Summary
यहाँ हम एक ही जीवित जानवर के भीतर और आक्रामक शल्य चिकित्सा हस्तक्षेप (उदाहरण के लिए, बायोप्सी) से पहले और बाद में मस्तिष्क ट्यूमर कोशिकाओं के उच्च संकल्प समय चूक multiphoton इमेजिंग के लिए एक विधि का वर्णन. इस विधि ट्यूमर कोशिकाओं 'प्रवासी, आक्रामक, और एक एकल सेल स्तर पर proliferative व्यवहार पर इन इनवेसिव शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं के प्रभाव का अध्ययन करने की अनुमति देता है.
Abstract
बायोप्सी कैंसर के इलाज के लिए देखभाल के मानक हैं और चिकित्सकीय रूप से फायदेमंद होते हैं क्योंकि वे ठोस ट्यूमर निदान, पूर्वानुमान, और व्यक्तिगत उपचार निर्धारण की अनुमति देते हैं। हालांकि, बायोप्सी और अन्य इनवेसिव प्रक्रियाओं द्वारा ट्यूमर वास्तुकला के क्षोभ ट्यूमर प्रगति पर अवांछित प्रभाव के साथ जुड़ा हुआ है, जो आगे इन प्रक्रियाओं के नैदानिक लाभ में सुधार करने के लिए गहराई से अध्ययन किया जा करने की आवश्यकता है। पारंपरिक स्थिर दृष्टिकोण, जो केवल ट्यूमर का एक स्नैपशॉट प्रदान करते हैं, उनके प्रवास के रूप में ट्यूमर सेल व्यवहार पर बायोप्सी के प्रभाव को प्रकट करने की क्षमता में सीमित हैं, एक प्रक्रिया बारीकी से ट्यूमर द्रोह से संबंधित. विशेष रूप से, ट्यूमर सेल प्रवास अत्यधिक आक्रामक मस्तिष्क ट्यूमर, जहां स्थानीय ट्यूमर प्रसार कुल ट्यूमर लकीर लगभग असंभव बनाता है में महत्वपूर्ण है. multiphoton इमेजिंग और पुरानी इमेजिंग खिड़कियों के विकास वैज्ञानिकों समय के साथ जीवित जानवरों में इस गतिशील प्रक्रिया का अध्ययन करने की अनुमति देता है. यहाँ, हम पहले और एक ही जीवित जानवर में एक बायोप्सी के बाद मस्तिष्क ट्यूमर कोशिकाओं के उच्च संकल्प अनुदैर्घ्य इमेजिंग के लिए एक विधि का वर्णन. यह दृष्टिकोण ट्यूमर सेल व्यवहार (प्रवास, आक्रमण, और प्रसार) पर इस प्रक्रिया के प्रभाव का अध्ययन करना संभव बनाता है। इसके अलावा, हम लाभ और इस तकनीक की सीमाओं पर चर्चा, साथ ही इस पद्धति की क्षमता ट्यूमर लकीर या कीमोथेरेपी के प्रत्यारोपण सहित अन्य शल्य चिकित्सा हस्तक्षेप के लिए कैंसर सेल व्यवहार में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए Wafers.
Introduction
सबसे ठोस ट्यूमर के लिए देखभाल के मानक निदान के लिए ऊतक बायोप्सी शामिल, रोग का निदान, और व्यक्तिगत उपचार निर्धारण1,2. कुल मिलाकर, इन प्रक्रियाओं नैदानिक लाभ दे, लेकिन हाल ही में सबूत इंगित करता है कि बायोप्सी और अन्य अधिक इनवेसिव प्रक्रियाओं, ट्यूमर लकीर के रूप में, भी नकारात्मक ट्यूमर प्रगति को प्रभावित कर सकते हैं3,4,5 , 6.हालांकि इन प्रक्रियाओं में रोगी देखभाल अपरिहार्य रहते हैं और उनके लाभ उनके नकारात्मक प्रभाव को दूर, यह पूरी तरह से इन नकारात्मक प्रभाव के पीछे तंत्र को समझने के क्रम में रोगियों की सुरक्षा को अधिकतम करने के लिए आवश्यक है और इन प्रक्रियाओं के सकारात्मक प्रभाव और उन्हें और भी अधिक चिकित्सकीय फायदेमंद बनाते हैं.
ट्यूमर प्रगति पर बायोप्सी-मध्यस्थ अवांछित प्रभाव ऊतक विघटन4,5के जवाब में प्रणालीगत परिवर्तन और ट्यूमर microenvironment में परिवर्तन से ट्रिगर कर रहे हैं। इस प्रकार, यह जीवित पशुओं में इस प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए आवश्यक है। हालांकि, इन न्यूनतम इनवेसिव प्रक्रियाओं के सूक्ष्म परिणाम अक्सर व्यक्तियों के बीच बड़े बदलाव से प्रच्छन्न किया जा सकता है. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री या ट्रांसक्रिप्शनल एक्सप्रेशन विश्लेषण पर आधारित पारंपरिक तरीके इन प्रभावों को अनदेखा कर सकते हैं या उनकी पहचान करने के लिए बड़ी संख्या में जानवरों की आवश्यकता हो सकती है। इसके अलावा, इन स्थिर दृष्टिकोण ऐसे प्रवास और आक्रमण के रूप में ट्यूमर सेल व्यवहार में परिवर्तन की पहचान करने की क्षमता की कमी, गतिशील प्रक्रियाओं है कि ट्यूमर द्रोह के साथ सहसंबंधित. इन ट्यूमर सेल सुविधाओं अत्यधिक आक्रामक मस्तिष्क ट्यूमर के लिए विशेष महत्व के हैं, ग्लियोब्लास्टोमा multiforme (GBM) के रूप में, जहां ट्यूमर कोशिकाओं के स्थानीय प्रसार शल्य लकीर को सीमित करता है और रोगी अस्तित्व7कम हो जाती है. पूरी तरह से समझने के लिए कैसे बायोप्सी जीबीएम कोशिकाओं के व्यवहार को प्रभावित, एक अनुदैर्घ्य दृष्टिकोण है कि जीवित जीवों के शारीरिक संदर्भ में इन कोशिकाओं के दृश्य की अनुमति देता है की जरूरत है.
शल्य चिकित्सा प्रत्यारोपित पुरानी इमेजिंग खिड़कियों के साथ संयोजन में उच्च संकल्प intravital इमेजिंग के हाल के विकास वैज्ञानिकों कई दिनों से अधिक जीवित चूहों में ट्यूमर कोशिकाओं के गतिशील व्यवहार का अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है8,9. इस शक्तिशाली दृष्टिकोण का उपयोग करना, हम अध्ययन कर सकते हैं कैसे ट्यूमर कोशिकाओं के proliferative, प्रवासी, और घुसपैठ िया व्यवहार एक ही माउस में एक बायोप्सी के जवाब में कई दिनों से अधिक परिवर्तन. अन्य तकनीकों की तुलना में जो लाइव चूहों में ट्यूमर की बहु-दिन की निगरानी की अनुमति देते हैं, जैसे चुंबकीयअनुनाद इमेजिंग (एमआरआई)10, पॉजिट्रॉन उत्सर्जन टोमोग्राफी/ दृष्टिकोण विशिष्ट एकल सेल स्तर पर ट्यूमर सेल व्यवहार का अध्ययन और सूक्ष्म ट्यूमर के भीतर होने वाले परिवर्तनों को जानने की संभावना प्रदान करता है.
यहां, हम ट्यूमर असर चूहों के मस्तिष्क में बायोप्सी की तरह चोट और पूर्व और पोस्टबायोप्सी अनुदैर्घ्य इंट्राविटल इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए एक विस्तृत विधि का वर्णन करते हैं। इस विधि संभवतः इस तरह के आंशिक ट्यूमर लकीर या कीमोथेरेपी वेफर्स के प्रत्यारोपण के रूप में अन्य शल्य चिकित्सा हस्तक्षेप, अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है।
Protocol
सभी प्रयोग नीदरलैंड के कला और विज्ञान अकादमी, नीदरलैंड की पशु कल्याण समिति के दिशानिर्देशों के अनुसार किए गए थे। इस पांडुलिपि में इस्तेमाल प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल CentralComisie Dierproven (सीसीडी) और इंस्टेंटी वोर Dierenwelzizn (IvD) द्वारा अनुमोदित किया गया.
1. ट्यूमर सेल प्रत्यारोपण और कपाल इमेजिंग खिड़की की तैयारी
- सर्जिकल तैयारी
- किसी भी तनाव या लिंग के वयस्क चूहों (gt; 6 सप्ताह पुराने) का प्रयोग करें. बाँझ पानी में 1:1:2 की खुराक पर इंजेक्शन (फ्लुनिसोन [न्यूरोलेप्टिक] + फेनेटाइल [ओपिओइड]) +0.4 एमएल/किलोग्राम) + बेंजोडाइजेपाइन शामक (2 मिलीग्राम/किलोग्राम) इंजेक्शन लगाकर एक चूहे को बंद करें। अंगुली चुटकी द्वारा जानवर के sedation राज्य का आकलन करें।
नोट: इस प्रोटोकॉल में, दोनों महिला और पुरुष C57BL/6 चूहों इन प्रयोगों में इस्तेमाल ट्यूमर सेल लाइन की एक ही आनुवंशिक पृष्ठभूमि के कारण इस्तेमाल किया गया (GL261). माउस पूरी तरह से 1.5 ज के लिए बेहोश रहना होगा. वैकल्पिक रूप से, इस तरह के आइसोलुरेन (1.5%-2% isoflurane/ - एक स्टीरियोटेक्टिक फ्रेम पर माउस माउंट और एक नाक दबाना और दो कान सलाखों का उपयोग कर सिर को सुरक्षित।
- शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए एक हीटिंग लैंप का उपयोग करें। हीटिंग दीपक सावधानी के साथ इस्तेमाल किया जाना चाहिए, वैकल्पिक रूप से पानी recirculating हीटिंग पैड इस्तेमाल किया जा सकता है.
- माउस के कॉर्निया को सुखाने से बचाने के लिए आंखों का मरहम लगाएं।
- खोपड़ी पर फर दाढ़ी करने के लिए तेज कैंची का उपयोग करें (अपनी खोपड़ी के आधार पर माउस की आंखों से डोर्सल क्षेत्र) और 70% इथेनॉल के साथ उजागर त्वचा को कीटाणुरहित करें।
- तेज कैंची के साथ एक परिपत्र तरीके से त्वचा को काटें और एक कपास झाड़ू के साथ नीचे periosteum दूर परिमार्जन। lidocaine की एक बूंद लागू करें 1% + एपिनेफ्रिन 1:100,000 5 मिनट के लिए, और एक कपास झाड़ू के साथ अतिरिक्त हटा दें.
- त्वचा के किनारों को सायनोऐक्रिलेट गोंद के साथ खोपड़ी तक गोंद करें।
- 4x आवर्धन के साथ एक विच्छेदन स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत स्टीरियोटेक्टिक फ्रेम रखें।
- विच्छेदन माइक्रोस्कोप के माध्यम से खोपड़ी कल्पना और सही पार्श्विक हड्डी पर व्यास में 5 मिमी के एक परिपत्र नाली ड्रिल। खोपड़ी पर किसी भी दबाव से बचने, इस कदम को सावधानी से और केवल सतही रूप से करें।
- कॉर्टेक्स बफर की एक बूंद लागू करें (125 एमएम NaCl, 5 एमएम KCl, 10 एमएम ग्लूकोज, 10 एमएम HEPES बफर, 2 MM MgSO4, और 2 MM CaCl2 [pH 7.4]) और पतली संदंश का उपयोग कर हड्डी फ्लैप उठा.
- निम्नलिखित चरणों के लिए, मस्तिष्क की सतह प्रांतस्था बफर के साथ कवर रखें जब तक अन्यथा संकेत दिया.
- विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, मस्तिष्क की सतह कल्पना और घुमावदार, पतला, बहुत ठीक बिंदु चिमटी का उपयोग कर ड्यूरा मैटर हटा दें। यदि इस स्तर पर खून बह रहा है, तो इसे रोकने के लिए एक अवशोषित जिलेटिन स्पंज का उपयोग करें।
- किसी भी तनाव या लिंग के वयस्क चूहों (gt; 6 सप्ताह पुराने) का प्रयोग करें. बाँझ पानी में 1:1:2 की खुराक पर इंजेक्शन (फ्लुनिसोन [न्यूरोलेप्टिक] + फेनेटाइल [ओपिओइड]) +0.4 एमएल/किलोग्राम) + बेंजोडाइजेपाइन शामक (2 मिलीग्राम/किलोग्राम) इंजेक्शन लगाकर एक चूहे को बंद करें। अंगुली चुटकी द्वारा जानवर के sedation राज्य का आकलन करें।
- ट्यूमर सेल इंजेक्शन
- पीबीएस के $3 $L में फ्लोरोसेंट ट्यूमर कोशिकाओं की वांछित राशि को पुन: निलंबित करें (उदाहरण के लिए, इस प्रोटोकॉल में दिखाए गए प्रयोगों के लिए, 1 x 105 GL261 कोशिकाओं को इंजेक्ट किया गया)।
नोट: जबकि किसी भी फ्लोरोसेंट मार्कर इस्तेमाल किया जा सकता है, एक परमाणु मार्कर दृढ़ता से सलाह दी है, विश्लेषण के दौरान व्यक्तिगत ट्यूमर कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए. इसके अतिरिक्त, एक histone से जुड़े फ्लोरोसेंट मार्कर, जैसे H2B, गुणसूत्र संघनन कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और इस प्रकार, सेल विभाजन की निगरानी करने के लिए. इस तरह के Dendra2 के रूप में एक फोटो स्विच करने योग्य मार्कर का उपयोग, फोटो अंकन और कई दिनों में ट्यूमर कोशिकाओं की ट्रैकिंग की अनुमति देता है4,13. - एक बिंदु शैली 2 सुई के साथ एक 10 जेडएल गैस तंग सिरिंज में ट्यूमर कोशिकाओं लोड और stereotaxic manipulator हाथ पर इसे ठीक.
- कॉर्टेक्स बफर निकालें. कपाल के बीच में सिरिंज की नोक रखें और खोपड़ी की सतह से 0.5 मिमी की गहराई पर डालें। वैकल्पिक रूप से, ट्यूमर सेल निलंबन को समायोजित करने के लिए मस्तिष्क में एक छोटी सी जगह बनाएं। इसके लिए, सिरिंज को 1 मिमी की गहराई तक डालें और फिर इंजेक्शन से पहले इसे 0.5 मिमी तक पुनः प्राप्त करें।
- कॉर्टेक्स बफर की एक बूंद लागू करें.
- धीरे-धीरे एक microsyringe पंप इंजेक्टर (250-400 nL/min) का उपयोग कर सेल निलंबन सुई। सिरिंज निकालें और यदि आवश्यक हो तो किसी भी रक्तस्राव को रोकने के लिए एक अवशोषित जिलेटिन स्पंज का उपयोग करें।
- पीबीएस के $3 $L में फ्लोरोसेंट ट्यूमर कोशिकाओं की वांछित राशि को पुन: निलंबित करें (उदाहरण के लिए, इस प्रोटोकॉल में दिखाए गए प्रयोगों के लिए, 1 x 105 GL261 कोशिकाओं को इंजेक्ट किया गया)।
- कपाल इमेजिंग विंडो तैयारी
- प्रांतस्था बफर निकालें और खिड़की के नीचे हवा के बुलबुले से बचने के लिए craniotomy साइट पर सिलिकॉन तेल की एक बूंद जगह है.
- एक 6 मिमी कवरस्लिप के साथ उजागर मस्तिष्क सील. कवरस्लिप और खोपड़ी के बीच सायनोऐक्रिलेट गोंद लागू करें। मस्तिष्क और कवरस्लिप के बीच न्यूनतम दूरी सुनिश्चित करने के लिए ठीक चम्मित्र की मदद से खोपड़ी के खिलाफ कवरस्लिप को धीरे से दबाएं।
- खोपड़ी की सतह पर दंत एक्रिलिक सीमेंट लागू करें, कवरस्लिप के किनारे को कवर करें। एक पतली स्टेनलेस स्टील की अंगूठी प्लेस (1.5 बाहरी व्यास में मिमी, आंतरिक व्यास में 1 मिमी) craniotomy के आसपास और दंत सीमेंट सूखी करने के लिए अनुमति देते हैं. वैकल्पिक रूप से, सिर के शीर्ष पर अंगूठी सुरक्षित करने के लिए सीमा पर कुछ गोंद जोड़ें।
नोट: यह सिर निर्धारण प्रणाली एक उल्टे माइक्रोस्कोप पर इमेजिंग के लिए इष्टतम है: इमेजिंग बॉक्स में एम्बेडेड छोटे मैग्नेट कपाल इमेजिंग विंडो (CIW) निर्धारण की सुविधा. इस प्रोटोकॉल में दिखाए गए प्रयोगों में, एक उल्टे सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग किया गया था। ईमानदार माइक्रोस्कोप के लिए, निर्धारण एक बार या grooves कि शिकंजा या एक थाली है कि अंगूठी फिट बैठता है की मदद से माइक्रोस्कोप से जुड़ा जा सकता है के साथ एक अंगूठी के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है. - दर्द प्रबंधन के लिए, 100 डिग्री प्रति किलो buprenorphine subcutaneously की एक खुराक सुई और एक हीटिंग पैड पर ठीक करने के लिए पशु की अनुमति.
- संवर्धन के लिए कटा हुआ कागज के साथ एक व्यक्ति के पिंजरे में माउस प्लेस. बारीकी से पहले कुछ दिनों और प्रति सप्ताह 2x के लिए दैनिक माउस की निगरानी, उसके बाद, सामान्य व्यवहार के लिए, प्रतिक्रिया, और उपस्थिति.
2. इंट्राविटल इमेजिंग
नोट: ट्यूमर सेल इंजेक्शन और पहले intravital इमेजिंग सत्र के बीच समय अंतराल इस्तेमाल ट्यूमर सेल लाइन के प्रकार पर निर्भर है। इस प्रोटोकॉल में दिखाए गए प्रयोगों के लिए, 1x 105 GL261 कोशिकाओं इंजेक्शन और छवि 10 दिन बाद किया गया.
- इमेजिंग तैयारी
- एक चेहरा मुखौटा के माध्यम से आइसोफ्लुरेन इनहेलेशन संज्ञाहरण का उपयोग कर माउस को बंद करें (1.5%-2% आइसोफ्लुरेन/ओ2 मिश्रण)।
- निर्जलीकरण को रोकने के लिए माउस को 100 डिग्री सेल्सियस लवणीय बफर के साथ इंजेक्ट करें।
नोट: लंबी अवधि के इमेजिंग के लिए, माउस एक subcutaneous जलसेक पंप के माध्यम से हाइड्रेटेड किया जा सकता है. - माउस फेस-अप को इमेजिंग बॉक्स में रखें. इमेजिंग बॉक्स के लिए CIW के निर्धारण प्रदान करने के लिए एपर्चर के आसपास एम्बेडेड एक 1 मिमी व्यास छेद और छोटे मैग्नेट के साथ एक धातु की थाली का प्रयोग करें। बॉक्स के दूसरी ओर एक आउटलेट द्वारा एक फेसमास्क के माध्यम से isoflurane परिचय (0.8%-1.5% isoflurane/ वैकल्पिक रूप से, माउस के मुख्य भाग को ठीक करने के लिए टेप का उपयोग करें.
नोट: रक्त वाहिका दृश्य या अन्य रंगों के लिए Fluorescently लेबल डेक्सट्रन इस बिंदु पर नसों में इंजेक्ट किया जा सकता है. - वैकल्पिक रूप से, माउस के महत्वपूर्ण पर नजर रखने के लिए एक पल्स ऑक्सीमीटर और एक हीटिंग जांच का उपयोग करें।
नोट: इस प्रयोग में, यह एक पल्स oximeter और एक हीटिंग जांच का उपयोग करने के लिए आवश्यक नहीं था क्योंकि माउस इमेजिंग समय अवधि (2-3 ज) भर में स्थिर था. हालांकि, लंबे समय तक इमेजिंग समय के लिए, और अधिक गहन निगरानी की जरूरत हो सकती है. - 25x सेट (उदा., HCX IRAPO NA0.95 WD 2.5 मिमी) पानी का उद्देश्य सबसे कम z-स्थिति के लिए और पानी की एक बड़ी बूंद जोड़ें.
नोट: एक पानी विसर्जन माइक्रो मशीन का उपयोग अत्यधिक लंबी अवधि के प्रयोगों के लिए सलाह दी है क्योंकि यह वैज्ञानिकों प्रयोग के दौरान पानी जोड़ने के लिए अनुमति देता है. वैकल्पिक रूप से, एक शुष्क उद्देश्य इस्तेमाल किया जा सकता है. - 37 डिग्री सेल्सियस पर रखा एक अंधेरे जलवायु कक्ष से लैस माइक्रोस्कोप पर इमेजिंग बॉक्स स्थानांतरण। CIW कवरस्लिप के उद्देश्य को तब तक लाइए जब तक कि पानी की बूंद इसे छू न जाए।
- एपिफ्लोरेसेंस मोड का उपयोग करना, नेत्रिका के माध्यम से ट्यूमर का निरीक्षण और ध्यान में कोशिकाओं को लाने के लिए।
- समय चूक छवि अधिग्रहण
- छवि के लिए ब्याज की कई पदों का चयन करें, और सॉफ्टवेयर में उनके निर्देशांक रिकॉर्ड. सुनिश्चित करें कि चयनित पदों ट्यूमर के विभिन्न साइटों से प्रतिनिधि पदों रहे हैं (प्रत्येक ट्यूमर अलग हो सकता है, लेकिन स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए, पदों की एक ही राशि है कि ट्यूमर कोर के लिए केंद्रीय हैं और सभी चूहों भर में किनारों का चयन करें).
नोट: ट्यूमर या पूरे दिखाई ट्यूमर के एक हिस्से का एक टाइल स्कैन किया जा सकता है; हालांकि, अगर ट्यूमर बड़ा है, इस विधि छवियों के बीच समय चूक में वृद्धि होगी. इसके अलावा, अगर ट्यूमर कोशिकाओं को तेजी से कदम, यह समय के साथ एक ही कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है. - multiphoton मोड पर स्विच और सही तरंगदैर्ध्य के लिए लेजर धुन. ध्यान दें कि, photodamage से बचने के लिए, उच्च तरंगदैर्ध्य वांछित हैं.
नोट: Dendra2 इमेजिंग के लिए, एक 960 एनएम तरंगदैर्ध्य इस्तेमाल किया गया था. उद्देश्य इन प्रयोगों में इस्तेमाल के साथ, 1.3 की एक ज़ूम ट्यूमर नाभिक का एक अच्छा संकल्प पाने के लिए और ट्यूमर के एक प्रतिनिधि क्षेत्र को स्कैन करने के लिए पर्याप्त था। - लाइव मोड में जाओ और ट्यूमर सेल संकल्प समझौता किए बिना ट्यूमर कोशिकाओं की अधिकतम मात्रा प्राप्त करने के क्रम में प्रत्येक स्थिति के लिए एक z-स्टैक को परिभाषित। छवियों के बीच चरण आकार को 3 डिग्री उ के रूप में परिभाषित करें।
- स्कैनिंग गति बढ़ाने के लिए द्विदिश मोड का उपयोग करें. छवि रिज़ॉल्यूशन कम से कम 512 x 512 पिक्सेल होना चाहिए.
- 2 ज के लिए हर 20 मिनट में विभिन्न पदों पर ट्यूमर की मात्रा की छवियों को प्राप्त प्रत्येक छवि अधिग्रहण से पहले उद्देश्य के लिए पानी जोड़ें।
नोट: समय चूक छवियों स्वचालित रूप से सॉफ्टवेयर में सही समय चूक की स्थापना करके प्राप्त किया जा सकता है. हालाँकि, माउस ले जा सकते हैं, और स्थिति या z-स्टैक समय के साथ स्थानांतरित कर सकते हैं, डेटा हानि के कारण. इसलिए, यह समय चूक मैन्युअल रूप से करने के लिए और जाँच करें और अधिग्रहण के बीच में xyz shifts के लिए समायोजित करने के लिए सिफारिश की है। - इस कदम पर, वैकल्पिक रूप से, फोटो स्विच Dendra2 फ्लोरोसेंट मार्कर.
नोट: के रूप में समय चूक इमेजिंग का विरोध किया (जो व्यक्तिगत ट्यूमर कोशिकाओं के गुणों का अध्ययन करने की अनुमति देता है और कैसे वे समय के साथ बदल), यह कई दिनों में मस्तिष्क में ट्यूमर सेल घुसपैठ के क्षेत्र का अध्ययन करने की अनुमति देगा4. इस कदम का एक विस्तृत विवरण GligoriJevic एट अल13द्वारा वर्णित है. - के बाद पिछले छवि का अधिग्रहण किया है, मंच से माउस को हटाने और यह एक हीटिंग पैड पर ठीक करने के लिए अनुमति देते हैं. निर्जलीकरण को रोकने के लिए, नमकीन के 100 डिग्री एल को subcutaneously दिया जा सकता है। बायोप्सी की तरह चोट किया जाता है जब तक अपने पिंजरे में माउस प्लेस.
- छवि के लिए ब्याज की कई पदों का चयन करें, और सॉफ्टवेयर में उनके निर्देशांक रिकॉर्ड. सुनिश्चित करें कि चयनित पदों ट्यूमर के विभिन्न साइटों से प्रतिनिधि पदों रहे हैं (प्रत्येक ट्यूमर अलग हो सकता है, लेकिन स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए, पदों की एक ही राशि है कि ट्यूमर कोर के लिए केंद्रीय हैं और सभी चूहों भर में किनारों का चयन करें).
3. बायोप्सी की तरह चोट और CIW प्रतिस्थापन
- पहले इमेजिंग सत्र के 1 दिन बाद ट्यूमर साइट पर बायोप्सी की तरह चोट बनाएं।
नोट: वैकल्पिक रूप से, एक और प्रक्रिया, आंशिक ट्यूमर हटाने की तरह, किया जा सकता है.- पहले चरण 2.1.1 में वर्णित के रूप में आइसोफ्लुरेन इनहेलेशन संज्ञाहरण का उपयोग कर माउस को बंद करें।
नोट: जबकि इंजेक्शन संज्ञाहरण इस्तेमाल किया जा सकता है, इस प्रक्रिया CIW प्रत्यारोपण से कम है, और साँस लेना संज्ञाहरण यह संभव ठीक नियंत्रण करने के लिए और समय माउस बेहोश रहता है कम करने के लिए बनाता है. - एक stereotaxic फ्रेम पर माउस प्लेस और दो कान सलाखों और एक नाक दबाना के साथ अपने सिर को सुरक्षित. पेडल सजगता की कमी से संज्ञाहरण की गहराई की जाँच करें। प्रक्रिया के दौरान माउस बेहोश रखने के लिए स्टीरियोटैक्सिक सर्जरी के लिए संज्ञाहरण मुखौटा का प्रयोग करें।
- एसीटोन में एक कपास झाड़ू लेना और मस्तिष्क के खिलाफ कवरस्लिप रखती गोंद को नरम करने के लिए कवरस्लिप के किनारे के चारों ओर फैला।
- इसे उठाने के लिए कवरस्लिप के नीचे पतली बिंदु संदंश स्लाइड करें। यदि इस बिंदु पर कवरस्लिप टूट जाता है, तो कांच के टुकड़ों को हटाने के लिए संदंश का उपयोग करें।
- मस्तिष्क को नम रखने के लिए कॉर्टेक्स बफर लागू करें।
- ट्यूमर में 25 जी सुई को 1 मिमी की गहराई तक डुबोएं। सुई निकालें और यदि आवश्यक हो, तो एक जिलेटिन बाँझ स्पंज को लागू करके रक्तस्राव को रोकें।
नोट: यह कदम अधिक सही ट्यूमर क्षेत्र की पहचान करने के लिए एक फ्लोरोसेंट स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत किया जा सकता है (यदि ट्यूमर बहुत छोटा है). इसके अतिरिक्त, बायोप्सी क्षेत्र की पहचान करने के लिए पंचर के दौरान फ्लोरोसेंट पॉलीस्टाइरीन 1 डिग्री मीटर मोती का 1 डिग्री एल समाधान इंजेक्ट किया जा सकता है। - सिलिकॉन तेल के साथ मस्तिष्क की सतह सील और शीर्ष पर एक 6 मिमी कवरपर्ची गोंद।
- पहले चरण 2.1.1 में वर्णित के रूप में आइसोफ्लुरेन इनहेलेशन संज्ञाहरण का उपयोग कर माउस को बंद करें।
4. बार-बार इमेजिंग
- बायोप्सी की तरह चोट (और लगातार दिनों पर यदि आवश्यक हो) डालने के बाद एक दिन, ऊपर चरण 2 में वर्णित के रूप में intravital इमेजिंग दोहराने का आकलन कैसे समय के साथ ट्यूमर सेल व्यवहार में परिवर्तन. ट्यूमर है कि पूरे ट्यूमर क्षेत्र के प्रतिनिधि होगा के कई पदों का चयन करें.
नोट: फ्लोरोसेंट मोती बायोप्सी क्षेत्र की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, तो गैर-बायोप्सी क्षेत्रों की तुलना में बायोप्सी क्षेत्रों में ट्यूमर सेल व्यवहार छवि के लिए उन्हें स्थानीयकृत।
5. छवि विश्लेषण
- समय चूक छवियों मैन्युअल रूप से प्राप्त किए गए थे, तो उन्हें एक फ़ोल्डर में गठबंधन.
- माइक्रोस्कोप (जैसे, LasX या LAS AF) के साथ जुड़े वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर में समय चूक LIF फ़ाइल खोलें। टैब प्रक्रिया का चयन करें और प्रक्रिया उपकरण और मर्जकरें. समय अनुक्रम की पहली छवि का चयन करें और पहलेक्लिक करें. समय अनुक्रम की दूसरी छवि का चयन करें और दूसराक्लिक करें. आयाम मर्ज करेंमें, समय के लिए t का चयन करें. लागूकरें क्लिक करें. दो टाइमपॉइंट के साथ एक नई फ़ाइल जनरेट किया जाएगा। अनुक्रम की पहली छवि के रूप में नए जनरेट की गई फ़ाइल का उपयोग कर, सभी timepoints के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएँ।
- किसी भी xyz shift के लिए अधिग्रहित z-स्टैक को ठीक करें.
नोट: इस प्रोटोकॉल में वर्णित प्रयोगों के लिए, एक कस्टम-डिजाइन किए गए Visual Basic सॉफ़्टवेयर प्रोग्राम सुधार के लिए उपयोग किया गया था। वैकल्पिक रूप से, अन्य उपलब्ध सॉफ़्टवेयर का उपयोग किया जा सकता है, जैसे ImageJ या Imaris.- मर्ज किए गए समय-चूक फ़ाइल पर राइट-क्लिक करके सॉफ़्टवेयर से TIFF फ़ाइलों को निर्यात करें। RAW डेटा सहेजेंका चयन करें. निर्यात की गई फ़ाइलें चैनल, समय, और z-स्थिति के अनुसार नामित एक फ़ोल्डर में निर्यात की जाएँगी.
- TIFF फ़ाइलें कस्टम-डिज़ाइन किए गए Visual Basic सॉफ़्टवेयर प्रोग्राम में खोलें।
- timepoints, z-stacks, और चैनल की संख्या निर्धारित करें।
- प्रकटन के क्रम से प्रत्येक चैनल को एक रंग असाइन करें.
- प्रपत्र दिखाएँ फलक में, प्रत्येक समय बिंदु के लिए, ऊपर (U) या नीचे (D) बटन पर क्लिक करके z में shift को सही करें.
- Intravital छवि निर्माण पैनल में, xy पारी के लिए सही करने के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए चैनल का चयन करें. ट्यूमर कोशिकाओं से संकेत के आधार पर, सही करने के लिए हरी चैनल का चयन करें। xy सुधार के लिए स्वचालित क्लिक करें.
- तीन लगातार z-stacks की एक अधिकतम प्रक्षेपण के रूप में सही छवियों निर्यात. पैनल चयनमें , पहले (आरंभ) और अंतिम (अंत) z-slices की संख्या का परिचय निर्यात किया जाना है . अधिकतमका चयन करें. $ के लिए अलग फ़ोल्डरचुनें. क्याकरें क्लिक करें. उनमें से प्रत्येक के लिए, तीन z-स्टैक, समय चूक छवियों को एक अलग फ़ोल्डर में निर्यात किया जाएगा.
- वैकल्पिक रूप से, ऊतक लोचदार विरूपण के लिए सही है।
नोट: ऊतक लोचदार विरूपण प्रयोगों के लिए, एक मैच गति मुआवजा सॉफ्टवेयर प्रोग्राम कठोर और लोचदार ऊतक विरूपण14के लिए सही करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। - समय चूक फिल्म में पूरा z-स्टैक में एकल कोशिकाओं को ट्रैक.
नोट: ट्यूमर कोशिकाओं को मैन्युअल रूप से उपयोग कर ट्रैक किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, एक ImageJ प्लगइन (MTrackJ). जबकि सही, यह xy विमान तक ही सीमित है और बहुत समय लेने वाली है. वैकल्पिक रूप से, ट्यूमर कोशिकाओं को पूर्ण z-volume भर में स्वचालित रूप से ट्रैक किया जा सकता है, ट्यूमर सेल विभाजन का उपयोग कर (उदा., Imaris सॉफ्टवेयर). हालांकि, अत्यधिक घने ट्यूमर में, स्वचालित ट्रैकिंग कम सटीक है और अधिक ट्रैकिंग त्रुटियों को जन्म दे सकते हैं.- खोलें और प्रत्येक समय चूक श्रृंखला (तीन लगातार z-stacks के लिए) अलग से ट्रैक. ImageJ करने के लिए समय चूक छवियों युक्त फ़ोल्डर खींचें.
- टैब Plugins का चयन करें gt; ट्रैकिंग gt; MtrackJ| प्रत्येक समय बिंदु पर प्रत्येक कक्ष पर जोड़ें और क्लिक करके प्रत्येक व्यक्तिगत कक्ष को ट्रैक करें.
- उपाय पर क्लिक करके और फ़ाइल को बचाने के द्वारा पटरियों के उपाय निकालें.
Representative Results
मस्तिष्क ट्यूमर सेल व्यवहार पर बायोप्सी के प्रभाव का आकलन करने के लिए, हम इस प्रोटोकॉल में वर्णित प्रक्रिया प्रदर्शन किया. ग्लियोमा-GL261 कोशिकाओं-एक परमाणु फ्लोरोसेंट प्रोटीन (H2B-Dendra2) C57BL/6 चूहों के मस्तिष्क में इंजेक्शन थे, और एक पुरानी CIW प्रत्यारोपित किया गया था. समय-चूक इंट्राविटल इमेजिंग एक ही जानवर पूर्व और बाद बायोप्सी की तरह ट्यूमर को चोट पर किया गया था (चित्र 1ए, बी)। अलग-अलग ट्यूमर कोशिकाओं के प्रवास का निर्धारण समयके साथ-साथ z-स्टैक के विभिन्न xy विमानों में प्रवास पथ को ट्रैक करके किया गया था (चित्र 1C) और प्रवासी कोशिकाओं के प्रतिशत के रूप में पूर्व और पश्यतिबायोप्सी (चित्र 1F) के रूप में प्लॉट किया गया था । ट्यूमर सेल प्रसार दर को एच 2 बी-टैग किए गए Dendra2 संघनन के आधार पर mitosis पर निर्धारित किया गया था (चित्र 1D) और विभाजन कोशिकाओं के प्रतिशत के रूप में प्लॉट किया गया था पूर्व और postbiopsy (चित्र 1E) . हम पहले और एक ही ट्यूमर में बायोप्सी के बाद प्रवास वेग के वितरण की तुलना में और पाया कि प्रवासी कोशिकाओं की संख्या (वेग और 4 डिग्री मीटर/ वेग और 4 डिग्री उधे (चित्र 2क) प्रति ट्यूमर औसत पर, हम एक 1.75 देखा (एसडी $ 0.16) प्रवासी कोशिकाओं के प्रतिशत में गुना वृद्धि जब एक बायोप्सी की तरह चोट प्रदर्शन किया गया था, चूहों कि बायोप्सी नहीं थे नियंत्रित करने की तुलना में (चित्र 2B). हम एक सप्ताह के लिए ट्यूमर सेल व्यवहार की निगरानी की और पाया कि, हालांकि प्रवासी ट्यूमर कोशिकाओं का प्रतिशत अंततः दोनों नियंत्रण और बायोप्सी चूहों में कमी आई, बायोप्सी चूहों अभी भी नियंत्रण चूहों की तुलना में एक उच्च प्रवासी क्षमता का प्रदर्शन ( चित्र 2C) समय के साथ ट्यूमर सेल proliferative व्यवहार के विश्लेषण से पता चला एक 1.52 (एसडी $ 0.26) - बायोप्सी पर माइटोटिक घटनाओं की संख्या में गुना वृद्धि, nonbiopsied नियंत्रण चूहों के सापेक्ष (चित्र 2 डी)..
ट्यूमर सेल proliferative और प्रवासी व्यवहार पर बायोप्सी के मनाया प्रभाव CIW प्रतिस्थापन सर्जरी (एक बायोप्सी की तरह चोट प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक) के कारण एक कलाकृति थी कि क्या परीक्षण करने के लिए, हम चूहों के एक समूह में ट्यूमर सेल व्यवहार की निगरानी की है कि CIW लिया एक बायोप्सी के बिना प्रतिस्थापन. इस समूह में, हमने ट्यूमर कोशिकाओं के प्रवास या प्रसार के किसी भी प्रेरण का निरीक्षण नहीं किया, यह दर्शाता है कि ट्यूमर कोशिका प्रसार और प्रवास दरों में वृद्धि विशेष रूप से बायोप्सी जैसी चोट (चित्र 3ए, बी) द्वारा ट्रिगर की गई थी।
फ्लोरोसेंट प्रोटीन Dendra2 की स्थिर फोटो-परिवर्तनीयता कई दिनों से ट्यूमर सेल घुसपैठ का अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है। पराबैंगनी / नीले प्रकाश के संपर्क में आने पर, Dendra2 अपरिवर्तनीय हरे से लाल करने के लिए बंद है. इस संपत्ति का उपयोग करते हुए, ट्यूमर के एक वर्ग क्षेत्र को प्रकाशित किया गया था और $ 200 Dendra2-expressing ट्यूमर कोशिकाओं बायोप्सी से पहले फोटो-मार्क किए गए थे (चित्र 4)। बायोप्सी के एक दिन बाद, हम फोटो-स्विच्ड क्षेत्र relocalized और ट्यूमर कोशिकाओं है कि आसपास के ट्यूमर ऊतक में घुसपैठ की थी की मात्रा मापा. हमने पाया कि घुसपैठ क्षेत्र 1.72 (एसडी $ 0.41) एक बायोप्सी की तरह चोट के बाद ट्यूमर में बड़ा था nonbiopsied नियंत्रण ट्यूमर की तुलना में (चित्र 4). हालांकि इस दृष्टिकोण केवल ट्यूमर सेल थोक घुसपैठव्यवहार पर जानकारी प्रदान करता है और एक एकल सेल स्तर पर नहीं, यह कम समय चूक इमेजिंग दृष्टिकोण से लेने वाली है और अनुसंधान पर विशेष रूप से ध्यान केंद्रित सवालों के लिए पसंद की विधि हो सकता है घुसपैठ के व्यवहार का अध्ययन.
चित्रा 1: ट्यूमर सेल व्यवहार पर बायोप्सी प्रभाव के अनुदैर्घ्य intravital इमेजिंग के लिए प्रायोगिक सेटअप. (ए) अंगूठी और चुंबकीय धारक के डिजाइन को दर्शाने वाला आरेख। (बी) प्रयोगात्मक कार्यप्रवाह का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. ट्यूमर कोशिकाओं चूहों के दिमाग में इंजेक्शन हैं और एक CIW की स्थापना की है. ट्यूमर के विकास पर, एक पहले (prebiopsy) समय चूक इमेजिंग सत्र किया जाता है। अगले दिन, बायोप्सी और CIW प्रतिस्थापन लागू कर रहे हैं. इमेजिंग (पोस्टबायोप्सी) के बाद एक दिन, एक दूसरी बार चूक इमेजिंग सत्र किया जाता है. लंबी अवधि के प्रभाव के लिए, बाद इमेजिंग सत्र किया जा सकता है. (सी) छवियाँ एक समय चूक फिल्म जहां GL261 H2B-Dendra2 ट्यूमर कोशिकाओं को ट्रैक किया गया के प्रतिनिधि स्नैपशॉट दिखा. लाल लाइनों व्यक्तिगत ट्यूमर सेल पटरियों को दर्शाती है। पैमाने बार - 50 डिग्री मी (डी) जीएल 261 H2B-Dendra2 ट्यूमर में विभाजित कोशिकाओं को प्रदर्शित करने वाले विवो समय चूक छवियों में प्रतिनिधि। मिटोसिस के विभिन्न चरणों में संकेत दिए गए हैं: प्रोफेज (पी), प्रोमेटाफेज (पीएम), मेटाफेज (एम), एनेफेज (ए), और टेलोफेज (टी)। पैमाने की छड़ र् 50 उ. रेखांकन , (ई) प्रवासी और (च) कोशिकाओं को पूर्व और पश्यति विभाजित करने के प्रतिशत को दर्शाता है। प्रत्येक बिंदु एक व्यक्ति जानवर में मापा सभी पदों में प्रवासी कोशिकाओं का प्रतिशत इंगित करता है. डेटा मतलब के रूप में दिखाए जाते हैं - छह चूहों के S.E.M. (** पी और lt; 0.01, युग्मित टी-परीक्षण). यह आंकड़ा Alieva एट अल अल से संशोधित किया गया है4. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: प्रतिनिधि परिणाम ट्यूमर सेल प्रवास और प्रसार दरों पर बायोप्सी के प्रभाव दिखा. (क) जलप्रपात से पता चलता है कि अलग-अलग चूहों में बेसल प्रवास के सापेक्ष सेल वेग वितरण में परिवर्तन होता है। आंकड़ों को माध्य के रूप में दर्शाया गया है - पांच चूहों के S.E.M. (ख) नियंत्रण में प्रवासी कोशिकाओं की संख्या (नीला) और बायोप्सी (लाल) पशुओं की संख्या प्रवासी कोशिकाओं की संख्या के लिए सामान्यीकृत पूर्व हस्तक्षेप (द ] 6 चूहे, * *पी एंड एलटी; 0.0001, छात्र के t-परीक्षण). (सी) ट्यूमर सेल व्यवहार कई दिनों में ट्रैक किया गया था. दिखाया गया है सामान्यीकृत (पूर्व हस्तक्षेप के सापेक्ष) समय के साथ अलग-अलग चूहों में प्रवासी कोशिकाओं की संख्या (n gt; 4 चूहों प्रति शर्त, * *पी और lt; 0.0001, दो तरह ANOVA). (घ) नियंत्रण (नीला) और बायोप्सी (लाल) जंतुओं में विभाजित कोशिकाओं की सामान्यीकृत संख्या। प्रति व्यक्ति जानवर, मूल्यों postintervention मूल्यों preintervention के लिए सामान्यीकृत किया गया (n $ 5 चूहों, *पी और 0.01, छात्र के t-परीक्षण). यह आंकड़ा Alieva एट अल अल से संशोधित किया गया है4. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: CIW प्रतिस्थापन ट्यूमर सेल व्यवहार पर कोई प्रभाव नहीं है. देशांतरीय इंट्राविटल इमेजिंग से पता चलता है कि बायोप्सी के बिना CIW के प्रतिस्थापन प्रवास और प्रसार दरों पर कोई प्रभाव नहीं है. (क) दर्शित स्थितियों के लिए प्रवासी कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि। हर प्रतीक एक व्यक्ति माउस के मतलब का प्रतिनिधित्व करता है, और n- 4 चूहों. (ख) संकेतित स्थितियों के लिए बढ़ते कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि। हर प्रतीक एक व्यक्ति माउसके मतलब का प्रतिनिधित्व करता है (एन $ 4 चूहों, *पी और lt; 0.01, * *पी और lt; 0.001, एन एस - तुच्छ, न्यूमैन-Keuls के साथ एक तरह से ANOVA हॉक परीक्षण के बाद). यह आंकड़ा Alieva एट अल अल से संशोधित किया गया है4. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 4: आरेख जिसमें Dendra2 फोटो-स्विचिंग के साथ प्राप्त प्रयोगात्मक सेटअप और प्रतिनिधि परिणाम दिखाए गए हैं। बायोप्सी पर ट्यूमर सेल घुसपैठ की निगरानी करने के लिए, Dendra2-expressing ट्यूमर कोशिकाओं यूवी / नीले प्रकाश रोशनी और छवि द्वारा एक वर्ग क्षेत्र में फोटो स्विच कर रहे हैं, बायोप्सी से पहले 1 दिन. बायोप्सी के एक दिन बाद, फोटो-स्विच्ड क्षेत्र को पुनः स्थानीयीकृत और पुनर्निर्मित किया जाता है। दिखाया गया है प्रतिनिधि Dendra2 ट्यूमर सेल घुसपैठ की छवियों, चैनल घटाव का उपयोग कर सही कर रहे हैं. सफेद डॉटेड रेखा घुसपैठ क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करती है। पैमाने की पट्टी - 50 डिग्री मी. ग्राफ बायोप्सी (लाल) और नियंत्रण (नीले) चूहों के लिए साजिश रची वृद्धि हुई फोटो स्विच क्षेत्र से पता चलता है. हर डॉट एक व्यक्ति माउस कामतलब मूल्य का प्रतिनिधित्व करता है (एन $ 5 चूहों, *पी और lt; 0.05, छात्र के t-परीक्षण). यह आंकड़ा Alieva एट अल अल से संशोधित किया गया है4. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
Discussion
यहाँ हम आक्रामक शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं के जवाब में एकल सेल स्तर पर ट्यूमर सेल व्यवहार में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए एक विधि का वर्णन, इस तरह के एक बायोप्सी के रूप में, एक जीवित जानवर के मस्तिष्क में. एक पुरानी CIW के सर्जिकल प्रत्यारोपण के साथ अनुदैर्घ्य multiphoton इमेजिंग के संयोजन से पहले और एक ही जानवर4में बायोप्सी के बाद ट्यूमर सेल प्रवास, आक्रमण, और प्रसार के परिमाणीकरण सक्षम बनाता है। ट्यूमर बहुदिन की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया अन्य दृष्टिकोण की तुलना में, जैसेbioluminescent इमेजिंग12, एमआरआई10, या पीईटी / अंतर्निहित ट्यूमर प्रगति.
सफलतापूर्वक इस विधि को करने के लिए, कई कार्यविधियों में महारत हासिल की जानी चाहिए। इस प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण कदम CIW प्रत्यारोपण और प्रतिस्थापन कर रहे हैं. इन चरणों की तकनीकी जटिलता सटीक और शल्य कौशल है कि स्थिर प्रशिक्षण के साथ प्राप्त किया जा सकता है की आवश्यकता है. CIW सर्जरी के दौरान जटिलताओं, इस तरह के खून बह रहा है जो मस्तिष्क की सतह को कवर कर सकते हैं के रूप में, बाद इमेजिंग के लिए चुनौतीपूर्ण साबित हो सकता है. बाँझ उपकरण या पर्यावरण की कमी है, साथ ही पूरी तरह से मस्तिष्क की सतह सील करने के लिए विफलता, मस्तिष्क की सतह पर एक संक्रमण का कारण बन सकता है (कवरस्लिप के तहत सफेद तरल), जो इमेजिंग समस्याग्रस्त और दृढ़ता से जिसके परिणामस्वरूप समझौता कर देगा व्याख्या. इस प्रोटोकॉल का एक अन्य आम मुद्दा समय चूक इमेजिंग के दौरान पशु आंदोलन है. जबकि किसी भी xyz बदलाव प्रयोग के बाद सही किया जा सकता है, यह जानकारी के किसी भी नुकसान को रोकने के लिए प्रत्येक समय बिंदु से पहले प्रत्येक स्थिति के निर्देशांक को सही करने के लिए सिफारिश की है. ऊतक विरूपण एक अतिरिक्त समस्या है जो एक उल्टे सूक्ष्मदर्शी पर इमेजिंग करते समय पाई जाती है। जब माउस को सुपाच्य स्थिति में रखा जाता है तो मस्तिष्क ऊतक संपीड़न से ग्रस्त होता है। ऊतक विरूपण की डिग्री पर निर्भर करता है, ट्यूमर सेल ट्रैकिंग सेल विस्थापन की एक गलत परिमाणीकरण के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. इसे रोकने के लिए, कठोर और लोचदार विरूपण के लिए एक सॉफ्टवेयर14इस्तेमाल किया जा सकता है.
हालांकि इस प्रक्रिया ट्यूमर व्यवहार में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए एक व्यापक आवेदन प्रदान करता है, कुछ सीमाओं पर विचार किया जाना चाहिए. इस विधि वैज्ञानिकों की गहराई तक छवि करने के लिए अनुमति देता है 1.6 मिमी (एक ऑप्टिकल पैरामीट्रिक थरथरानवाला के उपयोग के साथ); हालांकि, इसका मतलब यह है कि इमेजिंग सतही मस्तिष्क प्रांतस्था क्षेत्रों15तक ही सीमित है. इस प्रकार, कुछ मस्तिष्क ट्यूमर गहरी मस्तिष्क संरचनाओं में स्थित, brainstem क्षेत्र में स्थित फैलाना आंतरिक pontine gliomas सहित, इस प्रोटोकॉल के साथ अपने मूल मस्तिष्क वातावरण में अध्ययन नहीं किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल का एक और सीमा ट्यूमर है कि छवि की जा सकती है की मात्रा है. हालांकि कुल ट्यूमर मात्रा स्कैनिंग अधिक से अधिक जानकारी प्राप्त करने के लिए वांछित है, अक्सर, ट्यूमर आकार और प्रवासी कोशिकाओं की गति कारकों को सीमित किया जा सकता है. प्रत्येक ट्यूमर प्रकार के लिए, इमेजिंग के लिए एक इष्टतम समय चूक पर विचार किया जाना चाहिए। यदि छवियों के बीच समय सीमा बहुत लंबी है, यह ट्यूमर कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए मुश्किल हो सकता है. एक गुंजयमान स्कैनर का उपयोग अत्यधिक स्कैनिंग समय कम कर सकते हैं, एक बड़ा ट्यूमर16की इमेजिंग की अनुमति. अंत में, इस प्रोटोकॉल के मैनुअल छवि विश्लेषण बहुत समय लेने वाली हो सकता है, तो बजाय, स्वचालित 3 डी ट्रैकिंग के लिए कार्यक्रमों का इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, ट्रैकिंग के परिणाम हमेशा नेत्रहीन निगरानी की जानी चाहिए क्योंकि स्वचालित सेल ट्रैकिंग के लिए एल्गोरिदम शायद ही कभी ब्याज की कोशिकाओं के बिल्कुल प्रवास recapitulate करने के लिए डिज़ाइन कर रहे हैं.
यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल के थोड़ा अनुकूलन अनुप्रयोगों की एक भी व्यापक रेंज सक्षम कर सकते हैं. बायोप्सी प्रदर्शन करने के बजाय, अन्य (सर्जिकल) हस्तक्षेप लागू किया जा सकता है, जैसे आंशिक ट्यूमर लकीर या कीमोथेरेपी वेफर्स की डिलीवरी। एक शल्य चिकित्सा प्रत्यारोपित microtube के माध्यम से यौगिकों के अलावा इस प्रोटोकॉल के साथ जोड़ा जा सकता है औषधीय रूप से ब्याज की विशिष्ट अणुओं को लक्षित. हमें उम्मीद है कि इस मॉडल ट्यूमर सेल व्यवहार पर एक निश्चित हस्तक्षेप के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए लक्ष्य अध्ययन में उपयोगी हो जाएगा. एक ही जानवर में दोहराया उपायों के प्रदर्शन की संभावना न केवल ट्यूमर में होने वाले परिवर्तन पर अधिक सटीक डेटा प्रदान करता है, लेकिन यह भी बहुत अध्ययन के प्रति आवश्यक प्रयोगात्मक जानवरों की संख्या कम कर देता है।
Disclosures
लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
लेखकों उनके इमेजिंग समर्थन और एलेन Wehrens और हन्ना जॉनसन proofreading और पांडुलिपि संपादन के लिए Anko de Graaff और Hubrecht इमेजिंग केंद्र धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25g x 16 mm hypodermic needles | BD Microlance | 300600 | |
| 701 RN 10uL SYR W/O NEEDLE | Hamilton | 7635-01 | |
| Absorbable gelatin sponge | Pfizer | Gelfoam | |
| Coverslips round 6 mm | VWR international | 631-0168 | |
| Cyanoacrylate glue | Pattex | Pattex Ultra gel | |
| Dental cement | Vertex Dental | Vertex Self-Curing | |
| Drill | Dremel | Dremel 3000 (dental drill may be more convenient) + 105 Engraving Cutter | |
| Fine curved Tweezers | Dumont | AGT508 | |
| Hypnorm | VetaPharma Ltd | Hypnorm (Fentanyl citrate 0,315 mg/ml+ Fluanison 10 mg/ml) | |
| Midazolam | Actavis | Midazolam Actavis 5mg/ml | |
| Opthalmic ointment | Kela Veterinaria | Duodrops veter kela 10 m | |
| Quintessential Stereotaxic Injector (QSI) | Stoelting | 53311 | |
| Silicone Oil | Sigma Aldrich | 181838 | |
| Stereotaxic frame | Stoelting | Lab standard stereotaxic, rat and mouse | |
| Surgical stereo microscope | Olympus | ||
| Temgesic (0.3 mg/ml) | BD Pharmaceuticals | 283732 | |
| Vannas Tübingen Spring Scissors | Harvard Apparatus | 72-8508 | |
| Xylocaine (Lidocaine 1% + Epinephrine 1:100,000) Local anesthetic | Astrazeneca | Xylocaine (Lidocaine 1% + Epinephrine 1:100,000) |
References
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