Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

זיהוי של הקולטנים Orexin ו אנדוקאנאיאיד ב בוגרים Zebrafish באמצעות פרוקסידאז ואימונוofloroiסנס שיטות

Published: June 25, 2019 doi: 10.3791/59308
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 2, 1
1Department of Sciences and Technologies (DST), University of Sannio, 2Endocannabinoid Research Group, Institute of Biomolecular Chemistry, 3Department of Veterinary Medicine and Animal Productions, University of Naples Federico II

Summary

הציגו כאן הם פרוטוקולים עבור האפיון אימונוהיסטוכימיה ולוקליזציה של מזון orexin, וקולטנים orexin, ו קולטנים אנדוקאנביאיד בבטן ובמוחות של השמנה רגילה דיאטה המושרה (DIO) בוגרים דג זברה מודלים באמצעות שיטות אימונוimmunoperixidase וכפולות.

Abstract

אימונוהיסטוכימיה (IHC) היא טכניקה מאוד רגיש וספציפי מעורב בזיהוי של אנטיגנים היעד בסעיפים רקמה עם נוגדנים עם תוויות. זהו תהליך רב-שלבים שבו האופטימיזציה של כל שלב חיונית להשגת האות הספציפי האופטימלי. באמצעות IHC, ניתן לזהות את ההפצה והלוקליזציה של סמנים ספציפיים ולחשוף מידע על שימור אבולוציוני. יתר על כן, IHC מאפשר הבנה של ביטוי והפצה של שינויי הסמנים בתנאים פתולוגיים, כגון השמנה. IHC, בעיקר את הטכניקה החיסונית, ניתן להשתמש בדגים מבוגרים כדי לזהות את הארגון והפצה של מולקולות שימור של phylogenetically, אבל פרוטוקול IHC סטנדרטי אינו מהווה הליך מגנטי. Orexin ו אנדוקאנאיאיד הם שתי מערכות שמרו במיוחד מעורבים בשליטה של צריכת מזון פתולוגיה השמנה. שדווחו כאן הם פרוטוקולים המשמשים להשגת מידע על orexin פפטיד (OXA), קולטן orexin (OX-2R), ו קולטן קנביאיד (CB1R) לוקליזציה והפצה בבטן ובמוח של נורמלי המושרה דיאטה שמנים (DIO) מבוגרים דגים מודלים. כמו כן תיאר הן שיטות לפרוקסידאז וכפולה החיסונית, כמו גם הכנת ריאגנטים, קיבעון, פרפין-הטבעה, והקפאה של רקמת דג זברה והכנה עבור הפעילות האנדוגניים בשלב והרקע כתמים מנגד. מערכת הפרמטרים המלאה מתקבלת מניסויים קודמים של IHC, שדרכם הראינו כיצד מערכת חיסונית יכולה לסייע בהבנת ה-OXs, OX-2R והפצת CB1R, לוקליזציה ושימור ביטוי בדגי מבוגר רקמות. התמונות המתקבלות עם עוצמת אות ספציפית מאוד הובילה לאישור כי דג זברה מתאימים מודלים בעלי חיים עבור מחקרים אימונוהיסטוכימיה של הפצה, לוקליזציה, ושימור אבולוציוני של סמנים ספציפיים ב מצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים. הפרוטוקולים המוצגים כאן מומלצים לניסויי IHC בדגי מבוגרים.

Introduction

אימונוהיסטוכימיה (ihc) היא טכניקה קלאסית הוקמה היטב בשימוש כדי לזהות רכיבים סלולריים או רקמות (אנטיגנים) על ידי הנוגדן אנטיגן אינטראקציה1,2. ניתן להשתמש בו כדי לזהות את הלוקליזציה וההפצה של biomolecules היעד בתוך הרקמה. IHC משתמשת בתגובות אימונולוגיים וכימיים כדי לזהות אנטיגנים בסעיפים רקמות3. הסמנים העיקריים המשמשים להדמיה של אינטראקציות אנטיגן-נוגדן כוללים צבעי פלורסנט (immunofluorescence) ו-המצע האנזים התגובות צבע (פרוקסידאז), שניהם מצוענים ל נוגדנים4. באמצעות תצפית מיקרוסקופית ניתן לקבוע את הלוקליזציה של רקמת התווית, אשר בקירוב מתאים ללוקליזציה של אנטיגן היעד ברקמה.

שתי שיטות קיימות עבור התגובות פלורסנט או כרומוגניים כדי לזהות חלבון: שיטת איתור ישירה, שבה הנוגדן העיקרי הספציפי מתויג ישירות; ואת השיטה לזיהוי עקיף, שבו הנוגדן העיקרי הוא בלתי מצומת בעוד הנוגדן המשני נושאת את התווית5,6,7. לשיטה העקיפה יש כמה יתרונות, שהוא בעיקר הגברה האותות שלה. כמו-כן, בניגוד לטכניקות מולקולאריות אחרות של מולקולות וסלולר, ניתן לדמיין את ההפצה, הלוקליזציה והביטוי של שני חלבונים או יותר המתבטאים בתוך תאים ורקמות7. בחירת שיטת האיתור המשמשת בשימוש תלויה בפרטים הניסיוניים.

עד כה, IHC משמשת רבות במחקר בסיסי ככלי רב עוצמה וחיוני כדי להבין את ההפצה והלוקליזציה של סמנים ביולוגיים ואת הפרופיל הכללי של חלבונים שונים ברקמות ביולוגיות מאדם לחסרי חוליות8, מיכל בן 10 , מיכל עשור , 11. הטכניקה מסייעת להציג מפה של ביטוי החלבון במספר רב של אברי בעלי חיים רגילים ושונים וסוגי רקמות שונות, המראים אפשרות כלפי מטה או מעלה ביטוי הנגרם על-ידי שינויים פיזיולוגיים ופתולוגיים. IHC היא טכניקה רגישה מאוד הדורשת דיוק ובחירה נכונה של שיטות להשגת תוצאות אופטימליות12. קודם כל, גורמים שונים רבים כגון קיבעון, לחצות את הפעילות, לאחזור אנטיגן, ורגישות של נוגדנים יכול להוביל שווא חיובי שווא אותות שליליים13. בחירת הנוגדנים היא אחד השלבים החשובים ביותר ב-IHC והיא תלויה במגוון האנטיגן ובזיקה לחלבון ולמינים הנמצאים תחת חקירה7.

לאחרונה, יש לנו אופטימיזציה של הטכניקה ihc כדי לזהות חברים של orexin/היפושנון מערכות אנדוקנאיאיד בתוך רקמת מבוגרים דג זברה. אנו מתמקדים בעיקר על קיבוע, רקמה הטבעה באמצעות שתי גישות שונות, הפרדה והרכבה (אשר יכול להשפיע על החלטה ופרטים במהלך ניתוח מיקרוסקופיים), חסימה (כדי למנוע תוצאות חיוביות שווא ולהפחית את הרקע)14. מאפיינים חשובים אחרים הם הנוגדנים מפרט ובסלקטיביות והשכולים של פרוטוקולים IHC בודדים. המפתח למתן ספציפיות נוגדן הוא השימוש של פקדים שליליים (כולל לא נוגדנים הראשי או רקמות כי ידוע לא לבטא את החלבונים היעד), כמו גם פקדים חיוביים (כולל רקמות כי ידוע לבטא את החלבונים היעד)15 . בחירת נוגדנים עבור ihc מבוססת על בסיס המינים שלהם-ספציפיות (הסבירות שבה הם מגיבים עם אנטיגן של עניין) ואת אנטיגן-נוגדן מערכות זיהוי מחייב המשמש4,5,6 ,7. במקרה של פרוקסידאז, הצבע של התגובה נקבע על ידי הבחירה של כרומוגן התלול, בדרך כלל diaminobenzidine (חום)16. מצד שני, אנימשתמש בנוגדנים בעלי מצועם עם פלואורופראור כדי להמחיש ביטוי חלבון במקטעים של רקמות קפואות ומאפשר ניתוח קל של חלבונים מרובים ביחס למערכת האיתור הרומוגנית מיכל 5 , 7. לאחר מכן

בטכניקת פרוקסידאז, הנוגדן המשני הוא מעלה באוב כדי biotin, מולקולה מקשר מסוגל לגייס מולקולה עיתונאי כרומוגניים [avidin-biotin קומפלקס (ABC)], המוביל הגברה של האות מכתים. עם שיטת העיתונאי ABC, האנזים peroxidase מגיב עם 3, 3 '-diaminobenzidine (בתוספת), הפקת כתמים בצבע חום אינטנסיבי שבו האנזים נקשר הנוגדן המשני, אשר ניתן לנתח עם מיקרוסקופ אור רגיל. כתמים ABC, בשל הזיקה הגבוהה של אבידין עבור biotin, מייצרת תגובה מהירה ואופטימלית, עם כמה נוגדנים משניים המחוברים לאתר של הנוגדן העיקרי הפעילות. שיטת זיהוי כרומוגניים זו מאפשרת ניתוח הדסיטומטלי של האות, המספקת נתונים חצי כמותיים המבוססים על התאמה של רמות האות החום עם ביטוי חלבון רמות18.

עם שיטות immunofluorescence גילוי סימולטני של חלבונים מרובים אפשרי בשל היכולת של fluorochromes שונים כדי לפלוט אור באורכי גל ייחודיים, אבל חשוב לבחור fluorochromes בזהירות כדי למזער חפיפה ספקטרלית 5. יתר על כן, השימוש בנוגדנים העיקריים במינים מארחים שונים ממזער את הקשיים הנוגעים לפעילות החוצה. במקרה זה, כל מיני-נוגדן משני ספציפי מזהה רק סוג אחד של נוגדן ראשוני. כתבים פלואורסצנט הם מולקולות אורגניות קטנות, כולל נגזרים מסחריים, כגון אלקסה פלואו צבעים.

מודלים רבים של בעלי חיים משמשים להבנת מצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים מסוימים. עד כה, הוא הוקם כי מסלולים מטבולית רבים נשמרים במהלך האבולוציה. לכן, מחקרי IHC במודלים של אורגניזמים כגון מצדגים יכולים לספק תובנה לבראשית ולתחזוקה של מצבים פתולוגיים ובלתי פתולוגיים17. זוהי מטרת דו ח זה כדי להמחיש פרוטוקולים ihc כי ניתן לבצע על רקמת דג זברה למבוגרים ולהשתמש כדי לקבל תמונות מפורטות של הפצה ולוקליזציה של oxa, OX-2r, ו CB1R ברמות היקפיים והמרכזי. דווח גם הם פרוטוקולים עבור יישום של שתי שיטות הגדולות IHC עקיף ברקמות היקפיים והמרכזית של דג מבוגר. מתוארים היא שיטה עקיפה, אשר מאפשרת הגברה האות במקרים שבהם נוגדן משני מצומת לצבוע פלורסנט (שיטת החיסונית) או כתב אנזים (פרוקסידאז שיטה). הן כרומוגניים והן שיטות זיהוי פלורסנט בעלי יתרונות וחסרונות. מדווח בפרוטוקול זה הוא השימוש ב-IHC, בעיקר במערכת החיסונית, מדגם בעלי חיים הנפוץ ביותר ללימוד מערכות ההתפתחותיות בתנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים שונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. פרוטוקול פרוקסידאז

הערה: הדגים מתקבלים על ידי פרופ ' אומיד ספארי (המחלקה לדיג, הפקולטה למשאבי טבע וסביבה, אוניברסיטת פרדוסי משהד, משהד, איראן)10.

  1. ניתוח רקמות
    1. הקריבו את דגי הדגים באמצעות שמיים במים קפואים (5 חלקים קרח/1 חלקי מים, 4 ° c); להשאיר אותם עד הפסקת כל התנועה כדי להבטיח מוות על ידי היפוקסיה.
    2. הסר במהירות את המעיים והמוח בשיטת החיתוך הבאה:
      1. מייבשים את הדג על מגבת נייר ומניחים אותו מsagittally על מחצלת מחולקת, חוסמת את החלק הגחוני של ארובת העין וחלק בשרני של הזנב.
      2. למעי: חותכים את העור ומסירים בזהירות את העור ושריר הבסיס מהצד של הדג עד שהאברים הפנימיים גלויים לעין. להסיר את המעיים מחלל הגוף מותח אותו החוצה.
      3. למוח: להסיר את הראש עם סכין גילוח. להסיר רקמה רכה מהצד הגחוני של הגולגולת עם מלקחיים. פתח את הגולגולת והוצא את העצם. מהצד הגחוני של המוח להסיר את העור ואת עצמות הגולגולת מהצד השני של המוח. . תסיר את המוח
  2. קיבוע רקמות
    1. לתקן את הרקמות הניתוח על ידי טבילה טריים 4% פאראפורמאלדה (כלפי מתחת) במאגר פוספט (PB, pH 7.4, 4 ° צ') עבור 3 h בטמפרטורת החדר (RT).
      1. להכין 0.1 M PB על ידי המסת 1.755 g של נה2פו4H2O ו 4.575 g של Na2hpo4 ב 450 mL של מים מזוקקים (DH2O), ולהתאים ל-PH של 7.4 עם כמות הצורך של naoh 1n.
      2. הכינו 4% כדור הבסיס התרמי 4 גרם של ה100 mL של 0.1 M PB (pH 7.4) על ידי עצבנות על צלחת חום. כאשר הטמפרטורה של 60 ° צ' מגיע, להוסיף 2-4 טיפות NaOH 1N כדי לקבל פתרון ברור. שמאל למעלה 4% ב RT ושליטה pH. כוונן את ה-pH ל-7.4.
        הערה: קיבוע רקמות עבור יותר מ 4-6 h עשוי להוביל לקיבוע יתר, אשר מסכות אנטיגנים, הגבלת נוגדנים-אפירופה כריכה. זמן הקיבעון תלוי בגודל הרקמה.
  3. הטבעת רקמה
    1. לשטוף את הרקמות 5x עבור 5 דקות כל אחד, על ידי שקיעה 0.1 M PB (pH 7.4).
    2. מייבשים את הרקמות על ידי טבילה נוספת באלכוהול 70% (6 דקות), 80% (6 דקות), 95% (5 דקות), 95% (5 דקות), 100% (1 דקות) ו-100% (1 דקות).
    3. להבהיר את הרקמות על ידי שקיעה ב 100% אלכוהול: קסילן (1:1) עבור 10 דקות, ואז 2x ב קסילן עבור 5 דקות כל אחד.
    4. לחדור את הרקמות עם פרפין שעווה (56 ° c) פעמיים עבור 1 h כל אחד על ידי טבילה ישירה בפרפין.
    5. להטביע את הרקמות בגושי פרפין בטמפרטורת החדר (RT) ולאחסן ב-RT עד לחסימת.
  4. חיתוך רקמות
    1. לחתוך את הרקמות לתוך מקטעים ילתית או משונן עם עובי של 8 יקרומטר עם מיקרוטומה, ולאסוף את הסעיפים בסדרה חלופית על שקופיות זכוכית דביק על המים והתחמם ב 38 ° c.
    2. לייבש את השקופיות עם מקטעים ב 37 ° c בלילה.
  5. הידרזציה ומיפוי של חתכי רקמה
    1. Dewax עווה את הסעיפים על ידי טבילה קסילן עבור 5 דקות ואחריו טבילה קסילן עבור 3 דקות.
    2. השקה מחדש את הסעיפים על ידי טבילה בשקופיות עוקבות באלכוהול 100% II (1 דקות), 100% I (1 דקות), 95% (1 דקות), 75% (1 דקות), 50% (1 דקות), ולאחר מכן הצב את השקופיות ב-dH2O (5 דקות).
      הערה: לגמרי לעוות את הסעיפים לפני תחילת התגובה. אם הסעיפים עדיין יש עקבות של פרפין, לבצע טבילה נוספת קסילן עבור 5 דקות או יותר.
  6. שליפת אנטיגן
    1. לטיפול בסעיפים עם מאגר ציטראט (0.01 M, pH 6.0) על ידי הצבת השקופיות בתמיסה וחימום במיקרוגל במשך 5 דקות בכוח המקסימלי.
    2. . תנו לחלקים להתקרר
    3. חזור על מחזור של 5 דקות במיקרוגל בכוח המקסימלי כדי להשלים את האחזור אנטיגן.
      1. הכנת מאגר ציטראט (0.01 m, pH 6.0) על ידי המסת 2.10 g של חומצת לימון ב 100 ml של dh2o ו-5.882 g של נתרן ציטראט בשנת 200 ml של dh2o. מערבבים נתרן ציטראט (0.01 m) עם חומצת לימון (0.01 m) ביחס של היקף הדיסק והתאמת ה-pH ל 6 באמצעות HCl 0.1 N.
  7. חסימת peroxidase אנדוגני
    1. מתחם הרקמה על השקופיות. עם עט עמיד בממס
    2. לשטוף את הסעיפים 3 פעמים, 5 דקות כל אחד, עם תמיסת מלוחים טריס-באגירה (TBS) (0.1 M, pH 7.3).
      1. להכין 0.1 M TBS על ידי המסת 12.1 g של בסיס טריזמה ו 9 גרם של הנאל ב 950 mL של dH2O ולהתאים ל-pH 7.3 עם HCl 0.1 n.
    3. לחסום את הפעילות peroxidase אנדוגני על ידי שקופיות טבילה בפתרון של 0.75% H2O2 עבור 5 דקות ב RT.
      1. הכינו את הפתרון 0.75% h2o 2 המסת 5 מ ל 30% h2o 2 ב 195 ml של dH2o.
        הערה: אנזימים ndogenous יכולים להגיב עם ריאגנטים IHC ולהניב תוצאות חיוביות שווא. יתר על כן, רקמות הvascularized מאוד לבטא peroxidase אנדוגניים רבים, אשר יכול להוביל אינטנסיבי רמות הצביעת והרקע. טיפול עם 0.75% H2O2 מקומים אנדודוגני peroxidase ומפחית באופן משמעותי את הרקע הלא ספציפי.
  8. חסימה של בינדי אתרי ng וחדירות רקמות
    1. מודלת את מקטעי הרקמה בעזרת TBS/0.4% טריטון (TBS-T) חוסם את המאגר, המכיל את הנסיוב העיקרי (NRS), עבור 30 דקות ב-RT כדי לחסום אתרי איגוד לא ספציפיים.
      1. להכין 0.4% טריטון ידי המסת 0.4 mL של טריטון X-100 ב 100 mL של TBS.
      2. הכינו את הפתרון TBS-T מאגר חסימה על ידי המסת 1% סרום רגיל ב-TBS המכיל 0.4% טריטון X-100 (1 מ ל של סרום רגיל + 8.2 mL של TBS + 0.8 mL של 0.48 טריטון X-100).
        הערה: בחר את מינים של סרום לבעלי חיים בהתאם למנחה של הנוגדן המשני (למשל, כאשר משתמשים בנוגדן משני של עז נגד ארנבת, השתמש בסרום עז רגיל).
  9. דגירה של רקמה עם נוגדן ראשוני
    1. מודלת את הסעיפים לילה בתיבה לח ב RT עם נוגדנים העיקרי מדולל ב-TBS-T. הכתם את הסעיפים עם הנוגדן העיקרי הבא:
      1. נוגדן עז נגד OX-2R מדולל 1:200, אשר מזהה את C-מסוף של החלבון.
      2. נוגדן עז נגד שור-A מדולל 1:200 [orexin-A (C-19)], אשר מזהה את C-מסוף של החלבון.
        הערה: ודא שהנוגדן העיקרי מגיב באמצעות הסמנים המעניינים. להגדיר עם איזה אפירופה של ביואוהנוגדנים הנוגדן העיקרי מגיב באמצעות יישור גנים. למשל, האפירופה של שור-א ממופה בין ה-aa 50-100 של השור האנושי-A (O43612) ואילו האפיטויום של שור-2R ממופה בסמוך ל50 האחרון של ה-C-טרמינל של האדם.
  10. דגירה של רקמות עם נוגדן משני
    1. לשטוף את סעיפים 3x עבור 5 דקות כל אחד, עם 0.1 M TBS (pH 7.3).
    2. מודלת את הסעיפים עבור 1.5 h ב-RT עם נוגדן משני biotinylated ו הארנב אנטי עז אנטיגלובולין (H + L) מצופחת עם biotin, אז לדלל 1:100 ב-TBS-T.
      הערה: לבדוק ולמצוא את הדילול השונה של נוגדנים ראשיים ומשניים כדי למצוא את מיטבי החומר המאפשר צמצום הרקע.
  11. תגובה Peroxidase
    1. לשטוף את סעיפים 3x עבור 5 דקות כל אחד, עם 0.1 M TBS (pH 7.3).
    2. מודלת את הסעיפים עם מורכבות avidin-biotin (ABC) עבור 1 h.
      1. הכן פתרון ABC הוספת שתי טיפות של רכיב A ואחריו שתי טיפות של רכיב B ב 5 מ ל של TBS.
    3. לשטוף את סעיפים 3x עבור 5 דקות כל אחד, עם 0.1 M TBS (pH 7.3).
    4. לטפל בסעיפים עם המצע כרומוגן 3, 3 '-diaminobenzidine-4 (קורטוב).
      1. הכנת פתרון התוספת הוספת טיפה אחת (כ 30 μL) של כרומוגן מתרכז ל 1 מ ל של מדלל, ומערבבים היטב לפני השימוש.
        הערה: הכן את פתרון ה-ABC לפחות 30 דקות לפני השימוש ושמור את הקומפלקס ב-4 ° צ' עד השימוש כדי לאפשר כריכה יציבה של avidin/biotin. הכינו את התמיסה הטרייה של העבודה, החלה על מקטעי הרקמה, והתפתחו עד שהצבע מתאים. כאשר התגובה הרומוגנית ממירה את האתרים האפימגניים לצבע חום ועוצמת האות מתאימה להדמיה, המשך לשלב הבא. תזמון של התפתחות הדקה עשוי להשתנות ממספר שניות עד 10 דקות. עבור שור-A ואוקס-2R 1, 2 דקות זה מספיק. יש לטפל בטיפול ב-"בזהירות", כפי שהוא מסרטן.
  12. מייבש מזון והרכבה
    1. לשטוף את כל הסעיפים 3x עבור 5 דקות כל אחד, עם 0.1 M TBS (pH 7.3) כדי לעצור את התגובה טיפה.
    2. מייבשים את הסעיפים על ידי טבילה בשקופיות עוקבות באלכוהול 50% (2 דקות), 75% (2 דקות), 95% (2 דקות), 100% I (2 דקות), 100% II (2 דקות).
    3. להבהיר את הפרוסות על ידי שקיעה 2x ב קסילן 10 דקות כל אחד.
    4. הר הסעיפים עם DPX (dibutyl וטיל המאביק) השסטנט עבור היסטולוגיה, הוספת שתי טיפות של מדיה הרכבה לשקופיות וציפוי באיטיות עם coverslips.
      הערה: מאז טבילת הרקמה בריכוזים גוברת של אלכוהול במהלך התייבשות תוצאות החדירה לאלכוהול של רקמות והחלפת מים עם אלכוהול, לקבוע זמן התייבשות מדויק לא מעל מייבשים את הרקמות. לבצע את הטבילה קסילן לאחר התייבשות כדי להבהיר את הרקמה ולהסיר כל עודף או אלכוהול שנותרו.
  13. פקדים
    1. חזור על סעיפים 1.1 – 1.12, השמטת הנוגדן העיקרי ו/או החלפת הנוגדן העיקרי או הנוגדן המשני IgG ידי TBS (פקדים שליליים).
    2. חזור על סעיפים 1.1 – 1.12 מראש כל נוגדן ראשוני עם עודף של פפטיד היחסי (100 מ"ג של פפטיד/1 מ ל של נסיוב מדולל).
    3. חזור על סעיפים 1.1 – 1.12 באמצעות רקמה שונה כשליטה חיובית (למשל, רקמת עכבר).
      הערה: הכינו את כל המאגרים רעננים, זמן קצר לפני ההתחלה. הסירו בזהירות את הנוזלים העודפים בכל שלב עם פיפטה או נייר סינון סביב המקטעים, תמיד שומרים על הסעיפים רטובים.
  14. רכישת תמונה וניתוח
    1. השיגו תמונות דיגיטליות בתאורה מתמדת ובאותה הגדלה בעזרת מיקרוסקופ המצויד במצלמה דיגיטלית.
    2. בצע ניתוח למחצה כמותי של עוצמת הצביעת באמצעות תוכנת דימות (ראה טבלת חומרים).
      1. פתח את התמונות שנלכדו, בתבנית קובץ. אבל או. tiff, להערכת מדדים של החיוביות של OX-A או OX2-R.
      2. בחר את הלחצן תחת מדידה ולחץ על Counti באופן ידני. הרוזן את מספר פרופילי התא המוכתמים ישירות מהמסך על-ידי הצבת סימון על תאים חיוביים על-ידי לחיצה על העכבר.
      3. לבחור אזור של ריבית (ROI) אזור (3 x 103 יקרומטר2) כדי לכמת את צפיפות אותות החיסוני (צפיפות אופטית, OD).
      4. לקבוע את הפיקסל עם העוצמה הגבוהה ביותר (חיובי גבוה) ולפחות אינטנסיביות (שלילי) בתוך התמונה מנותח כדי להקצות את האפס כערך של הרקע (כלומר, חלק של רקמה נטול תאים מוכתמים).
      5. העריכו את ה-OD על-ידי עבודה על קנה מידה לוגריתמי של ספיגת הרוויה. בניתוח תמונה דיגיטלית, עוצמת הפיקסל ' טיפה ' נעה מהערך הכהה ביותר (0) לעובי (255 ערך) הבהיר ביותר.
      6. קבע את ה-OD על-ידי התוויית היסטוגרמה של הערכים הבאים: log10(255/I), כאשר "I" הוא ערך העוצמה בפיקסלים שניתן על-ידי התוכנית ונקבע על-ידי הפחתת הרקע.
        הערה: התגובה הקבועה והיציבה פרוקסידאז ניתן לנתח תחת מיקרוסקופ שדה בהיר בכל עת. בצע את הספירה של תאים המסומנים בתווית במקטע חלופי כדי להימנע מספירה כפולה של אותו תא ממקטעים סמוכים.

2. פרוטוקול אימונולוורנסנציה

  1. ניתוח רקמות
    1. להקריב ולנתח את החיות כמתואר בסעיף 1.1.
  2. קיבוע רקמות
    1. לתקן את המעיים ואת המוח על ידי טבילה עבור 3 h ב 4% בכיוון הכלפי מטה ב 4 ° c.
      1. הכינו PB ו-4% כדור במול כמו בסעיף 1.2.1.
        הערה: זמן הקיבעון תלוי בגודל הרקמה. קיבוע רקמות עבור יותר מ 4-6 h עשוי להוביל לקיבוע יתר, אשר מסכות אנטיגנים ומגביל נוגדן-אפירופה כריכה.
  3. הטבעת רקמה
    1. לשטוף את הרקמות 3x עבור 5 דקות כל אחד, עם 0.1 M PB (pH 7.4).
    2. לניקוי הקריוציט, העבירו את הרקמות ל -20% סוכרוז ב-PB (0.1 M, pH 7.4) והמשך הלילה ב -4 ° c. ואז, להעביר את הרקמות 30% סוכרוז ב 0.1 M PB (pH 7.4) ולשמור על לילה נוסף ב 4 ° c.
    3. הטמע את הרקמות בבלוק של מתחם הקיצוץ האופטימלי בטמפרטורת החיתוך (OCT). כדי לעשות זאת, להכין מלחמה קטנה של חנקן נוזלי, לקחת רדיד אלומיניום, ולחתוך אותו לחצי כדי ליצור מחבת. את המחבת המכילה את הרקמות המלאות בתרכובת OCT יש לטבול בחנקן הנוזלי עד לקירור מתחם אוק. ניתן לאחסן את הרקמות הקפואות ב-80 ° c עד לאחר השהייה.
  4. חיתוך רקמות
    1. להעביר את גושי רקמות קפוא כדי קריוסטט ב-20 ° c וחותכים בסעיפים ילתית או משונן של 10 μm.
    2. לאסוף את הרקמות בסעיפים סידוריים חלופיים על שקופיות זכוכית דביק מתאים אימונוהיסטוכימיה ולאחסן אותם ב-20 ° c עד השימוש.
      הערה: אחסן שקופיות בין-20 ° צ' ו-4 ° צ' בתיבת שקופית כהה או בפנקס שקופיות.
  5. חסימת אתרי קשירה לא ספציפיים וחדירות רקמות
    1. דדקייט באזור הרקמה בשקופית. עם עט עמיד בממס
    2. לשטוף את סעיפים 3x עבור 5 דקות כל אחד, עם 0.1 M PB (pH 7.4).
    3. מודלת את הסעיפים עם 1% סרום חמור מומס מאגר החדירות PB-טריטון X-100 0.3% (PB-T) עבור 30 דקות ב-RT כדי לחלחל את קרום התא ולחסום את האתרים איגוד לא ספציפי.
      1. הכינו את טריטון X-100 0.3% המסת 0.3 mL של טריטון X-100 בתוך 100 mL של 0.1 M PB (pH 7.4).
      2. להכין את הפתרון חסימת המסת 1% החמור הסרום דונקי ב PB המכיל 0.3% TritonX-100.
        הערה: מינים של בעלי חיים של הנסיוב המשמש החדירות ומאגרי חסימה תלויים המארח של הנוגדן המשני.
  6. דגירה עם שילוב של נוגדנים ראשוניים
    1. לשטוף את סעיפים 3x עבור 5 דקות כל אחד, עם 0.1 M PB (pH 7.4).
      1. מודלת את הסעיפים לילה בתיבה לח ב RT עם שילוב של נוגדנים העיקרי מדולל PB-T. התערובות הבאות של נוגדנים עיקריים ניתן להשתמש: נוגדן עז נגד שור-2R מדולל 1:100/הארנב נוגדן נגד CB1R מדולל 1:100, או נוגדן עז נגד OX-A מדולל 1:100/הארנב נוגדן נגד CB1R מדולל 1:100.
  7. דגירה עם שילוב של נוגדנים משניים
    1. לשטוף את סעיפים 3x עבור 5 דקות כל אחד, עם 0.1 M PB (pH 7.4).
    2. מודלת את הסעיפים עבור 2 h ב RT עם 1) שילוב של החמור נגד הארנב אלקסה Fluor 488-נוגדן משני מצוח החמור נגד עז אלקסה Fluor 594-מעלה מעלה נוגדן משני 1:100 ב PB-T; או 2) שילוב של חמור נגד עז אלקסה Fluor 488-מצותת נוגדן משני החמור נגד הארנב אלקסה Fluor 594-מעלה מעלה נוגדן מדולל 1:100 ב PB-T.
      הערה: השתמש בנוגדנים משניים שפותחו באותו מארח בעל חיים. הסרום הרגיל חייב להשתייך לאותו מינים של הנוגדן המשני (למשל, השימוש בנוגדנים משניים שפותחו בחמור ובסרום רגיל לחמור). לדלל את הנוגדנים העיקריים והמשניים עם חסימת מאגר המכיל את חומרי הניקוי כדי להגדיל את החדירות התאים ולהפחית את הרקע.
  8. הרכבה על רקמות
    1. לשטוף את סעיפים 3x עבור 5 דקות כל אחד, עם 0.1 M PB (pH 7.4).
    2. מכתים את הסעיפים עם DAPI לצבוע גרעיני (4 ', 6-diamidino-2-פניינילידול) מוכן המסת 1.5 μL של DAPI (1 מ"ג/mL) ב 3 מ ל של PB.
    3. כיסוי שקופיות עם הרכבה בינונית (ראה טבלת חומרים). זה בינונית להרכבה מימית מייצב את דגימת רקמות וכתמי לשימוש לטווח ארוך. ניתן לאחסן דגימות פלורסנט בחשכה ב -4 ° c. כדי להאריך את חיי fluorofores, להשתמש במדיום הרכבה antifed.
      הערה: בחר מדיום הרכבה טוב. אחד הפרמטרים החשובים ביותר של הסוכנים להרכבה הוא מדד השבירה (nD), אשר צריך להיות סביב 1.5, השבירה המדד של זכוכית. מדיום ההרכבה בשימוש כאן יכול לשמש במיוחד עם הדגימה מוכן לדטרמינציות אנזים ו השומנים (כלומר, הדגימה כי לא צריך להיות מיובש עם סדרה עולה של אלכוהול).
  9. פקדים
    1. חזור על סעיפים 2.1 – 2.8, תוך השמטת הנוגדן הראשי או המשני, או החלפה בשלב הספציפי של קטריולוגיה העיקרי או המשני עם PB (בקרה שלילית).
    2. חזרה סעיפים 2.1 – 2.8, מראש קליטת כל נוגדן ראשוני עם עודף של פפטיד היחסית (100 מ"ג של פפטיד/1 מ ל של נסיוב מדולל).
    3. חזור על סעיפים 2.1 – 2.8 על פרוסות של מוח העכבר (בקרה חיובית).
      הערה: הכינו את כל המאגרים רעננים, זמן קצר לפני ההתחלה. הסירו את עודפי הנוזלים בזהירות בכל שלב עם פיפטה או נייר סינון סביב המקטעים, תמיד שומרים על חתך לח.
  10. רכישת תמונה
    1. השתמש במיקרוסקופ מוקד מצויד בשלב x-y-z ממונע, מצלמה דיגיטלית, והרכישה וניתוח תמונה תוכנה כגון שקלים-רכיבים C כדי להתבונן ולנתח את הסעיפים מוכתם חיסוני. לרכוש תמונות דיגיטליות באמצעות מטרות של 5-20-40x.
    2. קח את התמונות של כל מקטע בהגדלה נמוכה (מטרת 10x או 20x) בכל אחד מהערוצים הזמינים כדי להלחין מונטאז ' להגדלה נמוכה, המספק סקירה של האזור כולו כדי להקל על הלוקליזציה והתיעוד של OX-2R/CB1R ביטוי אנטומי. נרמל את התמונות הפלואורסצנטית לניגודיות מקסימלית ולשכבת-על לפני הניתוח.
    3. לאסוף טורי Z-ערימות של תמונות ברחבי התחום של עניין. לרכוש את התמונות דרך שישה מטוסי מוקד (Z-step) עם צעדים מיקוד של 1 – 1.8 יקרומטר לכסות את נפח הרקמה שבו שור-2r/CB1R coexpression הוא דמיינו כמו הצבע הצהוב. לביצוע אוסף זה עבור כל ערוץ (אדום, ירוק, כחול) בנפרד, באמצעות מיקרוסקופ Z-ממונע.
    4. השתמש בתוכנת הדמיה לפירוק תמונות על-ידי יישום של עשר איטראציות וכווץ את התמונות של מטוסי ה-Z הטוריים לתמונת הקרנה מקסימלית אחת.
    5. התאימו את המיקרוגרפים לאור וניגודיות באמצעות Adobe Photoshop 6.01 (אדובי מערכות, סן חוזה, CA).
      הערה: בצע את שלב הפירוק במהלך ההתבוננות כדי להקטין עוד יותר את הרקע. הגבל את חשיפת השקופיות לאור כדי למנוע הלבנת התמונות.
  11. אנליזת תמונות
    1. בצע ניתוח כמותי של שור-2r/CB1R coexpression על מקטעים עבים בעובי 10 יקרומטר (n = 5 בעלי חיים לכל קבוצה) על-ידי כיסוי כל אזור העניין של כל חיה.
    2. לכמת את השור-2R/CB1R coexpression כמספר של מגוון חיובי צהוב עם מערכת חצי אוטומטית של ניתוח תמונה. תוכנת imagins יכולה לספק רמה גבוהה יותר של פרטים, עם נתונים כמותיים בנוגע לאזורי החפיפה בין הבדיקות הפלורסנט השונות.
    3. מכמת את הדקדטה באמצעות כלים סף לעוצמת האות בשני הערוצים. פתח את קובץ ליף,. tiff או קבצי. jpg ובחר תמונה – סף. בחרו ' הגדרה אוטומטית ' או ' שיטה ידנית ' ולהסדיר את הסף עד שכל המכתמים ייבחרו. ניתוח התפלגות עוצמות הפיקסלים באזור של התמונה שאינו מכיל עצמים אימונוולאביתיים כדי להשיג את סף הרקע. קבע רקע זה בנפרד עבור כל תמונה. התוכנית מסירה את סף הרקע על-ידי הגדרת קו הבסיס של עוצמות הפיקסלים לערך הרקע.
    4. בחר לנתח – למדוד ולבחור את הפרמטרים להיות נמדד (בעוצמה מינימלית, ערכי מקסימום, ממוצע; מספר/צפיפות של האימונויניום מכווץ).
    5. לספור את הדקדטה צהוב לאורך הנפח של הרקמה 4 Z-ערימות עבור כל קטע, באמצעות ערימות מיד מעל או מתחת למישור המיקוד הטוב ביותר. אל תכלול את האזורים הנמצאים מחוץ למוקד מהניתוח.
      הערה: בצע ספירה של תאים המסומנים בתווית במקטע חלופי כדי למנוע ספירה כפולה של תאים זהים מadjacents מקטעים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

נתוני הנציג עבור הפרוקסידאז הצביעת מוצגים באיור 1 ובאיור 2. אימונוהיסטוככימיים ניתוח של התפלגות שור-A ו-OX-2R בבטן של דגי מבוגרים הראו אתרי לוקליזציה שונים של OX-A ו-OX-2R ואת העליות שלהם ביטוי בתאי המעיים של ה-DIO. כתמים חומים עזים עבור שור-A נצפתה בתאים של המעי האמצעי והקדמי (איור 1A, A1). הביטוי החיסוני של שור-A נתן אותות ברורים בהשוואת המעיים השונים, היורדת מהקדמית לכיוון המעי האמצעי (איור 1b, B1). הפקד השלילי שימש כהפניה לרקע ולאישור הספציפיות של האות OX-A (איור 1E). החשיפה הממושכת לגובה כרומוגן הביאה להגדלת עוצמת הרקע (איור 1D). תוצאות דומות נצפו עבור הביטוי החיסוני של שור-2r במעי של דיו ובקרת הדיאטה דג זברה (איור 2). מוגבר שור-A האות ב-DIO מבוגרים של הדגים היה מלווה על ידי ביטוי יתר של אוקס-2R בהשוואה השוואת מעיים אחרים (איור 2R, B1).

הנתונים שהושגו באמצעות הפרוקסידאז מאומתים, אושרו על ידי הגדלת הביטוי OX-A ו-OX-2R במעיים של מבוגרים בעלי משקל מרבי ביחס לשליטה (איור 3). יתר על כן, באמצעות החיסונית כפול של כפולה, זה היה אפשרי להשיג מידע על הביטוי של קולטן אנדוקאנמיאיד CB1R ואת שיתוף ההתאמה שלה עם OX-A או שור-2R בבטן ובמוח של דיאטה בקרה ו-מבוגרים מבוססי דיו. היתרון של immunofluorescence הוא שהוא מניב אות מפורט יותר עם פחות מידע סיפק על מורפולוגיה רקמות, לעומת טכניקה פרוקסידאז. באמצעות שיטת החיסונית, קבענו בעבר אינטראקציות אנטומיים בין OX-2R ו CB1R בבטן ובמוח10.

הניתוח המדויק של התמונות האימונולומוטיים הראה את העלייה של שור-2r/CB1R co-לוקליזציה בבטן של מבוגרים בוגרים של הדגים בהשוואה לדיאטה בקרת דג זברה (איור 3b, C). מצב דומה נצפה באזורים שונים במוח, כגון הטלנצונאלון, ההיפותלמוס (לרוחב, ובעל האזורים הצדדיים), tectum אופטיים, שפורפרת טורוס, וגרעין מפוזר של האונה הנחותה (איור 4). שלילי (איור 5A, B) וחיובי (מוח העכבר) (איור 5a) בקרות שימשו כהפניות לרקע ולאשר את הספציפיות של CB1R ו-OX-2r אותות.

יתר על כן, על ידי מכתים כפול עם שור-A/CB1R, זה נצפה בנוירונים orexinergic של ההיפותלמוס כי היה גידול של שיתוף לוקליזציה מלווה בגידול של אוקס-A אות פלורסנט (איור 6). תוצאות אלה מראות כיצד immunofluorescence כפול יכול לעזור לזהות ביטוי בחלבון שימור מבחינה פיזיולוגית, לוקליזציה שיתוף של חלבונים היעד, ואת ההפצה שלהם/או ביטוי שינויים בתנאים פתולוגיים שונים.

Figure 1
איור 1: לוקליזציה החיסונית Orexin במעיים של דיו לעומת בקרת דיאטה מבוגרים zebrafish. (A) שור-פעילות immunoreactivity התאים של המעי המדיאלי של דיאטה שליטה zebrafish. (A1) OX-פעילות חיסונית בתאי המעי המדיאלי של דיו. (ב) שור-פעילות חיסונית בתאים של המעי הקדמי של דיאטה בקרה zebrafish. (ב1) OX-פעילות חיסונית בתאי המעי הקדמי של מערכת הדגים של DIO. (A1, B1) גידול של שור-A תאים חיוביים בהשוואה רקמות שונות של המעי האמצעי והקדמי של מיכל zebrafish. (ג) שור-פעילות חיסונית בתאים של המעי הקדמי של מערכת הדגים של DIO. (ד) פרוקסידאז תגובה לשור-A לאחר חשיפה ממושכת ל-"קמצוץ". (E) שליטה שלילית. סרגל קנה מידה: 50 יקרומטר (a, a1, b, b1); 100 יקרומטר (C, D, E). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: Orexin 2 לוקליזציה חיסוני קולטן במעי של דיו לעומת בקרת דיאטה מבוגרים zebrafish. (א) שור-2r החיסונית בתאי המעי האמצעי של דיאטה בקרה zebrafish. (A1) מערכת החיסונית OX-2R בתאים של המעי האמצעי של מערכת הדגים. (ב) שור-2r מערכת החיסונית בתאים של המעי הקדמי של דיאטת בקרה zebrafish. (ב1) מערכת החיסונית של OX-2R בתאי המעי הקדמי של מערכת הדגים. (A1, B1) גידול של שוורים-2R חיובי תאים בהשוואה רקמות שונות של המעי האמצעי והקדמי של מיכל zebrafish. סרגל קנה מידה: 50 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: התפלגות של שור-A (ירוק)/cb1r (אדום) ו-ox-2R (אדום)/cb1r (ירוק) ואת שיתוף ההתאמה שלהם עם OX-2r/CB1R (צהוב) במעיים של דיו לעומת בקרת דיאטה למבוגרים zebrafish. (א) שור-A/CB1R שיתוף ביטוי במעיים של מבוגר דיאט דג שליטה. (ב) שור-2r/CB1R ביטוי בתוך המעיים של דיאטה שליטה zebrafish. (ג) שור-2r/CB1R ביטוי בתוך המעיים של מבוגרים הדגים של DIO. גידול של שור-2R/CB1R co-לוקליזציה (נקודות צהובות) במעיים של DIO zebrafish. סרגל קנה מידה: 25 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: התפלגות של שור-2r (אדום) ו CB1R (ירוק) ואת שיתוף ההתאמה שלהם עם OX-2r/CB1R (צהוב) במוח סעיפים ילתית של דיו לעומת בקרת דיאטה בוגרים zebrafish. (א) שור-2r/CB1R ביטוי בטלנצאלון של דיאטת השליטה בדגים. (A1) OX-2R/CB1R ביטוי בטלנצאלון של DIO. (ב) שור-2r/CB1R ביטוי בתוך לרוחב, האזור הגחוני והעורף של ההיפותלמוס, tectum אופטית, שפורפרת טורוס, לפזר את הגרעין של האונה הנחותה של דיאטה בקרת דג זברה (B1) שור-2r/CB1R ביטוי בתוך לרוחב, הגחוני, ו באזורים האלה של ההיפותלמוס, tectum אופטיים, שפורפרת טורוס, ו לפזר את הגרעין של האונה הנחותה של מיכל zebrafish. (ג) גבוה יותר של ההגדלה האופטית המציגה את הביטוי המשותף של OX-2r/CB1R (צהוב) ב דיאטה שליטה zebrafish. (ג1) הגדלה גבוהה יותר של tectum אופטיים המציגה את הביטוי המשותף של OX-2R/CB1R (צהוב) ב-DIO הדגים. (ד) מסוים של ה tectum האופטי המציג את ההפצה והביטוי המשותף של שור-2r/CB1R (צהוב) ב-DIO הדגים. DAPI (כחול) שימש לנגד גרעיני כתמים. CP: גרעין התלמי האחורי המרכזי; Dd: בכיוון ההוא; Dc: מרכזי; Dl: לרוחב; Dm: המדיאלי; Dp: חלק אחורי של הטלנצאת הפרק; Hd: האזור הגבי של ההיפותלמוס הפריחדרית; Hv: האזור הגחוני של ההיפותלמוס הפריחדרית; LH: חלק לרוחב של ההיפותלמוס; PGl: לרוחב ו PGm: גרעיני פרה המדילי; PGZ: האזור האפור החדרית של tectum אופטי; . תיאו: מעקב אופטי TL: longitudinalis טורוס; מחלות ומחלות. סרגל קנה מידה: 50 יקרומטר (a, a1, c, c1); 250 יקרומטר (b and b1); 25 יקרומטר (ד). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: שור-2R וביטוי חלבון CB1R וספציפיות במוח מבוגר של דג והיפוקמפוס של העכבר. (א) שליטה שלילית בשור-2r על-ידי ספיגה מראש עם הפפטיד היחסי. (ב) שליטה שלילית בCB1R על ידי הספיגה מראש עם הפפטיד היחסי. (ג) שליטה חיובית של שור-2r/CB1R בהיפוקמפוס של העכבר. PGZ: האזור האפור הבין חדרית של tectum אופטי; . תיאו. סרגל קנה מידה: 100 יקרומטר (A, B); 250 יקרומטר (C). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: הפצת שור-a (ירוק) ו-CB1R (אדום) ושיתוף ההתאמה שלהם עם OX-a/CB1R (צהוב) בסעיפים ההיפותלמי של דיו לעומת בקרת דיאטה בוגרים zebrafish. (א) שור-a/CB1R ביטוי בהיפותלמוס של דיאטה שליטה דג זברה (1) הגדלה גבוהה מראה את השור-A/CB1R ביטוי בתוך ההיפותלמוס לרוחב. פירוט של שור-A/CB1R-ביטוי שיתוף המציג לוקליזציה בסמוך של שור-A/CB1R או שיתוף לוקליזציה וחפיפה של שור-A/CB1R בתאים זהים. (ב) שור-A/CB1R שיתוף ביטוי ב ההיפותלמוס של מגדל דיו (ב) הגדלה גבוהה יותר המציגה את השור המוגבר-A/CB1R ביטוי בתוך ההיפותלמוס לרוחב. פירוט של שור-A/CB1R-ביטוי שיתוף המציג לוקליזציה בסמוך של שור-A/CB1R או שיתוף לוקליזציה וחפיפה של שור-A/CB1R בתאים זהים. LH: חלק לרוחב של ההיפותלמוס. סרגל קנה מידה: 50 יקרומטר (A, B); 25 יקרומטר (A1, B1). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הכנה לדוגמא

הכנת הדוגמה היא השלב הקריטי הראשון ב-IHC. פרוטוקול אמין מאפשר תחזוקה של מורפולוגיה של תאים, ארכיטקטורת רקמות ואנטיגניות. שלב זה מחייב איסוף רקמות נכון, קיבוע והסדר22,23. המטרה של קיבעון היא לשמר את הרקמה ולהפחית את הפעולה של אנזימים רקמות או מיקרואורגניזמים. בפרט, שלב הקיבוע משמר רכיבים סלולאריים ומbiomolecules, מונע העברת המרכיבים הסלולריים (כגון אנטיגנים ואנזימים), מייצב חומרים סלולאריים מפני השפעות אברימים של ההליכים הבאים, ו מקלה על כתמים חיסוני4,7,24.

לפני הסרת בנייה, הרקמה מוכנה ונשמרת באמצעות הטבעה פרפין (שיטה פרוקסידאז) או cryopreserved (הקפאה בקריורומפדיה, בשיטות מרובות החיסונית). שיטת השימור משויכת לסוג הקיבעון7. לאחר קיבעון ושימור, הרקמות חתוכות על ידי מיקרוטומה אם מוטבע בפרפין, או בקריוסטט אם הוא מוטבע בקריופדיה. רקמות הן בדרך כלל פרוסות בטווח עובי של 8-10 יקרומטר ו רכוב על שקופיות. עבור פרוקסידאז צביעת, המדגם עשוי לדרוש צעדים נוספים כדי לבטל את המסכה על כריכת נוגדנים, כולל דפפיזציה ו אנטיגן retrieveal25,26. יש לזכור כי קיבעון יתר יכול לגרום מיסוך האפירופה, בעוד הקיבעון התחתון יכול לגרום מעט לא אות חיובי עם כתמים בקצה כבד.

חסימה והפחתת רקע

בשיטה הפרוקסידאז, הזיקה הגבוהה של אבידין עבור ביוטין היא כנראה אחראי על הייצור המהיר של כתמים ברקע. יתר על כן, מאז תגובת avidin-biotin בלתי הפיך, הרקע לא ניתן להסיר18,27. במהלך IHC, הרקע הגבוה יכול גם להיות מיוצר על ידי קשירה לא ספציפית לביודוגני רקמה ביולוגית. הידרופובי ואינטראקציות יונית (כגון אלה המיוצרים על ידי קולגן ורקמות חיבור אחרות כגון אפיתל ו adipocytes), כמו גם פעילות אנזימים אנדוגניים, הם גורמים עיקריים של כתמים ברקע. ביוטין אנדודוגני או אנזימים וכריכת הידרופובי חייב להיות ממוזער לפני כתמים נוגדן, אשר ניתן להשיג על ידי תוספת של חומרי ניקוי, כגון טריטון X-100, במאגרי חסימת28.

השימוש ב-0.3%-0.4% טריטון X-100 במאגרי החסימות גם מאפשר חדירות מלאות של הנוגדנים לתוך מקטעי הרקמה. יתר על כן, למרות שנוגדנים מעדיפים להיות מיוחדים עבור אפירופה אחד, קשירה חלקית לאתרים על חלבונים שאינם ספציפיים אפשרית, המובילה לצביעת הרקע הגבוה29. האיגודים הלא ספציפיים יכולים להסוות את האות של אנטיגן היעד30. כדי להפחית כתמים ברקע שאינם ספציפיים, יש להשחיז דגימות באמצעות מאגר החוסם אתרים לא מוגדרים. מאגרי חסימה נפוצים כוללים סרום רגיל או סרום בקון30. מינים של סרום חוסם צריך להיות זהה למארח של הנוגדן המשני. מומלץ לקבוע את זמן הדגירה הטוב ביותר. ריכוז הסרום הרגיל במאגר החסימות הוא עוד קביעה חשובה של31. יתרה מזאת, כדי לסלק את הצביעת הרקע, חיוני להשתמש בדילול האופטימלי של הנוגדנים הראשיים והמשניים. לכן, יש לבחור זמן דגירה בזהירות, בנוסף לטמפרטורה (כלומר, להגדיל את הזמן אם ביצוע ב -4 ° c, להקטין את הזמן אם ב RT) ומערכת האיתור.

בחירת נוגדן

מבחר הנוגדנים לצביעת IHC חשוב ויכול להשפיע על התוצאה הניסיונית32. כדי להבטיח כי הנוגדן יגיב כראוי, את האפיפי המזוהה על ידי זה חייב להיחשב. הבנת החלבון היעד ואת תפקידה, רקמות ולוקליזציה subcellular, והאם עובר שינויים לאחר ההעברה יכול לעזור לקבוע את הבחירה של נוגדן. צעד חשוב נוסף הוא בדיקה של ריכוזים שונים של נוגדן ראשי/משני כדי לשמור על הרקע ואת aspecificity ברמה מינימלית תואמת לאות מסוים. יתר על כן, חשוב לבדוק את המינים מחדש כדי לאשר תאימות נוגדן ראשוני ומשני ואת היכולת של הנוגדן העיקרי כדי לזהות את היעד אנטיגן בקונפורמציה יליד שלה. צעד חשוב נוסף עבור בחירת הנוגדן העיקרי הוא יישור גנטי. הדבר מבטיח כי הנוגדן העיקרי מגיב עם הסמנים של הריבית ומספק מידע על האפירופה מוכר על ידי הנוגדן במודל חיה ספציפי. היישור גנטי גם מספק את האפשרות של בחירת נוגדנים מסוגל לזהות את האפיסקופים כי הם שנשמרים האבולוציה.

פקדים

כדי להבהיר ספציפיות של הנוגדנים, היבט חשוב הוא הביצועים של הפקדים, אשר מאפשר זיהוי של כתמים ספציפיים. הפקדים כוללים: i) רקמה הידועה לבטא את האנטיגן כשליטה חיובית; ii) רקמה הידועה שלא לבטא את האנטיגן כשליטה שלילית; iii) השמטה של הנוגדן העיקרי או ספיגת הנוגדן העיקרי עם פפטיד ספציפי כדי לאשר את הנוגדן המשני אינו מגיב עם רכיבי רקמות אחרים14,33.

בטכניקות IHC, מספר שלבים עלולים לגרום לבעיות לפני השגת ההכתמים הסופיים. מכתים רקע חזק וכתמים לא ספציפי אנטיגן היעד יכול להיגרם על ידי ביוטין אנדודוגני או הראשי/משני נוגדן החוצה פעילות ופעילות אנזימים עניים או הנוגדן העיקרי הנוגדנים, בהתאמה. מכתים רקע ואיגוד לא ספציפי ניתן למנוע על ידי חסימת אנזימים אנדוגניים לפני הדגירה עם הנוגדן העיקרי. שימוש בסרום רגיל הוא הדרך הטובה ביותר לחסום אינטראקציות לא ספציפיות30. בחירת המאגר החוסם תלויה בשיטת הזיהוי שבשימוש. יתר על כן, רקמה ידוע חוסר הביטוי של אנטיגן היעד כמו שליטה שלילית יכול לפעול כהתייחסות כדי לקבוע את כמות הרקע מכתים34. התצהיר של האות כרומוגניים או הניאון בפקד שלילי מאשר נוכחות של כתמים לא ספציפיים. יתר על כן, מספיק חסימת זמן חסימת מוביל לרקע גבוה, בעוד חסימת מוגזמת מוביל לאות נמוך35.

ב פרוקסידאז כתמים, הנוכחות של peroxidase אנדוגניים ברקמה היא גורם נוסף של העדות רקע חום. הטיפול עם H2O2 לפני הדגירה עם הנוגדן העיקרי חוסם את peroxidase האנדודוגני36,37. להיפך, בעזרת האימונולובורציה, הקיבעון ממלא תפקיד מרכזי ביצירת האוטואונטית. כדי למנוע התאמה אוטומטית, שיטת הקיבעון הטובה ביותר, זמן קיבעון, והכנת רקמות יש לבחור בקפידה. שלב קריטי נוסף של IHC הוא אימות של הנוגדן העיקרי. נוגדן נחשב תקף אם הוא מייצר דפוס עקבי וספציפי מכתים ברקמות מסוים או תא/subcellular הרכיבים, אם הספיגה מראש של הנוגדן העיקרי עם פפטיד ספציפי לא להניב מכתים38. ב immunofluorescence כריכה לא ספציפית מראה את עוצמת פלורסנט דומה תחת שלושה גלאי צבע ניאון, בעוד האות הוא משתנה מאז מצוכי שונים מובפים נוגדנים משניים משמשים. היבטים אלה של הכנת רקמות IHC וכתמים נוגדן חייב להיות ממוען כדי להתגבר על בעיות הצביעת.

IHC, אם כי טכניקה פשוטה יחסית, מציגה מספר מגבלות ותלויות בגורמים רבים39. אחת הנקודות הקריטיות היא קיבעון פורמלין, אשר יכול לשנות את הביטוי של שלאחר תרגום חלבונים ששונו. מצד שני, הרקמות הקבועות של הפרפין-מוטבע ניתן לאחסן לטווח ארוך בטמפרטורת החדר, בעוד רקמות קפואות ניתן לאחסן עד שנה אחת בלבד-80 ° c. יתר על כן, רקמות קפואות יכול להיפגע על ידי היווצרות של גבישי קרח, אשר יכול להשפיע על הפרטים subcellular שינוי ihc כתמים40,41. לגבי המחקרים שלנו, ההיבט הקשה ביותר היה למצוא נוגדנים העיקרי מסוים נגד מולקולות של דג דג זברה. למרות הוכרה דג זברה כמודל חיה תקף עם מידה שימור מאוד של מבנה, נוגדנים מעט מאוד פותחו שיכולים לזהות חלבונים ספציפיים ומולקולות אחרות ב-דג זברה. כדי להתגבר על מגבלות אלה, חשוב לאמת את הנוגדנים על ידי ניתוח בלוק מערבי ויישור גנטי.

העניין הגובר בשיטות IHC הוביל להתפתחות של מכתים מאוד מיוחד שיכול לעזור לימודי החקירה42. IHC נמצא בשימוש עם תדר גובר כדי לזהות את נוכחותם של סמנים מולקולריים ספציפיים והשינויים שלהם על פני הפתווגיות שונות. שתי הגישות מומחשות כאן, הפרוקסידאז והאימונולובורנציה, יש יתרונות בהתאמה וחסרונות43. פרפין-רקמה מוטבעת, המשמש בטכניקת פרוקסידאז, יכול לאפשר ברזולוציה גבוהה של תאים ורקמות ולחשוף פרטים על התפלגות כמות היעד של חלבונים44,45. עם זאת, פרפין רקמות מוטבע אינם מתאימים לimmunofluorescence מאז הפרפין יכול להסוות את האנטיגניות ולהוביל46הזריחה לא ספציפית. מצד שני, קריוחלק של רקמת התחתית שומר על נוגדי הרקמה האנדוגניים ולהוביל ירידה בזריחה לא ספציפית. גם אם האיכות הטכנית של הקריודורים נמוך בהרבה מזה של הרקמה המוטבעת פרפין, הם יכולים להניב תוצאות חוקיות באמצעות טכניקת IHC47.

יתר על כן, בעוד הטבעה פרפין טוב יותר לשמר פרטים מורפולוגיים, הקפאה שומרת על אנזימים וביטוי אנטיגן, המוביל להכתמים חיסוני מפורט יותר. הטכניקה החיסונית מאפשרת גם גילוי עכשווי של שניים או שלושה biomolecules שונים, חשיפת האינטראקציות האפשריות, כפי שמודגם בעבודה הקודמת שלנו עבור orexin ומערכות אנדוקנביאיד10. בין הטכניקות המשמשות כדי לזהות את התפלגות ורמות של biomolecules ספציפי, IHC מאפשר לא רק את ההגדרה של ביטוי מורפולוגי ספציפי והפצה של מולקולות וחלבונים, אלא גם את האפשרות לבצע כמותי ניתוח.

באמצעות immunofluorescence, התפלגות הcodistribution של biomolecules יכול גם להיות מובן יותר, כמו גם האינטראקציות האפשריות והשינויים שלהם במקרים של הפתווגיות שונות48. מיקרוסקופיה קונפוקלית, במהלך 20 השנים האחרונות, משמשת לעתים קרובות לחקר התפלגות תאית ומשנית של חלבונים רבים במוח היונקים. מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית מאפשר גם את ההדמיה (באמצעות fluorophores או צבעי פלורסנט) של מבנים ספציפיים של עניין, כגון חלבונים, אורגלים, וחומר ביולוגי אחר; אותות כאלה ניתן להשתמש הן קבוע מערכות ביולוגיות לחיות מבנים ספציפיים התמונה משנה49. הפונקציה המודולטית הפוטנציאלית של biomolecules בתאי תא ספציפיים ניתן לחקור באמצעות ויזואליזציה של דפוסי הביטוי שלהם, בעוד התפקיד של איתות חלבון בתוך הרקמות עשוי להיות נחשף באמצעות התפלגות נוירואנטומית של ביטוי אנזים מטבולית או קולטנים.

העבודה הטכנית המוצגת מציגה גישות ihc, בעיקר אימונולובורנציה, כדי ללמוד שתי מערכות שמרו במידה רבה, orexin ו אנדוקנביאיד, במודל מבוגר דג זברה. בפרט, ניתן להשתמש בשיטות immunofluorescence כדי לקבוע את ההתפלגות, הסכום היחסי ואינטראקציות אנטומיות של חלבונים ספציפיים ברקמות היעד. הקפאה של הרקמות הכנופנה כדאי לשמר חלבונים רגישים מאוד הרגישים להתדרדרות מהירה. יתר על כן, הקריוגנית נחשבת לשמור טוב יותר אנטיגן ואנטי, והוא מאפשר ללמוד שלאחר תרגום חלבונים שונה DNA.

גם אם רקמות קפואות (לעומת מקטעים פרפין-מוטבע) הם עבים יותר, אשר הסלים את היכולת להתבונן מורפולוגיה רקמות בפירוט, מיקרוסקופ קונפוקלית מאפשר הדמיה לדוגמה בפירוט רב ומגביר את יכולות ההדמיה. יתרה מזאת, ניתן להשתמש בimmunofluorescence לניתוח כמותי של עוצמת הצביעה, וניתוח הדסיטומטלי של האות מספק נתונים כמותיים. זה מאפשר לקבוע קשרים עם רמות האות fluorochrom עם רמות ביטוי חלבון על ידי התבוננות באזורים של לוקליזציה שיתוף. עבודה זו מתארת וממחישה פרוטוקולים שיכולים לשמש לחקר השימור האבולוציוני של חלבונים חשובים ב-zebrafish המבוגר. השימוש ihc, בעיקר immunofluorescence, בוגרים דג זברה יכול לעזור להדגיש את התועלת של מודל זה בעלי חיים בחקר הביטוי מורפולוגית והפצה של biomolecules שימור מאוד, כמו גם לחשוף שינויים אפשריים ברחבי תנאים פתולוגיים שונים הקשורים לphysiopathology האנושי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אינם מצהירים על ניגודי אינטרסים.

Acknowledgments

מחקר זה היה נתמך על ידי Fondi Ricerca די Ateneo (FRA) 2015-2016, אוניברסיטת סאנניו.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti CB1 Abcam ab23703
Anti OX-2R Santa Cruz sc-8074
Anti-OXA Santa Cruz sc8070
Aquatex Merck 1,085,620,050
Biotinylated rabbit anti-goat Vector Lab BA-5000
citric acid Sigma Aldrich 251275
Confocal microscope Nikon Nikon Eclipse Ti2
Cryostat Leica Biosystem CM3050S
DAPI Sigma Aldrich 32670
Digital Camera Leica Biosystem DFC320
Digital Camera for confocal microscope Nikon DS-Qi2
Donkey anti goat Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A11055
Donkey anti goat Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A11058
Donkey anti rabbit Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A21206
Donkey anti rabbit Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A21207
Ethanol absolute VWR 20,821,330
Frozen section compound Leica Biosystem FSC 22 Frozen Section Media
H2O2 Sigma Aldrich 31642
HCl VWR 20,252,290
ImmPACT DAB Vector lab SK4105
Microscope Leica Biosystem DMI6000
Microtome Leica Biosystem RM2125RT
Na2HPO4 Sigma Aldrich S9763
NaCl Sigma Aldrich S7653
NaH2PO4H2O Sigma Aldrich S9638
NaOH Sigma Aldrich S8045
Normal Donkey Serum Sigma Aldrich D9663
Normal Rabbit Serum Vector lab S-5000
paraffin wax Carlo Erba 46793801
Paraphormaldeyde Sigma Aldrich P6148
sodium citrate dihydrate Sigma Aldrich W302600
Triton X-100 Fluka Analytical 93420
Trizma Sigma Aldrich T1503
VectaStain Elite ABC Kit Vector lab PK6100
Xylene Pure Carlo Erba 392603

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brandtzaeg, P. The increasing power of immunohistochemistry and immunocytochemistry. Journal of Immunological Methods. 216, 49-67 (1998).
  2. Haines, D. M., West, K. H. Immunohistochemistry: forging the links between immunology and pathology. Veterinary Immunology and Immunopathology. , 151-156 (2005).
  3. Onul, A., et al. Application of immunohistochemical staining to detect antigen destruction as a measure of tissue damage. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 60 (9), 683-693 (2012).
  4. Ramos-Vara, J. A. Technical aspects of immunohistochemistry. Veterinary Pathology. 42 (4), 405-426 (2005).
  5. Coons, A. H., Kaplan, M. H. Localization of antigen in tissue cells, II: improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. The Journal of Experimental Medicine. 91 (1), 1-13 (1950).
  6. Coons, A. H., Leduc, E. H., Connolly, J. M. Studies on antibody production, I: a method for the histochemical demonstration of specific antibody and its application to a study of the hyperimmune rabbit. The Journal of Experimental Medicine. 102 (1), 49-60 (1955).
  7. Ramos-Vara, J. A., Miller, M. A., et al. When tissue antigens and antibodies get along: revisiting the technical aspects of immunohistochemistry--the red, brown, and blue technique. Veterinary Pathology. 51 (1), 42-87 (2014).
  8. Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M. Applications of immunohistochemistry. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 2 (Suppl 2), S307-S309 (2012).
  9. Al-Hussinee, L., et al. Immunohistochemistry and pathology of multiple Great Lakes fish from mortality events associated with viral hemorrhagic septicemia virus type IVb. Diseases of Aquatic Organisms. 93 (2), 117-127 (2011).
  10. Imperatore, R., et al. Overlapping Distribution of Orexin and Endocannabinoid Receptors and Their Functional Interaction in the Brain of Adult Zebrafish. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 62 (2018).
  11. Concas, A., et al. Immunochemical Localization of GABAA Receptor Subunits in the Freshwater Polyp Hydra vulgaris. Neurochemical Research. 41 (11), 2914-2922 (2016).
  12. Mania, M., et al. Expression and distribution of leptin and its receptors in the digestive tract of DIO (diet-induced obese) zebrafish. Annals of Anatomy. , 37-47 (2017).
  13. Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomarker Insights. 5, 9-20 (2010).
  14. Holmseth, S., et al. Specificity controls for immunocytochemistry: the antigen preadsorption test can lead to inaccurate assessment of antibody specificity. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 60 (3), 174-187 (2012).
  15. Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (1), 6-12 (2011).
  16. Hsu, S. M., Soban, E. Color modification of diaminobenzidine (DAB) precipitation by metallic ions and its application for double immunohistochemistry. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 30 (10), 1079-1082 (1982).
  17. Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. The emerging use of zebrafish to model metabolic disease. Disease Models & Mechanisms. 6 (5), 1080-1088 (2013).
  18. Hsu, S. M., Raine, L., Fanger, H. Use of avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques: a comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 29 (4), 577-580 (1981).
  19. Cristino, L., et al. Obesity-driven synaptic remodeling affects endocannabinoid control of orexinergic neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (24), E2229-E2238 (2013).
  20. Imperatore, R., et al. Genetic deletion of monoacylglycerol lipase leads to impaired cannabinoid receptor CBR signaling and anxiety-like behavior. Journal of Neurochemistry. 135 (4), 799-813 (2015).
  21. Laperchia, C., et al. The excitatory/inhibitory input to orexin/hypocretin neuron soma undergoes day/night reorganization. Brain Structure and Function. 222 (8), 3847-3859 (2017).
  22. Eltoum, I., Fredenburgh, J., Grizzle, W. E. Advanced concepts in fixation: 1. Effects of fixation on immunohistochemistry, reversibility of fixation and recovery of proteins, nucleic acids, and other molecules from fixed and processed tissues. 2. Developmental methods of fixation. Journal of Histotechnology. 24 (3), 201-210 (2001).
  23. Mueller, C., et al. One-step preservation of phosphoproteins and tissue morphology at room temperature for diagnostic and research specimens. Public Library of Science One. 6 (8), e23780 (2011).
  24. Howat, W. J., Wilson, B. A. Tissue fixation and the effect of molecular fixatives on downstream staining procedures. Methods. 70 (1), 12-19 (2014).
  25. Dupre, M. P., Courtade-Saidi, M. Immunocytochemistry as an adjunct to diagnostic cytology. Annales de Pathologie. 32 (6), 433-437 (2012).
  26. Shi, S. R., Liu, C., Taylor, C. R. Standardization of Immunohistochemistry for Formalin-fixed, Paraffin-embedded Tissue Sections Based on the Antigen Retrieval Technique: From Experiments to Hypothesis. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 39, 741-748 (2006).
  27. Giorno, R. A comparison of two immunoperoxidase staining methods based on the avidin-biotin interaction. Diagnostic Immunology. 2 (3), 161-166 (1984).
  28. Ramos-Vara, J. A., Saeteele, J. Immunohistochemistry. Making and Using Antibodies: A Practical Handbook. Howard, G. C., Kaser, M. R. , CRC Press. Boca Raton, FL. 273-314 (2007).
  29. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
  30. Buchwalow, I., Somoloiva, V., Boecker, W., Tiemann, M. Nonspecific binding of antibodies in immunohistochemistry: fallacies and facts. Scientific Reports. 1, 28 (2011).
  31. Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohistochemistry and multiple labeling with antibodies from the same host species to study adult hippocampal neurogenesis. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
  32. Kalyuzhny, A. E. The dark side of the immunohistochemical moon: industry. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 57 (12), 1099-1101 (2009).
  33. Hewitt, S. M., Baskin, D. G., Frevert, C. W., Stahl, W. L., Rosa-Molinar, E. Controls for immunohistochemistry: the Histochemical Society's standards of practice for validation of immunohistochemical assays. Endocrinology. 155 (3), 676-687 (2014).
  34. Ivell, R., Teerds, K., Hoffman, G. E. Proper application of antibodies for immunohistochemical detection: antibody crimes and how to prevent them. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 62 (10), 693-697 (2014).
  35. Stradleigh, T. W., Ishida, A. T. Fixation strategies for retinal immunohistochemistry. Progress in Retinal and Eye Research. 48, 181-202 (2015).
  36. Boi, G., Scalia, C. R., Gendusa, R., Ronchi, S., Cattoretti, G. Disaccharides Protect Antigens from Drying-Induced Damage in Routinely Processed Tissue Sections. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (1), 18-31 (2016).
  37. Curran, R. C., Gregory, J. Demonstration of immunoglobulin in cryostat and paraffin sections of human tonsil by immunofluorescence and immunoperoxidase techniques. Effects of processing on immunohistochemical performance of tissues and on the use of proteolytic enzymes to unmask antigens in sections. Journal of Clinical Pathology. 31 (10), 974-983 (1978).
  38. O'Hurley, G., et al. Garbage in, garbage out: a critical evaluation of strategies used for validation of immunohistochemical biomarkers. Molecular Oncology. 8 (4), 783-798 (2014).
  39. Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomarker Insights. 5, 9-20 (2010).
  40. Mayersbach, H. V. Principles and limitations of immunohistochemical methods. Journal of Royal Microscopical Society. 87 (2), 295-308 (1967).
  41. Shi, S. R., Liu, C., Taylor, C. R. Standardization of immunohistochemistry for formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections based on the antigen-retrieval technique: from experiments to hypothesis. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 55 (2), 105-109 (2007).
  42. Dixon, A. R., et al. Recent developments in multiplexing techniques for immunohistochemistry. Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (9), 1171-1186 (2015).
  43. Mölne, J., Breimer, M. E., Svalander, C. T. Immunoperoxidase versus immunofluorescence in the assessment of human renal biopsies. American Journal of Kidney Diseases. 45 (4), 674-683 (2005).
  44. Gerdes, M. J., et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11982-11987 (2013).
  45. Zhang, P., Lehmann, B. D., Shyr, Y., Guo, Y. The Utilization of Formalin Fixed-Paraffin-Embedded Specimens in High Throughput Genomic Studies. International Journal of Genomics. , 1926304 (2017).
  46. Xie, R., et al. Factors influencing the degradation of archival formalin-fixed paraffin-embedded tissue sections. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (4), 356-365 (2011).
  47. Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).
  48. Drummen, G. P. Fluorescent probes and fluorescence (microscopy) techniques--illuminating biological and biomedical research. Molecules. 17 (12), 14067-14090 (2012).
  49. Marks, K. M., Nolan, G. P. Chemical labeling strategies for cell biology. Nature Methods. 3 (8), 591-596 (2006).

Tags

ביוכימיה סוגיה 148 אימונוהיסטוכימיה פרוקסידאז קולטן orexin קולטן אנדוקנביאיד המוח דג זברה דג זברה המעי
זיהוי של הקולטנים Orexin ו אנדוקאנאיאיד ב בוגרים Zebrafish באמצעות פרוקסידאז ואימונוofloroiסנס שיטות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Imperatore, R., D'Angelo, L., De… More

Imperatore, R., D'Angelo, L., De Girolamo, P., Cristino, L., Paolucci, M. Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods. J. Vis. Exp. (148), e59308, doi:10.3791/59308 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter