Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att använda thiazole orange för upptäckt av DNA i gelelektrofores experiment. Användningen av thiazole orange tillåter eliminering av etidiumbromid och fluorescens upptäckt kan uppnås med antingen UV eller blått ljus.
Abstract
DNA gelelektrofores använda agaros är ett vanligt verktyg i molekylärbiologi laboratorier, att tillåta separation av DNA-fragment efter storlek. Efter separation, är DNA visualiseras genom färgning. Den här artikeln visar hur du använder thiazole orange färga DNA. Thiazole orange jämför positivt till gemensamma färgning metoder, i detta känsliga, billig, hetsiga med UV- eller blått ljus (för att förhindra skador på prov) och säkrare än etidiumbromid. Labs redan utrustade att köra DNA elektrofores experiment med etidiumbromid kan generellt växla färgämnen utan ytterligare ändringar till befintliga protokoll, med UV-ljus för upptäckt. Blue-light upptäckt att undvika prov skador kan dessutom uppnås med ett blått ljus källa och utsläpp filter. Labs redan utrustade för blå-ljus upptäckt kan enkelt växla färgämnen utan ytterligare ändringar till befintliga protokoll.
Introduction
Syftet med denna metod är att identifiera DNA i agaros gel med thiazole orange (till) för fluorescens upptäckt. På grund av dess låga kostnader och gynnsam säkerhetsprofil, kan thiazole orange se särskild nytta i grundutbildning laboratorier och forskningslaboratorier som utför molekylärbiologi, särskilt nering och kloning.
Etidiumbromid är fortfarande den vanligaste färgämnen för upptäckt av DNA i agaros gel. Detta är främst eftersom det kan erhållas mycket billigt och kräver endast excitation med UV-ljus för upptäckt. Båda etidiumbromid metylbromid och thiazole orange är billiga, med låg upptäckten gränser (1-2 ng/lane)1. Det finns två huvudsakliga nackdelar till etidiumbromid, dock som thiazole orange förbättras.
Först etidiumbromid är ett mutagen2 med särskild hantering, frakt och bortskaffande krav, medan thiazole orange är mindre mutagena (3 – 4 x mindre mutagen i Ames test)3,4 och kan slängas generellt med gemensamma kemiskt avfall.
Andra kräver etidiumbromid UV-ljus för upptäckt. Thiazole orange på samma sätt kan använda UV-ljus om så önskas, men kan också upptäckas med blått ljus. UV-ljus, har medan vanligen används, några framträdande nackdelar. Först, det är skadligt på människors hud och ögon. Medan UV-ljus kan användas på ett säkert sätt av utbildad personal, hud- eller olycksskador (funktionellt liknar solbränna) från laboratoriet UV ljus är inte ovanliga bestämt med oerfarna forskare. Andra är UV-ljus oerhört skadligt för DNA prover5, vilket minskar framgången av nedströms experiment (såsom ligatur och omvandling)1,6,7. TILL tillåter identifiering med blått ljus (λex, max = 510 nm (488 nm och 470 nm visar också stark excitation)), som inte orsakar hudskador eller DNA skada (även om några intensiva ljuset kan fortfarande vara skadligt för ögonen), kraftigt minska riskerna för både forskare och provet.
Är inte endast fluorescerande färgämne alternativet till etidiumbromid; dess fördel är kostnaden. TILL upptäcktes på 1980-talet som en retikulocyter fläcken8, och har funnit verktyg i ett antal DNA-baserade fluorescens experiment9,10,11,12,13. Det är för närvarande säljs av flera leverantörer. TILL är modersubstansen av ytterligare, dyrare, blå-ljus – detectable kommersiella färgämnen, och beter sig på samma sätt under elektrofores, med UV- eller blått ljus för upptäckt1. Medan andra färgämnen är mer känsliga för mycket låga koncentrationer, DNA än antingen EtBr eller till, för generiska elektrofores experiment, är dessutom sådana färgämnen oöverkomligt dyr i många sammanhang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. förbereda gelen
Obs: För allmänna gelelektrofores protokoll, se även F.Å Lee, et al. 14.
- Blanda agaros (~ 1% w/v, procentandel kan varieras för viss storlek separationer) i buffert (ca 70 mL till en mini gel (8 x 7 cm)). Buffertar är vanligen TAE (tris-acetat-EDTA, 40 mM Tris, 20 mM acetat, 1 mM EDTA, pH ca 8,6) eller TBE (tris-Borat-EDTA, 90 mM Tris, 90 mM Borat, 2 mM EDTA, pH cirka 8,3)).
- Lägg till thiazole orange till en slutlig koncentration på 1,3 μg/mL.
- Lös thiazole orange i DMSO att göra 10.000 x stamlösning (13 mg/mL). Samtidigt inte särskilt ljuskänsligt, lagra till i mörka när inte i använda. Denna lösning är stabilt vid rumstemperatur för ~ månader; långsiktig lagring kan uppnås genom frysning alikvoter (DMSO kommer att frysa i ett standard kylskåp). Glöm inte att helt smälta och resuspendera en fryst lösning före användning.
Obs: Kan gelen också färgas med till efter elektrofores (se steg 2,6). Tag till har en bättre säkerhetsprofil över etidiumbromid, standard molekylärbiologi laboratoriesäkerhet försiktighetsåtgärder bör bibehållas.
- Lös thiazole orange i DMSO att göra 10.000 x stamlösning (13 mg/mL). Samtidigt inte särskilt ljuskänsligt, lagra till i mörka när inte i använda. Denna lösning är stabilt vid rumstemperatur för ~ månader; långsiktig lagring kan uppnås genom frysning alikvoter (DMSO kommer att frysa i ett standard kylskåp). Glöm inte att helt smälta och resuspendera en fryst lösning före användning.
- Mikrovågsugn blandningen av agaros, buffert och thiazole orange att upplösa agaros (cirka 60 s). Detta steg benämns ofta som ”smälter”. Snurra (5 s) till stöd upplösning om det behövs.
Obs: Till kan också läggas efter mikrovågsugnen om föredrog. - Låt agaros lösningen svalna kort innan du häller i gel gjutning apparater som innehåller en lämplig kam.
- Låt agaros lösningen att stelna till en gel.
2. lastning och kör gelen
- Placera gelen i elektrofores apparaten om inte redan finns.
- Lägga till kör buffert (TAE eller TBE som ovan) för att täcka ytan av gelen.
- Ladda DNA-prover (vanligen 10 μL) använder ett lastning färgämne. Inkludera en DNA dimensionering stege för referens.
- Sätt fast locket och elektroder (gelen ska köras mot röda anoden (positiv)).
- Spänning (vanligtvis ~ 100V för en mini gel, även om storleken på gel kan kräva en modifierad spänning att förhindra skadliga gelen) tills lastning färgämne har rest ett lämpligt avstånd (ca 4-7 cm för en mini gel, även om avståndet kan variera beroende på exakt applicering).
Obs: Liksom etidiumbromid och många andra DNA bindande färgämnen, thiazole orange är positivt laddade. Följaktligen kommer dessa färgämnen migrera i motsatt riktning av electrophoresing DNA. För prover som körs långt ner gelen för förbättrad separation, så småningom färgämnet kommer att skilja från de mindre DNA-fragment, vilket resulterar i svag färgning. I dessa fall bör gelen färgas som i steg 2,6. Denna situation är inte unik för till, någon laddade positivt färgämne som reversibelt interagerar med DNA kommer uppvisar detta beteende (inklusive etidiumbromid, till, och andra). - Om till lades inte före gel gjutning (steg 1.2), fläcken genom att sänka ner gelen i bufferten som innehåller thiazole orange.
- Förbereda tillräckligt buffert (TAE eller TBE) med 1,3 μg/mL thiazole orange att helt täcka gelen och Blötlägg gelen med försiktig skakning tills banden är fullt upptäckta (ungefär 20 min).
3. visualisering av thiazole orange agarosgel (UV-transilluminator)
- Ta bort gelen från elektrofores apparater och plats på en UV-transilluminator.
FÖRSIKTIGHET: UV-ljus är skadligt för huden och ögonen. Tänk att bära lämpliga öga (skyddsglasögon) och ansiktsskydd (visir). Händerna bör ha handskar och långa ärmar bör bäras. - Om så önskas önskas utskuren DNA band från gelen (för ytterligare matsmältningen eller ligatur, till exempel). Exponera gelen för UV-ljus för så kort en lång tidsperiod som möjligt vid excision. UV-ljus (oavsett DNA färgämne) skadar DNA.
- Extrahera DNA från gel segmentet med en lättillgänglig kit eller protokoll15.
4. visualisering av thiazole orange agarosgel (blå-ljus transilluminator eller ficklampa)
- Ta bort gelen från elektrofores apparater och plats på en blå-ljus transilluminator (~ 470 nm maximala utsläpp våglängd). Alternativt, en blå LED (~ 470 nm) ficklampa kan riktas på gelen (antingen uppifrån eller nerifrån).
Obs: Medan känslighet är lägre med en blue-light-transilluminator med etidiumbromid, DNA färgas med etidiumbromid kan upptäckas med denna blue-light-protokollet. - Använd en bärnstensfärgad utsläpp filter (~ 560 nm longpass, antingen glasögon eller square) för att filtrera blått ljus, för visualisering av fluorescens från DNA: thiazole orange komplex.
Obs: Utan bärnsten utsläpp filter, det är mycket svårt att upptäcka DNA band på grund av intensiteten av blå-ljus exciteringskälla.
Varning: Även om blått ljus saknar förmåga att akut skada vävnader (kontrasterande UV), långvarig exponering för intensivt blått ljus kan skada ögon och bärnsten utsläpp skyddsglasögon eller filter bör användas. - Om så önskas, skära ut önskad DNA band från gelen för ytterligare program.
Obs: Eftersom blått ljus inte skadar DNA, är det inte nödvändigt att snabbt skära ut band (t.ex. när använder UV magnetiseringen i steg 3,2). - Extrahera DNA från gel segmentet med en lättillgänglig kit eller protokoll15.
5. Bildinsamling
- Välj lämpliga inställningar för magnetisering och utsläpp i gel-imaging apparater. De excitation och utsläpp av thiazole orange (λex, max = 510 nm (488 nm och 470 nm visar också stark excitation, förutom stark excitation vid UV-våglängder); λem = 527 nm) är nästan identiska med vanliga blå-ljus – detectable kommersiella färgämnen, så instrument kan har förinställda inställningar för filter som kan användas.
Obs: Vissa filterinställningar för blå-ljus – detectable kommersiella färgämnen faktiskt använda skadliga UV-ljus för magnetisering, så var försiktig om imaging innan skära ut band. Använd en blå ljus exciteringskälla om möjligt när DNA band kommer att vara censurerade efter imaging. - I avsaknad av en tänkbar system med lämpliga filter, placera ett gult filter mellan kameran och gel/blå-ljus exciteringskälla.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Thiazole orange möjliggör detektering av DNA, utan att använda etidiumbromid och utan att använda DNA-skadande UV-ljus. Etidiumbromid är känd att vara mutagena, så att eliminera den från labbet kan vara fördelaktigt. UV-ljus skadar DNA och sänker förvandling effektivitet avsevärt, medan blått ljus inte skadar DNA. Detektionsgränserna är likartade mellan etidiumbromid, thiazole orange och ett gemensamt, blå-ljus – påvisbara kommersiella DNA färgämne (figur 1, se Tabell för material), med detektionsgränsen för alla tre färgämnen ~ 1-2 ng/lane i en mini gel 1.
För vanliga applikationer såsom skära ut ett restriktionsenzym som rötas band sig thiazole orange lämpar särskilt väl. Upptäckten av DNA med blå ljus magnetisering är robust och okomplicerad och vetenskapsmannen behöver inte rusa till punktskatter DNA som de skulle om att upptäcka med UV-ljus. En plasmid sänktes med restriktionsenzym att isolera en insert (figur 2, en gel är avbildad på tre olika sätt). Skäret är lätt upptäckas med att med blått ljus förutom UV, att låta nedströms applikationer sker utan rädsla för skador i DNA från UV-exponering.
Figur 1 . Upptäckt av DNA använder thiazole orange, gemensamma blå-ljus – detectable kommersiella DNA färgämne och etidiumbromid med blå eller UV-ljus. Gel skiva bilder representerar två-faldig utspädning av ett 120-ng band av DNA över gelen (bandet är ett 3,0 kb band från 2-log stege). Denna siffra har ändrats från O'Neil, et al.1, Reproducerad med tillstånd. Se O'Neil, et al.1 fullständig information om experimentet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Flera bilder av samma thiazole orange-färgade agarosgel av en begränsning digest. (A) Excitation med UV-transilluminator. (B) excitation med blå ljus transilluminator. (C) excitation med blå ljus ficklampa (spets som är något synligt, ur fokus, i bilden längst ned). Lane 1:2-log stege, 1 μg totala DNA (stora band av 3,0 kb, 1,0 kb och 0,5 kb är märkt). Lane 2: 0,5 μg av pEF-GFP plasmid DNA (5,1 kb) smält med HindIII (förväntade storlek 5,1 kb). Lane 3: 0,5 μg av pEF-GFP rötas med HindIII och mina (förväntade storlekar: 3.7 kb, 1.3 kb). Gel kördes med 1,3 μg/mL thiazole orange i gelen. Alla bilder tagna med standard utsläpp filter (590/110 nm), exponering optimerad för intensiv band. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Etidiumbromid har länge varit ett standardverktyg i molekylär biologi lab, trots känd toxicitet. Det lider också kräver UV-ljus, vilket skadar DNA som det är att bli upptäckt. Thiazole orange erbjuder ett billigt alternativ till etidiumbromid, liksom användbara men dyra kommersiella färgämnen.
Fördelarna med thiazole orange är således två gånger. Först, thiazole orange kan bara användas som en ersättare till etidiumbromid. Geler kan förberedas identiskt till EtBr, med att ersätta som fläcken (steg 1.2). Detektionsgränserna är liknande (~ 1-2 ng/lane)1. Att byta färgämnen eftersom thiazole orange kan upptäckas med UV-ljus (steg 3) precis som EtBr krävs ingen ytterligare utrustning. Exponering för UV-ljus snabbt skadar DNA, vilket kan orsaka fel nedströms experiment såsom ligatur och omvandling1. UV-ljus är också skadlig för hud och ögon, som kräver noggrann säkerhetsföreskrifter.
Den andra fördelen till är att det erbjuder möjligheten att skifta från UV excitation. Detektering med blått ljus (ersätter steg 3 till steg 4) eliminerar skador på DNA och begränsar risken att vetenskapsmannen. Blue-light excitation och upptäckt av till kan uppnås med en blue-light-transilluminator, och även med en billig blå LED-ficklampa (båda ~ 470 nm maximala utsläpp våglängd, båda kräver en bärnstensfärgad utsläpp filter). Korrekt tillämpning av magnetiseringen våglängder (steg 4.1) och utsläpp filter (steg 4,2) är viktig för framgången av experiment (se även steg 5.1). Ljuskällor och utsläpp filter är lätt tillgängliga, dock, och med minimal investering, labs kan få fördelar av blå-ljus excitation och undvika UV-ljus skador.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av start medel till TDG från Christopher Newport universitet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-log DNA ladder | New England Biolabs | N0469S | |
| Agarose (Genetic Analysis Grade) | Fisher | BP1356-100 | |
| Blue-light flashlight | WAYLLSHINE (Amazon) | WAYLLSHINE Scalable Blue LED | |
| ChemiDoc MP | Biorad | 1708280 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| ethidium bromide | Fisher | BP1302-10 | For comparison, not necessary for protocol |
| Gel apparatus (Owl Easy Cast) | Thermo Scientific | B1A | |
| Qiagen Qiaquick Gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Safe Imager Viewing Glasses | Invitrogen | S37103 | Necessary for using blue light flashlight.* |
| SafeImager 2.0 (Blue light transilluminator) | Invitrogen | G6600 | Blue light flashlight may be used as alternative |
| SYBR Safe | Invitrogen | S33102 | For comparison, not necessary for protocol |
| TAE (Tris-Acetate-EDTA) | Corning | 46-010-CM | |
| Thiazole orange | Sigma-Aldrich | 390062 | |
| *Glasses are also included with Invitrogen G6600 | |||
References
- O'Neil, C. S., Beach, J. L., Gruber, T. D. Thiazole orange as an everyday replacement for ethidium bromide and costly DNA dyes for electrophoresis. Electrophoresis. 39 (12), 1474-1477 (2018).
- McCann, J., Choi, E., Yamasaki, E., Ames, B. N. Detection of carcinogens as mutagens in the Salmonella/microsome test: assay of 300 chemicals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (12), 5135-5139 (1975).
- Evenson, W. E., Boden, L. M., Muzikar, K. A., O’Leary, D. J. 1H and 13C NMR Assignments for the Cyanine Dyes SYBR Safe and Thiazole Orange. The Journal of Organic Chemistry. 77 (23), 10967-10971 (2012).
- Beaudet, M., Cox, G., Yue, S. Molecular Probes, Inc. , USA. WO/2005/0333342 (2005).
- Pfeifer, G. P., You, Y. H., Besaratinia, A. Mutations induced by ultraviolet light. Mutation Research. 571 (1-2), 19-31 (2005).
- Cariello, N. F., Keohavong, P., Sanderson, B. J., Thilly, W. G. DNA damage produced by ethidium bromide staining and exposure to ultraviolet light. Nucleic Acids Research. 16 (9), 4157 (1988).
- Hartman, P. S. Transillumination can profoundly reduce transformation frequencies. BioTechniques. 11 (6), 747-748 (1991).
- Lee, L. G., Chen, C. H., Chiu, L. A. Thiazole orange: a new dye for reticulocyte analysis. Cytometry. 7 (6), 508-517 (1986).
- Nygren, J., Svanvik, N., Kubista, M. The Interactions Between the Fluorescent Dye Thiazole Orange and DNA. Biopolymers. , 1-13 (1998).
- Svanvik, N., Westman, G., Wang, D., Kubista, M. Light-Up Probes: Thiazole Orange-Conjugated Peptide Nucleic Acid for Detection of Target Nucleic Acid in Homogeneous Solution. Analytical Biochemistry. 281 (1), 26-35 (2000).
- Yang, P., De Cian, A., Teulade-Fichou, M. P., Mergny, J. L., Monchaud, D. Engineering Bisquinolinium/Thiazole Orange Conjugates for Fluorescent Sensing of G-Quadruplex DNA. Angewandte Chemie International Edition. 48 (12), 2188-2191 (2009).
- Fang, G. M., Chamiolo, J., Kankowski, S., Hovelmann, F., Friedrich, D., Lower, A., Meier, J. C., Seitz, O. A bright FIT-PNA hybridization probe for the hybridization state specific analysis of a C → U RNA edit via FRET in a binary system. Chemical Science. 9 (21), 4794-4800 (2018).
- Pei, R., Rothman, J., Xie, Y., Stojanovic, M. N. Light-up properties of complexes between thiazole orange-small molecule conjugates and aptamers. Nucleic Acids Research. 37 (8), e59-e59 (2009).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), 1-5 (2012).
- Vogelstein, B., Gillespie, D. Preparative and analytical purification of DNA from agarose. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 615-619 (1979).
