhaltung der Funktion des Herzmuskels. Forschung hat gezeigt, dass mitochondriale Dysfunktion ein wichtiger Faktor für beeinträchtigte Herzfunktion bei Herzinsuffizienz gefunden. Im Gegensatz dazu möglicherweise Wiederherstellung defekter mitochondriale Funktion wohltuende Wirkung auf die Verbesserung der Herzfunktion bei Herzinsuffizienz. Daher könnte die regulatorischen Mechanismen und Identifizierung neuer Regler für mitochondriale Funktion Einblicke die genutzt werden könnten, um neue therapeutische Zielstrukturen für die Behandlung von Herzkrankheiten zu entwickeln. Hier ist kardialen Myozyten mitochondriale Atmung mit einer einzigartigen Zellkultursystem analysiert. Zunächst wurde ein Protokoll optimiert, um schnell zu isolieren und hohe Rentabilität Neugeborenen Maus Herzzellen Kultur. Dann ist eine 96-Well-Format extrazelluläre Flussmittel Analyzer verwendet, um den Sauerstoff-Verbrauch von diesen Kardiomyozyten zu beurteilen. Für dieses Protokoll wir säen Bedingungen optimiert und demonstrierte, dass Neugeborenen Maus Herzzellen Sauerstoff-Verbrauch leicht in eine extrazelluläre Flux-Analysator beurteilt werden kann. Wir beachten, dass unser Protokoll auf eine größere Größe der Kultur auch kann und andere Studien, wie z. B. die intrazelluläre Signal- und kontraktile Analyse Funktion.
Introduction
Um eine stetige kardiale kontraktile Funktion aufrecht zu erhalten, müssen die Herzzellen eine konstante Versorgung mit zellulären Energie hauptsächlich in Form von ATP1pflegen. Im Herzen entsteht etwa 95 % der ATP durch Mitochondrien, vor allem durch Oxidative Phosphorylierung, zeigt, dass Mitochondrien Herzfunktion2,3bioenergetische maßgeblich beteiligt. Unterstützen diese Vorstellung ist, dass Dysregulation der mitochondrialen Funktion zu Kardiomyopathie und Herzinsuffizienz4,5führen kann. Umgekehrt, Wiederherstellung der Funktion der Mitochondrien hat gezeigt, dass das Versagen der Herzfunktion verbessern Herz-6,7. Daher konnte studieren des Mechanismus der mitochondrialen Bioenergetik und Identifizierung neuartige Regulatoren der mitochondrialen Funktion in Kardiomyozyten verraten nicht nur mechanistische Einblicke der kardialen Energieerzeugung aber auch Einblick, der führt zur Entwicklung neuer therapeutischer Ziele zur Behandlung von Herz-Kreislauferkrankungen6,8.
Im Vergleich zu das ganze Herz, die enthält einer Mischungaus von Myozyten und nicht Myozyten9, Cardiomyocyte Kulturen sind hochrein, mit minimalen Kontamination von nicht-Myozyten aus dem Herzen, wie z. B. Fibroblasten und Endothelzellen10. Darüber hinaus ermöglicht isolieren Herzzellen von neugeborenen Welpen züchten eine große Anzahl von Zellen in einer kleinen Menge der Zeit, im Vergleich zu isolierenden Zellen von Erwachsenen Herzen10,11. Vor allem primäre kultivierten erwachsenen Maus Herzzellen haben kurze überleben Zeiten (z.B. 24 h) und auf längere Zeit de-Punkte unterscheiden. Neugeborenen Maus Herzzellen können überleben und für mehr als 7 Tage in der Kultur, wodurch sie ideal für die Prüfung der Auswirkungen der Wirkstoffe und Genmanipulation auf die Funktion der Mitochondrien in Kardiomyozyten10manipuliert werden. Natürlich gibt es biologische Unterschiede zwischen den Erwachsenen und Neugeborenen Zellen, aber die längere Dauer, die für Kultur neonatale Zellen macht sie geeignet für viele verschiedene Arten von Studien, einschließlich der Funktion der Mitochondrien.
Bisher wurden primäre kultivierte Neugeborene Maus und Ratte Kardiomyozyten als Modelle zur kardialen Bioenergetik12,13zu studieren. In den letzten Jahren verwendet Studien einen extrazelluläre Flux-Analysator Sauerstoff-Verbrauch (OCR) messen und auswerten oxidative Kapazität bei Maus und Ratte neonatale Kardiomyozyten14,15. Während mit Ratten verglichen, die Zellviabilität des Neugeborenen Maus Herzzellen ist niedriger und hat größere Variabilität16. Außerdem macht die Fähigkeit, Zellen aus gentechnisch veränderter Mausmodelle im Mausmodell Zelle sehr wichtig. Da die OCR-Studien so empfindlich auf Zell-Zahl und Dichte Aussaat sind, braucht man Entwicklung eines reproduzierbaren, zuverlässig und einfach Protokolls, konsequente Zellausbeute und Rentabilität zu erzielen.
Hier berichten wir über ein optimiertes Protokoll, das entwickelt worden ist die kultivierte Maus neonatale Herzzellen zusammen mit einem 96-Well-Format extrazelluläre Flux-Analysator für OCR-Analyse verwendet. Dieses Protokoll wird die Reproduzierbarkeit des Assays stark erhöht. Darüber hinaus das Protokoll nicht nur bietet eine neuartige und reproduzierbare Methode für OCR-Analyse, sondern könnte auch zu einer größeren Größe Kultur für andere experimentelle Zwecke, wie die möglicherweise notwendigen myofibrillären Funktionen zu studieren und intrazellulären angepasst werden Signalwege.
Dieses Protokoll beschreibt insbesondere eine eintägige Verfahren zur Isolierung und Kultur des Neugeborenen Maus Herzzellen in eine 96-Well Zellplatte Kultur. Darüber hinaus beschreibt es die Verfahren zur Messung der Sauerstoff-Verbrauch mit einem extrazellulären Flux-Analyzer. Alle Lösungen sind steril oder steril filtriert. Alle Werkzeuge werden mit 75 % igem Ethanol sterilisiert. Wir bieten eine Tabelle von Materialien für verschiedene Teile des Verfahrens. Für die Kultivierung von Kardiomyozyten, erfolgen alle Abläufe und Schritte in eine Standardzelle Kultur Kapuze. Dieses Protokoll ist für die Isolierung von Neugeborenen Mäuseherzen aus einem Wurf (ca. 8-10 Welpen) entwickelt. Das Protokoll kann jedoch auch zur Isolierung von Herzzellen aus mehreren Würfen angepasst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Für die Arbeit mit Neugeborenen Mäusen Bitte verweisen auf lokale Hochschulinstitut Leitlinien Satz her durch die Pflege der Tiere-Programme und die institutionellen und anderen einschlägigen Bestimmungen einhalten. Alle in diesem Protokoll beschriebene Methoden wurden von der UC San Diego institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) genehmigt und Bundes- und einzelstaatlichen Vorschriften einhalten.
1. Vorbereitung der Reagenzien
- 25 mL Pre Aufschlusslösungvorbereiten: HBSS (ohne Ca2 + und Mg2 +) ergänzt mit Trypsin (0,5 mg/mL). Sterilisieren Sie die Lösung mit einem 0,22 µm-Filter und halten Sie auf dem Eis bis zur Verwendung. Stellen Sie vor Aufschlusslösung am Tag des Experiments.
Hinweis: Es ist wichtig, HBSS ohne Ca2 + zu verwenden und Mg2 +, als Ca2 + und Mg2 + bewirkt Myozyten Kontraktion und anschließende Zelltod während der Isolation. - 30 mL Kollagenase Verdauung Puffervorzubereiten: Kollagenase (0,8 mg/mL, ca. 350 U/mL) in HBSS (ohne Ca2 + und Mg2 +) Puffer gelöst. Sterilisieren Sie die Lösung mit einem 0,22 µm-Filter und halten Sie auf dem Eis bis zur Verwendung. Kollagenase Aufschlusslösung am Tag des Experiments zu machen.
- 500 mL Cardiomyocyte Nährmedien (Wachstumsmedien)vorbereiten: 375 mL DMEM, 125 mL M-199, 25 mL Pferd Serum und 12,5 mL FBS vermischen. Ergänzen Sie mit 1 % Penicillin und Streptomycin 1 % ige Lösung.
- Mitochondriale Stresstest Mediumvorbereiten: machen 200 mL DMEM basierte Stresstest Medium (DMEM ohne Nahco33, siehe Tabelle der Materialien) mit 1 mM Natrium Pyruvat, L-Glutamin, 2 mM und 10 mM Glukose und 2 mM Hepes ergänzt.
Hinweis: 1 L des Mediums mit DMEM ohne Natrium Pyruvat, L-Glutamin, Glukose und Hepes, Filer steril, erstellen und speichern bei 4 ° C. Bereiten Sie das Stresstest-Medium am Tag des Tests durch das Hinzufügen von anderen Reagenzien. Mit DMEM ist Medium ohne Nahco33 kritisch. - PH-Wert des mitochondrialen Stresstest Medien auf 7,4 am Tag der Nutzung anpassen. Warmen Medien auf 37 ° C vor dem Gebrauch.
- Oligomycinvorbereiten: 5 mL einer 5 mM Vorratslösung in DMSO vorbereiten, machen 250 µL-Aliquots und Lagerung bei-20 ° C.
- FCCPvorbereiten: 5 mL einer 5 mM Vorratslösung in DMSO vorbereiten, machen 250 µL-Aliquots und Lagerung bei-20 ° C.
- Antimycin Avorzubereiten: 5 mL einer 5 mM Vorratslösung in DMSO vorbereiten, machen 250 µL-Aliquots und Lagerung bei-20 ° C.
- Rotenonvorbereiten: 5 mL einer 5 mM Vorratslösung in DMSO vorbereiten, machen 250 µL-Aliquots und Lagerung bei-20 ° C.
Hinweis: Alle Reagenzien und Lösungen, die in diesem Protokoll verwendeten sind in Tabelle 1aufgeführt.
(2) Ernte- und Pre-Verdauung von Herzen von neugeborenen Mäusen (Tag 1)
- Autoklaven-Schere, Pinzette und Moria Löffel zu sterilisieren.
- Führen Sie alle Schritte in der Zelle-Kultur-Haube für Sterilität.
- Aliquoten 5 mL HBSS (ohne Ca2 +, Mg2 +) in jede Vertiefung eine 6-Well Zellplatte Kultur; auf Eis legen. Aliquoten 10 mL HBSS in einer Kulturschale 10 cm Zelle.
- 20 mL Trypsin Pre Aufschlusslösung in einem 50 mL sterile konische Rohr vorzubereiten. Halten Sie alle Lösungen auf Eis.
- Tauchen Sie schnell Neugeborenen (Tag 0) Mäuse in 70 % Ethanol-Lösung für die Sterilisation.
- Welpen mit steriler Schere (gerade) ohne Narkose zu enthaupten, und Brust entlang dem Brustbein Zugriff auf der Brusthöhle und das Herz öffnen. (Abbildung 1A)
Hinweis: 1) ist es wichtig, P0 neugeborene Mäusen zu verwenden, um hohe Zellenentwicklungsfähigkeit zu erreichen. (2) dieses Euthanasie-Verfahren ist für Neugeborene nach NIH und der American Veterinary Medical Association Leitlinien 17zulässig. - Herz aus dem Körper zu extrahieren, mit einer feinen Schere und Transfer sofort in der sterilen Zelle Kulturschale mit HBSS (ohne Ca2 +, Mg2 +) (Abbildung 1 b).
- Entfernen Sie alle verbleibenden Lungengewebe, größere Schiffe, etc. (und Atrien, falls gewünscht). Waschen Sie Herzen in die HBSS-Lösung mit sanfter Bewegung.
- Schneiden Sie jedes Herz mit einer feinen Schere in 8 Stücke und übertragen Sie alle Herzgewebe mit der Pinzette in einen Brunnen von einer 6-Well Kultur Zellplatte mit HBSS (Abbildung 1 und 1 D).
- Waschen Sie die Herzen durch die Übertragung der Herzen von Brunnen zu Brunnen in der 6-Well-Platte voller HBSS, mit einem Löffel Moria (Abbildung 1).
Hinweis: Übertragen die Herzen von Brunnen zu Brunnen, ist genug, um das Blut zu waschen. Da Blut enzymatische Verdauung stört ist es wichtig, die Herzen mit HBSS waschen und Blut zu entfernen. - Übertragen Sie die Herzen mit einem Löffel Moria in einer konischen Röhrchen mit 20 mL Trypsin (0,5 mg/mL) und inkubieren Sie mit sanften Agitation bei 4° C für 4 h (Abbildung 1E).
3. bereiten Sie eine Kultur 96-Well-Platte (Tag 1)
- 5 mL der Beschichtungslösung vorbereiten: PBS mit 0,5 % Gelatine (Autoklav vor Gebrauch) und 1 % Fibronektin Lösung. (z.B. 5 mL Gelatine-Lösung plus 50 µL Fibronektin-Lösung)
- Aliquoten 50 µL der Beschichtungslösung in jede Vertiefung der 96-Well Zellplatte Kultur (siehe Tabelle der Materialien). Wenn Bläschen vorhanden sind, entfernen Sie sie mithilfe einer Pipette 20 µL Luftblasen heraus zu saugen.
Hinweis: Es ist wichtig, die Oberfläche von jedem Bohrloch mit Beschichtungslösung decken. - Inkubieren Sie die Platte in einem 37 ° C Zelle Kultur Inkubator für 1 h oder mehr, um die Matrix-Beschichtung trocknen lassen.
- Aspirieren Sie jede verbleibende Beschichtungslösung vor der Aussaat Kardiomyozyten.
(4) enzymatische Verdauung und Beschichtung von Zellen (Tag 1)
- Wärmen Sie Kollagenase Aufschlusslösung im Wasserbad 37 ° C vor.
Hinweis: Dieser Schritt ist wichtig für effiziente enzymatische Verdauung zu erreichen ist. - Das konische Rohr mit Herzen und Pre Aufschlusslösung von 4 ° C zu einer Zelle Kultur Haube zu bewegen. (Abb. 1F)
- Lassen Sie die Herzen auf den Boden des Rohres sinken und entfernen Sie die Pre-Verdauung-Lösung mithilfe einer serologischen 10 mL-Pipette (1 bis 2 mL des Mediums Isolierung verbleiben in der Röhre).
- Fügen Sie 10 mL HBSS in die Röhre. Wieder aussetzen die Herzen mit HBSS 2-3 Mal mit einer serologischen Pipette 10 mL Trypsin zu waschen. Aspirieren HBSS (1 bis 2 mL verbleiben in der Röhre).
- Fügen Sie 10 mL vorgewärmten Kollagenase Aufschlusslösung in das Rohr mit Herzen. (Abbildung 1)
- Inkubieren Sie das Rohr mit Herzen im Wasserbad 37 ° C für 10 min ohne Agitation (1. Verdauung).
- Verschieben Sie nach 1. Verdauung das Rohr in der Zelle-Kultur-Haube. Sanft genannte Herzen wieder aussetzen die Herzen in das Rohr sanft 10 Mal mit einer serologischen 10 mL-Pipette. Dadurch werden Herzen zu zerstreuen und Zellen von Herzgewebe freigegeben werden. (Abbildung 1 H)
Hinweis: Da Kardiomyozyten sehr empfindlich sind, ist sanft Verreibung wichtig, hohe Rentabilität zu erreichen. - Lassen Sie das unverdaute Gewebe sinken, verdaute Lösung angereichert in Herzmuskelzellen (ca. 9-10 mL), eine neue konische Rohr übertragen und sofort hinzufügen einer gleichen Menge von Zellkulturmedien, Kollagenase Verdauung zu stoppen.
- Hinzugeben Sie 10 mL Kollagenase Aufschlusslösung in das Rohr mit den restlichen unverdauten Herzgewebe.
- Das Rohr mit Herzgewebe im Wasserbad 37 ° C für 10 min inkubieren (2. Verdauung).
- Wiederholen Sie die Prozedur 4.7 und 4.8.
Hinweis: Wiederholen Sie es gibt noch viel unverdautes Gewebe, Verdauung noch einmal. In den meisten Fällen sind jedoch zwei Verdauung genug, um die meisten Zellen von Herzgewebe zu zerstreuen. - Legen Sie eine sterile Zelle-Sieb (100 µm-Nylon-Mesh) in eine neue sterile 50 mL konische Rohr. Vornässen der Zelle Sieb mit ca. 2-3 mL Zellkulturmedien und Zellen durch die Zelle-Sieb passieren. Spülen Sie die Zelle-Sieb mit ca. 2-3 mL Zellkulturmedien. (Abbildung 1I)
- Zentrifugieren Sie konischem Rohr mit Kardiomyozyten für 5 min bei 180 X g (Abbildung 1J). Abzusaugen Sie den überstand (Abbildung 1 K), die Zelle Gewebe Ablagerungen enthalten und wieder aussetzen der Zelle Pellet in 10 mL von Zellkulturmedien (Abbildung 1 L).
- Sanft Aufschwemmen der Zellen und Platte auf einer 10 cm Zelle Kulturschale (Kunststoff ohne jede Art von Beschichtung) und inkubieren Sie für 1 Stunde in eine Zelle Kultur Inkubator (1. Pre-Plating) (Abbildung 1 M). Pre-Beschichtung können nicht-Kardiomyozyten, wie Fibroblasten und Endothelzellen, zur Einhaltung der unbeschichteten Zellkultur-Schale.
Hinweis: An dieser Stelle Kardiomyozyten sind in der Regel eine Runde Form und glänzend unter dem Mikroskop erscheinen. (Abbildung 1N). - Nach 1 h Inkubation sanft schütteln Sie die Platte, waschen Sie nicht anhaftende Zellen (angereichert in Herzmuskelzellen) aus der Kulturschale 10 cm und wieder auszusetzen Sie Zellen durch wiederholt das Zellkulturmedium über das Gericht mit einer serologischen 10 mL-Pipette pipettieren. Dann übertragen Sie nicht anhaftende Zellen (angereichert in Herzmuskelzellen) in eine neue Zelle Kulturschale 10 cm (Kunststoff ohne jede Beschichtung) und inkubieren Sie für weitere 1 h in einer Zelle Kultur Inkubator (2. Pre-Beschichtung).
Hinweis: Zellen, mit denen die nicht beschichteten Platte befestigt sind überwiegend nicht Kardiomyozyten: Fibroblasten und Endothelzellen, die unter dem Mikroskop (Abbildung 1O) visualisiert werden können. - Nach 2. Pre-Beschichtung, sanft schütteln Sie die Platte, waschen Sie nicht anhaftende Zellen (Herzmuskelzellen) von 10 cm-Kulturschale, dann übertragen Sie die Herzzellen in ein neues 50 mL konische Röhrchen.
5. zählen Zellen und Beschichtung in einer 96-Well Zellplatte Kultur (Tag 1)
- Zählen Sie die Zellen mit einem Hemocytometer.
- Die Zellen in einer extrazellulären Matrix beschichtet 96-Well Kultur Zellplatte bei einer Dichte zwischen 10-30 x 103 Zellen/Brunnen mit einer Multi-Kanal-Pipette in einem Endvolumen von 200 µL (Abbildung 1 P) Platte. Verwenden Sie Brunnen A1, A12, H1 und H12 für Hintergrund: 200 µL Kulturmedium als andere Brunnen in diese Vertiefungen (keine Zellen) hinzufügen. Inkubieren Sie die Platte in einem 37 ° C Zelle Kultur Inkubator.
Hinweis: In dieser Studie wurde Sauerstoffverbrauch mittels unterschiedlichen Zelldichten z. B. 10 x 103, 20 x 103oder 30 x 103 Zellen/gut getestet. (Abbildung 2A). Auch, wie oben beschrieben, Herzmuskelzellen sofort nach Isolierung sind in der Regel eine Runde Form und glänzend unter dem Mikroskop erscheinen. Entwicklungsfähigen Zellen werden innerhalb von 16-24 h Kultur abflachen.
6. Sauerstoff-Verbrauch-Assay mit einer 96-Well-Format extrazelluläre Flux Analyzer (Tag2)
Hinweis: Sauerstoff-Verbrauch-Assay kann einen Tag nach der galvanischen Zellen durchgeführt werden oder später. Neonatale Kardiomyozyten kultiviert unter Verwendung dieses Protokolls bis zu 7 Tage überleben kann, post isoliert.
- Ein Flussmittel Analyzer Sensorkassette-Hydrat (siehe Tabelle der Materialien) für mindestens 3 Stunden, aber ideal für einen ganzen Tag vor dem Test. Fügen Sie 200 µL der Kalibrator Lösung (siehe Tabelle der Materialien) in den einzelnen Brunnen der Dienstprogramm-Platte wieder auf den Teller Dienstprogramm der Sensorkassette und brüten in einem 37 ° C Inkubator ohne CO2 oder O2 Ergänzung.
- Ändern Sie Zellkulturmedien in Mitochondrien Stresstest Medium eine Stunde vor dem Test. Herzmuskelzellen sind zerbrechlich. Daher vorsichtig entfernen Sie den Zellkulturmedien mithilfe einer Multi-Kanal-Pipette und waschen Sie die Zellen mit 200 µL vorgewärmten mitochondriale Stresstest Medien zweimal. Nach dem zweiten waschen fügen 175 µL vorgewärmten Mitochondrien Stresstest Medien und Kultur der Zellen in einem 37 ° C Inkubator ohne CO2 oder O2 Ergänzung.
- Konzentrierte Testverbindungen vorzubereiten. Mitochondrien-Stress-Test Vorbereitung 3,0 mL 16 µM Oligomycin, 9 µM FCCP und einer Mischung aus 20 µM Rotenon und 20 µM Antimycin A, alle im mitochondrialen Stresstest Medium.
Hinweis: Jede Verbindung in der Konzentration beschrieben wurde getestet. Allerdings ist es notwendig, die Konzentration von jeder Verbindung im eigenen Labor titrieren. - Laden Sie 25 µL jeder Verbindung in den Injektor Häfen der Sensorkassette mit einer Mehrkanal-Pipette (Abbildung 1Q). Das Volumen und die Endkonzentration sind in Tabelle 2beschrieben.
- Extrazelluläre Flux-Assay-Protokoll eingerichtet. Das Programm wird in beschrieben Tabelle 3.
- Starten Sie das Programm. Legen Sie zuerst die Sensorkassette in die Maschine für die Kalibrierung (Abbildung 1R). Der Kalibrator für die Test-Platte zu ersetzen, sobald die Kalibrierung abgeschlossen ist.
Hinweis: Mit der vom Hersteller mitgelieferten Software, geben Sie Gruppen von Brunnen und jede Verbindung und Port. - Falls gewünscht, nach der Probe verwerfen Sie sorgfältig alle Assay Medium mithilfe einer Multi-Kanal-Pipette und speichern Sie die Zelle Kultur Mikrotestplatte bei-20 ° C für zukünftige Zelle Normalisierung mit Protein Assay.
- Protein-Inhalt zu messen. Fügen Sie 50 µL RIPA Zelle Lysis Standardlösung (siehe Tabelle der Materialien). Inkubieren Sie die Platte auf dem Eis für 30 min, voll Zellen lysiert. Übertragen Sie sämtliches Material auf eine neue klare Flachboden 96 gut Assay Platte.
- Messen Sie Proteinkonzentration von BCA-Test nach Hersteller Protokoll.
Hinweis: Beschichtung des Brunnens mit extrazellulären Matrix führt zu einer hohen Proteinkonzentration in jede Vertiefung. Daher den Betrag der Hintergrund betreffendes (keine Zellen) tatsächliche Zelle Proteinkonzentration zu subtrahieren. Die Konzentration des Proteins abgeleitet von Zellen ist gering, in einer Kultur der 96-Well-Platte. Darüber hinaus variiert Proteinkonzentration von Brunnen zu Brunnen durch extrazelluläre Matrix Beschichtung. Daher empfiehlt sich mit Handynummer, um die OCR zu normalisieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mithilfe des Protokolls beschrieben, waren die Herzen von Tag 0 neugeborenen Welpen isoliert. 5 x 105 Zellen/Pup stammen, und Herzmuskelzellen bei dichten von 10 x 103, 20 x 103oder 30 x 103 Zellen/Brunnen, in 96-well-Platten (Abbildung 2A) ausgesät wurden. Nach Übernachtung Kultur fanden sich Kardiomyozyten Kunststoff beschichteten Oberfläche gut an und es gab sehr wenige ungebundene Zellen (ungebunden Zellen werden weiterhin angezeigt, so rund und glänzend, im Vergleich zu den gesunden, befestigt Zellen die hast) () Abbildung 2A ( und B). Zu diesem Zeitpunkt waren spontan Auftraggeber Kardiomyozyten leicht sichtbar. Aussaatdichte von 30 x 103 Zellen/Well Zusammenfluss zeigte einen Tag nach der Aussaat, wie die Zellen verteilt. Wie die Anzahl der Runden (tot) Zellen sehr niedrig waren, zeigten diese Ergebnisse, dass das Protokoll hohe Zellviabilität von Kardiomyozyten gibt. Herzzellen waren Immunostained mit einem Antikörper gegen sarkomerischer α-Actinin, ein Cardiomyocyte spezifische Marker18 als Beweis für diese Aussage. Wie in Abbildung 2gezeigt, zeigten die meisten Zellen positive Färbung der α-Actinin zeigt die hohe Reinheit der Cardiomyocyte Isolation.
Ein Schema eines typischen mitochondrialen Stress Tests ist in Abbildung 3dargestellt. Die mitochondriale Stress-Test beginnt mit einer Baseline-Messung von Sauerstoff-Verbrauch (OCR). Danach ist die Injektion von Oligomycin, die ATPase hemmt. Der Unterschied vor und nach Oligomycin Injektion zeigt die OCR in Verbindung mit ATP-Produktion. Dann wurde der abkoppeln Agent FCCP injiziert, um maximale Sauerstoff-Verbrauch zu messen. Atemwege Reservekapazität kann als Differenz zwischen basalen berechnet werden und die maximale OCR. Zu guter Letzt mit der Injektion von zwei Elektronentransport komplexe Inhibitoren (Antimycin A und Rotenon), mitochondriale Atmung vollständig stoppt und OCR verringert auf den niedrigsten Stand. Durch die Blockierung der mitochondrialen Aktivität auf dieser Ebene ist Sauerstoff-Verbrauch nicht mitochondriale. Basalen Atmung, Proton Leck und maximale Atmung berechnet als Differenz zwischen nicht-mitochondriale Atmung (OCR in Anwesenheit von Antimycin A und Rotenon) und Basismessung, OCR in Anwesenheit von Oligomycin und OCR in der Vorhandensein von FCCP, beziehungsweise.
In dieser Studie erfolgte OCR-Analyse mittels einer 96-Well-Format extrazelluläre Flussmittel Analyzer System eines Tages nach Zelle isoliert. Darüber hinaus wurden um die Wirkung von Serum Hunger auf OCR, drei Stunden vor der Probe, testen den Zellkulturmedien, regelmäßige Wachstum Zellkulturmedien mit Serum oder ohne Serum geändert. Nach dem Lauf wurden OCR Messdaten 1 bis 12 für jede gut, in eine Kalkulationstabelle für Aufzeichnungen und weitere Analysen exportiert. Metabolische Eigenschaften wurden wie folgt ermittelt:
Non-mitochondriale Atmung = durchschnittliche OCR (10, 11, 12)
Basalen Atmung = durchschnittliche OCR (1, 2, 3)-durchschnittliche OCR (10, 11, 12)
ATP-Produktion = durchschnittliche OCR (1, 2, 3)-durchschnittliche OCR (4, 5, 6)
Proton Leck = durchschnittliche OCR (4, 5, 6) - durchschnittliche OCR (10, 11, 12)
Maximale Atmung = durchschnittliche OCR (7, 8, 9) - durchschnittliche OCR (10, 11, 12)
Wie in Abbildung 4A, OCR-Werte wurden leicht analysiert und die Auswirkungen der injizierten Verbindungen waren auch offensichtlich. Vor allem die Variation von Brunnen zu Brunnen war klein, dargestellt durch den Standardfehler. Erhöhung der Zelle Nummer führte zu erhöhten Basismessung, Oligomycin und Atmung FCCP behandelt. Im Vergleich zum Serum verhungerten Zellen, lag OCR in Zellen analysiert, die mit Wachstumsmedien inkubiert worden waren. Wie in Abbildung 4 bdargestellt, zeigt OCR als basale Atmung Proton Leck (Oligo) und maximale Atmung (FCCP) pro 1 x 104 LiPo-Zellen. OCR pro 10 x 103 Zellen übertraf in Aussaatdichte von 20 K und 30 K Zellen/Brunnen, 10 K Zellen/gut. Wie in Abbildung 4dargestellt verhungert zum Ausdruck bringen, OCR bezogen auf basale Atmung, die relative OCR von Proton Leck (Oligo) und maximalen (FCCP) zeigen ähnliche Werte zwischen Wachstumsmedien und Serum Gruppen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Dichte Aussaat nicht die relative Proton Leck und maximale oxidative Kapazität auswirkt.
Insgesamt durch die Verwendung dieses Protokolls, waren sehr guten Ausbeuten von Neugeborenen Maus Herzzellen erfolgreich isoliert und kultiviert. OCR kann mithilfe dieser Myozyten eine extrazelluläre Flussmittel Analyzer bewertet werden. Die Ergebnisse zeigen auch, dass Dichte Aussaat nicht deutlich OCR berechnet, indem die Anzahl von Zellen auswirkt. Kurzfristig (3 h) Serum Hunger verringert sich jedoch OCR. Die Informationen sind nützlich zum Testen der Maus neonatale Kardiomyozyten OCR mit verschiedenen experimentellen Bedingungen.
Abbildung 1: Isolierung und Kultur des Neugeborenen Herzzellen von neugeborenen Mäusen Tag 0. (A) Neugeborene werden eingeschläfert, und das Herz wird aus dem Thorax durchschnitten. (B) Herzen werden in HBSS (ohne Ca2 +, Mg2 +) gewaschen. (C) wird jedes Herz in 8 Stücke geschnitten. (D) Herzen werden in einem 6-Well-Platte voller HBSS verschoben. Herzen werden gewaschen, mit einem Löffel Moria von Brunnen zu Brunnen zu übertragen. (E) Herzen sind bereits verdaut in Trypsin-HBSS bei 4 ° C mit sanften Agitation. (F) Predigested Herz Gewebe nach 4 h Inkubation bei 4 ° C. (G) Herz Gewebe nach 10 min Kollagenase Verdauung. (H) Collagenase verdaut Herz, die Gewebe verrieben werden. (ich) isolierten Kardiomyozyten wurden durch eine Zelle Sieb gefiltert. (J) Kardiomyozyten sind durch Zentrifugation pelleted. (K) Kollagenase und Nährmedien werden durch Absaugen entfernt. (L) Kardiomyozyten sind wieder in frischem Nährmedium schweben. (M) Kardiomyozyten sind in einer Plastikschale 10 cm für Pre-Plating kultiviert. (N) A repräsentatives Bild der Herzmuskelzellen (rund und glänzend Zellen) nach 1 h von Pre-Beschichtung. (O) nach Pre-Beschichtungs- und dann entfernen von nicht-anhaftende Kardiomyozyten, verbleibenden Zellen, die in der Regel Fibroblasten und Endothelzellen sichtbar sind. (P) Plating Herzzellen in eine 96-Well-Platte. (Q) Reagenzien in Injektion Häfen Sensorkassette geladen. (R) Putting Sensorkassette in eine extrazelluläre Flux-Analysator-Maschine. Maßstabsleiste = 0,1 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Kultur der Kardiomyozyten auf extrazelluläre Flux-Analysator-96-Well-Platte. (A) repräsentative Bilder von Herzmuskelzellen in 96-Well-Platten mit angegebenen Zelldichten unmittelbar nach der Aussaat (obere Reihe) oder 18 h Post Aussaat (untere Zeile). (B) eine höhere Vergrößerung Bild von Kardiomyozyten 18 h Post Aussaat in einer Zelle Dichte von 10 x 103 Zellen/gut. (C) Kardiomyozyten wurden mit Anti-sarkomerischer α-Actinin Antikörper (grün) und DAPI (als eine nukleare Fleck) (blau) gefärbt. Maßstabsleiste = 0,1 mm. Die Immunostaining Methoden finden Sie in unserem vorherigen Veröffentlichung18. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3. Schematische Darstellung der mitochondrialen Stress-Test. Bioenergetische Parameter, einschließlich basale, ATP-verknüpft, maximale und Non-mitochondriale Atmung und Atemwege Kapazitätsreserven sowie Proton Leck auf der Spur mit entsprechenden mitochondriale Effektoren beschrieben sind. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: mitochondriale Stress Test. (A) repräsentative Rückverfolgung von Sauerstoff-Verbrauch (OCR, in pMoles/min) der Neugeborenen Maus Herzzellen. Zu den o.g. Zeiten, Oligomycin (Oligo, 1 µM), FCCP (800 nM), und RAA (Rotenon und Antimycin A, 1 µM) wurden injiziert. Für jede Messung wird dem Mittelwert und der Standardfehler des Mittelwertes (SEM) von 10 einzelnen Brunnen vorgestellt. (B) OCR wird als basale Atmung, Oligo (Proton Leck) und FCCP (maximale Atmung) pro 10 x 103 Zellen berechnet. (C) OCR ist relativ basal Atmung ausgedrückt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Name des Reagenz und Lösung | Vorbereitung | Notizen |
| Trypsin Pre Aufschlusslösung | Trypsin in HBSS (ohne Ca2 + und Mg2 +) auflösen. Endkonzentration beträgt 0,5 mg/mL. Sterilisieren Sie die Lösung mit einem 0,22 µm-Filter und halten Sie auf dem Eis bis zur Verwendung. | Stellen Sie vor Aufschlusslösung am Tag des Experiments. |
| Kollagenase Aufschlusslösung | Trypsin in HBSS (ohne Ca2 + und Mg2 +) auflösen. Endkonzentration beträgt 0,5 mg/mL. Sterilisieren Sie die Lösung mit einem 0,22 µm-Filter und halten Sie auf dem Eis bis zur Verwendung. | Kollagenase Aufschlusslösung am Tag des Experiments zu machen. |
| Cardiomyocyte Kultur, Medien | Vermischen Sie 375 mL DMEM, 125 mL M-199, 25 mL Pferd Serum und 12,5 mL FBS. Ergänzen Sie mit 1 % Penicillin und Streptomycin 1 % ige Lösung. | Cardiomyocyte Kulturmedien vor dem Experiment erfolgen kann und für einen Monat bei 4 ° C gelagert werden. |
| Mitochondriale Stresstest medium | Erstens machen 1 L des Mediums mit DMEM ohne jedes Natrium-Pyruvat, L-Glutamin, Glukose und Hepes, filtern, um zu sterilisieren und bei 4 ° c lagern Am Tag des Tests fügen Sie Natrium Pyruvat, L-Glutamin, Glukose und Hepes hinzu. PH auf 7,4 vor Gebrauch anpassen (Sterilisation ist nicht erforderlich). | Endkonzentration für Ergänzungen sind folgende: Natrium Pyruvat (1 mM), L-Glutamin (2 mM), Glukose (10 mM) und Hepes (2 mM) |
| Oligomycin Lager | Oligomycin in DMSO auflösen. Zuerst bereiten Sie 5 mL der Stammlösung. Wenn Oligomycin vollständig in DMSO aufgelöst ist, machen Sie 250 µL-Aliquots, Lagerung bei-20 ° C. | Nehmen Sie am Tag des Tests einen aliquoten zu verwenden. Vermeiden Sie viele Gefrier-Tau-Zyklen. |
| FCCP Lager | FCCP in DMSO auflösen. Zuerst bereiten Sie 5 mL der Stammlösung. Endkonzentration beträgt 5 mM. Wenn FCCP vollständig in DMSO aufgelöst ist, machen Sie 250 µL-Aliquots, Lagerung bei-20 ° C. | Nehmen Sie am Tag des Tests einen aliquoten zu verwenden. Vermeiden Sie viele Gefrier-Tau-Zyklen. |
| Antimycin A Lager | Antimycin A in DMSO auflösen. Zuerst bereiten Sie 5 mL der Stammlösung. Endkonzentration beträgt 5 mM. Sobald Antimycin A ist völlig aufgelöst in DMSO, bilden 250 µL-Aliquots, Lagerung bei-20 ° C. | Nehmen Sie am Tag des Tests einen aliquoten zu verwenden. Vermeiden Sie viele Gefrier-Tau-Zyklen. |
| Rotenon Lager | Rotenon in DMSO auflösen. Zuerst bereiten Sie 5 mL der Stammlösung. Endkonzentration beträgt 5 mM. Wenn Rotenon vollständig in DMSO aufgelöst ist, machen Sie 250 µL-Aliquots, Lagerung bei-20 ° C. | Nehmen Sie am Tag des Tests einen aliquoten zu verwenden. Vermeiden Sie viele Gefrier-Tau-Zyklen. |
| Zelle Kulturlösung Platte Beschichtung | Stellen Sie zunächst 200 mL 0,5 % Gelatine-Lösung. Lösen Sie die Gelatine in PBS und Autoklaven. Am Tag des Experiments fügen Sie 50 µL Fibronektin-Lösung in 5 mL Gelatine-Lösung zu Beschichtungslösung hinzu. | 0,5 % Gelatine-Lösung kann bei Raumtemperatur bis zu 2 Monate lagerfähig. |
Tabelle 1: Reagenzien und Lösungen.
| Spritzenport | Verbindungen und Konzentration | Lautstärke beim Lauf (µl) injiziert | Endkonzentration im Test |
| A | 16 µM oligomycin | 25 | 2 ΜM |
| B | 9 ΜM FCCP | 25 | 1 ΜM |
| C | 20 µM Rotenon (Rot) und 20 µM Antimycin A (AA) |
25 | 2 µM der einzelnen |
Tabelle 2: Injektion Mischungen.
| Schritte und Verfahren | Messungen und Schleifen |
| Kalibrierung | - |
| Gleichgewichtherstellung | - |
| Baseline-Messung | 3 Mal: 3 min. mischen, warten, 2 min, 3 min zu messen |
| Injizieren Port (Oligomycin) | - |
| Messungen | 3 Mal: 3 min. mischen, warten, 2 min, 3 min zu messen |
| Injizieren von Port B (FCCP) | - |
| Messungen | 3 Mal: 3 min. mischen, warten, 2 min, 3 min zu messen |
| Injizieren von Port C (RAA) | - |
| Messungen | 3 Mal: 3 min. mischen, warten, 2 min, 3 min zu messen |
Tabelle 3: Extrazelluläre Flussmittel Analyzer Programm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dieser Studie haben wir ein einfaches Protokoll für die Isolierung und Kultivierung Maus neonatale Kardiomyozyten etabliert. Durch die Verwendung dieser Kardiomyozyten, haben wir auch die Voraussetzungen für die Sauerstoff-Verbrauch messen mit einem extrazellulären Flussmittel Analyzer System optimiert. Das Protokoll erlaubt verwenden Maus neonatale Kardiomyozyten als Modellsystem um zu untersuchen, wie verschiedene Faktoren Sauerstoffverbrauch in den wichtigsten arbeitenden Zellen des Herzens, vergleichbar mit, was in der intakten Orgel gemessen würde ändern können. Unser Protokoll unterscheidet sich von zuvor veröffentlichten Protokolle16,18. Erstens um hohe Rentabilität zu erzielen, sind nur Welpen sofort bei der Geburt verwendet (z.B. P0), anstatt diejenigen Tage Null bis drei Tage alt (P0 bis P3 Welpen), die häufig in anderen Protokollen16,19verwendet werden. Zweitens waren um die Zeit des Experiments zu minimieren, Herzen nur mit Trypsin für 4 h vorverdaut. Darüber hinaus beschäftigten wir um das Verfahren zu vereinfachen und reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen, eine minimale Anzahl von Schritten, wie beschrieben. Zum Beispiel unser Protokoll verwendet nur zwei Arten von Puffer, PBS und HBSS, und nur eine Art von Zellkulturmedien und Unruhe während der Kollagenase Verdauung nicht beschäftigen.
Um hohe Tragfähigkeit des Neugeborenen Maus Herzzellen, zu erreichen, die wichtig für die Reproduzierbarkeit der OCR-Assay ist, gibt es einige kritische Punkte. Erstens ist mit P0 neugeborenen Welpen und Durchführung von Trypsin Pre-Verdauung und Kollagenase Verdauung am selben Tag entscheidend für hohe Rentabilität zu erreichen. Zweitens während der Kollagenase Verdauung, es empfiehlt sich nicht das Herzgewebe im 37 ° C Wasserbad zu agitieren. Unruhe in vielen Protokollen wird oft empfohlen, fanden wir, dass dies nicht notwendig, da P0 Herzen sind leicht von Kollagenase verdaut werden. Schließlich ist es wichtig, die Herzmuskelzellen nach Kollagenase Verdauung zu distanzieren, sanft verreiben Herzgewebe.
Wir haben auch getestet, Myozyten von P1 und P2 Pup Herzgewebe, das gleiche Protokoll verwenden. Jedoch für diese älteren Herz Proben fanden wir ist es notwendig, Trypsin vor Verdauung über Nacht ausgeführt werden, um ausreichende Erträge in Zelle (Daten nicht gezeigt) zu erzielen. Darüber hinaus wurde die Zellviabilität für P1 und P2 Kardiomyozyten rund 60 %, ähnlich wie in anderen Studien16veröffentlicht. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass P0 Myokard relativ geringere Mengen der extrazellulären Matrix als ältere Herz, das ermöglicht kürzerer Zeiten für Trypsin Pre-Verdauung hat, was zu höheren Zellviabilität und ergibt sich aus diesen jungen Herzen.
Extrazelluläre Flussmittel (XF) Analyse ist eine wichtige und beliebte Methode zur Messung der bioenergetische Funktion in den Zellen und isolierte Mitochondrien20,21geworden. Bis heute eine Reihe von Studien verwendet Ratte neonatale Kardiomyozyten und Sauerstoffverbrauch, mit einem Agilent XF24 System22,23,24 gemessen. Diese Studien mit Rattenzellen im Gegensatz zur Maus-abgeleitete Zellen wurden wahrscheinlich durchgeführt, wie die Rattenzellen in der Regel höhere Zellviabilität und Assay Reproduzierbarkeit, verglichen mit der Maus kardialen Myozyten hier studiert haben. Angesichts der Tatsache, dass gentechnisch veränderte Tiere vor allem in Mauslinien generiert wurden, bietet eine einfache und reproduzierbare Protokoll für bioenergetische Funktion bei Neugeborenen Maus Herzzellen, analysieren, diskutieren, wie wir in diesem Manuskript Studienmöglichkeiten Funktion der Mitochondrien in Maus kardialen Myozyten. Diese Methode kann leicht auf Daten, die führen können, zu verstehen, neue Mechanismen für bioenergetische Verordnung im Herzen, durch den Einsatz neuer oder vorhandener genetisch manipulierte Maus Linien25,26übersetzt werden.
In dieser Studie haben wir die Wirkung der Zellzahl und Dichte auf OCR getestet. Wie in Abbildung 4 bdargestellt, ähnelte OCR in Brunnen mit 10 x 103, 20 x 103und 30 x 103 Zellen/gut, gemessen. Da die Beschichtung 30 x 103 Zellen/Well konfluierende Brunnen innerhalb eines Tages nach der Aussaat produziert, empfiehlt es sich, Teilen von Zellen zwischen 10 x 103 30 x 103 Zellen/gut in eine 96-Well-Platte für die OCR-Assay. Interessanterweise fanden wir, dass 3 h Serum verhungern OCR verringert. Wachstumsfaktoren sind dafür bekannt, aktiviert Glykolyse und Sauerstoff-Verbrauch-27zu erhöhen. Es wurde auch berichtet, dass Wachstumsfaktoren insgesamt verbessern Zellaktivität und Kontraktion der Herzmuskelzellen3,28. Cardiomyocyte Kontraktion ATP Erzeugung benötigt2, die Sauerstoff-Verbrauch abhängig. Daher zufolge diese Daten Serum Hunger Sauerstoffverbrauch durch Inaktivierung von Kardiomyozyten verringert. Wir würden empfehlen, die Wirkung des Serums Hunger auf OCR in eigene experimentelle Einstellung testen.
Wie bereits erwähnt, spielen die Mitochondrien Schlüsselrollen in Herzfunktion. Identifizierung von neuartigen Regulatoren und Wege oxidativen Stoffwechsel regulieren könnte daher ein Mittel, um neue therapeutische Targets für die Behandlung von Herzinsuffizienz zu identifizieren bereitstellen. Da eine 96-well-Format die Möglichkeit, eine größere Anzahl von Testbedingungen im Vergleich zu einer 24-well-Format testen vorsieht, könnte dieses Protokoll auch ein hoher Durchsatz-Bildschirm zur Identifizierung neuartige bioenergetischer Regulierungsbehörden in Kardiomyozyten29 leicht angepasst werden . So, durch die Kombination unserer Protokoll mit genetisch manipuliert neonatale Kardiomyozyten, wie diejenigen, die mitochondriale Mutationen30haben, könnten interessante Studien die Auswirkungen von chemischen Verbindungen oder cDNA-Bibliotheken auf OCR in auf dem Bildschirm Wild-Typ Vs. metabolisch-Defekte Herzmuskelzellen.
Wir sind uns bewusst, dass Neugeborene und Erwachsene Kardiomyozyten viele unterschiedliche Eigenschaften und Funktionen des Stoffwechsels31, einschließlich Ausdruck Niveaus von Glukose und Fettsäuren metabolische Enzyme32haben. Daher ideal um in-vitro-kultivierte Herzmuskelzellen als Modellsystem des intakten Herzens zu verwenden, wäre es wichtig, ein Protokoll, um effizient analysieren OCR in adulten Kardiomyozyten weiterzuentwickeln, so dass man ihre oxidative Kapazität vergleichen könnte und Eigenschaften mit Neugeborenen Kardiomyozyten. Zukünftige Studien werden müssen fortgesetzt werden, um diese Methode zu einem reproduzierbaren System mit Erwachsenen kardialen Myozyten anzupassen.
Zusammenfassend lässt sich sagen zeigen wir eine einfache und reproduzierbare Protokoll für die Analyse von Sauerstoff-Verbrauch mit primären kultivierten Maus Neugeborenen Maus Herzzellen. Mithilfe dieses Protokolls konnten wir erfolgreich isolieren und Kultur Maus neonatale Kardiomyozyten und Ausführen dieser OCR-Assay mit einem 96-Well-Format extrazelluläre Flussmittel Analyzer System. Unser Protokoll gibt hohe Rentabilität und vor allem konstant reproduzierbare Ergebnisse. Obwohl die aktuelle Studie vor allem auf Sauerstoffverbrauch und eine mitochondriale Stresstest ausgerichtet ist, könnte das Protokoll leicht angepasst werden, Fettsäureoxidation und Glykolyse in Herzmuskelzellen zu analysieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Wir möchten alle Ross Lab und Murphy Lab Mitgliedern danken. Diese Arbeit wird unterstützt durch die American Heart Association (14SDG17790005), Y.C NIH (HL115933, HL127806) und VA Verdienst (BX003260), R.S.R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antimycin A | SIGMA | A8674 | Inhibits complex III of the mitochondria |
| Cell strainer 100 μm pores | FALCON | 352360 | To capture undigested tissue |
| Collagenase type II | Worthington | LS004176 | To make collagenase digestion solution |
| D-Glucose | SIGMA | 75351 | To make mitochodnrial stress test medium |
| DMEM high glucose | Life technologies | 11965-092 | To make cell culture medium |
| DMEM without NaHCO3, Glucose, pyruvate, glumanine, and Hepes | SIGMA | D5030-10X1L | To make mitochodnrial stress test medium |
| FCCP (Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) | SIGMA | C2920 | Uncouples mitochondrial respiration |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life technologies | 26140-079 | To make cell culture medium |
| Fibronectin from bovine plasma | SIGMA | F1141-5MG | To make coating solution for tissue culture plates |
| Fine scissors | Fine Sciences Tools | 14060-10 | For dissection of hearts |
| Gelatin from porcine skin | SIGMA | G-1890 | To make coating solution for tissue culture plates |
| HBSS (Hank's balanced salt solution, without Ca2+, Mg2+) | Cellgro | 21-022-CV | To wash hearts and make pre-digestion and collagnase digestion solution |
| HEPES (1 M) | Fisher scientific | 15630080 | To make mitochodnrial stress test medium |
| Horse serum | Life technologies | 26050-088 | To make cell culture medium |
| L-Glutamine | SIGMA | G-3126 | To make mitochodnrial stress test medium |
| M-199 | Cellgro | 10-060-CV | To make cell culture medium |
| Moria spoon | Fisher scientific | NC9190356 | To wash hearts |
| Oligomycin | SIGMA | 75351-5MG | Inhibits mitochondrial ATP synthase |
| RIPA buffer | Fisher scientific | 89900 | To lyse the cells for protein assay |
| Rotenone | SIGMA | R8875 | Inhibits complex I of the mitochondria |
| Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer |
Agilent | Device used to analyze oxygen consumption rate | |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102601-100 | Package of flux analyzer culture plates, sensor cartridges, and calibrant |
| Sodium pyruvate | SIGMA | P2256 | To make mitochodnrial stress test medium |
| Straight scissors | Fine Sciences Tools | 91401-12 | For dissection of hearts |
| Syringe filter 0.2 μm size | For sterile filtration of digestion medium | ||
| Trypsin | USB Corporation | 22715 25GM | To make pre-digestion solution |
References
- Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart. Physiological Reviews. 85 (3), 1093-1129 (2005).
- Wang, K., et al. Mitochondria regulate cardiac contraction through ATP-dependent and independent mechanisms. Free Radical Research. , 1-10 (2018).
- Kolwicz, S. C. Jr, Purohit, S., Tian, R. Cardiac metabolism and its interactions with contraction, growth, and survival of cardiomyocytes. Circulation Research. 113 (5), 603-616 (2013).
- Rosca, M. G., Hoppel, C. L.
- Wai, T., et al. Imbalanced OPA1 processing and mitochondrial fragmentation cause heart failure in mice. Science. 350 (6265), aad0116 (2015).
- Bayeva, M., Gheorghiade, M., Ardehali, H. Mitochondria as a therapeutic target in heart failure. Journal of American College Cardiololgy. 61 (6), 599-610 (2013).
- Camara, A. K., Bienengraeber, M., Stowe, D. F. Mitochondrial approaches to protect against cardiac ischemia and reperfusion injury. Frontiers in Physiology. 2, 13 (2011).
- Brown, D. A., et al. Expert consensus document: Mitochondrial function as a therapeutic target in heart failure. Nature Reviews Cardiology. 14 (4), 238-250 (2017).
- Zhou, P., Pu, W. T.
- Parameswaran, S., Kumar, S., Verma, R. S., Sharma, R. K. Cardiomyocyte culture - an update on the in vitro cardiovascular model and future challenges. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 91 (12), 985-998 (2013).
- Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes. Journal of Vissualized Experiments. 10 (114), (2016).
- Gibbs, C. L., Loiselle, D. S.
- Mdaki, K. S., Larsen, T. D., Weaver, L. J., Baack, M. L. Age Related Bioenergetics Profiles in Isolated Rat Cardiomyocytes Using Extracellular Flux Analyses. PLoS One. 11 (2), e0149002 (2016).
- Neary, M. T., et al. Hypoxia signaling controls postnatal changes in cardiac mitochondrial morphology and function. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 340-352 (2014).
- Hill, B. G., Dranka, B. P., Zou, L., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V. M. Importance of the bioenergetic reserve capacity in response to cardiomyocyte stress induced by 4-hydroxynonenal. Biochemical Journal. 424 (1), 99-107 (2009).
- Sreejit, P., Kumar, S., Verma, R. S. An improved protocol for primary culture of cardiomyocyte from neonatal mice. In vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 44 (3-4), 45-50 (2008).
- AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. , Available from: https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf (2013).
- Manso, A. M., et al. Talin1 has unique expression versus talin 2 in the heart and modifies the hypertrophic response to pressure overload. Journal of Biological Chemistry. 288 (6), 4252-4264 (2013).
- Wang, G. W., Kang, Y. J. Inhibition of doxorubicin toxicity in cultured neonatal mouse cardiomyocytes with elevated metallothionein levels. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 288 (3), 938-944 (1999).
- Divakaruni, A. S., et al. Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2013).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS One. 6 (7), e21746 (2011).
- Sansbury, B. E., Jones, S. P., Riggs, D. W., Darley-Usmar, V. M., Hill, B. G. Bioenergetic function in cardiovascular cells: the importance of the reserve capacity and its biological regulation. Chemico-Biological Interactions. 191 (1-3), 288-295 (2011).
- Sharp, W. W., et al. Dynamin-related protein 1 (Drp1)-mediated diastolic dysfunction in myocardial ischemia-reperfusion injury: therapeutic benefits of Drp1 inhibition to reduce mitochondrial fission. FASEB Journal. 28 (1), 316-326 (2014).
- Tigchelaar, W., et al. Hypertrophy induced KIF5B controls mitochondrial localization and function in neonatal rat cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 97, 70-81 (2016).
- Graham, B. H., et al. A mouse model for mitochondrial myopathy and cardiomyopathy resulting from a deficiency in the heart/muscle isoform of the adenine nucleotide translocator. Nature Genetics. 16 (3), 226-234 (1997).
- Zhao, Y. Y., et al. Defects in caveolin-1 cause dilated cardiomyopathy and pulmonary hypertension in knockout mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (17), 11375-11380 (2002).
- Vander Heiden, M. G., et al. Growth factors can influence cell growth and survival through effects on glucose metabolism. Molecular and Cellular Biology. 21 (17), 5899-5912 (2001).
- Detillieux, K. A., Sheikh, F., Kardami, E., Cattini, P. A. Biological activities of fibroblast growth factor-2 in the adult myocardium. Cardiovascular Research. 57 (1), 8-19 (2003).
- Wang, R., et al. The acute extracellular flux (XF) assay to assess compound effects on mitochondrial function. Journal of Biomolecular Screening. 20 (3), 422-429 (2015).
- Dai, D. F., et al. Age-dependent cardiomyopathy in mitochondrial mutator mice is attenuated by overexpression of catalase targeted to mitochondria. Aging Cell. 9 (4), 536-544 (2010).
- Ritterhoff, J., Tian, R. Metabolism in cardiomyopathy: every substrate matters. Cardiovascular Research. 113 (4), 411-421 (2017).
- Uosaki, H., Taguchi, Y. H. Comparative Gene Expression Analysis of Mouse and Human Cardiac Maturation. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 14 (4), 207-215 (2016).
