Summary
Представленный метод создает естественные травоядные поврежденные ткани растений путем применения личинок Manduca sexta к отдельным листьям картофеля. Ткань завода is assayed для выражения 6 homologs фактора транскрипции, включинных в предыдущих реакциях к травоядной насекомой.
Abstract
Мультитрофический характер исследований экспрессии генов травоядных насекомых требует большого количества биологических репликаций, создавая потребность в более простых, более рационализированных протоколах травоядных. Возмущения жевательных насекомых обычно изучаются в целых растительных системах. Хотя вся эта стратегия организма популярна, нет необходимости, если подобные наблюдения могут быть воспроизведены в одном отдельном листе. Предполагается, что основные элементы, необходимые для трансдукции сигнала, присутствуют в самом листе. В случае ранних событий в трансдукции сигнала, клетки должны только получать сигнал от возмущения и передавать этот сигнал соседним клеткам, которые анализируются на экспрессию генов.
Предлагаемый метод просто меняет сроки отсоединения. В целых экспериментах завода личинки ограничиваются одним листом, который в конечном итоге отделяется от растения и прослеживаются на экспрессию генов. Если порядок иссечения обращен вспять, от последнего в цельных исследованиях растений, до первого в отдельном исследовании, эксперимент по кормлению упрощается.
Solanum tuberosum var. Kennebec распространяется узловой передачи в простой среде культуры тканей и передается в почву для дальнейшего роста при желании. Листья вырезаются из родительского растения и перемещаются в петри блюда, где кормление проводится с личинок этапов M. sexta. Поврежденная ткань листьев анализируется для выражения относительно ранних событий в трансдукции сигнала. Анализ экспрессии гена определил факторы транскрипции Cys2-His2 (C2H2), подтверждающие успех использования отдельных листьев в ранних исследованиях. Метод легче выполнять, чем целые заражения растений и использует меньше места.
Introduction
Травоядный набор в движение ряд молекулярных событий, в ходе которых растение может как определить нападение и смонтировать соответствующий ответ для его выживания. Растение получает два основных сигнала от жевательных насекомых; один из физических повреждений тканей, а другой от насекомых конкретных веществ. Повреждение связанных молекулярных моделей (DAMPs) высвобождаются в ответ на повреждение, созданное личинки ротовых рта и вызвать четко определенные реакции раны, что приводит к увеличению гормона жасмоновой кислоты и транскрипции защитных генов1. Одним из самых известных DAMPs является systemin, полипептид, который образуется в результате расщепления большего белка просистемина после того, как лист ранен2,3. Реакция раны жасмониной кислоты дополнительно модулируется травоядными молекулярными паттернами (HAMPs), которые могут быть получены из слюны гусеницы, содержимого кишечника (регургитант) и кала (frass)4. Насекомые используют эти вещества, чтобы либо повысить или уклониться от обороны ответ5. Транскрипционные факторы затем ретранслировать сообщение от гормональныхсигналов в защите ответ через регулирование вниз по течению обороны генов 6,7,8.
Некоторые исследования взаимодействия растительного и насекомого, используемые в лабораторных условиях, имеют смоделированный тип, с целью приближения естественного метода кормления насекомым. Имитация травоядной травы, как правило, достигается путем создания искусственного повреждения тканей растений с различными инструментами, которые имитируют конкретный механизм насекомых рот достаточно, чтобы вызвать выпуск DAMPs и вызвать производство оборонных генов. Другие насекомые конкретных компонентов, таких как устные выделения или регургитант часто добавляются, чтобы повторить вклад от HAMPs9,10,11. Создание определенного размера и типа раны и применение точных количеств ГАМК является одним из преимуществ такого рода исследований и может предложить более воспроизводимые результаты. Естественные исследования травости, где повреждение ткани растений достигается путем применения полевых или лабораторно-воспитанных насекомых, часто являются более сложными, потому что размер раны и hamP суммы регулируются поведением насекомых и добавить изменчивость Данных. Естественные против смоделированных методов и их преимущества и недостатки хорошо обсуждаются в литературе12,13,14.
Для изучения ранних сигнальных событий, таких как транскрипционные факторы, определенный процент листа необходимо потреблять в относительно короткий промежуток времени, поэтому личинки должны начать жевать немедленно и поддерживать потребление, пока лист не заморожен для анализа. M. sexta является ненасытной подачи на нескольких solanaceous растений во многих из его личинок этапов, что делает его идеальным для придавая максимальный ущерб в относительно короткий промежуток времени15. Это удобно при изучении ранних сигнальных событий, так как реакция растения происходит почти сразу после того, как насекомое контактирует с поверхностью листа16,17. Широко используемый метод клетки зажима сдерживания доказывает неуклюже, по мере того как множественные клетки потребовали бы постоянн регулировки в течении эксперимента для того чтобы позволить для удаления или добавления личинок. Листья также должны быть достаточно большими и достаточно сильными, чтобы поддерживать несколько насекомых кормления в то же время. Эти виды картофельных растений требуют большого количества места для наблюдения за кормлением. Larvae часто перемещается в нижней части поверхности листьев, что также делает кормления наблюдений довольно трудно. Использование целых растений для выполнения этих экспериментов является явно громоздким.
В настоящем исследовании используются отдельные листья, изолированные в чашках Петри, а не целые растения, чтобы упорядочить и упростить весь подход к изучению травоядной травы. Применение протокола в данном исследовании ограничивается наблюдением группы факторов транскрипции C2H2, индуцированных в начале картофельных листьев после травоядного повреждения личинками M. sexta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол предназначен для одного человека, чтобы настроить, сделать наблюдения и собирать образцы. Несколько запусков одной и той же установки могут быть объединены для увеличения биологической репликации. Любые дополнительные повторения эксперимента должны быть созданы в то же время суток, чтобы устранить возможные суточные влияния на экспрессию генов. Протокол предназначен для создания 3 «зараженных» листьев для 5 отдельных точек времени сбора урожая. Совмещенные листья управления для каждого времени указывают на создание в общей сложности 30 образцов. Эксперимент может быть выполнен с различными размерами листьев и личинок этапов, но рекомендуется, чтобы размер листьев, личиночной стадии и время заражения быть последовательным на протяжении всей процедуры.
1. Подготовка картофельных растений
ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги, требующие стерильной техники должны быть выполнены в ткани культуры капюшон18,19.
- Подготовка Kennebec plantlets из эксплантного источника.
- Подготовьте среду распространения.
- Добавьте 4,43 г Мурашиге и Скуга (MS) с витаминным порошком, 20 г сахарозы и 2 г замены агара до 1 л обратного осмоса (RO) очищенной воды в 2 l колбе с спин-баром. Переложить колбу на перемешать тарелку и перемешать. Отрегулируйте рН до 5.8 с помощью NaOH, продолжая перемешивать.
ПРИМЕЧАНИЕ: Агар не растворится до тех пор, пока не будет автоматически. - Добавьте 1 мл консерванта/биоцида и автоклава на жидкий цикл в течение 20 мин (121 кС, 101,3 кПа). Удалите среду из автоклава сразу после завершения цикла и охладите его до 50 градусов по Цельсию. Передача 100 мл стерильных и охлажденных сосудов среды к стерильной культуре (например, Magenta или Plantcon) с использованием стерильной техники в капюшоне культуры тканей.
- Добавьте 4,43 г Мурашиге и Скуга (MS) с витаминным порошком, 20 г сахарозы и 2 г замены агара до 1 л обратного осмоса (RO) очищенной воды в 2 l колбе с спин-баром. Переложить колбу на перемешать тарелку и перемешать. Отрегулируйте рН до 5.8 с помощью NaOH, продолжая перемешивать.
- Подготовка эксплантного материала.
- Получить эксплантный источник, как Kennebec семян картофеля и удалить все следы почвы путем мытья с помощью крана H2O. Удалить ростки и нарезать 2 см кусочки стерильной скальпеля.
- Стерилизовать проростки штук путем замачивания в течение 15 с в 70% этанола, а затем 13 мин в 1:1 отбеливатель (1 часть RO-вода: 1 часть концентрированного гермицидального / коммерческого отбеливателя класса). Промыть 5 раз в стерильных H2O.
- Передача эксплантного материала в стерильные сосуды культуры тканей с размножением среды в капюшоне культуры тканей с использованием стерильной техники. Перенесите сосуды в камеру культуры тканей растений и выражайте в течение 2кв20123 недель или до тех пор, пока растения не образуются при 24 градусах По цельсию, 16 ч света (140 мм-2с -1)/8 ч темного фотопериода.
- Подготовьте среду распространения.
- Подготовка узловораспространимых тканей культуры картофельных растений.
- Подготовка узловой среды передачи.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволит сделать 10 сосудов культуры ткани, которые могут быть использованы в тот же день или могут быть сделаны заранее и храниться при 4 кВ до узловой передачи.- Добавьте 36,43 г питательной смеси агара до 1 л очищенной от RO воды в 2 l колбу с спин-баром. Переложить колбу на перемешать тарелку и перемешать. Отрегулируйте рН до 5.8 с помощью KOH, продолжая перемешивать.
ПРИМЕЧАНИЕ: Агар не растворится до тех пор, пока не будет автоматически. - Автоклав на жидком цикле в течение 20 мин (121 кС, 101,3 кПа). Удалите среду из автоклава сразу после завершения цикла и охладите его до 50 градусов по Цельсию. Передача 100 мл стерильных охлажденных узлов переноса средних к стерильной культуре сосудов (см. Таблицаматериалов) с использованием стерильной техники в капюшоне культуры тканей.
- Добавьте 36,43 г питательной смеси агара до 1 л очищенной от RO воды в 2 l колбу с спин-баром. Переложить колбу на перемешать тарелку и перемешать. Отрегулируйте рН до 5.8 с помощью KOH, продолжая перемешивать.
- Приготовьте узловые черенки.
- Получить растения Kennebec, выращенные из эксплантного материала (производится в шаге 1.1.2). Плантлеты должны иметь не менее 3-4 узлов (точки ветвей). Удалите листья с помощью стерильных ножниц или скальпеля. Вырезать ветви близко к основному стеблю, оставляя около 2 мм ветви ткани.
- Удалите узловые секции из стебля, разрезая примерно на 2 мм выше и ниже каждой точки или узла. Упорядочить узловые черенки в стерильных тканей культуры сосуд, содержащий узловой передачи среды (производится в шаге 1.2.1.2) в той же ориентации, как и в предыдущем сосуде (ветвь указывая вверх).
- Перенесите сосуды с узловыми черенками в камеру культуры тканей растений и вырастуте в течение 2 кв20123 недель при 24 градусах по Цельсию, 16 ч свет (140 мм-2с -1)/8 ч темный фотопериод.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая узловая резка вырастет в новый растительный завод. Количество черенков в каждом сосуде определяет размер листа. Меньше черенков, передаваемых на судно, приведет к большим листьям. Три растения на судно будут иметь 15 мм х 20 мм листьев в 2'u20123 недель.
- Подготовка узловой среды передачи.
- (Необязательно) Подготовка почвы выращивается Кеннебек картофельных растений.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для производства больших листьев, узловые размножаемые картофельные растения могут быть перенесены в почву.- Передача картофельных растений, выращенных в узловой среде передачи почвы, осторожно потянув растение из среды, пока все корневой ткани освобождается от агара.
- Перенесите в почву чуть выше 1-го узла от корней и слегка упакуйте почву вокруг пересадки. Вода мягко, чтобы обеспечить контакт почвы с корневой системой.
- Поместите в камеру роста с 16 ч свет (140 мольм -2s -1)/8 ч темный фотопериод и 25/20 C день / ночь температуры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Растения готовы, когда два верхних полностью расширенных листьев достигли размера, подходящего для ассеа.
- (Необязательно) Приготовьте клубневые картофельные растения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Картофельные растения, выращенные из клубней, крупнее и надежнее и могут быть полезны при выращивании личинок на растениях или при желании ночного кормления личинок.- Поместите картофель клубень 6 глубоко в 10 в горшок, содержащий смесь почвы дополняется 10 мл гранулы медленного удобрения релиза.
- Поместите в камеру роста с 16 ч свет (140 мольм -2s -1)/8 ч темный фотопериод и 25/20 C день / ночь температура. Растения готовы примерно 30-й u201240 дней от посадки клубня.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте растения, которые начали цвести.
2. Подготовка насекомых для кормления
- Получить желаемую личиночное место M. sexta.
ПРИМЕЧАНИЕ: Larvae для этого исследования были воспитаны на искусственной диете через 5 instar20 и поставил опытный человек из внутренних насекомых. Larvae также может быть выращена частично или полностью на растительной ткани. Larvae не едят сразу перед линькой и, скорее всего, есть сразу после линьки, поэтому соответствующая постановка имеет важное значение21. - Передача личинок в соответствующий сосуд сдерживания (например, 6-, 12-, 24-ну хорошо ткани культуры блюдо) в зависимости от размера личинки. В блюде должна быть одна личинка на хорошо.
ПРИМЕЧАНИЕ: Larvae может отображать территориальное или людоедское поведение без источника пищи и может получить травму, если размещены вместе. - (Необязательно) Голодали личинки до 2 ч, как это может улучшить личиночное кормление.
ПРИМЕЧАНИЕ: Larvae должны быть в сосуде сдерживания, хранящемся в камере роста в течение этого времени.
3. Установка компонентов для эксперимента по заражению
ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите схематическое резюме на рисунке 1.
- Сделайте шаблоны размещения для каждого момента сбора урожая.
ПРИМЕЧАНИЕ: Полезно настроить 5 различных лотков для каждого момента сбора урожая. Это держит образцы организованы и позволяет блюда, которые будут перемещены вокруг более эффективно, как набор без изменения их расположения. Если будут выполнены расчеты в процентах от ущерба, это необходимо, так как изображения до и после заражения должны быть захвачены в той же фокусной длине.- Получить 5 крепких лотки способны держать набор из шести соответствующих размеров Петри блюда и линии с белой бумагой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Размер чашки Петри основан на размере листа, выбранном для кормления. Лист должен легко поместиться в блюдо, не касаясь сторон. Например, блюдо 60 мм х 15 мм подходит для листьев длиной до 50 мм в длину или ширину. - Проследите набор из шести кругов, используя соответствующее размер ы Петри блюдо на бумаге в каждом лотке. Этикетка один набор кругов "контроль" A, B и C, а другой "зараженных" A, B и C. Также наметьте каждый шаблон размещения соответствующим временем сбора урожая.
- Получить 5 крепких лотки способны держать набор из шести соответствующих размеров Петри блюда и линии с белой бумагой.
- (Необязательно) Настройка камеры для захвата изображения «до заражения» и «после заражения».
- Закрепите камеру на стенде в соответствующем фокусном длине для захвата всех блюд Петри в шаблоне размещения.
- Этикетка время сбора урожая точки трубки.
- Наметьте набор из 30, 1,7 мл микроцентрифуговых труб, соответствующих каждому кругу в шаблоне размещения. Этикетка труб, чтобы надлежащим образом определить возмущение (контроль / зараженных), письмо репликации растений (A, B или C) и время сбора урожая (количество минут после периода заражения).
- Приготовьте блюда Петри, выбранные в шаге 3.1.1.
- Поместите стерильный фильтровальный бумажный диск в каждой из 30 блюд Петри со ступени 3.1.1. Добавить стерильную воду, чтобы смочить диски; не допускайте, чтобы избыток воды вбассейневаться в блюдо. Поместите каждое блюдо в каждом из шести кругов в каждом шаблоне размещения.
- Позиция три картофельных растений рядом с каждым шаблоном размещения. Убедитесь, что растения одинакового возраста и относительного размера.
4. Выполнение заражения
ПРИМЕЧАНИЕ: Один шаблон времени сбора урожая/размещения устанавливается одновременно.
- Удалите два верхних по размеру листа с каждого растения стерильными ножницами и поместите один лист в тарелку Петри и один в зараженное блюдо Петри для каждого растения (A, B и C). Провести этот процесс как можно быстрее.
- (Необязательно) Перенесите шаблон размещения на стенд камеры, чтобы запечатлеть изображение «до заражения».
- Передача личинок к каждому зараженного блюда с помощью мягких щипц высоцы как можно быстрее. Установите таймер для желаемого времени заражения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Период времени, когда личинки потребляют ткани листьев является "время заражения". Это то, что может быть определено эмпирически с помощью нескольких тестовых листьев / личинок до начала фактического заражения. Выбранное «время заражения» должно быть последовательным для всех зараженных листьев.
ПРИМЕЧАНИЕ: Larvae должны быть обработаны с осторожностью мягкими щипками касания. Со 2-го по 4-й instar может быть схвачен мягко их рога или живота. - Наблюдайте подавать для того чтобы убеждаться что все личинки едят. Larvae должны быть добавлены / удалены на основе кормления поведения. Держите крышки на блюдах Петри как можно больше.
ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько личинок могут быть использованы на лист. - Удалить личинки из листьев в конце времени заражения. Запустите таймер для сбора урожая.
- (Необязательно) Перенесите шаблон размещения на стенд камеры, чтобы запечатлеть изображение «после заражения».
ПРИМЕЧАНИЕ: Все шесть листьев в шаблоне размещения собирают в определенное время сбора урожая.
5. Листья для сбора урожая
- Перенесите каждый лист в соответствующую помеченную трубку в конце каждого моментасбора урожая и немедленно заморозьте, опустив трубку в жидкость N 2. Храните собранную ткань растений при -80 градусах Цельсия до изоляции РНК.
- Повторите шаги 4'u20125.1 для каждого момента сбора урожая.
6. Обработка ткани листьев для анализа экспрессии генов
- Измельчить замороженные ткани листьев в порошок с микропестом.
- Изолировать общую РНК и процесс экспрессии генов, как ранее описано22.
7. (Необязательно) Оценка повреждения листьев
- Визуально оценить процент повреждения листьев или рассчитать площадь листа в до и после заражения изображений.
- Измерьте область листа с программными средствами (например, Фенофит)23.
- Из измерений области листа вычислить процент ущерба как
% повреждения , (лист области до - лист области после) / лист области до » х 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Потребление листьев определяет успех протокола. Здоровые, точно постановочные личинки должны начать подавать сразу после размещения на поверхности листа и кормления должны продолжаться в довольно последовательной манере на протяжении всего времени заражения. В видео 1, личинки в верхней начинает жевать сразу после размещения и поддерживает последовательную скорость во время кормления. Это особенно важно, если прослеживание ранних событий экспрессии генов после заражения. Личинка на дне не потребляет никакого листового материала и является примером неудачного заражения.
Визуальные приближения при потреблении листьев контролируются, чтобы обеспечить достаточный ущерб производится. Количество потребляемого листового материала можно рассчитать как процент повреждений с помощью изображений листьев до и после заражения. На рисунке 2 иллюстрируются переменные темпы потребления различными стадиями развития личинок M. sexta на различных видах картофельных растений. Листья на рисунке 2A были отделены от 2-недельного узлового размножаемых тканей культуры растений. Все листья в этой цифре имеют тот же размер, но были подвергнуты заражению различными стадиями личинок в течение 5 мин. Рисунок 2A: I-IV, Видео 2, Видео 3, Видео 4, и видео 5 иллюстрируют различные темпы потребления и кормления стилей для каждой личиночной стадии из части заражения. Это полезно в определении того, сколько повреждений возможно с помощью каждого листа и личинки стадии комбинации и иллюстрирует прожорливый характер старых личинок. Использование 1-го instar личинок не рекомендуется, как их челюсти не разработаны достаточно, чтобы произвести ущерб в 5 мин заражения окна. Важно отметить, что молодые более нежные листья, полученные из тканей культуры выращенных растений часто более приемлемым для личинок. На основе этих результатов, 4-й instar личинок были выбраны для дальнейшей оценки ущерба листьям из более зрелых, почвы выращенных картофельных растений. Почва выращенные заводы близко приблизительные те приобретенные в поле. Рисунок 2B иллюстрирует диапазон повреждений, когда 3-й и 4-й личинки instar были применены к листьям, отделенным от почвенных картофельных растений. Двухнедельные узловые размножаемые растения пересажены в почву и выращиваются еще на 3 недели. Поврежденные листья из почвенных растений делятся на три группы; 15-20%, 20-30% и 30-40%. Показано, что три листа в каждой группе представляют различные уровни урона для каждого диапазона. Листья из более зрелых почво-выращенных растений необходимо больше личинок применяется и больше времени заражения, чтобы достичь того же уровня ущерба, наблюдаемого в листьях от молодых узлов-распространяемых растений. Эти результаты иллюстрируют диапазон результатов, возможных от успешной травы из различных видов растений.
После успешного травоядного завершена и процент повреждения оценивается, листткании анализируется на экспрессию генов. Результаты экспрессии гена должны указывать на надежную индукцию или подавление стенограмм, участвующих в ответ на заражение. Рисунок 3 иллюстрирует профили экспрессии генов шести факторов транскрипции C2H2 в результате успешного эксперимента по травоядности в отдельных листьях. C2H2 цинковый палец St'FP2 был индуцирован M. sexta травоядной в картофеле в предыдущих исследованиях целого растения24. Несмотря на то, что St'FP2 был индуцирован травоядными в отдельном листе, заражение не было значительным по сравнению с эффектом самого отряда. Тем не менее, два других homologs St'FP2, St'FP5 и St'FP7, были значительно индуцированы на 40 и 80 минут после травоядной по сравнению с отдельными контроля. StLOX3 и StMYC2 являются маркером генов, индуцированных как раны и травы и указывают на участие жасмоновой кислоты регулируется защитные пути. Цель этого конкретного исследования состояла в том, чтобы определить инвазии-ответных транскрипционных факторов среди группы генов-кандидатов. Идентификация двух факторов транскрипции цинковых пальцев C2H2, которые надежно реагируют на M. sexta herbivory поддерживает использование отдельных листьев для анализов заражения.
Рисунок 1: Flowchart для протокола заражения. Схематическое представление шагов, включенных в экспериментальный рабочий процесс раздела заражения протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Повреждение листьев, вызванное личинками M. sexta. (A) Процент повреждения тканей культуры листья на каждой стадии личинки более 5 мин. Римские цифры I-IV относятся к видео 2-5 соответственно, которые показывают каждый instar кормления на листе на фото. (B) Диапазон повреждения почвы выращенных листьев на 4 instar более 20 мин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Анализ экспрессии генов листьев. Показано в режиме реального времени анализ экспрессии генов C2H2 цлинковых пальцев C2H2. Средний уровень транскрипта, 2зКТ с (ККТ и КТ испытательного гена - КТ гена экзогенного контроля). Акцизные листья контроля в (синих) и вырезанных зараженных листьях в (красных) отображаются в каждый момент времени. Каждое значение представляет собой среднее значение трех биологических репликаток. Трехсторонняя ANOVA была проведена на значениях «Ct». Значительные различия в контрольных листьях с течением времени указываются заглавными буквами. Значительные различия в зараженных листьев с течением времени указаны в нижней части дела букв. Значительные различия между контрольными и зараженными листьями в одно и то же время показаны со звездочкой. Значения Pr sgt; F были все меньше, чем 0,001, за исключением контрольного лечения St'FP6 с 0,0086. Бары ошибок представляют собой стандартное отклонение. Номера присоединения NCBI: StLOX3-X96406.1, St'FP2- MK809525, St'FP4-CV500970.1, St'FP6-DN587601.1, St'FP7-DN59005.1. Номера присоединений Spud DB от злт;http:/solanaceae.plantbiology.msu.edu-gt; являются StMYC2-PGSC0003DMT4000045204, St'FP3-PGSC0003DMT400044, St'5FP-PGSC000000000000000000000000000000000000000000000001. Эта цифра была изменена с22. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Видео 1: Видеоклип личиночного кормления. Второй instar M. sexta личинок кормления (вверху) и не кормления (внизу) на листе из двух недель старой культуры ткани выросли картофельные растения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правый клик для загрузки.)
Видео 2: Рисунок 2A видеоклип (I) личиночного кормления. Второй instar M. sexta личинки кормления на листе из двух недель старой культуры ткани выросли картофельные растения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правый клик для загрузки.)
Видео 3: Рисунок 2A видеоклип (II) личиночного кормления. Третий instar M. sexta личинки кормления на листе из двух недель старой культуры ткани выросли картофельного растения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правый клик для загрузки.)
Видео 4: Рисунок 2A видеоклип (III) личиночного кормления. Четвертая взвезда M. sexta личинка кормления на листе из двух недель старой культуры ткани выросли картофельного растения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правый клик для загрузки.)
Видео 5: Рисунок 2A видеоклип (IV) личиночного кормления. Пятая взвезда M. sexta личинка кормления на листе из двух недель старой культуры ткани выросли картофельного растения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правый клик для загрузки.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Использование существующих целых методов травоядной травы растений не нужно для достижения цели данного конкретного исследования (т.е. экран набор генов-кандидатов для их реакции на заражение). Очевидным преимуществом обособленного уточнения листьев является сокращение времени, необходимого для выполнения анализов травоядных. Громоздкий характер целых растений с клип клетки устраняется и анализы выполняются раньше, так как растения в возрасте 2 недель могут быть использованы для сбора листьев. Это также требует гораздо меньшеследоза во время кормления и меньше пространства камеры роста; как важно, когда эти ресурсы ограничены.
Ограничение этого асссе, а именно отряд, встречается, когда экспрессия оборонного гена ассссируется. Отслоение само вызывает реакцию раны и поэтому важно определить что действие отряд аттечное соединение оборон-гена. В одном исследовании с участием смоделированных травоядных, уровни стенограммы известного ингибитора протеазы протеазы обороны II(PIN2) были неожиданно высоко в контрольных листьях отдельных листьев картофеля, вероятно, из-за "ранение, вызванное во время сбора листьев" 25. Однако, применение насекомых регургитант от M. sexta значительно повышенный уровень экспрессии гена PIN2. Это иллюстрирует необходимость использования элементов управления, чтобы дразнить эффект отрешенности от реакции заражения.
Отдельные анализы листьев часто выполняются, чтобы сэкономить время, пространство и ресурсы. Они были использованы в скрининге для устойчивости к грибковым заболеваниям в пшенице26,27,и устойчивость к насекомым в сое28 и нуте29. Ассес широко принят в изучении патогена, который вызывает поздний упадок в картофеле30,31. Недавнее исследование показало, что отдельные анализы листьев были эквивалентны целом условную анализы в определении позднего сопротивления блайт в поле32.
Scant доказательства существуют в литературе, однако, для использования отдельных листьев для асссе для обороны гена экспрессии. Одно исследование профилированного шесть генов обороны в ответ на заражение клетов паука отдельных лима фасоли33. Листья также производится летучих веществ, которые индуцированные ответов обороны в близлежащих незараженных листьев, хорошо известная стратегия оборонно-генной экспрессии в растениях34. Насколько нам известно, не жевательные исследования травоядных насекомых на сегодняшний день использовать отдельные листья, чтобы провести исследование для экспрессии генов.
Ранее определенный заражения реагировать C2H2 цинк овый палец, St'FP2 не был значительно вызван заражения в текущем отдельном листе асссе. Помимо очевидной разницы всего растения по сравнению с отдельными листьями, предыдущее исследование использовало непрерывный тип заражения, в котором ткани растений был анализирован для экспрессии генов сразу же после удаления личинок24. Это отличается от прерывистого типа заражения, использованного в текущем исследовании, где удаление личинок сопровождалось периодом отдыха перед сбором листьев. В течение этого периода восстановления уровни St'FP2 быстро снижаются и могут привести к снижению уровня индукции St'FP2. Там также могут быть и другие так далеко неопределенных системных сигнальных компонентов, которые могут способствовать увеличению индукции наблюдается в целом исследование завода. Другая возможность заключается в том, что стенограммы St'FP2 могли бы достичь пика до 20-минутного времени сбора урожая. Очевидно, однако, что впечатляющая индукция St'FP5 и St'FP7 стенограммы делают этот тип протокола заражения актуальным. Другим ограничением нынешнего метода будет невозможность использовать личинки корневой кормления, такие как корневой корневой червь. Кроме того, не будет подходящим, когда весь завод связи, такие как корень лист сигнализации35 или сигнализации из системных листьев36,37 изучается.
Успех этого протокола во многом зависит от качества и точной постановки личинок, используемых в эксперименте. Навыки воспитания и базовые знания поведения M. sexta полезны, но не критичны. Тем не менее, получение здоровых, надлежащим образом постановочных личинок может непосредственно повлиять на успех кормления. Личинки ввести период покоя, который предшествует каждой личинки линьки, в течение которых они не питаются21. Очевидно, что такие личинки не повредят ткани листьев. Идеальное время для использования личинок сразу после линьки. Развитие поставил когорты насекомых конкретной личиночной стадии также улучшит воспроизводимость экспрессии генов, как растения могут по-разному реагировать на каждом этапе развития.
Доступ к насекомому идеально подходит для снабжения личинок. M. sexta яйца или личинки также могут быть заказаны из коммерческих источников38,39 и выращивается на диете или растительном материале до соответствующей стадии. Есть также несколько онлайн-инструментов, которые могут помочь определить каждый instar40,41,42. Личинки, выращенные на диете, не будут содержать растительных специфических компонентов, таких как микробные симбионты, приобретенные личинками, выращенными на растениях43. Профили экспрессии генов могут быть изменены, если эти компоненты отсутствуют. Larvae может быть частично или полностью выращены на их принимающей завода, если эти эффекты имеют важное значение для исследования. Удержание пищи от насекомых за несколько часов до кормления экспериментов может также улучшить поведение кормления. Собранные на местах личинки также могут быть надежными и выгодными, поскольку они подвергаются воздействию надлежащих трофических уровней, но это добавляет еще одну переменную, которая может или не подходит для всех исследований.
Важное значение имеет также производство здоровых растений, не связанных с насекомыми и пестицидами. Растения с вирусами, насекомыми-вредителями и грибковыми организмами введут смешанные факторы и представляют собой проблему в получении воспроизводимых данных.
Многие личинок instars, возраст овеки картофеля и размеры листьев могут быть объединены, чтобы настроить протокол для конкретного типа исследования. Продолжительность нашествия и время сбора урожая также могут быть скорректированы. Потенциально, многие другие взаимодействия растений и насекомых могут быть изучены с использованием отдельных листьев, если целые наблюдения завода используются в качестве базового. Отдельный анализ листьев является актуальной и ценной альтернативой целом учёные травы растений для анализа экспрессии генов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Боба Фаррара и Алексиса Парка за предоставление насекомых, используемых в этом исследовании, и за их опыт в личиночной постановке. Дополнительная благодарность Майклу Блэкберну и Сайкат Гош за критический обзор рукописи.
Упоминание торговых наименований или коммерческих продуктов в данной публикации предназначено исключительно для предоставления конкретной информации и не подразумевает рекомендации или одобрения Со стороны Министерства сельского хозяйства США.
Министерство сельского хозяйства США является поставщиком равных возможностей и работодателем.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| agar substitute | PhytoTechnology Laboratories | G3251 | product is Gelzan |
| containment vessel (6,12 or 24 well dish) | Fisher Scientific | 08-772-49, 08-772-50, 08-72-51 | many other companies sell these products |
| manduca eggs | Carolina Biological Supply Company | 143880 | 30-50 eggs |
| manduca eggs | Great Lakes Hornworm | NA | 50, 100, 250 or 500 eggs |
| manduca larvae | Carolina Biological Supply Company | call for specific larval instar requests | any instar |
| manduca larvae | Great Lakes Hornworm | call for specific larval instar requests | any instar |
| microcentrifuge tubes, 1.7 ml | Thomas Scientific | 1158R22 | these have been tested in liquid N2 and will not explode |
| Murashige & Skoog (MS) Basal Medium w/Vitamins | PhytoTechnology Laboratories | M519 | used to make propagation medium |
| nutrient agar mix | PhytoTechnology Laboratories | M5825 | product is Murashige & Skoog Basal Medium with vitamins, sucrose, and Gelzan |
| paper filter discs | Fisher Scientific | 09-805A | Whatman circles-purchase to fit in petri dish |
| petri dish, 60X15 mm or 100X15 mm | Fisher Scientific | FB0875713A or FB0875712 | purchase size appropriate for leaf size |
| potato tubers | any | B size (not organic) | suggest Maine Farmer’s Exchange |
| pots, 10" | Griffin Greenhouse Supplies, Inc. | 41PT1000CN2 | |
| preservative/biocide | Plant Cell Technology | NA | product is PPM (Plant Preservative Mixture) |
| seed potatoes for explant source | any | B size (not organic) | suggest Maine Farmer’s Exchange |
| slow release fertilizer (14-14-14 ) | any | NA | Osmocote is a popular brand name |
| soft touch forceps | BioQuip | 4750 | |
| soil mix | Griffin Greenhouse Supplies, Inc. | 65-51121 | product is Sunshine LC1 mix |
| sterile culture vessel | PhytoTechnology Laboratories | C2100 | Magenta-type vessel, PTL-100 |
| sterile culture vessel | Fisher Scientific | ICN2672206 | product is MP Biomedicals Plantcon |
References
- Choi, H. W., Klessig, D. F. DAMPs, MAMPs, and NAMPS in plant innate immunity. BMC Plant Biology. 16, 1-10 (2016).
- Pearce, G., Strydom, D., Johnson, S., Ryan, C. A. A polypeptide from tomato leaves induces wound-inducible proteinase inhibitor proteins. Science. 253, 895-897 (1991).
- Savatin, D. V., Gramegna, G., Modesti, V., Cervone, F. Wounding in the plant tissue: the defense of a dangerous passage. Frontiers in Plant Science. 470 (5), 1-11 (2014).
- Basu, S., Varsanit, S., Louis, J. Altering Plant Defenses: Herbivore-Associated Molecular Patterns and Effector Arsenal of Chewing Herbivores. Molecular Plant-Microbe Interactions. 31, 13-21 (2018).
- Chung, S. H., et al. Herbivore exploits orally secreted bacteria to suppress plant defenses. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 110, 15728-15733 (2013).
- Chen, M. -S. Inducible direct plant defense against insect herbivores: A review. Insect Science. 15, 101-114 (2008).
- Howe, G. A., Major, I. T., Koo, A. J. Modularity in jasmonate signaling for multistress resilience. Annual Review of Plant Biology. 69, 387-415 (2018).
- War, A. R., et al. Plant defence against herbivory and insect adaptations. AoB PLANTS. 10 (4), 1-19 (2018).
- McCloud, E. S., Baldwin, I. T. Herbivory and caterpillar regurgitants amplify the wound-induced increases in jasmonic acid but not nicotine in Nicotiana sylvestris. Planta. 203, 430-435 (1997).
- Schittko, U., Hermsmeier, D., Baldwin, I. T. Molecular interactions between the specialist herbivore Manduca sexta (Lepidoptera, Sphingidae) and its natural host Nicotiana attenuate: II. Accumulation of plant mRNAs responding to insect-derived cues. Plant Physiology. , 701-710 (2001).
- Halitschke, R., Schittko, U., Pohnert, G., Boland, W., Baldwin, I. T. Molecular interactions between the specialist herbivore Manduca sexta (Lepidoptera, Sphingidae) and its natural host Nicotiana attenuate. III. Fatty acid-amino acid conjugates in herbivore oral secretions are necessary and sufficient for herbivore-specific plant responses. Plant Physiology. 125, 711-717 (2001).
- Lortzing, T., et al. Transcriptomic responses of Solanum dulcamara to natural and simulated herbivory. Molecular Ecology Resources. 17, 1-16 (2017).
- Hjältén, J. Simulating herbivory: problems and possibilities. Ecological Studies. 173, 243-255 (2004).
- Lehtilä, K., Boalt, E. The use and usefulness of artificial herbivory in plant-herbivore studies. Ecological Studies. 173, 257-275 (2004).
- Schittko, U., Preston, C. A., Baldwin, I. T. Eating the evidence? Manduca sexta larvae can not disrupt specific jasmonate induction in Nicotiana attenuata by rapid consumption. Planta. 210, 343-346 (2000).
- Zebelo, S. A., Maffei, M. E. Role of early signalling events in plant-insect interactions. Journal of Experimental Botany. 66, 435-448 (2015).
- Maffei, M. E., Mithofer, A., Boland, W. Before gene expression: early events in plant-insect interaction. Trends in Plant Science. 12, 310-316 (2007).
- Goodwin, P. B., Adisarwanto, T. Propagation of potato by shoot tip culture in Petri dishes. Potato Research. 23, 445-448 (1980).
- Goodwin, P. B. Rapid propagation of potato by single node cuttings. Field Crops Research. 4, 165-173 (1981).
- Martin, P. A. W., Blackburn, M. B. Using combinatorics to screen Bacillus thuringiensis isolates for toxicity against Manduca sexta and Plutella xylostella. Biological Control. 42, 226-232 (2007).
- Bell, R. A., Joachim, F. G. Techniques for rearing laboratory colonies of tobacco hornworms and pink bollworms. Annals of the Entomological Society of America. 69 (2), 365-373 (1976).
- Lawrence, S. D., Novak, N. G. The remarkable plethora of infestation-responsive Q-type C2H2 transcription factors in potato. BMC Research Notes. 11, 1-7 (2018).
- Green, J. M., et al. PhenoPhyte: a flexible affordable method to quantify 2D phenotypes from imagery. Plant Methods. 8 (45), 1-12 (2012).
- Lawrence, S. D., Novak, N. G., Jones, R. W., Farrar, R. R. Jr, Blackburn, M. B. Herbivory responsive C2H2 zinc finger transcription factor protein StZFP2 from potato. Plant Physiology and Biochemistry. 80, 226-233 (2014).
- Korth, K. L., Dixon, R. A. Evidence for chewing insect-specific molecular events distinct from a general wound response in leaves. Plant Physiology. 115, 1299-1305 (1997).
- Browne, R. A., Cooke, B. M. Development and evaluation of an in vitro detached leaf assay for pre-screening resistance to Fusarium head blight in wheat. European Journal of Plant Pathology. 110, 91-102 (2004).
- Browne, R. A., et al. Evaluation of components of fusarium head blight resistance in soft red winter wheat germ plasm using a detached leaf assay. Plant Disease. 89, 404-411 (2005).
- Michel, A. P., Rouf Mian, M. A., Davila-Olivas, N. H., Canas, L. A. Detached leaf and whole plant assays for soybean aphid resistance: differential responses among resistance sources and biotypes. Journal of Economic Entomology. 103, 949-957 (2010).
- Sharma, H. C., Pampapathy, G., Dhillon, M. K., Ridsdill-Smith, J. T. Detached leaf assay to screen for host plant resistance to Helicoverpa armigera. Journal of Economic Entomology. 98, 568-576 (2005).
- Vivianne, G. A. A., et al. A laboratory assay for Phytophthora infestans resistance in various Solanum species reflects the field situation. European Journal of Plant Pathology. 105, 241-250 (1999).
- Kamoun, S., et al. A gene encoding a protein elicitor of Phytophthora infestans is down-regulated during infection of potato. Molecular Plant-Microbe Interactions. 10, 13-20 (1997).
- Nowakowska, M., Nowicki, M., Kłosińska, U., Maciorowski, R., Kozik, E. U. Appraisal of artificial screening techniques of tomato to accurately reflect field performance of the Late Blight resistance. Plos One. 9, e109328 (2014).
- Arimura, G., et al. Herbivory-induced volatiles elicit defence genes in lima bean leaves. Nature. 406, 512-515 (2000).
- Erb, M. Volatiles as inducers and suppressors of plant defense and immunity-origins, specificity, perception and signaling. Current Opinion in Plant Biology. 44, 117-121 (2018).
- Hasegawa, S., et al. Gene expression analysis of wounding-induced root-to-shoot communication in Arabidopsis thaliana. Plant, Cell and Environment. 34, 705-716 (2011).
- Ryan, C. A., Moura, D. S. Systemic wound signaling in plants: A new perception. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 99, 6519-6520 (2002).
- Hilleary, R., Gilroy, S. Systemic signaling in response to wounding and pathogens. Current Opinion in Plant Biology. 43, 57-62 (2018).
- Carolina Biological Supply Company. Hornworms. , Available from: https://www.carolina.com/hornworm/hornworms/FAM_143880.pr (2018).
- Great Lakes Hornworm. Products. , Available from: https://www.greatlakeshornworm.com/products/ (2018).
- The Board of regents of the University of Wisconsin System. Manduca. , Available from: http://labs.russell.wisc.edu/manduca/lifecycle/ (2018).
- Raising Manduca sexta. , Available from: https://acad.carleton.edu/curricular/Biol/resources/rlink/description2.html (2018).
- Berkley, C. Teach life cycles with the tobacco hornworm. , Available from: https://www.carolina.com/teacher-resources/Interactive/teach-life-cycles-with-the-tobacco-hornworm/tr30179.tr (2018).
- Chung, S. H., et al. Host plant species determines symbiotic bacterial community mediating suppression of plant defenses. Scientific Reports. 7, 1-13 (2017).
