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Biology

Differenzierung-Kapazität des menschlichen Aortenklappe perivaskuläre Fettgewebe Vorläuferzellen

Published: March 5, 2019 doi: 10.3791/59337
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Maine Medical Center Research Institute

Summary

Das Ziel dieses Protokolls ist, die Fähigkeit der Vorläuferzellen aus menschlichen perivaskuläre Fettgewebe abgeleitet, in mehrere Linien der Zelle differenzieren zu testen. Differenzierung war im Vergleich zu mesenchymalen Stammzellen aus menschlichen Knochenmark, die bekanntlich in Adipocyte, Osteocyte und Knorpelzelltransplantation Abstammungen zu differenzieren.

Abstract

Fettgewebe ist eine reiche Quelle von Multi-potenten mesenchymalen Stammzellen (MSC) in der Lage, Differenzierung in osteogene, adipogenen und Chondrogenic Linien. Adipogenen Differenzierung der Progenitorzellen ist ein wichtiger Mechanismus fahren Fettgewebe Expansion und Dysfunktion als Reaktion auf Adipositas. Verständnis Änderungen perivaskuläre Fettgewebe (PVAT) ist somit klinisch relevante in Stoffwechselerkrankung. Frühere Studien wurden jedoch überwiegend in der Maus und anderen Tieren durchgeführt Modelle. Dieses Protokoll verwendet humanen thorakale PVAT Proben von Patienten mit koronarer Bypassoperation Transplantat gesammelt. Fettgewebe aus der Aorta ascendens wurde gesammelt und verwendet für die Explantation der Stromazellen vaskulären Bruch. Wir zuvor bestätigt das Vorhandensein von adipösen Vorläuferzellen in menschlichen PVAT mit der Fähigkeit, sich in Lipid-haltigen differenzieren Adipozyten. In dieser Studie analysierten wir weiter die Differenzierung Potential der Zellen von den Stromazellen vaskulären Bruch, vermutlich mit Multi-potenten Vorläuferzellen. Wir verglichen PVAT gewonnenen Zellen menschlichen Knochenmark MSC für Unterscheidung in adipogenen, osteogene, und Chondrogenic Linien. Nach 14 Tagen der Differenzierung, bestimmte Flecken waren ausgelastet, um Lipid-Akkumulation in Adipozyten (Öl rot O), zu erkennen Schulterarthrose Ablagerungen in knochenbildenden Zellen (Alizarin rot) oder Glykosaminoglykane und Kollagen in den Chondrogenic Zellen (Masson Trichrome). Während des Knochenmarks MSC effizient in allen drei Linien differenziert, PVAT abgeleitete Zellen hatten adipogenen und Chondrogenic Potenzial, aber es fehlte ihm robuste osteogene Potenzial.

Introduction

Fettgewebe ist eine reiche Quelle von Multi-potenten mesenchymalen Stammzellen (MSC) in der Lage, Differenzierung in osteogene, adipogenen und Chondrogenic Linien1. Dieses Gewebe wird erweitert durch Hypertrophie der Reifen Adipozyten und de Novo Differenzierung von resident MSC zu Adipozyten. Perivaskuläre Fettgewebe (PVAT) umgibt den Blutgefäßen und regelt die Gefäßfunktion2,3. Adipositas-induzierte PVAT Erweiterung verschärft die Herz-Kreislauf-Krankheiten. Während der multipotente Potenzial von MSC aus menschlichen Subkutane Fettgewebe-Depots wurden gut untersuchte4,5, haben keine Studien explantiert und bewertet die Differenzierung Kapazität des menschlichen PVAT abgeleitet Vorläuferzellen, wahrscheinlich aufgrund die Invasivität der Beschaffung. Ziel dieser Arbeit ist es daher, liefern eine Methodik um explant und Vorläuferzellen aus menschlichen Aortenklappe PVAT von Patienten mit einer kardiovaskulären Erkrankung zu verbreiten und ihre Neigung zu knochenbildenden unterscheiden, Chondrogenic und adipogenen Linien zu testen. Unsere PVAT ist von der Website der Anastomose der Bypass-Prothese auf aufsteigende Aorta von adipösen Patienten mit koronarer Bypassoperation Transplantat. Frisch isolierte PVAT wird enzymatisch dissoziierten und Stromazellen vaskuläre Bruch ist isoliert und propagiert in-vitro-, ermöglicht uns, zum ersten Mal die Differenzierung Kapazität des menschlichen PVAT abgeleitet Vorläuferzellen zu testen.

Mit primären kultivierten menschlichen PVAT Stromazellen vaskulären Bruchteil, testeten wir drei Assays entwickelt, um Stammzellen/Vorläuferzellen in Richtung adipogenen, osteogene, oder Chondrogenic Linien unterscheiden zu induzieren. Unsere vorherige Studie identifiziert eine Bevölkerung von CD73 + CD105 + und PDGFRa + (CD140a) Zellen, die robust in Adipozyten6, differenzieren können, obwohl ihre Multipotenz nicht getestet wurde. PVAT regelt direkt vaskulären Ton und Entzündungen7. Die Begründung für die Prüfung der Differenzierung Potenzial dieser neuartigen Zellpopulation ist zu beginnen, der spezialisierten Einfluss der PVAT auf Gefäßfunktion und Mechanismen der PVAT Expansion während Fettleibigkeit zu verstehen. Diese Methode erhöht unser Verständnis der Funktionen von Fettgewebe abgeleitete Vorläuferzellen und ermöglicht es uns, zu identifizieren und vergleichen Sie Gemeinsamkeiten und Unterschiede der Vorläuferzellen aus verschiedenen Gewebe Quellen. Wir bauen auf etablierte und validierten Ansätze zum isolieren und Differenzierung von MSC auf verschiedenen Linien und optimieren Verfahren um die Lebensfähigkeit des menschlichen PVAT abgeleitet Vorläuferzellen zu maximieren. Diese Techniken haben breite Anwendungen in den Bereichen von Stamm- und Vorläuferzellen Zelle Forschung und Fettgewebe.

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Protocol

Die Verwendung von menschlichen Geweben in dieser Studie wurde bewertet und genehmigt durch die institutionelle Review Board of Maine Medical Center, und alle Mitarbeiter erhalten entsprechenden Ausbildung vor Experimenten.

1. Vorbereitungen

  1. Dissoziation-Puffer zu machen 50 mg Neuaufbau tierversuchsfreie Kollagenase/Dispase Mischung von ich Lösung mit 1 mL Nanopure H2O. Prepare 1 mg/mL Lösung durch Zugabe von 49 mL hohe Glukose DMEM mit 1 % w/V BSA, rekonstituierte Kollagenase / Dispase Lösung. Speichern Sie 5 mL arbeiten Aliquote bei-20 ° C und Warm auf 37 ° C mit einer Wasser-Bad-vor um zu verwenden.
  2. Antibiotische Lösung 49 mL HBSS 1 mL 100 X Antibiotikum/antimykotische Lösung (Endkonzentration ist 200 Einheiten/mL Penicillin, 200 Einheiten/mL Streptomycin und 0,5 µg/mL Fungizone) hinzu, und speichern auf dem Eis.
  3. Gelatine-Lösung (0,2 % w/V) durch Auflösen von 200 mg Gelatine aus bovine Haut in 100 mL Nanopure H2O. Autoklaven die Lösung für 20 min Vorbereitung und Lagerung bei 4 ° C.
  4. 500 mL PVAT Wachstumsmedien vorbereiten: hohe Glukose DMEM/F12 mit Glutamin ergänzen, Natrium Pyruvat und Natriumbicarbonat, ergänzt mit 10 % FBS und 100 µg/mL antimikrobieller Wirkstoff (siehe Tabelle der Materialien).
  5. Bereiten Sie 50 mL adipogenen Induktion Medien: 40,8 mL hohe Glukose DMEM, ergänzt mit 7,5 mL PVAT Wachstumsmedien, 500 µL 100 x Antibiotikum/antimykotische Lösung (Endkonzentration ist 100 Einheiten/mL Penicillin, 100 Einheiten/mL Streptomycin und 0,25 µg/mL Fungizone), 0,5 mM IBMX (500 mM Lager in 0,1 M NaOH), 1 µM Dexamethason (1 mM Lager in Ethanol), 5 µM Rosiglitazon (5 mM lieferbar in DMSO) 33 µM Biotin (66 mM Lager in DMSO), 100 nM Insulin (200 µM bestand in 0,1 % Essigsäure) und 20 µM Pantothensäure (100 mM Lager in H2 (O).
  6. Vorbereiten der adipogenen Linie 50 mL Steuermedien Induktion: 40,8 mL hohe Glukose DMEM mit 7,5 mL PVAT Wachstumsmedien und 500 µL des Stift-Strep (100 X bestand) ergänzt.
  7. Bereiten Sie 50 mL adipogenen Wartung Medien: 41,5 mL hohe Glukose DMEM ergänzt mit 7,5 mL PVAT Wachstumsmedien aus Schritt 1.3, 500 µL Stift-Strep (100 X bestand), 1 µM Dexamethason (1 mM Lager in EtOH), 33 µM Biotin (66 mM Lager in DMSO), 100 nM Insulin (200 µM bestand in 0,1 % Ac Schulrhythmus Säure), und 20 µM Pantothensäure (100 mM Lager in H2O).
  8. Die knochenbildenden und Chondrogenic Linien 500 mL Wachstumsmedien vorbereiten: hohe Glukose αMEM ergänzt mit 10 % FBS, 1 X Glutamin ergänzen (siehe Tabelle der Materialien), und 5 mL Stift-Strep (100 X bestand).
  9. Der knochenbildenden Linie 50 mL der Induktion Medien vorbereiten: 50 mL Knochenmark MSC Wachstumsmedien mit 10 nM Dexamethason und 10 mM β-Glycerophosphat ergänzt.
  10. Der Chondrogenic-Linie 50 mL der Induktion Medien vorbereiten: 50 mL Knochenmark MSC Wachstumsmedien mit 100 nM Dexamethason, 50 µg/mL Natrium Ascorbat-2-Phosphat und 10 ng/mL TGFβ1 ergänzt. Für die knochenbildenden und Chondrogenic Bedingungen dienen der basalen Knochenmark MSC Wachstumsmedien als Medien-Induktion.

2. Protokoll 1: Kultur menschlichen PVAT Zellen von den Stromazellen vaskulären Bruch

Hinweis: PVAT ist von der Website des Transplantats Anastomose auf die Aorta ascendens narkotisierten Patienten mit koronarer Bypass-Angioplastie reseziert. Aorta PVAT ist platziert in einem 15 mL konisch mit 10 mL Eis kalt hohe Glukose DMEM-F12 und an das Labor innerhalb 2 h nach Resektion von den OP-Saal übertragen. Aorta PVAT ist ausrangierte Gewebe während Bypass-Verfahren und hielt als nicht-menschlichen Themen Forschung durch interne Revisionsabteilung Maine Medical Center.

  1. Dieses Protokoll ist für ein ~ 500 mg Stück menschlichen PVAT (ca. 3 x 1 x 0,5 cm3). Übertragen Sie frische menschliche PVAT von DMEM auf eine 50 mL konische Röhrchen mit 25 mL antibiotische Lösung. Mit rockigen für 20 min bei 4 ° c inkubieren Während die PVAT in antibiotische Lösung ist, Tauwetter ein Aliquot der Dissoziation Puffer bei 37 ° C.
  2. 5 mL Dissoziation Puffer 50 µL 100 X Antibiotikum/antimykotische Lösung hinzu und mit einem 0,22 µm Spritze Filter zu sterilisieren. 1 auch von einer 24-Well-Platte 1 mL Gelatine-Lösung hinzufügen. Verwenden Sie in einer Laminar-Flow-Kapuze sterile Pinzetten und Scheren, um PVAT aus der antibiotischen Lösung auf eine sterile Petrischale zu übertragen. Fügen Sie 1 mL vorgewärmten Dissoziation Puffer des Gewebes und fein hacken das gesamte Gewebe in einer Aufschlämmung (kein Stück größer als ~ 2 x 2 mm-2) mit sterilen Zange und Schere Dissektion.
  3. Übertragen Sie die Gülle 1 mL auf 4 mL Dissoziation Puffer und inkubieren Sie das Rohr auf die Seite in einem vorgewärmten 37 ° C Orbitalschüttler bei 200 u/min für 1 h. Nach 1 h keine sichtbare Gewebe Stücke werden anwesend sein, und die Lösung erscheint als eine trübe Zellsuspension.
  4. Filtern Sie die Lösung durch ein 70 µm Zelle Sieb oben auf eine 50 mL konische Rohr gesetzt. Spülen Sie das Sieb mit einer zusätzlichen 10 mL antibiotische Lösung, so viele Zellen wie möglich zu erfassen. Quetschen Sie das Sieb nicht.
  5. Pellet-Zellen für 12 min bei 300 X g in einer schwingenden Eimer-Zentrifuge.
    Hinweis: Nach Zentrifugation wird das Rohr in einer fetthaltigen Deckschicht aus Adipozyten, eine Interphase und ein Pellet unterteilt werden. Die Kugel ist die stromale vaskulären Fraktion mit endothelial Zellen, Blutkörperchen, Immunzellen und Vorläuferzellen.
  6. Das Pellet in 10 mL HBSS und Zentrifuge für 5 min bei 300 X gaufzuwirbeln. Wiederholen Sie diesen Schritt für eine Gesamtmenge von 2 Wäschen in HBSS. Lösen Sie die roten Blutkörperchen nicht nach dem letzten waschen. Wiederholte Versuche mit mehreren kommerziell verfügbare Puffer und Inkubationszeiten führten zu einem deutlichen Rückgang Stammvater Zellhaftung und Lebensfähigkeit.
  7. Aspirieren Sie Gelatine aus 24-Well-Platte. Waschen Sie vorsichtig und 1 X mit HBSS, ungebundenen Gelatine zu entfernen.
  8. Aufschwemmen Stromazellen vaskulären Bruchteil Pellet mit intakten Erythrozyten in 1 mL Wachstumsmedien und Saatgut auf die Gelatine beschichtet gut. Hinzu kommt eine Endkonzentration von 25 ng/mL im Kulturmedium menschlichen FGF2 (Nukleinsäuretablette in PBS ergänzt mit 0,01 % BSA w/V). 24 h bei 37 ° C mit 5 % CO2inkubieren.
  9. Am nächsten Tag Brunnen Wachstumsmedien entfernen und waschen 5 X mit HBSS, roten Blutkörperchen und abgestorbene Zellen zu entfernen. Fügen Sie in 1 mL frisches Wachstumsmedien mit 25 ng/mL FGF2 ergänzt.
  10. Wechseln Sie das Medium alle 48 h, achten Sie darauf, mit 25 ng/mL ergänzen frische FGF2 jedes Mal.
  11. Zellen zu 100 % Zusammenfluss erreichen in der Regel 7-10 Tage nach Explant; Durchgang Zellen dann:
    1. Aspirieren Wachstum Medien und waschen monomolekularen Film 2 X in 1 mL HBSS. Aspirieren Sie alle HBSS aus dem Brunnen und Tropfen Sie ein paar der Zelle Dissoziation Lösung.
    2. Tippen Sie auf und wirbeln die Platte mehrmals und Inkubation bei 37 ° C mit 5 % CO2 für 5 – 7 min um die Zellen zu heben. Die freistehenden Zellen ~ 1 mL frisches Kulturmedium hinzu und verteilen 500 µL, 2 Brunnen von einer 24-Well-Platte, jeweils mit 500 µL Wachstumsmedien und 25 ng FGF2.
  12. Auch menschliche PVAT gewonnenen Zellen weiter ausbauen, wie im vorherigen Schritt angegeben. Jede Passage sollte nicht größer als eine 1:2-Spaltung sein. Zellen sind 5 – 7 mal passagiert vor Zuteilung für Differenzierung Assays.

3. Protokoll 2: Kultur menschlichen Knochenmark MSC Kolonien

Hinweis: Menschlichen Knochenmark MSC wie beschrieben8 isoliert und als frühe Passage Bestände in eingefroren gelagert Einfrieren Medien (70 % FBS 20 % basale DMEM und 10 % DMSO) ~ 100.000 Zellen/ml in flüssigen N2.

  1. Schnell auftauen ein Fläschchen des Knochenmarks MSC von der Flüssigkeit N2 in einem 37 ° C Wasserbad und Teller zu einem Brunnen einer Kultur 6-Well Platte mit 3 mL MSC Wachstumsmedien und Inkubation über Nacht bei 37 ° C und 5 % CO2.
  2. Am nächsten Tag, Aspirieren MSC Nährmedien und waschen Sie die Zellen 3 X in 2 mL HBSS. Bei 100 % Zusammenströmen, Aspirieren Wachstumsmedien und waschen Sie die Zellen 3 X in 2 mL HBSS. 500 µL/Well Zelle Ablösung Lösung hinzufügen und Inkubation bei 37 ° C und 5 % CO2 für 5 min. Tippen Sie auf die Platte, um alle Zellen sorgen verdrängt und Inhalte in einer 6-Well-Platte mit 2 mL MSC Wachstumsmedien 2 Vertiefungen gleichmäßig zu verteilen.
  3. Erweitern Sie im menschlichen Knochenmark und PVAT abgeleitet MSC parallel für ca. 5 – 7 Passagen oder bis Sie ausreichende Mengen zum Testen erreicht wurde.

4. Protokoll 3: Platte und induzieren adipogenen osteogene, und Chondrogenic Linien

  1. Entsprechenden Plattennummern von Knochenmark und PVAT gewonnenen Zellen pro Bohrloch einer 12-Well-Platte und angemessen repliziert für jede Versuchsbedingung. Für adipogenen und osteogene Bedingungen, ~ 200, 000 – 225.000 Zellen/Brunnen benötigt für Chondrogenic Bedingungen, 150.000 – 175.000 Zellen/Brunnen sind erforderlich.
    Hinweis: Wir liefen mindestens N = 3 replizieren Brunnen für Kontrolle und induzierten Bedingungen für jede experimentelle Linie für insgesamt 2 unabhängige läuft (N = total 6 Wiederholungen).
  2. Zellen aus menschlichen PVAT Stammvater Zell-Population und der menschlichen Knochenmark MSC Bevölkerung mit Zelle Ablösung Lösung und Inkubation bei 37 ° C und 5 % CO2 für 5 min. Pool Populationen in separaten 15 mL konische Röhrchen zu distanzieren. Drehen Sie das Fläschchen nach unten bei 500 X g für 7 min zu die Zellen zu Pellets. In 1 mL PBS Aufschwemmen Sie und verwenden Sie eine Hemocytometer, um die Anzahl von Zellen zu schätzen.
  3. Platte die Zellen im 12-wohlen Teller wie in Schritt 4.1 angegeben. Geben Sie separate Gerichte induzierte und nicht-induzierte adipogenen, osteogene, Geschäftsbedingungen, so dass-induzierte Zustand zu einem früheren Zeitpunkt ohne Unterbrechung weiter Kultur der induzierten Zustand behoben werden kann.
  4. 1,5 mL adipogenen und osteogene Induktion Medien in jede Vertiefung der induzierten Zustand hinzugeben. 1,5 mL adipogenen und osteogene-Induktion Medien in jede Vertiefung des Zustandes-induzierte hinzugeben. Beginnen Sie Inkubation der adipogenen und osteogene induzierte und nicht-induzierte Zellpopulationen bei 37 ° C und 5 % CO2.
  5. Spin-down das restliche Volumen des menschlichen PVAT Vorläuferzellen und menschlichen Knochenmark MSCs für 7 min bei 500 X g.
  6. Bestimmen Sie die Lautstärke benötigt, um verbleibende Knochenmark und PVAT abgeleitet Zelle Pellets zu einer Dichte von 100.000 Zellen/10 µL (106 Zellen/mL) aufzuwirbeln. Pellets in das berechnete Volumen des MSC Wachstumsmedium für Chondrogenic Abstammung Induktion aufzuwirbeln. Sanft bewegen das Volumen der Zellen nach oben und unten mit einem pipettieren, um eine homogene Verteilung zu gewährleisten.
  7. Pipette einen 10 µL Tropfen der Lösung konzentrierte Zelle in der Mitte von jedem Bohrloch eine Micromass von 100.000 Zellen zu bilden. Legen Sie 1 mL sterile H2O, im benachbarten Brunnen um Verdunstung zu verhindern. Inkubieren Micromass Kulturen für 2 h bei 37 ° C und 5 % CO2 erlauben die Micromass zu aggregieren.
  8. Nach 2 Stunden vorsichtig hinzugeben Chondrogenic Differenzierung Medien gespickt mit 10 ng/mL menschlichen TGFβ1 zu jedem der induzierten Zustand Brunnen. 1,5 mL der Medien-Induktion (Knochenmark MSC Wachstumsmedium) sorgfältig in die Vertiefungen-induzierte Zustand hinzufügen Verwenden Sie separate 12-Well-Platten für die induzierte und nicht-induzierten Bedingungen, so dass-induzierte Zustand zu einem früheren Zeitpunkt behoben werden kann.

5. Protokoll Nr. 4: Kultur adipogenen, osteogene, und Chondrogenic Linien für 14 Tage

  1. Kultur der induzierten und nicht-induzierten Bedingungen alle drei Linien für 4 Tage bei 37 ° C und 5 % CO2, erfrischende Medien alle 2 Tage. Am 4. Tag ändern Sie die induzierte adipogenen Abstammung Bedingung von Induktion Medien Wartung Medien für den Rest des Tests.
  2. Aller nicht-induzierten Bedingungen 10 % Formalin für 12 h entsorgen Formalin fixieren und waschen alle festen Brunnen 2 X mit PBS-Puffer zu entfernen alle Spuren von Formalin. Lagern Sie Platten mit PBS-Puffer bei 4 ° C bis zur Verarbeitung.
  3. Kultur der induzierten Bedingungen für eine Gesamtmenge von 14 Tagen, erfrischende Medien alle 2 Tage. Frische TGFβ1 am 10 ng/mL Endkonzentration mit jeder Aktualisierung der Chondrogenic Induktion Medien hinzufügen. Weiterhin die adipogenen Linie in der adipogenen Wartung und osteogene Abstammung Induktion Medien, alle 2 Tage erfrischende Kultur. Am 14. Tag fix alle induzierte Bedingungen für 12 h in 10 % Formalin für das Beflecken.
  4. Kratzen Sie oder Gießen Sie die Micromass in der induzierten Chondrogenic Zustand in einer Kassette für die Einbettung. Die Micromass in einer Reihe von zunehmend konzentrierter Alkohol Bäder für 5 min, beginnend bei 70 %, dann zweimal in 95 %, 80 % und zweimal mehr in absoluten Alkohol zu entwässern. Legen Sie die Kassette in einem Entalkoholisierung Agent und dann schließlich Betten Sie die Kassette in Paraffinwachs für schneiden und färben ein.

6. Protokoll Nr. 5: Färbung adipogenen Zustand mit Öl rot O

  1. Bereiten Sie Öl rot O-Stammlösung durch Auflösen von 350 mg Öl rot O in 100 mL 100 % Isopropanol. Mischen Sie für 2 h mit Stir Bar und Vakuum durch einen 0,2 µm-Filter. Stammlösung kann im Dunkeln bei Raumtemperatur 1 Jahr gelagert werden.
  2. Bereiten Sie Öl rot O Lösung durch Mischen von 3 Teilen-Stammlösung auf 2 Teile DiH20 (z.B. 60 mL der Stammlösung auf 40 mL DiH20) arbeiten. Die Endkonzentration von Öl rot O in die Arbeitslösung ist 2,1 mg/mL.
  3. Entfernen Sie alle Flüssigkeit aus Brunnen. Waschen Sie jeden gut 2 X mit 60 % Isopropanol, achten Sie darauf, alles Wasser von den Seiten der Brunnen komplett zu entfernen. Aspirieren Sie 60 % Isopropanol und fügen Sie schnell Öl rot O funktionierende Lösung ohne Berührung der Wände der Brunnen, der Boden bedeckt hinzu. Es ist wichtig, dass dieser Schritt schnell erledigt ist, so dass der Brunnen nicht trocken.
  4. Sobald das Öl rot O hinzugefügt wird, brüten Sie für 10 min bei Raumtemperatur mit sanftes Schaukeln.
  5. Entfernen Sie alle Öl rot O und sofort fügen Sie destilliertem H2O. Wash mit destilliertem H2O 10 m zu beginnen, ungebundenen Öl rot O. entfernen hinzu Nach 10 min, Öl rot O Aspirieren und wiederholen des Waschvorgangs 3 X.
  6. Sobald die Reinigung abgeschlossen ist, fügen Sie PBS und Bild der Zellen. Lagern Sie gefärbte Zellen mit PBS-Puffer bei 4 ° c

7. Protokoll 6: Färbung osteogene Zustand mit Alizarin rot

  1. Entfernen Sie alle Flüssigkeit aus jedem Brunnen. Fügen Sie entsprechende Volumen der 2 % igen Alizarin roten Fleck Lösung in jede Vertiefung (1,5 mL pro Bohrloch für eine 12-Well-Platte) und leicht kippen der Platte von Seite zu Seite, bis die Lösung vollständig den Boden des Brunnens bedeckt.
  2. 15 min bei Raumtemperatur inkubieren. Alizarin rot aus dem Brunnen zu entfernen. Spülen Sie jeweils gut viermal mit destilliertem H2O, wobei Vorsicht, nicht zu verdrängen, Kalzium-Kristallen sanft. Trocknen lassen.

8. Protokoll 7: Färbung Chondrogenic Zustand mit Masson Trichrome

  1. Backen Sie Folien in einem 60 ° C trocken Ofen für 30 min. Deparaffinize und Hydrat Abschnitte, destilliertes Wasser.
    1. Um deinen Durst, legen Sie Folien in drei 5 min Inkubationen mit Entalkoholisierung Agenten, gefolgt von 5 min Inkubationen in absteigender Alkoholkonzentrationen wie folgt: zwei bei 100 % (absolute Ethanol), zwei mit 95 % Alkohol, zwei bei 80 %, zwei bei 70 %, und schließlich zwei destilliert in H2kann in H2O bleiben O. gleitet, während Bouins Fixiermittel vorbereitet wird.
  2. Platz 40 mL Bouins Fixiermittel in einem Kunststoff microwavable Coplin Glas (unbedacht). Mikrowelle auf hoch bringen Temp auf 55 ° C. Legen Sie die Folie in beheizten Lösung für 20 min; ruhen lassen, auf der Theke abgedeckt. Waschen Sie in fließendem Leitungswasser für 10 min oder bis alle die gelbe Farbe verschwindet.
  3. Färben Sie Abschnitte in Weigerts Hämatoxylin für 10 min. Waschen in fließendem Leitungswasser für 10 min..
  4. Führen Sie Abschnitte in Beibrichs scharlachroten saures Fuchsin-Lösung für 10 min. Waschen 3 x 10 min im Leitungswasser zu Flecken. Beize Folien in Phosphotungstic/Phosphomolybdic saure Lösung für 10 Minuten. Nicht ausspülen.
  5. Legen Sie Folien direkt in Anilin blauen Lösung für 10 min. Spülen mit zwei kurzen Dips in Leitungswasser.
  6. Legen Sie Folien in 1 % Essigsäure Lösung 3 bis 5 Minuten waschen im Leitungswasser für 1 min. Platz in 95 % igem Ethanol für 1 min. gelief gemäß Schritt 5.4 und Halterung mit Kunstharz.

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Representative Results

Isolierung von Stromazellen vaskulären Fraktion aus menschlichen PVAT

Abbildung 1A zeigt eine schematische Darstellung der anatomischen Region, die darüberliegende der Aorta ascendens PVAT ermittelt wurden. Die Patientengruppen in der koronaren Bypass-Operation diese Proben von dem abgeleiteten6waren zuvor beschrie- Abbildung 1 b zeigt ein Beispiel für die menschlichen PVAT erhalten nach der Operation. Abbildung 1 zeigt einen repräsentativen PVAT Gewebe Abschnitt mit Masson Trichrome Fleck gebeizt. Abbildung 1 ist eine Phase Vertrag Schliffbild zeigt eine Population von PVAT abgeleitet Stromazellen Zellen während der Expansionsphase vor der Differenzierung. Zellen können erweitert und für zukünftige Verwendung eingefroren. Zellen sind in der Regel bei einer Dichte von 2,5 x 105 Zellen/mL in einem Medium, bestehend aus 70 % eingefroren FBS, 20 % basalen (Antibiotikum frei) DMEM-F12 und 10 % DMSO in einer Isopropanol Kammer herausnehmen bei-80 ° C für 24 h und zog in die flüssige Phase des flüssigen N2 Gefrierschrank für lange-t Erm-Lagerung.

Adipogenen Differenzierung

Parallel zur menschlichen Knochenmark stammenden MSC (Abb. 2AB) und PVAT abgeleitet Vorläuferzellen (Abbildung 2D) wurden Studien durchgeführt. Die linken Panels der Abbildung 2 zeigen den-induzierte Zustand, wo keine Lipid-Ansammlung ist offensichtlich. Die richtigen Platten zeigen Zellen nach Adipocyte Unterscheidung und Färbung von neutralen Lipiden mit Öl rot O. Während der Grad der Differenzierung in den menschlichen Aortenklappe PVAT-abgeleitete Zellen robuster ist, ausgestellt beide Quellen der menschlichen Zelle die Fähigkeit, in Richtung der adipogenen Linie zu unterscheiden.

Osteogene Differenzierung

Das osteogene Differenzierung-Protokoll wurde zum menschlichen Knochenmark stammenden MSC (Abb. 3A-C) und PVAT gewonnenen Zellen (Abbildung 3D– F) verwendet. Non-induzierte Zellen (Abb. 3AD) nicht mit Alizarin rot färben. Nach dem Protokoll osteogene Differenzierung die menschlichen MSC entwickelt verkalkte Knötchen, die befleckt mit Alizarin rot (Abb. 3 b– C), während menschliche Aorten PVAT gewonnenen Zellen nicht (Abbildung 3E-F). Diese Daten deuten darauf hin, dass unsere Vorbereitung der Zellen von den Stromazellen vaskulären Bruch der menschlichen PVAT fehlen zahlreiche Vorfahren mit der Fähigkeit zu unterziehen Osteogenesis. Je nach Studie und Zeit Kurs der Differenzierung ist es ratsam, follow-up standard Flecken mit Erkennung von molekularen Markern, die knochenbildenden Linie Engagement (z. B. RUNX2, Osterix, alkalische Phosphatase) oder Osteoblasten (Osteopontin, definieren Osteocalcin, alkalische Phosphatase, BAP1).

Chondrogenic Differenzierung

Zellen von beiden menschlichen Knochenmark MSC (Abb. 4A) abgeleitet und menschlichen PVAT (Abbildung 4 b) zeigen Merkmale charakteristisch für Chondrogenic Differenzierung, mit reichlich Kollagen Akkumulation in der Micromass. Micromasses gebildet aus menschlichen Knochenmark MSC und Aorta PVAT gewonnenen Zellen auch reichlich Anhäufung von Glykosaminoglykanen (blau) ausgestellt, wie durch Alcian blau Färbung (Abbildung 4-D, beziehungsweise). Morphologisch, wurden Strukturen ähnlich wie Lücken mit sitzen in Hohlräumen, die durch Ablagerung von Kollagen (Abbildung 4, Pfeile) umgebenden Zellen erkannt. Je nach Studie und Zeit Kurs der Differenzierung, die Erkennung von bestimmten Chondrogenic Marker (Aggrecan, Kollagen Typ II, Osteonectin, Sox9) ist sinnvoll.

Figure 1
Abbildung 1: morphologischen Eigenschaften der menschlichen PVAT. (A) Cartoon Darstellung der menschlichen Aorta (rot) mit den umliegenden PVAT (gelb). Pfeil zeigt die Aorta ascendens. (B) ein 480 mg Stück menschlichen Aortenklappe PVAT aus einer CABG-Patienten in DMEM vor der Dissoziation. (C) Masson von Formalin fixierten Paraffin-eingebetteten menschlichen PVAT trichrome Färbung (dunkelbraun/schwarz = Kerne, blau/lila = Bindegewebe, rosa = Zytoplasma; Beachten Sie, dass RBC erscheinen rötlich-rosa. (D) repräsentatives Bild der explantierten PVAT Stromazellen Zellen an 7 Tagen in der Kultur. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: adipogenen Differenzierung. (A) Phase Mikroskopie des menschlichen Knochenmark MSC in den nicht induzierten Zustand keine Anzeichen von Differenzierung zeigt. (B) Phase Mikroskopie des menschlichen Knochenmark MSC in der induzierten adipogenen Zustand zeigt einige Differenzierung und Immobilisierung von neutralen Lipiden, befleckt mit Öl rot O nach 14 Tagen. (C) Phase Mikroskopie der menschlichen Aorten PVAT abgeleitet Zellen in den nicht induzierten adipogenen Zustand keine Anzeichen von Differenzierung zeigt. (D) Phase Mikroskopie menschlicher Aorten PVAT stammenden Zellen in der induzierten adipogenen Zustand zeigt robuste Differenzierung und Immobilisierung von neutralen Lipiden, befleckt mit Öl rot O nach 14 Tagen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Osteogene Differenzierung. (A) Phase Mikroskopie des menschlichen Knochenmark MSC in den nicht induzierten osteogene Zustand keine Anzeichen von Differenzierung in Richtung einer osteogene Abstammung zeigt. (B) Phase Mikroskopie des menschlichen Knochenmark MSC in der induzierten Zustand nach 14 Tagen in Kultur zeigt Beweis der Differenzierung und die Bildung von Kalkablagerungen gebeizt mit Alizarin rot (Pfeile). (C) ein Bild von der gut mit der menschlichen Knochenmark MSC in die induzierte osteogene Bedingung folgt mit Alizarin rote Färbung zeigt reichlich Kalzium Ablagerung, was erfolgreiche Differenzierung in Richtung einer osteogene Abstammung (Pfeile, Kalzium-Abscheidung). (D) Phase Mikroskopie Aorten menschlicher Zellen in das nicht-induzierte osteogene Zustand PVAT abgeleitet keine Anzeichen der Differenzierung in Richtung einer osteogene Abstammung zeigt. (E) Phase Mikroskopie Aorten menschlicher Zellen in der induzierten osteogene Zustand nach 14 Tagen in Kultur PVAT abgeleitet zeigt keinen Beweis der Differenzierung in Richtung einer osteogene Abstammung oder Ablagerung von Kalzium, wenn nur mit Alizarin Rot gebeizt unspezifische Färbung. (F) ein Bild von der gut mit der menschlichen Aorten PVAT gewonnenen Zellen in der induzierten osteogene Zustand zeigt folgende Färbungen mit Alizarin rot nur unspezifische Färbung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Chondrogenic Differenzierung. (A, B) Lichtmikroskopie eines Abschnitts der Micromass durch menschlichen Knochenmark MSC (A) oder menschlichen Aortenklappe PVAT Vorläuferzellen (B) in der induzierten Chondrogenic Zustand nach 14 Tagen in Kultur gebildet und anschließend gefärbt mit Masson Trichrome, was darauf hindeutet erhebliche Ablagerung von Kollagen (blau) und schlägt vor, erfolgreiche Differenzierung in Richtung einer Chondrogenic Linie. (C, D) Lichtmikroskopie eines Abschnitts der Micromass gebildet von menschlichen Knochenmark MSC (C) oder menschlichen Aortenklappe PVAT Vorläuferzellen (D) in der induzierten Chondrogenic Zustand nach 14 Tagen in Kultur und anschließend mit Alcian blau gefärbt, was darauf hindeutet, Abscheidung von sauren Proteoglykane (z. B. Glykosaminoglykane) als befinden sich in der Regel im Knorpel. Gegenfärbung, nukleare schnell rot; Pfeile, Lücken-ähnlichen Strukturen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Adipöse Vorläuferzellen aus verschiedenen Depots unterschiedlich in Phänotyp und Differenzierung möglicher9. Kultivierung PVAT stammenden Vorfahren von einem einzigen Patienten Spender in gleichzeitige Induktion auf drei verschiedenen Linien, ermöglicht adipogenen, osteogene, und Chondrogenic, eine kontrollierte Untersuchung der pluripotenten Kapazität dieses Romans Bevölkerung von Vorläuferzellen. In diesem Bericht beschriebene Methode kann die Kapazität der Differenzierung Vorläuferzellen aus menschlichen PVAT zu testen und zu verstehen, ihre Funktion bei der Regulierung der PVAT Pathologien und Gefäßtonus verwendet werden. Einige Vorteile dieser Technik sind seine Einfachheit und Nutzung des primären menschlichen Gewebes von koronaren bypass-Patienten, so dass die Untersuchung der PVAT Stammvater Zellfunktion von Patienten mit schweren Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Allerdings Explantaten aus einem 500 mg Stück Gewebe in der Regel liefern < 1000 adhärenten Zellen und erfordern daher 5 – 7 Gänge, um angemessene zahlen, Hervorhebung eine wichtige Einschränkung dieses Ansatzes zu erhalten. Entscheidend für den Erfolg der Tri-Linie Differenzierung Experimente ist die Qualität der ersten Zelle Explant vom Spender PVAT. Es ist wichtig, das Gewebe gründlich vor der enzymatischen Dissoziation fein hacken. Darüber hinaus fanden wir im Gegensatz zu anderen Protokollen Explant einen dramatischen Verlust der Zellzahl, Wirtschaftlichkeit und Qualität bei der roten Blutzelle Lysis Puffer vor der Beschichtung verwendet wurde. Stattdessen empfiehlt es stark den gesamten Stromazellen vaskulären Bruch (einschließlich der roten Blutkörperchen) Platte. Nach 24 h adhärente Zellen haben angebracht und nicht lysiert roten Blutkörperchen kann durch wiederholte Waschungen mit HBSS entfernt werden. Passagierung der PVAT abgeleitet Stromazellen Zellen sollte nicht größer als 1:2 Teilungen. Wir beobachten einen Rückgang der Wachstumsrate als die Zellen Split 1:3 oder höher waren.

Die schwierigste Komponente des Trilineage Differenzierung Assays ist die Chondrogenic Bedingung, da es eine weniger gängige Methode der Kultivierung Zellen in einem "Micromass" und histologische Einbettung und Schneiden erfordert. Vorsicht ist geboten, um richtig Platte 10 µL-Tröpfchen von 100.000 Zellen und stören nicht die Masse zum Hinzufügen von Kulturmedium. Wir fanden Unterschiede zwischen Assays, unabhängig davon, ob die Micromass blieb bis auf den Teller eingehalten oder in das Medium suspendiert. Auch wenn die Masse nicht haften geblieben sind, die Micromass Struktur und Zelle Lebensfähigkeit konstant geblieben.

Stammzellen und Vorläuferzellen Zellen innerhalb der vaskulären Mikroumgebung sind verantwortlich für die Reparatur von Gewebe als Reaktion auf Verletzungen oder Krankheiten. Sehr gut charakterisiert Bevölkerungen, die von Pericyte/adventitial Fächer abgeleitet sind, gibt es zwar immer noch Kontroversen darüber, ob es ist eine standardisierte molekulare Identifizierung dieser Populationen in Menschen10,11 . In diesem Protokoll studieren wir eine Stammvater Zellpopulation speziell abgeleitet von menschlichen PVAT testen Sie ihre Neigung zu einer osteogene, Chondrogenic oder adipogenen Abstammung zu unterscheiden. Mit befleckenden Techniken, um zelluläre Engagement für jede Linie zu definieren, zeigen wir, dass im Gegensatz zu MSC aus menschlichen Knochenmark, Vorläuferzellen aus menschlichen PVAT nicht konnten in Richtung einer osteogene Abstammung (Abbildung 3) unterscheiden, sondern weisen robuste adipogenen Differenzierung. Die Chondrogenic Differenzierung beträgt zwischen dem Knochenmark und PVAT gewonnenen Zellen vergleichbar. Dies deutet darauf hin, dass PVAT abgeleitet Vorläuferzellen mehr Abstammung als Knochenmark MSC eingeschränkt sein könnte oder dass PVAT Vorfahren nicht ohne weiteres in osteogene Linien unterscheiden. Zukünftige Studien sollten eine Untersuchung der Gene und Proteine Ausdruck der Marker für jede Linie, die Differenzierung Kapazität des PVAT gewonnenen Zellen mehr quantitativ zu bewerten sind.

Fettgewebe Stammzellen wurden ein Fokus für regenerative Medizin-Anwendungen, durch einfachen Zugang und die hohe Zahl von Zellen, die aus Fettgewebe12,13abgeleitet werden können. Vaskuläre Zellen, Entzündungszellen, Fibroblasten, Präadipozyten und Fettgewebe Stammzellen befinden sich der Stromazellen vaskulären Anteil des Fettgewebes. Es gibt Unterschiede in der Stammzell-Bevölkerung anhand der anatomischen Lage der adipösen Depot und Adipocyte Eigenschaften14. Am wichtigsten ist, scheint die Fettgewebe gewonnenen Stammzellen nicht nur in mesenchymalen Linien15, sondern auch Potenzial anzunehmen neuronalen16,17 und epidermalen18 Schicksale differenzieren können.

Zahlreiche Studien konzentrierten sich auf Stamm/Vorläuferzellen aus menschlichen subkutane weißen Fettgewebe abgeleitet, aber nur wenige Studien haben Eigenschaften der Stammvater Populationen PVAT angesprochen. Jüngste Studien haben Adipocyte Vorläuferzellen aus PVAT umliegenden mesenterialen Gefäße oder thorakalen Aorta der Ratte isoliert. Diese CD34 + / CD140a + Populationen in Adipozyten differenzieren, die Fähigkeit, anderen Linien zu ziehen war zwar nicht getestet19.

Wir zeichnen vor kurzem adipösen Vorläuferzellen der Stromazellen vaskulären Anteil der menschlichen PVAT von Patienten mit fortgeschrittenen koronare Erkrankung6abgeleitet. Diese Fettgewebe Vorläuferzellen wurden CD73 + CD105 + und CD140a + und effizient differenziert in Adipozyten mit thermogene Eigenschaften (UCP1 Ausdruck)6. In der aktuellen Arbeit fanden wir eine begrenzte Linie Potenz der PVAT-abgeleitete Zellen im Vergleich zu dem Knochenmark stammenden MSC schlägt entweder einen Mangel oder minimale Bevölkerung von Fettgewebe Stammzellen, die aus anderen menschlichen Fettgewebe charakterisiert wurden. Eine Gegenleistung für dieses Protokoll ist die erwarteten Variabilität zwischen menschlichen Exemplare, die die Anzahl der Stammzellen/Vorläuferzellen innerhalb der PVAT Probe und ihre Fähigkeit zur Differenzierung auf unterschiedlichen Linien zu unterziehen beeinträchtigen können. Alter, Geschlecht, BMI, Medikamente und andere klinische Parameter wahrscheinlich beeinflussen den Phänotyp der Vorläuferzellen innerhalb PVAT. So erwarten erwartete zukünftigen Änderungen dieses Protokolls mehr klar definierten Stammvater Einwohner innerhalb der menschlichen PVAT und evtl. mit Zellsortierung, um spezifischen Sub-Populationen für Linie Studien zu isolieren.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Wir anerkennen die Unterstützung der Forschung Navigation am Maine Medical Center für die Unterstützung bei der Beschaffung von klinischen Gewebe und der Histopathologie und Histomorphometrie Kern (unterstützt von 1P20GM121301, L. Liaw PI) bei Maine Medical Center Research Institut für schneiden und färben. Diese Arbeit wurde unterstützt von NIH R01 HL141149 zu gewähren (L. Liaw).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Animal-free collagenase/dispase blend I   Millipore-Sigma SCR139 50mg
Alcian Blue NewComerSupply 1003A 1% Aqueous solution pH 2.5
Alizarin Red Amresco 9436-25G
alpha-MEM ThermoFisher 12561056
Aniline Blue NewComerSupply 10073C
Antibiotic/antimycotic ThermoFisher 15240062
Beibrich's scarlet acid fuchsin Millipore-Sigma A3908-25G
b-glycerophosphate Millipore-Sigma G9422-10G
Biebrich Scarlet EKI 2248-25G
Biotin Millipore-Sigma B4501-100MG
Bouin's fixative NewComerSupply 1020A
Bovine serum albumin Calbiochem 12659 stored at 4 °C
Cell detachment solution Accutase AT104
Bell strainer (70 mm) Corning 352350
Dexamethasone Millipore-Sigma D4902-100MG
DMEM Corning 10-013-CV 4.5 g/L glucose, L-glut and pyruvate
DMEM/F12 medium ThermoFisher 10565-042 high glucose, glutamax, sodium bicarbinate
DMSO Millipore-Sigma D2650
Fetal bovine serum Atlanta Biologicals  S11550
FGF2 Peprotech 100-18B
Formalin NewComerSupply 1090
Gelatin, bovine skin Millipore-Sigma G9391-500G
Glutamax ThermoFisher 35050061 glutamine supplement
HBSS Lonza 10-547F
IBMX Millipore-Sigma I5879-250MG
Insulin solution Millipore-Sigma I9278-5ML
Oil red O Millipore-Sigma O0625-100G
Pantothenic acid Millipore-Sigma P5155-100G
Penicillin-streptomycin solution ThermoFisher 15240062 100ml
Permount Fisher SP15-500
Phosphotungstic/phosphomoybdic acid solution Millipore-Sigma P4006-100G/221856-100G
Primocin Invivogen ant-pm-1 Antimicrobial reagent for culture media.
Rosiglitazone Millipore-Sigma R2408-10MG
TGFb1 Peprotech 100-21
Weigert's hematoxylin EKI 4880-100G

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References

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Biologie Ausgabe 145 menschliche perivaskuläre Fettgewebe adipösen Vorläuferzellen mesenchymale Stammzellen werden Osteogenesis angereizte Zelldifferenzierung Herz-Kreislauf-Krankheit
Differenzierung-Kapazität des menschlichen Aortenklappe perivaskuläre Fettgewebe Vorläuferzellen
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Scott, S. S., Yang, X., Robich, M., Liaw, L., Boucher, J. M. Differentiation Capacity of Human Aortic Perivascular Adipose Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (145), e59337, doi:10.3791/59337 (2019).

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