Summary
Presentamos aproximaciones experimentales para estudiar interactianos de RNA de doble cadena RNA Unión proteína quinasa RNA-activado (PKR) durante el ciclo celular mamífero con células HeLa. Este método utiliza formaldehído complejos RNA-PKR la reticulación y la inmunoprecipitación para enriquecer PKR-limite RNAs. Estos RNAs pueden analizarse más a través de la secuenciación de alto rendimiento o qRT-PCR.
Abstract
Kinase de proteína RNA-activado (PKR) es un miembro de las proteínas de la respuesta inmune innata y reconoce la estructura secundaria de doble cadena de ARN viral. Cuando se enlaza a los RNAs virales de doble hebra (dsARN), PKR experimenta la dimerización y autophosphorylation posterior. PKR fosforilada (pPKR) se activa e induce la fosforilación de la subunidad alfa del factor de iniciación eucariota 2 (eIF2α) para suprimir el traductor global. Creciente evidencia sugiere que PKR puede activarse en condiciones fisiológicas durante el ciclo celular o bajo diferentes condiciones de estrés sin infección. Sin embargo, nuestra comprensión de los activadores de RNA de PKR es limitado debido a la falta de un método experimental estandarizado para capturar y analizar la interacción PKR dsRNAs. Aquí, presentamos un experimental protocolo específicamente enriquecer y analizar PKR obligado RNAs durante el ciclo celular con células HeLa. Utilizamos la actividad eficiente de la reticulación de formaldehído para fijar complejos ARN-PKR y aislarlos mediante inmunoprecipitación. PKR co-immunoprecipitated RNAs pueden entonces ser procesados para generar una biblioteca de secuenciación de alto rendimiento. Una clase importante de dsRNAs celular interactuando PKR es RNAs mitocondriales (mtRNAs), que pueden existir como dsRNAs intermolecular a través de la interacción complementaria entre la cadena pesada y las RNAs de filamento de la luz. Para estudiar el strandedness de estos mtRNAs duplex, también presentamos un protocolo específico de filamento qRT-PCR. Nuestro protocolo está optimizado para el análisis de PKR-limite RNAs, pero puede ser fácilmente modificado para estudiar celular dsRNAs o RNA-interactianos de otras proteínas de Unión dsRNA.
Introduction
La proteína quinasa RNA-activado (PKR), también conocido como eucariótico de iniciación factor 2-alfa 2 (EIF2AK2), es una quinasa bien caracterizado que transmite informaciones de RNAs. Pertenece a la alfa de la subunidad de iniciación 2 traducción en eucariotas (eIF2α) familia cinasa y fosforila eIF2α en serina 51 en respuesta a la infección para suprimir traductor global1. En este contexto, el PKR es activado por RNAs virales de doble hebra (dsARN), que proporcionan una plataforma para PKR dimerización y autophosphorylation2. Además de eIF2α, PKR puede también fosforilan p53, sustrato del receptor de insulina 1, inhibidor κB y c-Jun N-terminal quinasa (JNK) para regular la actividad de numerosas señales de transducción vías3,4,5, 6.
PKR fue identificado originalmente como una quinasa que fosforila eIF2α durante la infección por poliovirus por reconocimiento dsRNAs7,8 de poliovirus. PKR se encuentra cada vez más para jugar múltiples roles más allá de la respuesta inmune, y su activación aberrante o mal funcionamiento está implicado en numerosas enfermedades humanas. Activado/Phosphorylated PKR (pPKR) se observa con frecuencia durante la apoptosis y es una característica común de pacientes con enfermedades crónico-degenerativas, particularmente las enfermedades neurodegenerativas como la de Huntington, Parkinson y la enfermedad de Alzheimer9 ,10,11,12,13. Además, PKR se activa bajo diferentes condiciones de estrés como la tensión metabólica y calor choque14,15,16,17. Por otra parte, inhibición de PKR resultado creciente de la célula proliferación y transformación maligna hasta18,19. Función PKR también es importante en la función normal del cerebro y durante el ciclo celular como el nivel de pPKR es elevada durante la fase M20,21,22. En este contexto, pPKR suprime traductor global y proporciona señales para sistemas de señalización mitóticos clave que se requieren para la correcta división celular20. Por otra parte, la activación prolongada de PKR resultó en fase G2/M23de las células de la detención del ciclo celular de ovario de hámster chino. En consecuencia, la fosforilación PKR está regulada por el bucle de retroalimentación negativa para asegurar la rápida desactivación durante de transición M/G121.
A pesar de la función de la amplia gama de PKR, nuestro entendimiento de la activación de PKR es limitado debido a la falta de un enfoque experimental estandarizado de alto rendimiento para capturar e identificar los dsRNAs que puede activar PKR. Estudios anteriores han demostrado que PKR puede interactuar con dsRNAs formado por dos invertido Alu repeticiones (IRAlus)20,24, pero la posibilidad de la existencia de dsRNAs celular adicional que puede activar PKR durante el ciclo celular o bajo condiciones de estrés en células humanas era inexplorado. El enfoque convencional en la identificación de RNA-interactianos de una proteína de unión a RNA (RBP) utiliza luz ultravioleta para reticulación RNA-RBP complejos25,26,27. Un estudio reciente había aplicado este método de reticulación UV en un sistema de ratón e identificó que RNAs nucleolares pequeño pueden regular la activación de PKR durante el estrés metabólico16. Utilizando eficiencia alta reticulación de formaldehído, presentamos un método alternativo para identificar RNAs PKR interactuando durante el ciclo celular en células de HeLa28. Un enfoque similar se ha aplicado para estudiar otras dsRBPs como Staufen y Drosha29,30,31. Encontramos que PKR puede interactuar con varios tipos de RNAs noncoding como corto elemento nuclear entremezclado (seno), largo había entremezclado elemento nuclear (línea), el elemento de retrovirus endógeno (ERV) y RNAs incluso alfa satélite. Además, nos demostró que PKR puede interactuar con el ARN mitocondrial (mtRNAs), que forma de dsRNAs intermolecular a través de la interacción complementaria entre la cadena pesada y la luz del filamento RNAs28. Una publicación reciente apoyado nuestros datos que algunos mtRNAs en forma de dos caras y puede activar sensores de dsARN como melanoma diferenciación asociada a proteina 5 inducir interferones32. Más importante aún, la expresión y localización subcelular de mtRNAs son moduladas durante el ciclo celular y por diversos factores de estrés, que puede ser importante en su capacidad para regular la activación de PKR28.
En este artículo, presentamos un protocolo detallado para una reticulación de formaldehído desarrollado recientemente y la inmunoprecipitación (fCLIP) método para capturar y analizar RNAs PKR interactuando durante el ciclo celular. Se demuestra el método para preparar muestras de detención del ciclo celular mediante timidina y nocodazole. A continuación presentamos el proceso de fCLIP para aislar RNAs PKR-limite y un método para preparar la biblioteca de secuenciación de alto rendimiento para identificar estos RNAs. Además, delinean los procedimientos detallados para analizar RNAs PKR-limita uso de qRT-PCR. En concreto, presentamos un procedimiento de transcripción reversa filamento específico para analizar el strandedness de mtRNAs. El protocolo descrito está optimizado para las células HeLa y PKR, pero pasos como la preparación de la muestra del ciclo celular, fCLIP y análisis específicos de filamento qRT-PCR pueden modificarse fácilmente para estudiar celular dsRNAs o identificar interactianos de RNA de otros dsRBPs.
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Protocol
1. solución y célula preparación
- Preparación de la solución
- Para el medio de cultivo celular, preparar medio de cultivo de células HeLa añadiendo 50 mL de suero bovino fetal (FBS) a 500 mL de medio modificado Eagle de Dulbecco (DMEM).
Nota: Pueden añadirse antibióticos al medio de cultivo celular, pero no utilizamos antibióticos. - Para el 0,1% paraformaldehido, disolver paraformaldehído al 4% (p/v) de 1 x Phosphate-Buffered salino (PBS) con calefacción en un plato caliente y diluido para hacer 30 mL de paraformaldehído al 0,1% (v/v) mediante la adición de 1 x PBS.
PRECAUCIÓN: Realizar todos los pasos en una campana de humos y tenga cuidado de no hervir la solución de paraformaldehído. Proteger la solución al 0.1% de la luz y almacenar a 4 ° C. Usar la solución dentro de un mes.
Nota: El pH de la solución de paraformaldehído al final de 0,1% (v/v) debe ser alrededor de 7. - Preparación de buffer de lisis de fCLIP: 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 15 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0,5% (v/v) nonidet-p40 (NP-40), 0,1% Tritón X-100, (v/v) 0,1% (v/v) sodio dodecil sulfato (SDS) y desoxicolato de sodio 0,1% (p/v). Añadir agua destilada triple (TDW) a 40 mL. Almacenar a 4 ° C.
- Preparar el tampón de lavado fCLIP: 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0,1% (v/v) NP-40, 0,1% Tritón X-100 (v/v) 0,1% (v/v) SDS y 0.1% (p/v) desoxicolato de sodio. Añadir capacidad a 40 mL. Almacenar a 4 ° C.
- Preparar 4 x buffer de PK: 400 mM Tris-HCl (pH 7.5), 200 mM NaCl, 40 mM EDTA y SDS 4% (v/v). Añadir capacidad a 40 mL. Almacenar a temperatura ambiente.
- Preparar el tampón de elución de fCLIP: 20 mL de 4 x PK tampón, 21 g de urea y 8,5 mL de capacidad. Preparar fresco.
- Preparar el tampón de elución de RNA: 0,3 M NaOAc y SDS 2% (w/v). Almacenar a temperatura ambiente.
- Preparar 2 x tinte de carga RNA: azul de bromofenol 0.025% (w/v), 0.025% (w/v) xileno cyanol, EDTA 5 mM, 0.05% (p/v) de SDS y formamida de 95% (v/v). Almacenar a-20 ° C.
- Preparación de buffer de x TBE 1: 0.089 M Tris borato y 0.002 M EDTA. Preparar 500 mL de tampón TBE.
- Para el medio de cultivo celular, preparar medio de cultivo de células HeLa añadiendo 50 mL de suero bovino fetal (FBS) a 500 mL de medio modificado Eagle de Dulbecco (DMEM).
- Preparación de células detenidas en fase S o M
- Semilla 750.000 ~ o ~ 1.000.000 HeLa células para muestras detenido en fase S o M, respectivamente. Crecen las células a 37 ° C y 5% de CO2 durante 24 h.
- Tratar las células con timidina de 2 mM e incubar durante 18 h a 37 ° C.
- Lavan las células dos veces con PBS. Añadir medio fresco e incubar de 9 h a 37 ° C.
- Para las células detenidas en fase S, tratar las células con timidina 2 mM. Para las células detenidas en fase M, tratar las células con 100 ng/mL nocodazole. Incubar por 15 h a 37 ° C y la cosecha de las células.
Nota: La homogeneidad de las muestras del ciclo celular puede ser comprobada utilizando FACS.
2. formaldehído Cross-linking e inmunoprecipitación
- Cosecha de células
- Para una muestra de fase S, recoger las células con un raspador celular y transferencia en un tubo cónico de 15 mL. Para una muestra de fase M, toque en el lado de la placa de cultivo celular para separar células detenidas en fase M y transferirlos a un tubo cónico de 15 mL.
Nota: Para aumentar la homogeneidad de las células detenidas en fase M, use un raspador celular. - Centrifugar las células a 380 x g a temperatura ambiente durante 3 minutos Retire el sobrenadante y resuspender con 1 mL de PBS frío y la transferencia en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
- Centrifugar las células a 10.000 x g a 4 ° C durante 30 s. Retire el sobrenadante completamente.
- Para una muestra de fase S, recoger las células con un raspador celular y transferencia en un tubo cónico de 15 mL. Para una muestra de fase M, toque en el lado de la placa de cultivo celular para separar células detenidas en fase M y transferirlos a un tubo cónico de 15 mL.
- Reticulación de formaldehído
- Añadir 750 μL de paraformaldehído al 0.1% durante 10 min a temperatura ambiente para fijar las células.
- Añadir 250 μL de glicina de 1 M e incubar un adicional 10 min a temperatura ambiente para calmar la reacción. Centrifugar las células a 10.000 x g a 4 ° C durante 30 s. Retire el sobrenadante completamente.
- Vuelva a suspender con 1 mL de PBS. Centrifugar las células a 10.000 x g a 4 ° C para 30 s y eliminar el sobrenadante.
- Resuspender con 400 μL de tampón de lisis fCLIP suplementado con 0.2% (v/v) inhibidor de la proteasa y el 2% (v/v) inhibidor de la Rnasa. Incubar en hielo por 10 min y someter a ultrasonidos usando un ultrasonicador.
- Añadir 11 μL de 5 M de NaCl para ajustar la concentración de NaCl a ~ 150 mM. Vortex brevemente y centrifugue a 21.130 x g a 4 ° C durante 15 minutos transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL previamente enfriada.
Nota: Conservar 40 μL del sobrenadante en un tubo de centrífuga nueva como la muestra de entrada. Tienda la entrada muestra a 4 ° C.
- Inmunoprecipitación
- Añadir 20 μL de perlas de proteína A en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
- Lavar los granos con 400 μL de tampón de lisis fCLIP. Centrifugue los granos a 1.000 x g a 4 ° C durante 1 minuto, retirar el sobrenadante y añadir 400 μL de tampón de lisis fCLIP cuidadosamente. Suavemente, vuelva a suspender las cuentas invirtiendo 3 ~ 4 veces.
- Repetir el lavado tres veces. Después del último lavado, eliminar completamente el sobrenadante.
- Vuelva a suspender las cuentas en 300 μL de tampón de lisis de fCLIP. Añadir 8,3 μL de 5 M de NaCl para ajustar la concentración de NaCl a ~ 150 mM. Añadir 10 μL del anticuerpo PKR e incubar durante 3 h en un rotador a 4 ° C.
- Centrifugue los granos a 1.000 x g a 4 ° C durante 1 minuto, retirar el sobrenadante y añadir 400 μL de tampón de lavado fCLIP. Suavemente, vuelva a suspender las cuentas invirtiendo 3 ~ 4 veces.
- Repetir el lavado dos veces. Después del último lavado, eliminar completamente el sobrenadante.
Nota: Nunca use un mezclador de tipo vórtex. Invertir el tubo suavemente con las manos. - Añadir 300 μL de lisado e incubar durante 3 h a 4 ° C en un agitador.
Nota: Tiempo de incubación más largo puede resultar en el enlace de mayor fondo. - Centrifugue los granos a 1.000 x g a 4 ° C durante 1 minuto, retirar el sobrenadante y añadir 400 μL de tampón de lavado fCLIP. Suavemente, vuelva a suspender las cuentas invirtiendo 3 ~ 4 veces.
- Repetir el lavado tres veces. Después del último lavado, eliminar completamente el sobrenadante.
- Añadir 300 μL de tampón de elución de fCLIP. Incubar en un Termomezcladores de 3 h a 25 ° C a fin de eluir PKR de los granos.
Nota: Preparar el fresco de buffer de elución de fCLIP. - Centrifugar a 1.000 x g a temperatura ambiente y transferir el sobrenadante a un tubo siliconado limpio.
Nota: Un tubo de microcentrífuga es también aceptable, pero es preferible tubo siliconado para evitar la evaporación durante el reticulación de paso (2.3.12). - Añadir 300 μL de proteinasa K (20 mg/mL) e incubar durante la noche a 65 ° C.
Nota: Utilice un Termomezcladores con cubierta climatizada para evitar la evaporación.
- Extracción de RNA
- Añadir 580 μL de ácido fenol cloroformo y agitar por 30 s. incubar a 37 ° C durante 1 hora.
- Vortex por 30 s y centrifugar a 12.000 x g a temperatura ambiente durante 10 minutos.
- Transferir la capa superior en un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 mL. Añadir el 1/10 volumen de NaOAc 3 M, 0,5 μL de coprecipitant (e.g., Glycoblue) y un volumen igual de isopropanol. Incubar durante una noche a-20 ° C.
- Precipitar el pellets por centrifugación a velocidad máxima a 4 ° C durante 1 hora.
Nota: Si no se observaron gránulos de ARN/ADN, agregar un adicional 0,5 μL de coprecipitant y centrifugar durante un adicional 1 h. continuar este paso hasta que se observan gránulos de ARN/ADN. - Quite el sobrenadante y agregar 1 mL de alcohol etílico al 75%. Centrifugar a 12.000 x g a 4 ° C por 5 min repetir el lavado una vez más. Quite completamente el sobrenadante y secar el precipitado a temperatura ambiente.
- Añadir 42 μL de TDW, 5 μL de DNasa buffer, 1 μL de inhibidor de la Rnasa y 2 μL de DNasa I. incubar a 37 ° C durante 1 hora.
- Añadir 150 μL de TDW y 200 μL de ácido fenol cloroformo. Vortex por 30 s. Centrifugar a 12.000 x g a temperatura ambiente durante 10 minutos.
- Transferir la capa superior en un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 mL. Añadir 20 μL de 3 M NaOAc, 0.5 μL de coprecipitant y 1 mL de alcohol etílico de 100%. Incubar durante una noche a-80 ° C.
- Pellets de precipitar y lavar con alcohol etílico al 75% como se describe en pasos 2.4.4 para 2.4.5.
- Vuelva a suspender en la cantidad apropiada de TDW.
3. secuencia biblioteca elaboración
- retiro de rRNA
- Vuelva a suspender los pellets de RNA de paso 2.4.10 con 28 μL del PST.
Nota: La máxima cantidad de ARN total debe ser menos de 5 μg. - Seguir los procedimientos previstos por la guía de referencia del kit de extracción de rRNA para quitar rRNA.
- Limpiar rRNA había agotado ARN mediante la adición de 160 μL de bolas magnéticas.
- Mezclar mediante pipeteo ~ 15 veces e incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos.
- Conecte el tubo de una barra magnética y eliminar el sobrenadante.
- Añadir 300 μL de alcohol etílico 80% mientras que los granos estén fijados en la barra magnética e incuban durante 30 s.
- Reemplazar el alcohol etílico con una solución fresca de 300 μL. Secar los granos en la barra magnética durante 12 minutos a temperatura ambiente.
- Vuelva a suspender las cuentas en 12 μL de TDW y mezclar mediante pipeteo 15 veces.
- Coloque los granos en la barra magnética y trasladar el sobrenadante a un tubo limpio de PCR.
- Agotan las fragmentada RNAs ribosomal (rRNAs) siguiendo los procedimientos previstos por rRNA Kit de agotamiento.
- Limpiar el ARN añadiendo 110 μL de granos magnéticos y repitiendo pasos 3.1.3.1 a 3.1.3.6.
- Vuelva a suspender los pellets de RNA de paso 2.4.10 con 28 μL del PST.
- Ligadura de etiquetado y adaptador de RNA
- En RNAs rRNA-agotado, añadir 2 μL de tampón de x CIAP 10, 1 μL de inhibidor de la Rnasa y 2 μL de la fosfatasa alcalina Antártica. Incubar a 37 ° C por 1 h y luego a 65 ° C por 5 min inactivar la fosfatasa.
- Agregar 3 μL de tampón de x PNK 10, 1,5 μL de inhibidor de la Rnasa, 1,5 μL de enzima T4 PNK, 0,8 μL de r-ATP y 1,7 μL del PST. Incubar a 37 ° C por 50 minutos.
- Añadir 1,5 μL de 10 mM ATP e incubar a 37 ° C durante 40 minutos adicionales.
- Detener la reacción agregando 170 μL del buffer de elución de RNA.
- Añada 200 μL de ácido fenol cloroformo y agitar durante 30 s. Centrifugar a 12.000 x g a temperatura ambiente durante 10 minutos.
- Transferir la capa superior en un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 mL. Añadir 20 μL de 3 M NaOAc, 0.5 μL de coprecipitant y 1 mL de alcohol etílico de 100%. Incubar durante una noche a-80 ° C.
- Precipitar el pellet de RNA y lavar con alcohol etílico al 75% como se describe en pasos 2.4.4 para 2.4.5. Vuelva a suspender en 4.5 μL del PST y añadir 9 μL de 2 x tinte carga de RNA.
- Calentar la muestra a 95 ° C por 5 min y carga en un gel de Urea-PAGE 10%.
- Correr el gel a 370 V durante 40 minutos.
Nota: Ejecutar previamente el gel a 370 V durante 90 minutos antes de cargar la muestra. - Corte el gel en la región de nucleótido de ~ 100 – 500 y romper el gel.
- Añadir 700 μL de 0,3 M de NaCl e incubar durante una noche a 4 ° C en un agitador.
- Transferir la solución a una columna y centrifugar a máxima velocidad a temperatura ambiente durante 5 minutos.
- Transferir el eluido en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL limpio. Añadir el 1/10 volumen de NaOAc 3 M, 0,5 μL de coprecipitant y un volumen igual de isopropanol. Incubar durante una noche a-20 ° C.
- 3' ligadura de adaptador
- Precipitar el pellet de RNA y lavar con alcohol etílico al 75% como se describe en pasos 2.4.4 para 2.4.5.
- Resuspender el pellet de RNA en 6,5 μL del PST y añadir 1 μL de 10 μM 3' adaptador.
- Transferir la solución a un tubo PCR e incubar a 70 ° C por 2 min.
- Añadir 1 μL de tampón de ligadura de 10 x, 0.5 μL de inhibidor de la Rnasa y 1 μL de ligasa de T4 RNA 2. Incubar a 28 ° C por 1 h, 25 ° C por 6 h y 22 ° C por 6 h.
- Añadir 12 μL de 2 x RNA carga tinte y calor a 95 ° C durante 5 minutos.
- Purificar de gel 3' adaptador ligarse RNAs como se describe en 3.2.9 a 3.2.13.
- 5' ligadura de adaptador
- Precipitar el pellet de RNA y lavar con alcohol etílico al 75% como se describe en pasos 2.4.4 para 2.4.5.
- Resuspender el pellet de RNA en μL 4,2 del PST y añadir 1 μL de 5 μM 5' adaptador.
- Transferir la solución a un tubo PCR e incubar a 70 ° C por 2 min.
- Agregar 0,8 μL de tampón de ligasa de x 10, 0.4 μL de inhibidor de la Rnasa, 0,8 μL de 10 mM ATP, 0,8 μL de ligasa de T4 RNA 1. Incubar a 28 ° C por 1 h, 25 ° C por 6 h y 22 ° C por 6 h.
- Transcripción reversa y amplificación por PCR
- 5' adaptador RNAs ligados, añadir 1 μL de cebador de transcripción inversa de 4 μM. Incubar a 70 ° C por 2 min y enfriar inmediatamente a 4 ° C.
- Añadir 4 μL de tampón de FS de x 5, 4 μL de 2.5 mM dNTP, 1 μL de 0,1 M TDT 1 μL de inhibidor de la Rnasa y 1 μL de transcriptasa reversa. Incubar a 50 ° C por 1 h y a 70 ° C por 15 minutos.
- Preparar la amplificación por PCR
- Mezclar 1 μL del producto de RT, 1 μL de cebador RPI de 25 μM, 1 μL de cebador de RP1 de 25 μM, 10 μL de 5 x buffer de HF, 4 μL de 2.5 mM dNTP, 32,5 μL del PST y 0,5 μL de polimerasa de alta fidelidad.
- Ejecutar programa PCR para 11 ~ 13 ciclos.
Nota: El programa de la polimerización en cadena es: 98 ° C por 30 s para un arranque en caliente, 98 ° C por 10 s, 60 ° C durante 30 s y 72 ° C por 45 s para la amplificación y 72 ° C durante 5 minutos. La etapa de amplificacion se repite por ciclos de 11-13.
- Limpiar los productos PCR usando 40 μL de los granos magnéticos y siguientes pasos 3.1.3.1 a 3.1.3.6 pero con 10 μL de capacidad a fin de eluir el ADN.
- Añadir 2 μL de colorante de carga de ADN de x 10. Cargar la muestra en un gel de acrilamida de 6% y ejecutar a 200 V durante 30 minutos.
- Tinción con Sybr oro (0.01% (v/v) en solución tampón de x TBE 1) durante 5 minutos a temperatura ambiente.
- La mancha en 1 x TBE solución tampón durante 5 minutos a temperatura ambiente.
- Corte el gel en la región de ~ 200 – 700 nucleótidos y romper el gel.
- Añadir 700 μL de 0,3 M de NaCl e incubar durante la noche a temperatura ambiente a fin de eluir el ADN.
- Cargar todo en una columna y centrifugar a máxima velocidad a temperatura ambiente durante 5 minutos.
- Transferir el eluido en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL limpio. Añadir el 1/10 volumen de NaOAc 3 M, 0,5 μL de coprecipitant y un volumen igual de isopropanol. Incubar durante una noche a-20 ° C.
- Precipitar el DNA pellets y lavar con alcohol etílico al 75% como se describe en pasos 2.4.4 para 2.4.5. Resuspender en 20 μL del PST.
- Analizar la muestra utilizando un secuenciador.
4. Análisis de RNAs PKR interactuando mediante qRT-PCR
- Método 1: Random hexamer transcripción reversa
- Resuspender el pellet de RNA de paso 2.4.10 con 8,5 μL de TDW y transfiera la solución a un tubo PCR.
- Añadir 0,5 μL de 100 μM random hexamers y 4 μL de mezcla de dNTP 2,5 mM.
- Calor la solución a 65 ° C por 5 min e inmediatamente incubar en hielo durante al menos 1 minuto.
- Hacer la reacción de la mezcla: 4 μL de tampón de x SSIV 5, 1 μL de 100 mM DTT, 1 μL de inhibidor de la Rnasa y 1 μL de transcriptasa reversa (200 U/μL). Añadir la mezcla de reacción a la solución de RNA.
- Incubar la mezcla a 23 ° C durante 10 min, 50 º C durante 10 min y 80 ° C durante 10 minutos.
- Analizar el cDNA utilizando un sistema PCR en tiempo real.
Nota: El programa de la PCR en tiempo real es: 95 ° C por 3 min para arranque en caliente, 95 ° C durante 5 s y 60 ° C durante 10 s para la amplificación y 95 ° C por 30 s, 65 ° C durante 30 s y 95 ° C para 30 s para derretir. La etapa de amplificacion se repite para 40 ciclos.
- Método 2: Filamento específico transcripción reversa
- Preparar una mezcla maestra de cartillas inversas: mezclar cantidades iguales de cartillas de reversa de la transcripción específico gen que contenga CMV promotor secuencia seguidas de ~ 20 nucleótidos de secuencias específicas de genes.
Nota: La concentración combinada de todos los iniciadores RT de genes específicos es 4 μM. - Resuspender el pellet de RNA de paso 2.4.10 con 8,5 μL de TDW y transfiera la solución a un tubo PCR.
- Agregar 0.5 μL de mezcla maestro de 4 μM de iniciadores de reversa de la transcripción y 4 μL de mezcla de dNTP 2,5 mM.
- Calor la solución a 65 ° C por 5 min e inmediatamente incubar en hielo durante al menos 1 minuto.
- Preparar la solución de reacción mezclando 4 μL de tampón de x SSIV 5, 1 μL de 100 mM DTT, 1 μL de inhibidor de la Rnasa y 1 μL de transcriptasa reversa (200 U/μL). Añadir la solución de reacción a la mezcla de RNA cebador.
- Incubar la solución a 50 ° C por 10 min y 80 ° C durante 10 minutos.
- Analizar el cDNA usando el sistema PCR en tiempo real.
Nota: El programa de la PCR en tiempo real es igual que el descrito en el método 1.
- Preparar una mezcla maestra de cartillas inversas: mezclar cantidades iguales de cartillas de reversa de la transcripción específico gen que contenga CMV promotor secuencia seguidas de ~ 20 nucleótidos de secuencias específicas de genes.
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Representative Results
Un esquema para el proceso de detención de las células HeLa en la fase S o M del ciclo celular se muestra en la figura 1. Para una muestra de fase detenido M, claramente podemos visualizar células redondas formadas bajo el microscopio (figura 2A). Para examinar la eficacia de la detención del ciclo celular, el contenido nuclear de la célula puede ser analizado utilizando FACS (figura 2B). La figura 3 muestra datos representativos para la prueba de eficacia de inmunoprecipitación, donde el anticuerpo D7F7 demuestra una capacidad superior a immunoprecipitate PKR. Esta diferencia en la eficacia de la inmunoprecipitación ha reflejado en la discrepancia en la distribución de la clase de las bibliotecas de secuenciación de alto rendimiento con dos anticuerpos distintos de PKR (figura 4). La especificidad del anticuerpo D7F7 es confirmada mediante análisis western blot toda de la immunoprecipitate PKR (figura 5A) y el lisado celular total (figura 5B). La figura 6 muestra la señal de radioisótopos antes y después del retiro de rRNAs durante la preparación de la biblioteca de secuenciación de alto rendimiento. La figura 7 muestra el enriquecimiento de mtRNAs en RNAs co-immunoprecipitated con PKR, pero no en RNAs co-immunoprecipitated con conejo IgG o DiGeorge síndrome cromosómica región 8 (DGCR8). La figura 8 muestra el filamento representante específico análisis de PKR-limite mtRNAs en S o M-fase qRT-PCR muestras de detenido.
Figura 1: esquema para las muestras de detención del ciclo celular de preparación. (A, B) Esquemas de la preparación de S (A) o M (B) detenido en fase de células HeLa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Análisis de ciclo celular detuvieron muestras. (A) imágenes de muestras detenidas en fase S o M de contraste de fase. Las barras indican 250 μm. (B) FACS análisis mostrando el contenido nuclear de las muestras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: prueba de eficacia de la inmunoprecipitación para anticuerpos PKR. Para el enriquecimiento acertado de RNAs de PKR-limite, debe utilizarse un anticuerpo con una eficacia definitiva inmunoprecipitación como el anticuerpo D7F7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: distribución de clase de RNA de bibliotecas de la secuencia elaborada con diferentes anticuerpos PKR. Usando los diferentes anticuerpos PKR de fCLIP dio lugar a una distribución de clase diferente de la secuencia asignada Lee. La discrepancia es probablemente debido a las diferencias en la eficacia de la inmunoprecipitación. Esta figura ha sido modificada de Kim et al.28. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: especificidad del anticuerpo D7F7 PKR. (A, B) Toda mancha blanca /negra occidental análisis de PKR immunoprecipitated (A) o lisado total HeLa (B) demostraron solamente una venda fuerte correspondiente al tamaño de PKR, indicando que el D7F7 es altamente específico en el reconocimiento de PKR. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: señal de radioisótopos para PKR co-immunoprecipitated RNAs. (A) PKR co-immunoprecipitated RNAs se podían detectar por etiquetar sus extremos 5' con r-ATP. (B) disminución de la señal radioistope se observó en retiro acertado de rRNA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: validación de PKR mtRNA interacciones. Sesión2 doble enriquecimiento de mtRNAs RNAs co-immunoprecipitated con anticuerpos indicados. Sólo la PKR immunoprecipitated co RNA muestra mostró fuerte enriquecimiento de mtRNAs. Anticuerpos IgG de conejo y de DGCR8 fueron utilizados como controles negativos. Esta figura ha sido modificada de Kim et al.28. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: Análisis de qRT-PCR específicos de la cadena de PKR-limite mtRNAs. (A, B) Transcripción reversa filamento específico se utilizó para analizar el strandedness de mtRNAs que eran co-immunoprecipitated con PKR de S (A) o células detenidas en fase M (B). Esta figura ha sido modificada de Kim et al.28. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El proceso de preparación de muestras detenidas en fase S o M se ilustra en la figura 1. Para detener las células en la fase S, se utilizó un método de doble bloque de timidina donde tratamos las células con timidina dos veces con un lanzamiento de 9 h en el medio para asegurar eficacia de detención alto (figura 1A). De detención de la fase de M, tratamos a las células una vez con timidina seguido de un lanzamiento de 9 h y después se aplicaron nocodazole bloque células en Prometafase (figura 1B). Un paso clave en la preparación de la muestra del ciclo celular es el lanzamiento del primer bloque de timidina. Para eliminar completamente la timidina, es fundamental lavar las células de al menos dos veces con PBS fresco. Lavado inadecuado y timidina residual pueden resultar en mayor heterogeneidad y viabilidad celular disminuida. El éxito de la detención de fase M se puede confirmar visualmente basado en el aumento en el número de células de forma redonda (figura 2A). Sin embargo, la muestra de fase M todavía contiene muchas células de interfase basadas en su morfología. Para recoger sólo la fase M detuvo células, aplicamos fuerza física para separar células en fase M de la superficie. El contenido nuclear de las células cosechadas más fue examinado usando FACS, que demostró un amplio pico entre 2n y 4n para la fase S y un pico agudo en 4n para la muestra de detenido de fase M (figura 2B). El protocolo presentado está optimizado para las células HeLa, que tienen un tiempo de duplicación de aproximadamente 24 horas. La idea de doble bloque de timidina y timidina nocodazole se puede aplicar a otras líneas celulares, pero las duraciones de tratamiento y liberación de medicamento exacto necesitan ser optimizado basado en el tiempo de duplicación de las células diana.
Identificar RNAs PKR interactuando, que complejos de reticulado PKR-RNA con formaldehído y enriquecida a través de inmunoprecipitación. Un factor clave que determina la precisión de los análisis posteriores es la eficiencia de la inmunoprecipitación. Hemos probado varios anticuerpos dirigidos a diferentes epítopes de la proteína PKR para determinar el anticuerpo para la preparación de la biblioteca de secuenciación de alto rendimiento. Como se muestra en la figura 3, encontramos que el anticuerpo D7F7 que reconoce la región del linker entre los dominios de Unión dsRNA y el dominio catalítico mostraron capacidad superior en la captura de PKR. El otro anticuerpo mostrado en la figura 3 (Milli) reconoce la región N-terminal, pero muestra una pobre habilidad en immunoprecipitating PKR. En consecuencia, la biblioteca de secuenciación de alto rendimiento preparada usando el anticuerpo de Milli contiene muchas lecturas de secuenciación de fondo que están dispersos por todo el genoma, particularmente en intrones, sin distintas acumulaciones en regiones específicas28 (Figura 4). Creemos que las discrepancias en las dos bibliotecas de secuenciación son sobre todo debido a las diferencias en la capacidad de los anticuerpos en la captura de PKR durante el paso de la inmunoprecipitación. Además, examinamos la especificidad del anticuerpo D7F7 PKR mediante análisis western blot entero de immunoprecipitate (figura 5A) y lisados de HeLa total (figura 5B). En ambas lacras, sólo observamos una banda fuerte que corresponde a PKR. Esto indica que el anticuerpo D7F7 es altamente específico y que los datos de secuencia obtenidos utilizando el anticuerpo D7F7 probable reflejan ciertos interactianos de RNA de PKR.
Un paso crítico en la preparación de la biblioteca de secuenciación de alto rendimiento es la eliminación de los rRNAs. Puesto que nosotros complejos de RNA-RBP reticuladas con formaldehído, utilizamos un ultrasonicador para lisis completa de las células. Este proceso dio lugar a la fragmentación de rRNAs, que reduce significativamente la eficiencia de la eliminación del rRNA usando el rRNA Kit de extracción. Para resolver este problema, primero utilizamos el rRNA Kit de retiro seguido por el rRNA agotamiento Kit (véase Tabla de materiales), que casi totalmente eliminado rRNAs y menos del 1% del total de la secuencia Lee se asignan al rRNAs. Utilizamos estos dos kits de forma secuencial porque el rRNA agotamiento Kit tiene una capacidad máxima de 1 μg y el rRNA Kit de retiro tiene una capacidad máxima de 5 μg. Hemos experimentado que el uso de más de la cantidad recomendada de ARN total resulta en gran cantidad de lecturas de secuencia asignado a rRNAs. El retiro acertado del rRNA puede confirmarse después de etiquetar el ARN con r-ATP a través de la reacción de PNK. Mientras que el ARNr RNAs empobrecidos mostraron una banda distinta alrededor 150 nt, la muestra antes de retiro de rRNA muestra fuerte señal en toda la región correspondiente a los años 50 ~ 300 nt (figura 6).
Una limitación de reticulación de formaldehído es la eficiencia de la inmunoprecipitación de disminución. Otras aplicaciones de formaldehído reticulación como immunocytochemistry normalmente utilizan solución de paraformaldehído al 4% para la fijación. Sin embargo, no puede aplicarse tal condición de fijación fuerte para fCLIP experimento ya que reduce significativamente la eficiencia de la inmunoprecipitación, que se traduce en un mayor fondo. Por otra parte, complejos de proteínas de reticulaciones formaldehído fijación además de complejos de proteína-RNA. Por lo tanto, se debe prestar precaución en la interpretación de los datos de fCLIP.
Como se informó anteriormente, mtRNAs forman dsARN intermolecular que es reconocido por PKR28. Primero validamos nuestros datos de secuenciación mediante el examen de las interacciones de PKR mtRNA mediante qRT-PCR. Utilizamos conejo IgG y anticuerpos de DGCR8 como controles negativos, que no mostró ningún enriquecimiento de mtRNAs (figura 7). De nota, DGCR8 fue utilizada como una proteína nuclear dsARN está físicamente separada del mtRNAs. Al mismo tiempo, PKR immunoprecipitated co ARN mostraron fuerte enriquecimiento de mtRNAs (figura 7).
Para analizar las interacciones mtRNA PKR, realizamos la transcripción reversa filamento específico para distinguir la mtRNAs de la cadena pesada de la mtRNAs del filamento de la luz (figura 8). Diseño de primers que tienen una secuencia del promotor CMV había seguido por una secuencia de genes específicos y luego utilizan una secuencia del promotor CMV primer izquierda como derecha cartillas gene-específicas para el análisis de qPCR reversa de la transcripción. También hemos probado promotor SP6 y pGEX secuencia cartilla secuencias en lugar de la secuencia del promotor CMV. Encontramos que mientras que pGEX y CMV promotor secuencias de la cartilla de la secuencia demostró buen resultado, utilizando la secuencia del promotor SP6 no. La diferencia es debido al bajo contenido de GC de la secuencia de promotor SP6 (~ 33%) en comparación con las del promotor CMV (~ 67%) y la cartilla de la secuencia de pGEX (~ 65%) secuencias. El esquema propuesto para transcripción reversa filamento específico puede aplicarse fácilmente a otros dsRNAs intermolecular, pero al diseñar los cebadores de transcripción inversa, el contenido de GC debe tenerse en cuenta.
En general, hemos demostrado la preparación de muestras de ciclo celular detenido y el enriquecimiento de RNAs PKR interactuando a través de entrecruzamiento de formaldehído y la inmunoprecipitación. Usando un anticuerpo de D7F7 altamente eficiente, con éxito hemos aislado RNAs PKR-limite e identificado estos RNAs mediante la generación y análisis de una biblioteca de secuenciación de alto rendimiento. Además, para analizar el strandedness de mtRNAs a PKR, presentamos un enfoque específico de cadena reversa de la transcripción. Esperamos que el protocolo presentado puede optimizarse fácilmente para estudiar interactianos de RNA de otro dsRBPs y strandedness de dsRNAs intermoleculares que se forman a través de la interacción complementaria entre sentido y antisentidas transcripciones.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el programa de investigación de ciencia básica a través de la nacional investigación Fundación de Corea (NRF) financiado por el gobierno de Corea Ministerio de ciencia y TIC (NRF-2016R1C1B2009886).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9260G | |
| 1 M Tris, pH 7.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9855G | |
| 1 M Tris, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9855G | |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-175-C | |
| 10% Nonidet-p40 (NP-40) | Biosolution | BN015 | |
| 10X DNA loading buffer | TaKaRa | 9157 | |
| 15 mL conical tube | SPL | 50015 | |
| 3' adaptor | 5'-rApp NN NNT GGA ATT CTC GGG TGC CAA GG/3ddC/-3' | ||
| 3 M Sodium Acetate pH 5.5 | Thermo Fisher Scientific | AM9740 | |
| 5' adaptor | 5'-GUU CAG AGU UCU ACA GUC CGA CGA UCN NNN-3' | ||
| 5 M NaCl | Thermo Fisher Scientific | AM9760G | |
| 50 mL conical tube | SPL | 50050 | |
| Acid-phenol chloroform, pH 4.5 | Thermo Fisher Scientific | AM9722 | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic beads DNA/RNA clean up |
| Antarctic alkaline phosphatase | New England Biolabs | M0289S | |
| Anti-DGCR8 | Made in house | ||
| Anti-PKR (D7F7) | Cell signaling technology | 12297S | |
| Anti-PKR (Milli) | Millipore EMD | 07-151 | |
| ATP (100 mM) | GE Healthcare | GE27-2056-01 | |
| Bromophenol blue sodium salt | Sigma-aldrich | B5525 | |
| Calf intestinal alkaline phosphatase | TaKaRa | 2250A | |
| Cell scraper 25 cm 2-position | Sarstedt | 83.183 | |
| CMV promoter sequence | 5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3' | ||
| Dulbecco's modified eagle medium | Welgene | LM001-05 | |
| dNTP mixture (2.5 mM) | TaKaRa | 4030 | |
| Ethanol, Absolute, ACS Grade | Alfa-Aesar | A9951 | |
| Fetal bovine serum | Merck | M-TMS-013-BKR | |
| Formamide | Merck | 104008 | |
| Glycine | Bio-basic | GB0235 | |
| GlycoBlue coprecipitant (15 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | AM9516 | |
| Isopropanol | Merck | 8.18766.1000 | |
| NEBNext rRNA Depletion Kit | New England Biolabs | E6318 | rRNA Depletion Kit |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404 | |
| Normal rabbit IgG | Cell signaling technology | 2729S | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 6148 | |
| PCR forward primer (RP1) | 5'-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GCG ATC TAC ACG TTC AGA GTT CTA CAG TCC GA-3' | ||
| PCR index reverse primer (RPI) | 5'-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT NNN NNN GTG ACT GGA GTT CCT TGG CAC CCG AGA ATT CCA-3' | ||
| PCR tubes with flat cap, 0.2 mL | Axygen | PCR-02-C | |
| Phosphate bufered saline (PBS) Tablet | TaKaRa | T9181 | |
| Phusion high-fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530 | High-fidelity polymerase |
| PlateFuge microcentrifuge with swing-out rotor | Benchmark | c2000 | |
| Polynucleotide kinase (PNK) | TaKaRa | 2021A | |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Sigma-Aldrich | 3115879001 | |
| qPCR primer sequence: CO1 Heavy | Forward/Reverse: 5′-GCCATAACCCAATACCAAACG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO1 Light | Forward/Reverse: 5′-TTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO2 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO2 Light | Forward/Reverse: 5′-GTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO3 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO3 Light | Forward/Reverse: 5′-CTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CYTB Heavy | Forward/Reverse: 5′-CAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CYTB Light | Forward/Reverse: 5′-GGATAGTAATAGGGCAAGGACG -3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: GAPDH | Forward/Reverse: 5′-CAACGACCACTTTGTCAAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND1 Heavy | Forward/Reverse: 5′-TCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND1 Light | Forward/Reverse: 5′-GTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND4 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CTCACACTCATTCTCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND4 Light | Forward/Reverse: 5′-TGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND5 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CTAGGCCTTCTTACGAGCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND5 Light | Forward/Reverse: 5′-TAGGGAGAGCTGGGTTGTTT-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND6 Heavy | Forward/Reverse: 5′-TCATACTCTTTCACCCACAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND6 Light | Forward/Reverse: 5′-TGCTGTGGGTGAAAGAGTATG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| Random hexamer | Thermo Fisher Scientific | SO142 | |
| Recombinant Dnase I (Rnase-free) (5 U/μL) | TaKaRa | 2270A | |
| Recombinant Rnase inhibitor (40 U/μL) | TaKaRa | 2313A | |
| Ribo-Zero rRNA Removal Kit | Illumina | MRZH116 | rRNA Removal Kit |
| Rotator | FINEPCR, ROTATOR AG | D1.5-32 | |
| RT primer sequence: CO1 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′ | ||
| RT primer sequence: CO1 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGCCATAACCCAATACCAAACG-3′ | ||
| RT primer sequence: CO2 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′ | ||
| RT primer sequence: CO2 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′ | ||
| RT primer sequence: CO3 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′ | ||
| RT primer sequence: CO3 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′ | ||
| RT primer sequence: CYTB Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGATAGTAATAGGGCAAGGACG-3′ | ||
| RT primer sequence: CYTB Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′ | ||
| RT primer sequence: GAPDH | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGAGCGATGTGGCTCGGCT-3′ | ||
| RT primer sequence: ND1 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND1 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND4 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND4 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTCACACTCATTCTCAACCC-3′ | ||
| RT primer sequence: ND5 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTTGGGTTGAGGTGATGATG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND5 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCATTGTCGCATCCACCTTTA-3′ | ||
| RT primer sequence: ND6 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGTTGAGGTCTTGGTGAGTG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND6 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCCATAATCATACAAAGCCCC-3′ | ||
| Siliconized polypropylene 1.5 mL G-tube | Bio Plas | 4167SLS50 | |
| Sodium dedecyl sulfate | Biosesang | S1010 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| SUPERase In Rnase inhibitor | Thermo Fisher Scientific | AM2694 | |
| SuperScript III reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientific | 18080093 | Reverse transcriptase for library preparation |
| SuperScript IV reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientific | 18090010 | Reverse transcriptase for qRT-PCR |
| SYBR gold nucleic acid gl stain | Thermo Fisher Scientific | S11494 | |
| T4 polynucleotide kinase | New England Biolabs | M0201S | |
| T4 RNA ligase 1 (ssRNA Ligase) | New England Biolabs | M0204 | |
| T4 RNA ligase 2, truncated KQ | New England Biolabs | M0373 | |
| Thermomixer | Eppendorf ThermoMixer C with ThermoTop | ||
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T9250 | |
| Tris-borate-EDTA buffer (TBE) | TaKara | T9122 | |
| Triton X-100 | Promega | H5142 | |
| Ultralink Protein A sepharose beads | Thermo Fisher Scientific | 22810 | Protein A beads |
| Ultrasonicator | Bioruptor | ||
| Urea | Bio-basic | UB0148 | |
| Vortex mixer | DAIHAN Scientific | VM-10 | |
| Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| γ-32P-ATP (10 μCi/μL, 3.3 μM) | PerkinElmer | BLU502A100UC |
References
- Meurs, E. F., et al. Constitutive expression of human double-stranded RNA-activated p68 kinase in murine cells mediates phosphorylation of eukaryotic initiation factor 2 and partial resistance to encephalomyocarditis virus growth. Journal of Virology. 66 (10), 5805-5814 (1992).
- Patel, R. C., Stanton, P., McMillan, N. M., Williams, B. R., Sen, G. C. The interferon-inducible double-stranded RNA-activated protein kinase self-associates in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (18), 8283-8287 (1995).
- Bennett, R. L., Pan, Y., Christian, J., Hui, T., May, W. S. The RAX/PACT-PKR stress response pathway promotes p53 sumoylation and activation, leading to G(1) arrest. Cell Cycle. 11 (1), 407-417 (2012).
- Yang, X., Nath, A., Opperman, M. J., Chan, C. The double-stranded RNA-dependent protein kinase differentially regulates insulin receptor substrates 1 and 2 in HepG2 cells. Molecular and Cellular Biology. 21 (19), 3449-3458 (2010).
- Zamanian-Daryoush, M., Mogensen, T. H., DiDonato, J. A., Williams, B. R. G. NF-kappa B Activation by Double-Stranded-RNA-Activated Protein Kinase (PKR) Is Mediated through NF-kappa B-Inducing Kinase and Ikappa B Kinase. Molecular and Cellular Biology. 20 (4), 1278-1290 (2000).
- Takada, Y., Ichikawa, H., Pataer, A., Swisher, S., Aggarwal, B. B. Genetic deletion of PKR abrogates TNF-induced activation of IkappaBalpha kinase. JNK, Akt and cell proliferation but potentiates p44/p42 MAPK and p38 MAPK activation. Oncogene. 26 (8), 1201-1212 (2007).
- Dabo, S., Meurs, E. F. dsRNA-dependent protein kinase PKR and its role in stress, signaling and HCV infection. Viruses. 4 (11), 2598-2635 (2012).
- Black, T. L., Safer, B., Hovanessian, A., Katze, M. G. The Cellular 68,000-Mr Protein-Kinase Is Highly Autophosphorylated and Activated yet Significantly Degraded during Poliovirus Infection - Implications for Translational Regulation. Journal of Virology. 63 (5), 2244-2251 (1989).
- Bando, Y., et al. Double-strand RNA dependent protein kinase (PKR) is involved in the extrastriatal degeneration in Parkinson's disease and Huntington's disease. Neurochemistry International. 46 (1), 11-18 (2005).
- Onuki, R., et al. An RNA-dependent protein kinase is involved in tunicamycin-induced apoptosis and Alzheimer's disease. The EMBO Journal. 23 (4), 959-968 (2004).
- Peel, A. Activation of the cell stress kinase PKR in Alzheimer's disease and human amyloid precursor protein transgenic mice. Neurobiology of Disease. 14 (1), 52-62 (2003).
- Peel, A. L. Double-stranded RNA-dependent protein kinase, PKR, binds preferentially to Huntington's disease (HD) transcripts and is activated in HD tissue. Human Molecular Genetics. 10 (15), 1531-1538 (2001).
- Suen, K. C., Yu, M. S., So, K. F., Chang, R. C., Hugon, J. Upstream signaling pathways leading to the activation of double-stranded RNA-dependent serine/threonine protein kinase in beta-amyloid peptide neurotoxicity. Journal of biological chemistry. 278 (50), 49819-49827 (2003).
- Nakamura, T., et al. A critical role for PKR complexes with TRBP in Immunometabolic regulation and eIF2alpha phosphorylation in obesity. Cell Reports. 11 (2), 295-307 (2015).
- Saito, S. Enhancement of the interferon-induced double-stranded RNA-dependent protein kinase activity by Sindbis virus infection and heat-shock stress. Microbiology and Immunology. 34 (10), 859-870 (1990).
- Youssef, O. A., et al. Potential role for snoRNAs in PKR activation during metabolic stress. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (16), 5023-5028 (2015).
- Murtha-Riel, P., Davies, M. V., Choi, S. Y., Hershey, J. W., Kaufman, R. J. Expression of a Phosphorylation-resistant Eukaryotic Initiation Factor 2 a-Subunit Mitigates Heat Shock Inhibition of Protein Synthesis. The Journal of Biological Chemistry. 268, 12946-12951 (1993).
- Benkirane, M., et al. Oncogenic potential of TAR RNA binding protein TRBP and its regulatory interaction with RNA-dependent protein kinase PKR. The EMBO Journal. 16 (3), 611-624 (1997).
- Koromilas, A., Roy, S., Barber, G., Katze, M., Sonenberg, N. Malignant transformation by a mutant of the IFN-inducible dsRNA-dependent protein kinase. Science. 257 (5077), 1685-1689 (1992).
- Kim, Y., et al. PKR is activated by cellular dsRNAs during mitosis and acts as a mitotic regulator. Genes & Development. 28 (12), 1310-1322 (2014).
- Kim, Y., et al. Deletion of human tarbp2 reveals cellular microRNA targets and cell-cycle function of TRBP. Cell Reports. 9 (3), 1061-1074 (2014).
- Zhu, P. J., et al. Suppression of PKR promotes network excitability and enhanced cognition by interferon-gamma-mediated disinhibition. Cell. 147 (6), 1384-1396 (2011).
- Dagon, Y., et al. Double-stranded RNA-dependent protein kinase, PKR, down-regulates CDC2/cyclin B1 and induces apoptosis in non-transformed but not in v-mos transformed cells. Oncogene. 20 (56), 8045-8056 (2001).
- Elbarbary, R. A., Li, W., Tian, B., Maquat, L. E. STAU1 binding 3' UTR IRAlus complements nuclear retention to protect cells from PKR-mediated translational shutdown. Genes & Development. 27 (13), 1495-1510 (2013).
- Cho, J., et al. LIN28A is a suppressor of ER-associated translation in embryonic stem cells. Cell. 151 (4), 765-777 (2012).
- Licatalosi, D. D., et al. HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing. Nature. 456 (7221), 464-469 (2008).
- Van Nostrand, E. L., et al. Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP). Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).
- Kim, Y., et al. PKR Senses Nuclear and Mitochondrial Signals by Interacting with Endogenous Double-Stranded RNAs. Molecular Cell. 71 (6), 1051-1063 (2018).
- Kim, B., Jeong, K., Kim, V. N. Genome-wide Mapping of DROSHA Cleavage Sites on Primary MicroRNAs and Noncanonical Substrates. Molecular Cell. 66 (2), 258-269 (2017).
- Ricci, E. P., et al. Staufen1 senses overall transcript secondary structure to regulate translation. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (1), 26-35 (2014).
- Kim, B., Kim, V. N. fCLIP-seq for transcriptomic footprinting of dsRNA-binding proteins: Lessons from DROSHA. Methods. , (2018).
- Dhir, A., et al. Mitochondrial double-stranded RNA triggers antiviral signalling in humans. Nature. 560 (7717), 238-242 (2018).
