Summary
ここでは、高感度で非放射性トレーサーを用いてマウスの糸球体透過性を試験するプロトコルを提示する。この方法は、小さな尿量で反復的な尿分析を可能にします。
Abstract
尿中のアルブミンの損失(アルブミン尿)は、心血管の結果を予測します。生理学的条件下では、少量のアルブミンを糸球体で濾過し、吸収限界に達するまで管状系で再吸収する。病理学的アルブミン濾過の早期増加は、したがって、アルブミン尿を分析することによって見逃されがちである。したがって、糸球体パーマ選択性をテストするためにトレーサーを使用することは有利と思われる。蛍光標識標識フッ素イソチオシアネート(FITC)-ポリスクロース(すなわち、FITC-Ficoll)は、糸球体透過性を研究するために使用することができる。FITC-ポリスクロース分子は糸球体によって自由に濾過されるが、管状系では再吸収されない。マウスおよびラットにおいて、FITC-ポリスクロースは、技術的に複雑な手順(すなわち、放射性測定、高性能液体クロマトグラフィー[HPLC]、ゲル濾過)を用いて糸球体透過性のモデルで調査されている。我々は、マウスにおけるFITC-ポリスクロース70(アルブミンのサイズ)に対する糸球透過性の早期および小さな増加をテストするために、FITC-ポリスクローストレーサーベースのプロトコルを改変し、促進した。この方法は小さい尿容積(5 μL)の反復的な尿の分析を可能にする。このプロトコルは、トレーサーFITC-ポリスクロース70が静脈内に適用され、尿が単純な尿カテーテルを介して収集される方法に関する情報を含む。尿は蛍光プレートリーダーを介して分析され、尿濃度マーカー(クレアチニン)に正規化され、技術的に複雑な手順を回避します。
Introduction
糸球体濾過バリア内の機能的または構造的欠陥は、アルブミンに対する糸球透過性を増加させ、尿中のアルブミンの検出(アルブミン尿)をもたらす。アルブミン尿は心血管の転帰を予測し、糸球体損傷1の重要なマーカーである。アルブミン尿の低レベルでさえ、正常範囲内に横たわって、増加した心血管リスク1に関連している。
生理学的条件下では、アルブミンは糸球体を通して濾過され、管状システム2、3でほぼ完全に再吸収される。マウスでは、尿中のアルブミンの検出は、通常、尿採取の24時間からアルブミン酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によって行われる。24時間の尿採取またはスポット尿からの尿を使用すると、アッセイ感受性の問題のためにアルブミン濃度の小さな違いが見逃される可能性があります。したがって、ほとんどの研究者は、毒素、薬物、腎外科による強い腎損傷によってアルブミン尿が誘発される動物モデルを使用する。
したがって、糸球体透過性の小さくて一過性の変化を検出する敏感な方法の発見は、フィールドにとって非常に重要である。Rippeらは、蛍光標識トレーサー、すなわちFITC-ポリスクロース70(すなわち、FITC-Ficoll 70)をアルブミン4の大きさで適用することにより、糸球体透過性を試験するラットモデルを提示した。トレーサーアプリケーションは、糸球体透過性(数分以内)の短期的な変化のテストを可能にし、非常に敏感な4.2つの研究は、マウス5、6でトレーサー法を使用している。その利点にもかかわらず、この方法は、残念ながら、欠点を持っています:それは技術的に非常に複雑で、放射性、および侵襲的です。尿のさらなる分析は、ゲル濾過またはサイズ排除HPLC5、6を用いてのみ行う。
本論文では、蛍光標識FITC-ポリスクロース70を用いてマウスの糸球体透過性を測定する代替的、敏感、非放射性、および高速方法を提示する。経尿道カテーテルを導入することにより、尿採取は膀胱穿刺、尿道切除術、および上腹部カテーテル塗布よりも侵襲性が低く、少なくとも30分毎に尿採取が可能である。蛍光プレートリーダー。尿中のトレーサー濃度は、酵素クレアチニンアッセイを使用して尿中のクレアチニン濃度に正規化される。
したがって、この新しい方法は、糸球体透過性の増加と早期糸球体損傷を研究するための敏感なツールを提供しています。
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Protocol
調査は、実験動物のケアと使用に関するガイド(米国国立衛生研究所第85-23号、1996年改訂)に記載されたガイドラインに従って実施されました。すべての動物実験は、関連する機関の承認に従って行われました(州政府ランデサムト・フュル・ナチュラル、ウムウェルト・ウンド・ヴェルブラウチャーシュッツ[LANUV]参照番号84-02.04.2012.A397)。
1. 機器、ソリューション、機器の準備
- 0.9%の滅菌塩化ナトリウム(NaCl)でFITC-ポリスクロース70を10mg/mLの最終濃度(すなわち、NaClの10mLで100mg)に再構成する。
- 透析FITC-ポリスクロース70溶液は、4°Cで一晩フリーFITC分子を除去する(分子量遮断[MWCO]10,000)。一定の撹拌下でFITC-ポリスクロース70の10mL当たり0.9%の無菌NaClの1Lを使用してください。光から守る。透析FITC-ポリスクロース70をアリコートし、-20°Cで保存する。
- FITC-ポリスクロース70ボルスの場合は、10mg/mL FITC-ポリスクロース70溶液の4 μLを0.9%NaClの996 μL(FITC-ポリスクロース70:40 μg/mL)に加えます。
- 平衡注入液の場合、10mg/mL FITC-ポリスクロース70溶液の20 μLを0.9%の無菌NaClの9.98 mLに加え、最終的な濃度20μg/mLにします。
- 実験溶液の場合、注入液に薬物または物質を添加する(例えば、アンジオテンシンII[Ang II][100 ng/kg/min])を25gマウス用に、1mM溶液のAng IIの3 μLを添加する。
- 手術のために、1つの剃り具、2つの外科クランプ、外科はさみの1組、2つのピンセット、2つの細かいピンセット、1組の細かいはさみ、および綿棒を準備する。ライゲーション手順のために2本の10cmシルク糸(4-0~6-0)を準備します。
- 中央静脈カテーテルの配置のために、21 G針で10 mLシリンジを準備する。針の先端を長さ30cmのカテーテル(内径[ID]0.58mm)に入れておきます。0.58 mm カテーテルを 10 cm カテーテルに接続します(ID は 0.28 mm)。小さいカテーテル斜めの先端を切り、頸静脈に導入される鋭い先端を作成する。
- 麻酔を調出す(すなわち、経皮麻酔ケタミン、体重100mg/kg、キシラジン、体重5mg/kg)を調出す。
- 針を捨て、先端からカテーテル1cmをマーキングすることにより、22Gアンジオカテーテルを準備します。加熱パッドを37°Cに予熱します。
- 血圧装置を準備し、必要に応じて血圧測定膜を変更します。
2. 準備段階
- 尿カテーテル
注: セクション 2.1 は、Reis ら 7.で説明したプロトコルに従います。図1および補足図1は、雌マウスにおける尿カテーテルの配置を示す。- ケタミン/キシラジンでマウスを麻酔する(ステップ1.8参照)。適切な麻酔を確認するためにつま先ピンチテストを使用してください。麻酔を維持するために、60分後に麻酔(例えば、投与量の半分)を繰り返し、つま先のピンチテストが反射的な引き出しをもたらさない場合に適切な麻酔が確認される。
注:このプロトコルではメスFVBマウスが使用される。 - マウスを37°Cの加熱パッドに後膜の再組み立てに置きます。下腹部を締め、尿道骨(例えば、顕微鏡下)を見つける。
- 22Gアンジオカテーテルのカテーテルのプラスチック部分を使用し、キシロカインゲルで潤滑します。遠位尿道軸を平行にしながら尿道骨に3mm入れ注意深く導入する(図1A)。
- 尿道骨内に先端を保ち、尿道の軸を維持することにより、アンジオカテスター180°の上部を回します(図1B)。
- カテーテル7mmをさらにマウスに入れ、膀胱内に入れられるようにする(図1C)。カテーテルを抵抗を超えて強制しないでください。抵抗が感じられた場合は、最初からカテーテルの位置を修正します。尿カテーテルの位置が正しい場合、尿は既にカテーテル内に現れる可能性があります。
- 1.5 mLの茶色のチューブをアンジオカテレータの上に置き、尿を採取します。尿の生産を高めるために皮下に0.9%NaClの1 mLを適用する。
- ケタミン/キシラジンでマウスを麻酔する(ステップ1.8参照)。適切な麻酔を確認するためにつま先ピンチテストを使用してください。麻酔を維持するために、60分後に麻酔(例えば、投与量の半分)を繰り返し、つま先のピンチテストが反射的な引き出しをもたらさない場合に適切な麻酔が確認される。
- 中央静脈カテーテル
- マウスの首を剃り、外科医に向かって頭で満たして置きます。テープでマウスの頭部をハイパーエクステンドします。
- 70%イソプロパノールで首を消毒する。つまみとはさみを使って、顎の下に小さな皮膚切開(5mm)を作ります。胸骨の真ん中に達するまで、胸骨の方向に約1cmの皮膚をカットします。
- はさみを使って、首の右側の皮膚を慎重に解剖します。マウスの右側に皮膚の長方形の切開を行い、首の軟部組織を露出させます。はさみとツイザーを使います。2つのクランプでスキンフラップを固定します。
注:頚静脈は甲状腺の左側に沿って走るか、甲状腺の右葉によってわずかに覆われている。この手順の後、手術のために顕微鏡を使用してください。 - 細かいインテッツァーの先端を使用して、鈍い準備によって慎重に頚静脈を露出させる。静脈枝の損傷を避けてください。
注:細かいはさみで組織を取り除く必要があるかもしれません。はさみを使用して組織を除去する場合は、出血のリスクが高まるので注意が必要です。 - 目に見える頚静脈(マウスの頭部に向かって)の遠位部分にシルク糸(4-0~6-0)で合字を置き、閉じます。糸をテープで固定して合字に張力を入れ、頸静脈にわずかな張力を確保します。頸静脈の近位部分の周りに合字を準備します。
- カテーテルを平衡注入液(ステップ1.4参照)で充填し、カテーテルが頚静脈を整列するようにテープでカテーテルを固定します。空気塞栓症を避けるために気泡のための制御。
- 挿入部位で細かいピンセットで頚静脈を持ち上げます(挿入部位は合字の1~2mm近位です)。チューブを頚静脈に平行に合わせます。内膜を目指して頸静脈を穿刺し、約2~4mmの挿入を行い、頸静脈の軸を平行にする。活発な動きを避けてください。
- 合字を閉じてカテーテルを固定します。顕微鏡を通して注意深く見ることによって合字の堅さのための制御。手術の現場に湿った綿棒を置きます。
- 血圧測定
- マウスが後部のリカムに横たわっている間、マウスの尾の下部にテールカフを置きます。測定を開始し、1時間あたり10倍繰り返します。測定値から平均を作成します。
- 血圧測定が正しくないと思われ、誤ったデータが生成される場合は、テールカフの位置を調整します。
3. 平衡化段階
- 平衡化段階が始まる前に尿採取管を変更し、氷の上に置きます。
- 21G針と大きなカテーテル(0.58mmのID)でFITC平衡相溶液で満たされた10 mLシリンジ(ステップ1.4参照)を導入し、シリンジポンプに入れておきます。
- 綿棒を折りたたみ、頚静脈に導入される小器のカテーテル(0.28 mmのID)のまわりでそれを置く。綿棒の中にカテーテルを置きます。逆行性血流または空気塞栓症を廃止するために綿棒の上にクランプを置きます。27 G 針を FITC ボーラスで満たされた 1 mL の注射器で小容器カテーテルの端に接続します。
- クランプを開き、FITCボーラス(100 μL)を適用します。クランプをもう一度閉じ、より大きなカテーテルを小さいカテーテルに接続します。シリンジポンプを0.008 mL/min(0.480 mL/h)で起動します。注入を60分間続けます。
4. 実験段階
注:この段階では、糸球体パーマ選択性に対する薬物の影響を調べることができる。
- 尿管(時時点0分)を別の1.5 mL茶色の管に変更します。小さい容器のカテーテルのまわりで綿棒を置き、ステップ3.3に示すようにクランプを閉じる。
- 大きなカテーテルを小容器カテーテルから取り外します。注射器を実験段階ソリューションに変更します(ステップ1.5を参照)。大きいカテーテルが平衡溶液で満たされるように注入ポンプを動かしてみましょう。
- 空気塞栓症を避けながらカテーテルを再接続し、クランプを再び開きます。シリンジポンプを0.008 mL/minで起動します。
- 注射器ポンプを60分間動かし続け、その後尿管内に尿を回収する(尿60分)。尿管を氷の上に置きます。
- 麻酔中に頸部脱臼によってマウスを犠牲にする。処分する前に、マウスが死んでいることを確認するために5分間観察されます。
5. 尿分析
-
蛍光測定
- 尿プールを解凍し、リン酸緩衝生理食生(PBS)で1:10に希釈します。
注:尿プールは、代謝ケージ内の12-24時間の尿コレクションで健康なマウスから収集された尿のプールです。 - 蛍光測定の基準を準備します。10個の茶色の1.5mLチューブを取り、ブランク(1:10希釈尿プール)と次のFITC-ポリスクロース70濃度(0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80、および160 μg/mL)にラベルを付けます。
- 希釈尿プールのピペ246 μLを1.5mLブラウンチューブに入れ、FITC-ポリスクロース70ストック濃度の4μLを加え(ステップ1.1参照)、最終的な濃度を160μg/mL FITC-ポリスクロース70に得る。希釈された尿プールのピペ状100 μLを他のすべてのチューブに入れます。
- 160 μg/mL FITC-ポリスクロース70チューブの100 μLを80 μg/mLチューブにピペッティングして1:2を希釈し、他の濃度を継続します。希釈された濃度の適切な混合物を保証する(例えば、継続する前にチューブを渦にすることによって)。
- 希釈された尿プールでマウス尿サンプル(0分、60分)1:10を希釈します。
- 各標準的なFITC-ポリスクロース70濃度のピペット5μLと、黒の384ウェルプレートに三重としてマウス尿サンプルの。気泡を避けるために、1,000 x gでプレートを15sで遠心分離します。
- プレートリーダーの384ウェルプレートを分析します。496 nmで励起を行い、525nmで蛍光を測定します。
- 尿プールを解凍し、リン酸緩衝生理食生(PBS)で1:10に希釈します。
-
クレアチニン測定
- 製造元の指示に従ってください。簡単に言えば、100 mMクレアチニン標準溶液の10 μLを990 μLのクレアチニンアッセイバッファーで希水ミン標準溶液を希釈して10μLを希水ミン標準溶液を調べて、1mM標準溶液を調用します。
- 1 mMクレアチニン標準溶液の0、2、4、6、8、および10 μLを96ウェルプレートに加え、それぞれ0、2、4、6、8、および10nmol/ウェル規格を生成します。各ウェルにクレアチニンアッセイバッファを追加し、体積を50μLにします。
- クレアチニンアッセイバッファーの42-44 μL、クレアチニンの2μL、クレアチニン酵素ミックスの2μL、クレアチニンプローブの2μLを加えて反応ミックスを調製します。ブランクの場合は、クレアチニンアッセイバッファーの44 μL、クレアチニン酵素ミックスの2μL、クレアチニンプローブの1-2 μLを使用します。
- 96ウェルプレートの各ウェルに適切な反応ミックスの50 μLを加え、37°Cの水平シェーカーで60分間インキュベートします。インキュベーション中にプレートを光から保護します。プレートリーダー上の570 nmで吸光度を測定します。
- すべての読み取り値から空白の値を減算してクレアチニン濃度を計算します。結果は単位ナノモル/マイクロリットルを有する。クレアチニンの濃度にクレアチニンの分子量(113.12 ng/nmol)を掛け、単位ナノグラム/マイクロリットルを受け取ります。
6. データ分析
- 標準曲線からFITC-ポリスクロース70尿濃度を計算します。
- 代表的な尿試料中のクレアチニン濃度にFITC-ポリスクロース70尿濃度を参照してください。
- 尿60分サンプルを対照および処置されたマウスの尿0分サンプルに参照する。
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Representative Results
図2に示すように、マウスにおける糸球体透過性を試験する方法は、3つの段階で構築されている。第1段階は、尿カテーテルと中央静脈カテーテルが置かれる調製段階と呼ばれる。第2段階は平衡化段階と呼ばれ、FITC-ポリスクロース70の静脈内ボーラス注入から始まり、続いてFITC-ポリスクロース70を60分間連続注入する。最後のフェーズは実験段階と呼ばれます。この段階では、FITC-ポリスクロース70の注入が継続され、薬物または他の物質が球体透過性に影響を与えるため試験することができる。尿は各段階の終わりに集される。
このトレーサーモデル内の糸球体透過性を調べるためには、粘膜を傷つけずに尿カテーテルを適切に配置することが不可欠です。女性のマウス膀胱への尿カテーテルの配置を図1で示す。カテーテルは尿道骨に3mm入れられ、頭蓋尿道軸と平行である(図1A)。カテーテルをマウスの尾部に向けて180°回し(図1B)、さらに膀胱に7mmを導入し、マウス脊椎と平行に(図1C,D)。
上述したように、マウスにおける糸球体透過性を試験する以前の方法は、尿試料5、6からのFITC-ポリスクロース70シグナルを精製するためにHPLCを用いて用いった。この方法では、トレーサーの以前の精製を行わずに蛍光測定を行うように、マウス尿中のPBS、マウス尿、およびFITC-ポリスクロース70を分析した。図3Aは、325nmの蛍光ピークを有するPBSの蛍光スキャンを示し、これは290nmでの励起フラッシュの効果であると思われる。在来マウス尿の蛍光スキャンは、395nm(図3B)で蛍光最大値を示す。マウスの尿に溶解したFITC-ポリスクロース70は、蛍光最大値を525nm(図3C、D)で表示する。図3Cは、マウス尿中のFITC-ポリスクロース70の蛍光測定を妨げないマウス尿を示す。FITC-ポリスクロース70の濃度の上昇は、蛍光強度の増加を示す(図3E)。
この方法が糸球体透過性の違いを検出できることを証明するために、Ang IIはモデルの実験段階で適用された。Ang IIは、非血圧関連用量での連続投与後60分でマウスの糸球透過性を増加させた(図4A,B)。Ang IIによる糸球透過性の増加は、Ang II受容体遮断薬(ARB)、すなわちカンデサルタン(図4A)によって遮断され得た。Ang IIウォッシュアウトは糸球体透過性を低下させた(図4A)。血圧はテールカフ法で測定し、群間に有意な差を示さなかった(図4B)。ポリスクロース70-およびFITC-ポリスクロース70注入動物は、FITC-ポリスクロース70-およびAng II処理動物の対照として機能する(図4C)。
図1:雌マウスにおける尿カテーテルの配置。マウス腹部の横図。(A)印付き潤滑カテーテルは、雌マウスの外尿道骨に3mmを導入する。尿道の頭蓋骨軸はカテーテルと平行である。左人差し指で下腹部の注意深い緊張は、外部尿道骨へのカテーテルの導入を容易にする。(B) カテーテルはマウスの尾に向かって180°回される。カテーテルの先端は外的な尿道の骨の中で3mmのままである。(C)カテーテルは現在、膀胱にさらに7ミリメートル導入される。カテーテルの方向はマウス脊柱と整列される。(D) マウス腹部の腹部図。カテーテルはマウスに10のmmを置かれる。(E) 尿は膀胱に正しい挿入で現れる。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: タイムライン上の実験手順の概略図。マウスのナルコシスの後、尿カテーテルが置かれる。中央静脈カテーテルを移植し、ベースライン尿が得られる(0分)。その後、FITC-ポリスクロース70ボルスは、中央静脈カテーテルを介して適用され、FITC-ポリスクロース70の連続注入が開始される。FITC-ポリスクロース70の平衡化相は60分続き、平衡化段階(0分)後および実験段階開始前に尿を採取する。この段階では、薬物または他の物質(アンジオテンシンIIのような)を適用することができる。実験段階の終わりに、尿は分析のために得られる(60分)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:FITC-ポリスクロース70の有無にかかわらずPBSおよびマウス尿の蛍光。(A)PBSの蛍光周波数スキャン(290nmの励起、325-700nmの発光)は325nmのシグナルを示し、これは290nmでの励起フラッシュの効果であると思われる。(B) マウスネイティブ尿の頻度スキャン(尿プールは1:10および1:20で希釈)において、尿中タンパク質自己蛍光によって引き起こされる可能性が高い395nmの最大値を有するシグナルがある。(C)FITC-ポリスクロース70(40μg/mL)を含有するマウス尿は、尿の自己蛍光の測定を妨げない525nmのシグナルピークを示す。(D)発光波長に応じてFITC-ポリスクロース70蛍光ピークの倍率。FITC-ポリスクロース70(1.25、2.5、5、10、20、および40 μg/mL)の異なる濃度が表示されます。(E)FITC-ポリスクロース70濃度の増加は、525nmの発光時の蛍光強度の増加を示す。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:アンジオテンシンII(Ang II)は糸球体透過性を増加させる。(A) Ang IIは、マウスの尿中のFITC-ポリスクロース70検出によって測定されたマウスの糸球体透過性を有意に増加させる(平均+SEM;n = 5;p < 0.004, クルスカル・ウォリス試験によってテストされました)尿中のFITC-ポリスクロース70濃度は、尿クレアチニン濃度に参照された。白い列(0分)は、Ang II刺激の開始前にFITC-ポリスクロース70レベルを表し、黒い列(60分)は、Ang II刺激開始後60分後にFITC-ポリスクロース70レベルを表し、灰色の列(120分または+60分)を表します。アンII刺激の追加60分またはアンIIウォッシュアウトの60分。(B)収縮期血圧をテールカフ法(平均+SEM)によりモニターした。対照群とAng II処置群との間に有意な血圧差は示されなかった。(C)ポリスクロース70及びFITC-ポリスクロース70は、マウスにおいて糸球体透過性を有意に変化させない。Ang IIはマウスの球体透過性を有意に増加させる(平均+SEM;n = 7、p < 0.005)。この図は、Konigshausenら8.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図1:雌マウスにおける尿カテーテルの配置の概略図。マウス腹部の横図。(A)印付き潤滑カテーテルは、雌マウスの外尿道骨に3mmを導入する。尿道の頭蓋骨軸はカテーテルと平行である。左人差し指で下腹部の注意深い緊張は、外部尿道骨へのカテーテルの導入を容易にする。(B) カテーテルはマウスの尾に向かって180°回される。カテーテルの先端は外的な尿道の骨の中で3mmのままである。(C)カテーテルは現在、膀胱にさらに7ミリメートル導入される。カテーテルの方向はマウス脊柱と整列される。(D) マウス腹部の腹部図。カテーテルは、雌マウスの外尿道骨に3mmを導入する。(E)カテーテルを180°回した後、さらに7mmをマウス膀胱に導入する。カテーテルの方向はマウス脊柱と整列される。この図は Reis et al.7から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
提示された方法は、研究者がトレーサーを使用して非常に敏感な方法でマウスの糸球体透過性をテストすることを可能にする。この方法では、糸球体透過性の短期的な増加は、少量の尿のみを使用して診断することができる。この技術をうまくマスターするための最も重要なステップは、1)マウス手術、特に中枢静脈のカナンテーションにおける手動専門知識の開発、2)粘膜に害を与えることなく尿カテーテルを配置すること、および3)取り扱いに関する手動の専門知識です。サンプルの小さい容積が付いている384ウェル版。
中央静脈カテーテルを配置する場合、カテーテルが頸静脈に浸透しないことが不可欠である。浸透を避けるために、遠位合字(ステップ2.2.7を参照)で頸静脈に緊張を置き、細かいピンセットで頸静脈を持ち上げて頸静脈の内気を拡張することをお勧めします。挿入部位を小さく保つために、カテーテルを挿入している間グロスの動きを避け、余分なティッシュを取除くことによって外科分野の最もよい眺めを常に保障しなさい。尿カテーテルの配置の最も重要なステップは膀胱への最終的な挿入である。抵抗が感じられた場合は、粘膜に誤った痕跡や損傷を引き起こさないために、最初からやり直すことをお勧めします。カテーテルの回転、潤滑、および穏やかな動き、ならびに訓練は、困難な場合7で助ける。
FITC-ポリスクロース70は、スクロースおよびエピクロロヒドリン9の蛍光標識、分岐、および架橋ポリマーである。これは、球状の形状と低い形状の非対称を有する球状分子として溶液中で振る舞うが、分子変形性9.他のショ糖分子と同様に、FITC-ポリスクロース70は糸球体によって濾過され、管状系4で再吸収されない。注入中のFITC分子のフリーを避けるために、マウスに塗布する前にFITC-ポリスクロース70溶液を透析した。透析されたFITC-ポリスクロース70分子を-20°Cで数ヶ月間保存することが可能です。FITC-ポリスクロース70は、このおよび他のプロトコルで静脈内に適用されるので、血液が尿サンプルを汚染しないことが不可欠である。したがって、尿カテーテルは、実験内の注意と抗凝固物質を慎重に配置する必要があります。FITC-ポリスクロース70の標準曲線は、最も正確な結果を得るためにマウス尿プールに溶解されます。異なる実験時点およびグループ間での尿の濃度差のために、FITC-ポリスクロース70濃度は、尿濃度を反映する尿中のマーカー(例えば、クレアチニン)を参照する必要があります。酵素アッセイにおけるクレアチニンの測定に対するFITC-ポリスクロース70蛍光の干渉はありそうにない。
FITC-ポリスクロース70蛍光の分析は、これらのプレートで5μLの小さな尿量を測定することができる黒の384ウェルプレートで行われるべきである。蛍光は測定可能なため、プレートを洗浄した後でも384ウェルプレート内で同じ井戸を再利用することはお勧めしません。気泡が蛍光の読み取りを妨げるので、プレートは分析の前に遠心分離する必要があります。あるいは、気泡はピペットの先端で手動で破壊することができる。
糸球体パーマ選択性をテストするためのポリスクロースの使用は、ほぼ40年前に10年前に説明された。蛍光標識ポリスクロースは、過去数年のラットでほぼ独占的に糸球体損傷研究で調査されている4,11,12,13,14,15 ,16,17,18,19,20.これは、マウスよりもラットの外科的処置が容易に起因する解剖学的理由を有する可能性がある。ラットでは、尿道検査は尿サンプル4、5、9、12、13、14、21を得るために使用される。血漿および尿サンプルを分析するために、プローブは高性能サイズの除外クロマトグラフィー4、5、9、12、13、14を受ける 、21.また、糸球体濾過速度(GFR)は、放射性51Cr-エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)4、5、9、12、13によって測定される。 、14、21.2つの以前の研究は、マウス5、6にFITC-ポリスクロース70を適用しました。マウスでは、上の尿カテーテルが膀胱6、20に導入される。尿および血漿プローブは、FITC-ポリスクロース70蛍光の分析の前にゲル濾過を行う。ラットと同様に、GFRは放射能6、20を介して分析した。マウスにおけるFITC-ポリスクロース70の適用に関する第2の出版物は、腸内透過性のモデルを用い、したがって、FITC-ポリスクロース70蛍光22のマウス尿を分析しなかった。したがって、提示された方法は、尿のサンプリングおよび分析を容易にするために改変された。尿サンプルは非侵襲的な経尿道尿カテーテルを通して容易に得ることができる。FITC-ポリスクロース70蛍光の尿分析は、以前の高性能サイズ排除クロマトグラフィーまたはゲル濾過なしで行われる。FITC-ポリスクロース70蛍光をマウス尿クレアチニンに参照することにより、放射性アッセイによるGFRの測定は必要ありません。
血圧の増加は糸球体透過性を高める。したがって、糸球体透過性を調べている間、血圧モニタリングは不可欠です。マウスの最も正確な血圧測定は凝固を防ぐためにカテーテルのヘパリニゼーションを必要とする中央動脈カテーテル23を介して行われる。低用量ヘパリニゼーションおよび尿カテーテル配置後に血液尿症の問題を経験しました。そこで、非侵襲的でヘパリニゼーションを必要としない血圧を測定するテールカフ技術を行うことにしました。麻酔の深さに応じて、テールカフ法による血圧モニタリングは時々困難です。血圧膜は事前にチェックする必要があり、マウスの位置は血圧記録の前に最適化する必要があります。
血圧測定の課題に加えて、この技術はまたFITC-ポリスクロース70の任意の単位を作り出すことによってまた制限される。これまでのところ、この技術は動物でのみ調査されており、したがって、ヒト糸球体フィルターとの関連性は依然として不明である。糸球体透過性の増加を調査する時間間隔は、マウスの尿産生に依存する。したがって、糸球体透過性の非常に短期的な増加(分単位)は、マウスの尿産生の欠如のために見逃される可能性がある。このプロトコルでは、FITC-ポリスクロース70は、糸球体濾過を介して血液から主に除去される尿クレアチニンに正規化されるが、近位管状分泌によっても。これは、この方法を用いて糸球体透過性を推定する際に誤差を生じ、ポリスクロース24の測定された分数クリアランスを減少させる。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
著者らは、クリスティーナ・シュヴァント、ブランカ・デュヴンジャク、ニコラ・クルに対し、卓越した技術支援と、蛍光スキャンに関する彼の助けに対するデニス・ソーン博士に感謝しています。この研究は、ドイツのフォルシュンゲミンシャフト(DFG)SFB 612 TP B18のL.C.R.およびL.S.への助成金によって支えられた。資金提供者は、研究の設計、データ収集と分析、出版の決定、または原稿の準備に何の役割も持ちはありませんでした。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Motic SMZ168 BL | Motic | SMZ168BL | microscope for mouse surgery |
| KL1500LCD | Pulch and Lorenz microscopy | 150500 | light for mouse surgery |
| Microfederschere | Braun, Aesculap | FD100R | fine scissors |
| Durotip Feine Scheren | Braun, Aesculap | BC210R | for neck cut |
| Anatomische Pinzette | Braun, Aesculap | BD215R | for surgery |
| Präparierklemme | Aesculap | BJ008R | for surgery |
| Seraflex | Serag Wiessner | IC108000 | silk thread |
| Ketamine 10% | Medistar | anesthesia | |
| Rompun (Xylazin) 2% | Bayer | anesthesia | |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm | Portex | 800/100/100 | Catheter |
| Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm | Portex | 800/100/200 | Catheter |
| Harvard apparatus 11 Plus | Harvard Apparatus | 70-2209 | syringe pump |
| BD Insyte Autoguard | BD | 381823 | urinary catheter |
| Multimode Detector DTX 880 | Beckman Coulter | plate reader | |
| 384 well microtiterplate | Nunc | 262260 | 384 well platte |
| Creatinine Assay Kit | Sigma-Aldrich | MAK080 | to measure creatinine concentration |
| 96 well plate | Nunc | 260836 | for creatinine assay |
| FITC-labeled polysuccrose 70 | TBD Consultancy | FP70 | FITC-ficoll |
| Angiotensin II | Sigma-Aldrich | A9525 | used to test glomerular permeability |
| BP-98A | Softron | for blood pressure measurement | |
| OTS 40.3040 | Medite | 01-4005-00 | heating plate for mouse surgery |
| Instillagel 6mL | Farco-Pharma GmbH | for urinary catheter | |
| Exacta | Aesculap | GT415 | shaver |
References
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