Summary
In vivo pattedyr modeller af kritiske mellemstore knogledefekter er afgørende for forskere studerer helbredende mekanismer og ortopædiske behandlingsformer. Her introducerer vi en protokol til oprettelse af reproducerbar, segmental, collum defekter i rotter stabiliseret ved hjælp af eksterne fiksering.
Abstract
Ortopædiske forskning er stærkt afhængig af dyremodeller for at studere mekanismer af knogle heling i vivo samt undersøge de nye behandlingsteknikker. Kritisk mellemstore segmental defekter udfordrende for at behandle klinisk, og forskningsindsatsen kunne drage fordel af en pålidelig, ambulante lille dyremodel af en segmental femoral defekt. I denne undersøgelse præsenterer vi en optimeret kirurgisk protokol for konsekvent og reproducerbar oprettelsen af en 5 mm kritiske diaphyseal defekt i en rotte lårbenet stabiliseret med ekstern fiksator. Den diaphyseal ostectomy blev udført ved hjælp af en brugerdefineret jig for at placere 4 Kirschner ledninger bicortically, som var stabiliseret med en tilpasset ekstern fiksator enhed. En oscillerende knogle så blev brugt til at oprette defekten. Enten en kollagen svamp alene eller en kollagen svamp dyppet i rhBMP-2 blev implanteret i defekten, og den knogleheling blev overvåget over 12 uger ved hjælp af røntgenbilleder. Efter 12 uger, rotter blev ofret, og histologisk analyse blev udført på kontrolelementet skåret og behandlet lårben. Knogledefekter indeholder kun kollagen svamp resulterede i ikke-union, mens rhBMP-2 behandling givet dannelsen af en periosteal afstumpede og ny knogle remodellering. Dyr genvundet godt efter implantation, og ekstern fiksation lykkedes at stabilisere de femoralis defekter over 12 uger. Denne strømlinet kirurgisk model kunne let anvendes til at studere knogleheling og afprøve nye ortopædisk biomaterialer og regenererende behandlinger in vivo.
Introduction
Ortopædisk traumer kirurgi fokuserer på at behandle en bred vifte af komplekse frakturer. Kritisk diaphyseal segmental knogle defekter har vist sig vanskeligt at behandle klinisk på grund af de omkringliggende muskler og periosteum nedsat regenerative evne samt manglende lokaliseret angiogenese1. Moderne behandlingsteknikker omfatter operativ fiksation med knogle podning, forsinket knoglegraft (Masquelet), knogle transport, fusion eller amputation2,3,4. Hos de fleste patienter, som har Ambulant funktion bevares efter deres traumer, med velfungerende distale lemmer, er lemmer restværdi klart en bedre behandling option5. Disse bjærgning behandlinger kræver ofte iscenesatte kirurgiske indgreb over et længere behandlingsforløb. Nogle forfattere har foreslået, at eksterne fiksering er overlegen i forhold til intern fiksering for disse ansøgninger på grund af nedsat vævsskader under implantation, faldt implanteret overfladeareal, og øget postoperativ indstillingsmuligheder af fiksator6. En prospektiv randomiseret kontrolleret forsøg er imidlertid i øjeblikket undervejs at tydeliggøre denne kontrovers indre versus ekstern fiksering i svær åbne frakturer af tibia7. Desværre, med enten behandling valgt, betydelige komplikation og fiasko satser stadig8,9. Med enten behandlingsmetode, hvad angår segmental knogletab, skal kirurgen slås med segmental diaphyseal defekter, der præsenterer væsentlige udfordringer. Rettelser af segmental defekter skal maksimere knogle stabilisering og samtidig forbedre osteogenic proces10,11.
Den kliniske betydning, men den lavere mængde, kritiske størrelse diaphyseal segmental defekter, er en effektiv, reproducerbare dyremodel nødvendige for, at forskerhold til videre behandlingsteknikker og i sidste ende forbedre kliniske resultater. Forskere har brug at studere i vivo fysiologisk helbredende mekanismer i et pattedyr dyremodel. Mens sådanne modeller af ekstern fiksation allerede findes12,13,14,15, håber vi at kunne give en mere pålidelig metode til ikke-fagforeningerne i ubehandlet dyr, mindske omkostningerne gennem valg af overkommelig fiksator materialer, og skitsere en ligetil kirurgisk protokol for nem anvendelse til fremtidige undersøgelser. Hovedformålet med denne protokol er at etablere en pålidelig og reproducerbar model af en kritisk diaphyseal defekt i rotter. Proceduren blev evalueret ved at vurdere stabilisering og knogle heling i rotte lårben over 12 uger. De sekundære mål inkluderet: at gøre en overkommelig model som en omkostningseffektiv som muligt, forenkling af kirurgisk tilgang og stabilisering og sikring af etisk pasning af dyrene. Forfattere og forskningsgruppe gennemført indledende forsøg med en række forskellige biomaterialer og potentielle regenerative behandlinger til at forbedre healing i denne segmental defekt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Rotter anvendes i denne undersøgelse modtog Daglig pleje i overensstemmelse med AVMA retningslinjer for aflivning af dyr: 2013 udgave16. Det institutionelle Animal Care og brug udvalg på University of Wisconsin-Madison evalueret og godkendt denne forsøgsplan, før projektet begyndte.
1. dyr
- Brug de outbred Sprague-Dawley mandlige rotter vejer ca 350 g.
2. forberedelse af morfogenetiske. knogle Protein-2 (rhBMP-2) gennemblødt svamp stilladser
Bemærk: Stillads forberedelse bør forekomme lige før implantation i lårbenet (Se trin 6.14).
- Følg producentens anvisninger for brugen af en etableret rhBMP-2 bone graft kit, der indeholder en kollagen svamp, frysetørret rhBMP-2 og sterilt vand til rekonstitution17. Vedligeholdelse af steriliteten, rekonstruere rhBMP-2 med det sterile vand til en koncentration på 1,5 mg/mL.
- Brug steril saks og en steril lineal, trim rhBMP-2 gennemblødt kollagen svamp til at omforme passer en 5 mm x 3 mm x 3 mm defekt.
- Ved hjælp af en sprøjte, distribuere, rhBMP-2 løsning jævnt over kollagen svamp så det absorberes.
3. forberedelse af brugerdefinerede ekstern fiksation enhed
Bemærk: Se figur 1A for en mere komplet liste over dimensioner.
- Skære aluminium ark stock (type 6061, 0.088" tykkelse) til to stykker (1,4" x 6") ved hjælp af en stiksav eller andre passende værktøj.
- Montere et stykke i fræsning maskine og bruger en 1/8" 90°-punkt carbide drill mill, skåret fire 'V' riller (0,035" dyb) på langs. Forlade de andre stykke gratis af nedskæringer.
- Skære enkelte plader af 0,3" bredde fra to stykker (figur 1B). Måle og bore skruehuller for 4-40 tråd. Tryk på pladen med 'V' riller med 4-40 tråd. Bore plade uden riller for en #4 skrue krop boremaskine.
- Sand begge stykker for at runde hjørner og reducere vægten (figur 1 c).
- Skrue stykker sammen med 4-40, 18-8 rustfri knap cap skruer (0,25"), således at rillerne er flush mod almindelig pladen (fig. 1 d)
4. bedøvelsesmiddel procedure og analgesi
- Fremkalde anæstesi ved at placere rotten i induktion kammer levere 4 L O2/min med 4% isofluran.
Forsigtig: Forskning personale skal undgå indånding af bedøvende gas og opretholde ordentlig hood og ventilation i laboratoriet. - Fjerne rotten fra salen efter rotten mister oprettende refleks, vedhæfte en næsen kegle og sted på vedligeholdelsesdosis af anæstesi gennem næsen (O2 levering sats til 2-3 L/min og 0,8% isofluran).
- Placere rotten på den hede afrivningsblok eller under opvarmning lys at forhindre hypotermi.
- Bekræfte den passende dybde af anæstesi ved at klemme tå eller teste den palpebral refleks.
- Anvende smøring til øjne til at forhindre udtørring af hornhinden.
- Levere en subkutan injektion af udvidet-release buprenorphin (1 mg/kg) på stammen/dorsum af rotte, langt fra operationsstedet, at give analgesi i op til 3 dage efter operationen.
5. aseptisk forberedelse og antibiotika preventatives
- Barbering området omkring hindleg ved hjælp af de 13th rib, foden, svinekroppens midterlinje og ventrale midterlinjen som margener.
- Krat barberede område ved hjælp af steril 2 x 2 gaze gennemblødt med 10% povidon-jod efterfulgt af 70% EtOH (4 gange hver, skiftevis).
- Administrere en intramuskulær injektion af cefazolin (20 mg/kg) i den operative quadriceps.
- Administrere enrofloxacin (0,25 mg/ml) i drikkevand i 7 dage efter operationen for fortsat antibiotisk beskyttelse.
- Placer rotter på medicineret foder (f.eks. Uniprim) for varigheden af undersøgelsen til at forhindre pin-tarmkanalen infektioner.
- Anvende dobbelt antibiotisk salve til grænsefladen hud-pin en gang dagligt i 3 dage efter operationen.
Bemærk: Undgå hvilken som helst ekstern fiksation pin eller klemme løsne, som kan bidrage til udviklingen af en infektion.
6. kirurgisk procedure
Bemærk: Gøre en samordnet indsats for at opretholde et sterilt felt og arbejdsområde og følg steril teknik i hele helhed af sagen.
- Udvide barberet ben gennem fenestrated, klare klæbrig drapere og dække kirurgisk bænk i sterile håndklæder til at oprette et sterilt felt.
- Palpere lårbenet og bruge en #15 blade til at oprette et anterolaterale snit gennem huden strækker sig fra knæskallen til den større trochanter på den proksimale femur.
- Omhyggeligt incise den laterale ben fascia langs intermuscular septum at adskille vastus lateralis musklen af quadriceps anteriorly fra hamstrings posteriort indtil det laterale lårbenet er eksponeret. Bevare bortføreren bagdelen senen indsættelse på større trochanter.
- Udføre en omhyggelig, atraumatisk omkredsen blødt væv dissektion og udsætte lårbenet på sit midten diaphysis starter på den laterale overflade. For at gøre dette, skal du bruge en #15 blade til at forsigtigt skære muskel fra den underliggende knogle ved at holde bladet parallelle mod konturen af knoglen overfladen. Bruge en periosteal elevator til at løfte muskel fra den udsatte knogle, som det er dissekeret og fortsætte omkring femurdiafyse indtil 7-10 mm af centrale diaphysis er blevet ryddet af blødt væv på alle sider til at forberede ostectomy.
Bemærk: Undgå skade på det mediale femoral neurovaskulære bundt. - Indsætte fire 1,0 mm Kirschner (k) ledninger: 2 proksimale og 2 distale i lårbenet vinkelret på det laterale lårbenet, instrueret lige lateralt for mediale. Sikre alle pins engagere både cortex (bicortical) for tilstrækkelig stabilitet (figur 2A).
- Start med den distale-mest pin først, blot på niveau med den laterale epicondyle. Sted jig flush til den laterale distale femur og indsætte en 1,0 gevind tip k-tråd.
- Opretholde placeringen af jig på knoglen, identificere, hvor de mest proksimale pin vil knogle baseret på jig huller. Når positionen bestemmes, omhyggeligt incise parallelt med fibre i bagdelen senen efter behov for at oprette et lille hul i væv til den proksimale pin til at passere, hvilket minimerer iatrogen skade på senen. Bore en 1.0 mm ikke-threaded k-wire i dette hul igen sikre pin engagerer både cortex (figur 2B).
- Fastholde jig's position i kontakt med knoglen og bore to 1.0 mm gevind k-tråde, én på hver side af den fremtidige defektstedets. Sikre pins engagere både cortex (figur 2 c).
- Placer den ekstern fiksator bar niveau 1 cm over huden og skrue stramt, låsning bar på plads. Klip overskydende pin længder (figur 2D).
- Forberede ostectomy (defekt skabelse) ved at placere en lille, buede retractor omkring den anteriore og posteriore lårben at beskytte omgivende bløde væv, muskler og neurovaskulære bundt. Udnytte en ~ 5 mm sagittal oscillerende savklinge, meget forsigtigt oprette en 5 mm segmental defekt gennem midten diaphysis. Anvende en lys, selv pres med saven til at undgå unødvendig fraktur (figur 2E).
- Anvend små mængder af kunstvanding (stuetemperatur 0,9% sterilt normale saltvand (NS)) efter behov samtidig skabe fejl for at undgå termisk nekrose af knoglen.
- Skylle såret ved hjælp af 10 mL af NS efter oprettelse af defekten.
- Administrere 0,1 mL af en 0,25% bupivacaine med adrenalin (1:200, 000) på såret som en smertestillende og vasokonstriktor.
- Indsæt stillads (5 mm x 3 mm x 3 mm) af kollagen svamp eller rhBMP-2 gennemblødt svamp (fra trin 2) ind i defekten. Hvert stillads bør være dimensioneret korrekt til at spænde længden og mængden af fejl, at hjælpe sponge bo i position.
Bemærk: på dette tidspunkt, mRNA komplekser kan være forberedt og injiceres som beskrevet i trin 7.1-7.3 nedenfor hvis udfører bioluminescens imaging. - Luk muskel flyet ved hjælp af simple afbrudt mønster med 4-0 resorberbar sutur. Lukke huden lag ved hjælp af en kørende subcuticular mønster med 4-0 resorberbar sutur og hud lim til at lukke huller omkring fremspringende benene.
- Fjerne rotten fra næsen kegle, forbliver på den hede afrivningsblok, og overvåger kontinuerligt indtil rotten er at konsekvent holde en oprejst stilling. På dette tidspunkt, sted i en rent bur til at inddrive.
7. forberedelse af kompleksbundet mRNA og bioluminescens imaging
Bemærk: Transfektion med mRNA komplekser bør udføres under operation 1 dag før luminescence billeddannelse. Brug steril teknik, når du håndterer mRNA.
- Mix 10 µL af mRNA kodning for Gaussia luciferase (stock koncentration af 1 µg/µL) med 30 µL af lipidic transfecting agent.
- Mulighed for mRNA-lipid komplekser til form af inkubere i mindst 5 min. ved stuetemperatur. Den lipidic transfecting agent vil kondensere mRNA molekyler, stabilisere dem og forbedrer effektiviteten af Transfektion.
Bemærk: Hvis komplekser ikke som straks anvendes, gemme dem i isen for maksimalt 1 h. - Ved hjælp af en 20 µL pipette udstyret med filtreret tips, injicere halvdelen af mængden af mRNA komplekser til de distale og proksimale ender af defekten, henholdsvis.
- Den følgende dag, 3 min før imaging, bedøver rotte ved hjælp af inhaleret isofluran som tidligere beskrevet i trin 4.1.
- Placere rotten i en i vivo billeddannelse kammer udstyret med en næse kegle levere vedligeholdelse isofluran (0,8% isofluran, O2 levering sats på 2-3 L/min).
- Injicere coelenterazine genopslemmes i saltvand i en dosis på 4 mg/kg legemsvægt i nærhed af defekten.
- Erhverve bioluminescens billeder med i vivo imaging system (IVIS) ifølge producentens instruktioner18.
8. imaging protokol
- Efter kalibrering plain Radiografisk maskinen, en X-ray system19, bedøver rotte ved hjælp af inhaleret isofluran som tidligere beskrevet (Se trin 4.1) og placere rotten i en næsen kegle med inhaleret isofluran (0,8% isofluran, O2 levering sats på 2-3 L/min.) til en anteroposterior (AP) lårbenet røntgenbillede.
- Mens rotten er i brystbenet recumbency, fremme den kirurgiske hindlimb frem, nedbøjning på hoften og kvæle joint. Flex knæ fælles ca 90 °. Tape pote plantar side ned, tæt på kroppen væggen. Placer tibia frem fra lårbenet at fjerne muligheden for sammenføje knoglerne. For at give mindre bortførelse af hoften, skal du placere en gennemskinnelig svamp (ca. 15 mm tyk) i lyske-regionen. Derefter få en anterior-posterior (kraniel-caudale) billede af lårbenet.
- Gentag denne AP lårbenet Radiografisk Se umiddelbart efter kirurgi, 4 uger, og 12 uger. Brug tape og gaze til korrekt position dyrets ekstremitet for kvalitet og konsekvent billeddannelse.
- Fjerne rotten fra næsen kegle og overvåger kontinuerligt indtil rotten er at konsekvent holde en oprejst stilling. Anbring tilbage ind i buret.
9. histologiske Procedure
- Aflive rotter i et kammer med inhaleret CO2 ifølge AVMA etiske standarder16.
- Følgende eutanasi, barbere hindlimb, Fjern skindet fra den udløsende ekstremitet og disarticulate lårbenet ved hoften. Fjern forsigtigt alle bløddele fra det udløsende lårbenet (herunder alle muskler, sener og ledbånd). Forlade kun et tyndt lag af muskler omkring defektstedets for at beskytte regionen helbredende mod utilsigtet beskadigelse under dissektion.
- Placer lårbenet i 10% Neutral Buffered Formalin ved stuetemperatur i 3-4 dage at give mulighed for fiksering. Holde et 15:1 formalin til væv volumen ratio. Ændre løsning når halvvejs gennem processen, fiksering.
- Afkalke lårbenet i en 15% ethylendiamintetra syre (EDTA) pH 6,5 løsning for 3-4 uger. Indsamle seriel røntgenbilleder for at bestemme afkalkning slutpunkt.
- Gennemskære lårben på langs med et snit fra forreste til bageste i midten af sagittale flyet. Indsende væv til standard paraffin indlejring og hæmatoxylin og eosin (H & E) farvning.
- Send H & E dias til en patolog til histologisk vurdering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Operationer blev udført i cirka en time af en kirurg med hjælp fra en assistent. Efter kirurgisk optimering, intra- og postoperative komplikationer var stærkt minimeret og brug af apparatet jig sikres ensartet størrelse (5 x 3 x 3 mm) og lokalisering af collum defekter. Rotter blev ambulante umiddelbart efterfølgende opsving fra anæstesi og synes ikke at have nogen ændrede adfærdsmønstre; deres gangart var ikke antalgic, og de syntes ikke at blive forstyrret af den ekstern fiksator.
Non-threaded k-tråde blev valgt for den mest proksimale pinkode (figur 2B), som den proksimale pin havde den højeste risiko for bryde når gevind ledninger blev brugt. I nogle tilfælde, især i kontrol styre dyr uden rhBMP-2 eller stilladser hvis defekter viste ingen tegn på heling/knogledannelse, en eller flere k-wire tips brød efter ca 8 uger som det ses i svampen kun røntgenbillede af skåret lårbenet ( Figur 3).
Røntgenbilleder og histologi (H & E pletten) blev analyseret for at vurdere niveauet af knogleheling. Negativ kontrol mangler der indeholder kun en kollagen svamp viste ingen tegn på bridging osteogenesis mellem proksimale og distale knogler kanterne (figur 3, figur 4). En lille mængde af nye knogle remodellering kan ses støder direkte op til cut lårbenet kant; defekten, selv viser manglende knoklet materiale, tilstedeværelsen af brusk, og nogle resterende hæmatom (figur 4). Mangler der indeholder rhBMP-2 gennemblødt svamp demonstreret betydelige knogle heling så tidligt som 4 uger efter operationen, som det fremgår af en røntgenfast afstumpede udjævning på tværs af defekten i figur 3. Ved 12 uger, betydelige nye mineral deposition (figur 4, NB: ny knogle, PC: periosteal afstumpede) har dannet i hele defekten. Væsentlige nye periosteal knoglen kan ses i den afstumpede strækker sig fra cut lårbenet kant, og knoglesplinter af vævet og gråt knoglen har udviklet gennem defekten. Brusk deposition er ikke set (figur 4).
Histologi (H & E pletten) blev også udført for både en ikke-inficerede kontrol og et eksempel på en inficeret lårbenet (figur 5). Inficerede lårbenet er betydeligt udvidet, viser tegn på en knoglens endosteale reaktion infiltrerer knogle cortex. Pilene indikerer områder af osteoklast-medieret patologiske knogleresorption. Ikke-inficerede lårbenet cortex forbliver kompakt og med en klart afgrænset gråt cortex. Antibiotika dosering var optimeret til også for at omfatte maksimal dækning efter operationen. Mens infektion omkring defektstedets kan forekomme, fortsatte administration af antibiotika topisk omkring pin websteder og i vand og kost lykkedes i at minimere postoperative infektion.
Yderligere imaging ved hjælp af In Vivo Imaging System (IVIS) illustrerer en bioluminescerende celler kan visualiseres i defekten efter implantation af en ekstern fiksator (figur 6). Eksterne pladen kan nemt fjernes til billedbehandling og erstattes efter afslutningen. Celler i den medullære kavitet luminescere efter Transfektion med kompleksbundet mRNA kodning for Gaussia luciferase. Det højeste niveau luminescens er fokuseret på stedet for femoral defekten og signalet er ikke blokeret af fiksering enhed pins. Dette er lovende for fremtidige undersøgelser afhængige bioluminescens eller fluorescens at måle biologiske ændringer såsom et gen eller protein udtryk under helingsprocessen.
Figur 1: Ekstern fiksator fabrikation. A: CAD skematisk af de forsamlede ekstern fiksator med kommenteret dimensioner for ordentlig fabrikation. Hver fiksator er sammensat af to aluminium plader holdt sammen med to skruer. B: plader skæres fra 1,4 "x 6" aluminiumsplader med 'V' riller skæres i bunden ark. C: skruehuller er boret ind i pladerne (gevind i pladen med 'V' riller) og alle kanter og hjørner er slebet runde og reducere vægten. D: samlet ekstern fiksator er strammet med skruer (4-40 x 0,25", 18-8 rustfri knappen head cap) når pins er på plads i 'V' rillerne på indersiden af aluminium plader. Den venstre ben er ikke gevind og er mest proksimalt på lårbenet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Skematisk pin placering, fiksator placering og defekt skabelse. A: den distale pin (1,0 mm gevind k-tråd) er placeret på regionen epicondyle metafyseale hjælp af jig (blå rektangel) for at vejlede korrekt pin indsættelse. Jig er placeret på den anterolaterale femoral overflade. B: den proksimale pin (1.0 mm ikke-threaded k-wire) er placeret ved hjælp af jig efter at lave et lille snit i bagdelen senen. C: de midterste ben (1,0 mm gevind k-tråd) er indsat ved hjælp af jig. D: jig er fjernet og de 2 plader er knyttet til benene ved hjælp af de 2 skruer til at sikre pladerne. Pladerne er strammet 1 cm over huden for at undgå pres på huden. E: en sagittal oscillerende sav bruges til at oprette en 5 mm defekt mellem de to midterste ben. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Repræsentative høj opløsning røntgenbilleder viser knogle healing med rhBMP-2 behandling. Billeder til negativ kontrol kollagen svamp og rhBMP-2 gennemblødt svamp grupper er vist på 0, 4 og 12 uger efter operationen. Gruppen rhBMP-2 behandling udviser betydelig healing efter 4 uger med afstumpede spanning defekten. Negativ kontrol lårbenet ender heler ikke med bro knogle og defekten forbliver en ikke-union. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Betydelig ny knogledannelse er set med rhBMP-2 behandling. Repræsentant 4 x forstørret H & E histologiske billeder for negativ kontrol kollagen svamp og rhBMP-2 gennemblødt svamp grupper både på cut lårbenet kant og inden for defekten. Ny knogle dannes omkring kontrol lårbenet kant, men betydelige udvidelser af både nye trabekulær knogle og periosteal afstumpede projektet fra behandlede lårbenet. Ingen knoklet materiale er set inden for kontrol defekt, mens betydelige knogledannelse kan iagttages i hele rhBMP-2 behandlede defekt. NB: ny knogle, F: lårben, C: brusk, H: blødning, PC: periosteal afstumpede. Skalalinjen: 200 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Inficerede lårbenet udstiller hypertrofi og inflammatoriske celle markører. H & E histologiske billeder i en ikke-inficerede femur i forhold til en inficeret lårbenet, i fuld visning og ved 4 x forstørrelse af boxed steder. Ikke-inficerede femoral cortex forbliver organiseret og afgrænsede, med lille tegn på betændelse. Inficerede lårbenet forstørrer meget, som det ses i fuld visning og cortex er brudt op af områder af resorption og nekrose (lilla celle klynger angivet med sorte pile). F: lårbenet. Skalalinjen: 200 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Gaussia luciferase signal registreret i defekten. Luminescence celler transfekteret med Gaussia luciferase mRNA er afbildet med IVIS efter eksterne plade fjernelse. Rød angiver den højeste luminescence intensitet i stedet for femoral defekten. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Lille dyremodeller for ortopædiske skader såsom komplet knoglebrud aktiverer forskning, der udforsker mekanismerne af osteogenesis og vurdering af det terapeutiske potentiale i biomaterialer20. Denne undersøgelse introducerer en rotte segmental defekt model stabiliseret af en brugerdefineret ekstern fiksator, der en lab og Biomedicinsk teknik holdet kan let reproducere for yderligere undersøgelser af bærende osteosynthetic knogle reparation.
Tidligere undersøgelser ved hjælp af kritiske mellemstore defekter i rotte modeller almindeligt stole på intern fiksering plader21,22,23,24. Selv om enten fiksering metode er klinisk acceptabel, har ekstern fiksation særskilte fordelene ved forårsager mindre bløde væv forstyrrelser og blodtab, faldende de samlede implanterede areal for at minimere muligheder for bakteriel kolonisering, og giver mulighed for postoperative indstillingsmuligheder og iscenesat kirurgiske indgreb6. Tidligere ekstern fiksation animalske fraktur modeller har brugt forskellige plade materialer, pin securement og/eller knogle skære metoder12,13,14. Fordi den ekstern fiksator i denne protokol blev gjort i lab's workshop med lavpris-aluminium og kan være let renoveret, blev udgifter minimeret. Dette giver økonomisk ekstern fiksator giver forskere til at udføre eksperimenter med flere dyregrupper uden at være begrænset økonomisk. I forhold til en intern fiksering model mener vi, at dette system er teknisk enklere og mere reproducerbare i et lille dyr model. Vores erfaring med disse modeller, intern fiksering er betydeligt mere krævende teknisk og kan kræve custom-fræset implantater. Til forfatternes viden, denne samlede protokollen er unik i sin brug af et specialdesignet jig kombineret med en tilpasset metal ekstern fiksator design15, såvel som dens brug af en oscillerende knogle så for bedre at kunne repræsentere den almindelige kliniske scenario af periosteal stripping udføres for at forberede fraktur websteder til fiksering. En sidste bemærkning om brug af en oscillerende saw i denne model er, at varmen genereret og periosteal driftsforstyrrelser, der opstår giver et sidste element af kontrol i danner en ikke-union model. Vores erfaring har været, at med andre metoder, i disse dyremodeller, efterforskere løber en risiko for kontrolelementerne healing.
For at sikre kirurgisk succes, der bør udvises forsigtighed ved flere kritiske trin: når incising og udfører omkredsen dissektion at eksponere lårbenet fra omkringliggende muskler, undgå foruroligende det ischiadicus nerve caudally, de femoralis fartøjer medialt, og bagdelen senen proksimalt. Sørge for at placere jig apparater parallel og flugter fladt, anterolaterale ansigt på lårbenet, således at alle pins er netop vinkelret på knoglen. Dette vil bekræfte den korrekt justering af den ekstern fiksator og reducere sandsynligheden for pin brud. Rækkefølgen af pin placering fundet at være mest ligetil var distale først, efterfulgt af proksimale og derefter begge midterste ben. Dette tilladt for færre forstyrrelser i bagdelen senen af den proksimale pin. Endelig er det vigtigt, at hver pin er placeret bicortically, gennemtrængende begge cortex, således at det ikke bakke ud af knoglen eller flytte ind den medullære kavitet.
En x-ray maskine habil i høj opløsning radiografi blev brugt til at overvåge status for knogleheling som kvalitative ændringer kan visualiseres let og ikke-invasivt over tid. Men, konsekvent ben positionering er afgørende for nøjagtig Radiografisk fortolkning som forskelle i placering kan være vildledende. Resultaterne fra denne undersøgelse er i overensstemmelse med tidligere arbejde viser, at en 5 mm femoral defekt forhindrer spontan knogleheling i normale rotter25. Derfor, enhver healing er noteret med ekstra behandlinger såsom rhBMP-2 gennemblødt svamp endeligt kan henføres til den respektive behandling (figur 3).
Mulige bekymringer for denne teknik omfatter pin brud, løsne og infektion. Problemer med proksimale pin brud i indledende test bedt om et skift fra gevind til ikke-threaded k-tråd. Non-threaded pins er mekanisk stærkere men også indebære større risiko for opbakning ud af cortex. Især i tomme knogledefekter, k-tråde kan bryde eller forskydes ca 8 uger på grund af langvarig cyklisk pin lastning og manglende heling (ligeledes til cykling/bøjning en papirclips). En streng antibiotika regime blev udnyttet til at omfatte en umiddelbar cefazolin injektion, daglig anvendelse af antibiotisk salve på webstedet indsnit 7 dage af enrofloxacin tilføjet til drikkevand og en medicineret foder. Dette antibiotikum protokol, sammen med de korrekte kirurgiske teknikker skitseret ovenfor, minimeret infektion (figur 5).
En af de yderligere fordele ved at bruge ekstern fiksering i en dyremodel er nem fjernelse for en uhindret udsigt over defekt og udskiftning efter billeddannelse. Dette giver mulighed for mere effektiv i vivo billeddannelse teknikker afhængig af fluorescens eller luminescence at vurdere ændringer såsom udtrykket genet eller protein. For eksempel, har vi vist, at celler i medullær hulrum transfekteret med kompleksbundet mRNA kodning for Gaussia luciferase kunne visualiseres med IVIS. Figur 6 viser, at luminescence signal detektionsevne ikke er blokeret af denne eksterne fiksering tilgang som det kan være med indre plader, skruer, eller intramedullært søm21,22,23 , 24. denne omkostningseffektive og reproducerbare kirurgisk protokol giver mulighed for konsistente skabelse og stabilisering af en kritisk størrelse femoral defekt, der efterligner den oprindelige behandlingsprogram for disse komplekse frakturer. Etablering af en pålidelig dyremodel er afgørende for enhver eksperimentelle behandlinger til endelige kliniske anvendelse. Vores model har vist forudsigelige resultater og minimal adfærdsændringer eller ubehag i vores dyr. Denne model kan anvendes med en bred vifte af biomateriale-baserede stilladser sammenholdt med de billeddiagnostiske teknikker udnyttes i dette papir for fremtidige translationel testformà ¥ l. Det er vores håb, at i arbejder med denne model, vil være i stand til at udtænke nye måder at behandle kritisk knogledefekter i traume patienter forskere. Dette kunne hjælpe med at undgå morbiditet og koste i langvarige behandlinger i øjeblikket ansat og eventuelt nedsætte antallet af amputationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ikke konkurrerende finansielle interesser eller fordele. Der har været nogen fordele modtaget direkte eller indirekte fra forfatteren af denne artikel.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af en NIH udstyr Grant 1S10OD023676-01 med ekstra støtte gennem University of Wisconsin afdelinger af ortopædi og rehabilitering og School of Medicine og folkesundhed. Vi vil gerne anerkende UW Carbone kræft Center støtte Grant P30 CA014520 og brug af deres små dyr Imaging facilitet, samt NIH uddannelse Grant 5T35OD011078-08 til støtte af H. Martin. Vi takker også Michael og Mary Sue Shannon for deres støtte til den muskel regenerering partnerskab.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sterile Saline | Baxter | 2F7124 | Used for irrigating wound and rehydration |
| 10% Iodine/Povidone | Carefusion | 1215016 | Used to prep skin |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 89370094 | Used as fixative |
| 1mm non-threaded kirschner wire | DePuy Synthes | VW1003.15 | Sterilized, used for the most proximal pin |
| 1mm threaded kirschner wire | DePuy Synthes | VW1005.15 | Sterilized, used for the 3 most distal pin slots |
| 2x2 gauze | Covidien | 4006130 | Sterilized, used to prep skin and absorb blood |
| 4-0 Vicryl Suture | Ethicon | 4015304 | Used to close muscle and skin layers |
| 4-40 x 0.25",18-8 stainless steel button head cap screws | Generic | External fixator assembly | |
| 4200 Cordless Driver | Stryker | OR-S-4200 | Used to drill kirschner wires |
| 4x4 gauze | Covidien | 1219158 | Sterilized, used to absorb blood |
| 70 % Ethanol | Used to prep skin | ||
| Baytril | Bayer Healthcare LLC, Animal health division | 312.10010.3 | Added to water as an antibiotic |
| Cefazolin | Hikma Pharmaceuticals | 8917156 | Pre-op antibiotic |
| CleanCap Gaussia Luciferase mRNA (5moU) | TriLink Biotechnologies | L-7205 | Modified mRNA encoding for Gaussia Luciferase, keep on ice during use |
| Coelenterazine native | NanoLight Technology | 303 | Substrate for Guassia Luciferase, used to assess luciferase activity in vivo |
| Double antibiotic ointment | Johnson & Johnson consumer Inc | 8975432 | Applied to pin sites post-op as wound care |
| Dual Cut Microblade | Stryker | 5400-003-410 | Used to create 5mm defect in femur |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Fisher | BP120-500 | Used to decalcify bone to prep for histology |
| Extended Release Buprenorphine | ZooPharm | Used as 3 day pain relief | |
| Fenestrated drapes | 3M | 1204025 | Used to establish sterile field |
| Handpiece cord for TPS | Stryker | OR-S-5100-4N | Used to create 5mm defect in femur |
| Heating pad | K&H Pet Products | 121239 | Rat body temperature maintenance |
| Hexagonal head screwdriver | Wiha | 263/1/16 " X 50 | External fixator tightening |
| Induction chamber | Generic | Anesthesia for rats | |
| Infuse collagen sponge with recombinant human Bone Morphogenic Protein-2 | Medtronic | 7510200 | Clinically relevant treatment used as positive control |
| Isoflurane | Clipper | 10250 | Anesthesia for rats |
| IVIS | Perkin Elmer | 124262 | Bioluminescence imaging modality |
| Jig | Custom | Used to place bicortical pins | |
| Lipofectamine MessengerMAX | Fisher Scientific | LMRNA003 | mRNA complexing agent that enables mRNA delivery |
| Sensorcaine-MPF (Bupivicane (0.25%) and Epinephrine (1:200,000)) | APP Pharmaceuticals, LLC | NDC 63323-468-37 | Applied to surgical site for pain relief and vasoconstriction |
| Sterile water | Hospira | 8904653 | Used as solvent for cefazolin powder |
| Titanium external fixator plates | Custom | Prepared in house with scrap titanium and milling machine | |
| Total Performance System (TPS) Console | Stryker | OR-S-5100-1 | Used to create 5mm defect in femur |
| TPS MicroSaggital Saw | Stryker | OR-S-5100-34 | Used to create 5mm defect in femur |
| Ultrafocus Faxitron with DXA | Faxitron | High resolution radiographic imaging modality | |
| Uniprim rat diet | Envigo | TD.06596 | Medicated rat diet |
| Universal Handswitch for TPS | Stryker | OR-S-5100-9 | Used to create 5mm defect in femur |
| Vetbond Tissue Adhesive | 3M | 1469 | Skin closure |
References
- Filipowska, J., Tomaszewski, K. A., Niedźwiedzki, Ł, Walocha, J. A., Niedźwiedzki, T. The role of vasculature in bone development, regeneration and proper systemic functioning. Angiogenesis. 20 (3), 291-302 (2017).
- Charalambous, C. P., Akimau, P., Wilkes, R. A. Hybrid monolateral-ring fixator for bone transport in post-traumatic femoral segmental defect: A technical note. Archives of Orthopaedic and Trauma Surgery. 129 (2), 225-226 (2009).
- Xing, J., et al. Establishment of a bilateral femoral large segmental bone defect mouse model potentially applicable to basic research in bone tissue engineering. The Journal of Surgical Research. 192 (2), 454-463 (2014).
- Chadayammuri, V., Hake, M., Mauffrey, C. Innovative strategies for the management of long bone infection: A review of the Masquelet technique. Patient Safety in Surgery. 9 (32), (2015).
- Koettstorfer, J., Hofbauer, M., Wozasek, G. E. Successful limb salvage using the two-staged technique with internal fixation after osteodistraction in an effort to treat large segmental bone defects in the lower extremity. Archives of Orthopaedic and Trauma Surgery. 132 (19), 1399-1405 (2012).
- Fragomen, A. T., Rozbruch, S. R.
- O’Toole, R. V., et al. A prospective randomized trial to assess fixation strategies for severe open tibia fractures: Modern ring external fixators versus internal fixation (FIXIT Study). Journal of Orthopaedic Trauma. 31, S10-S17 (2017).
- Fürmetz, J., et al. Bone transport for limb reconstruction following severe tibial fractures. Orthopedic Reviews. 8 (1), 6384 (2016).
- Dohin, B., Kohler, R. Masquelet’s procedure and bone morphogenetic protein in congenital pseudarthrosis of the tibia in children: A case series and meta-analysis. Journal of Children's Orthopaedics. 6 (4), 297-306 (2012).
- Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: Mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11, 45-54 (2015).
- Pascher, A., et al. Gene delivery to cartilage defects using coagulated bone marrow aspirate. Gene Therapy. 11 (2), 133-141 (2004).
- Glatt, V., Matthys, R. Adjustable stiffness, external fixator for the rat femur osteotomy and segmental bone defect models. Journal of Visualized Experiments. (92), (2014).
- Betz, O. B., et al. Direct percutaneous gene delivery to enhance healing of segmental bone defects. The Journal of Bone and Joint Surgery. 88 (2), 355-365 (2006).
- Fang, J., et al. Stimulation of new bone formation by direct transfer of osteogenic plasmid genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (12), 5753-5758 (1996).
- Kaspar, K., Schell, H., Toben, D., Matziolis, G., Bail, H. J. An easily reproducible and biomechanically standardized model to investigate bone healing in rats, using external fixation. Biomedizinische Technik. 52 (6), Berlin. 383-390 (2007).
- Leary, S., et al. AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2013 edition. American Veterinary Medical Association. , (2013).
- McKay, W. F., Peckham, S. M., Badura, J. M. A comprehensive clinical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 (INFUSE Bone Graft). International Orthopaedics. 31 (6), 729-734 (2007).
- Living lmage Software. , Perkin Elmer. (2006).
- Bassett, J. H. D., Van Der Spek, A., Gogakos, A., Williams, G. R. Quantitative X-ray imaging of rodent bone by faxitron. Methods in Molecular Biology. , 499-506 (2012).
- Histing, T., et al. Small animal bone healing models: Standards, tips, and pitfalls results of a consensus meeting. Bone. 49 (4), 591-599 (2011).
- Lieberman, J. R., et al. The effect of regional gene therapy with bone morphogenetic protein-2-producing bone-marrow cells on the repair of segmental femoral defects in rats. The Journal of Bone and Joint Surgery. 81 (7), 905-917 (1999).
- Tsuchida, H., Hashimoto, J., Crawford, E., Manske, P., Lou, J. Engineered allogeneic mesenchymal stem cells repair femoral segmental defect in rats. Journal of Orthopaedic Research. 21 (1), 44-53 (2003).
- Jiang, H., et al. Novel standardized massive bone defect model in rats employing an internal eight-hole stainless steel plate for bone tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (4), 2162-2171 (2018).
- Baltzer, A. W., et al. Genetic enhancement of fracture repair: Healing of an experimental segmental defect by adenoviral transfer of the BMP-2 gene. Gene Therapy. 7 (9), 734-739 (2000).
- Li, Y., et al. Bone defect animal models for testing efficacy of bone substitute biomaterials. Journal of Orthopaedic Translation. 3 (3), 95-104 (2015).
