Summary
우리는 실리콘 고무 (PDMS)로 제작 된 높은 처리량 견인력 분석방법을 제시한다. 이 새로운 분석은 다양한 생물학적 및 생물 의학 적 과정 및 질병 동안 세포 수축성의 물리적 변화를 연구하는 데 적합합니다. 우리는 상피-중간엽 전이 동안 수축성의 TGF-β 의존적 증가를 측정함으로써 이 방법의 유용성을 입증한다.
Abstract
세포 수축은 생물학의 다양한 측면에서 필수적이며, 운동성과 분열에서 부터 조직 수축 및 기계적 안정성에 이르기까지 다양한 과정을 유도하며 다세포 동물 생명의 핵심 요소를 나타냅니다. 부착 된 세포에서 acto-myosin 수축은 세포가 기판에 발휘하는 견인력에서 보입니다. 세포 수축의 dysregulation는 무수한 병리학에서 나타나며, 수축은 생물 물리학을 지표로 사용하는 다양한 진단 접근법에서 유망한 표적으로 만듭니다. 더욱이, 새로운 치료 전략은 세포 수축의 명백한 오작동을 교정에 기초할 수 있다. 그러나 이러한 응용 프로그램에는 이러한 힘의 직접 정량화가 필요합니다.
당사는 실리콘 엘라스토머 기반 견인력 현미경(TFM)을 병렬화된 다중 웰 형식으로 개발했습니다. 실리콘 고무, 특히 폴리디메틸실록산(PDMS)을 사용하여 일반적으로 사용되는 하이드로겔 폴리아크릴아미드(PAA)보다 특수 한 보관 조건이 필요하지 않은 무기한 유통 기한으로 견고하고 불활성 기판을 만들 수 있습니다. GPa 범위에 계수가 있는 기둥-PDMS 기반 접근법과 달리 여기에서 사용되는 PDMS는 약 0.4 kPa에서 100kPa에 이르는 매우 규정을 준수합니다. 우리는 이러한 대형 모놀리식 기판을 생화학적으로 독립적인 웰로 공간적으로 분할하여 TFM용 고처리량 플랫폼을 만들고, 기존 멀티웰 시스템과 호환되는 견인력 스크리닝을 위한 멀티 웰 플랫폼을 만들었습니다.
이 원고에서는 이 다중 웰 견인력 시스템을 사용하여 중형 전이(EMT)에 대한 상피를 검사합니다. 우리는 TGF-β에 노출시킴으로써 NMuMG 세포에서 EMT를 유도하고 EMT 동안 생물물리학적 변화를 정량화합니다. 우리는 TGF-β 노출의 농도 및 지속 시간의 함수로서 수축성을 측정합니다. 여기에서 우리의 사실 인정은 질병 생물물리학의 맥락에서 병렬화된 TFM의 유용성을 보여줍니다.
Introduction
Acto-myosin 수축은 활성 세포 역학의 필수 요소, 줄기 세포 분화운동성 및 증식에서 세포 행동에 영향을 미치는. 조직에서 수축성은 배아 발생의 극성 분리에서 기도 수축 및 심장 활동으로 의 활동을 유도합니다. 비판적으로, 긴장을 생성하기 위하여는, 세포는 첫째로 그들의 세포외 환경에 부착해야 합니다. 이 과정에서 이 수축은 주변 환경에 견인력을 생성합니다. 견인력 현미경 검사법 (TFM)은 다른 조건하에서 다양한 세포에서 이 힘을 정량화하는 쪽으로 양식의 다수에서 나타났습니다.
TFM 분야는 혁신과 응용의 뛰어난 폭을 보았다, 그 결과는 역학과 물리적 힘을 통합 생물학의 새로운 관점에 대한 길을 열었습니다. 주름 실리콘 기판 1을시작으로 연구자들은 세포 견인력을 측정하기 위해 다양한 기술을 적용했습니다. 이러한 접근법은 지속적으로 개선되었으며 이제 몇 미크론2의순서로 해상도 수준에 도달했습니다. 그러나, 한 가지 주요 문제점이 대두되고 있는데, 이는 사용 가능한 실리콘을 이용하여 적당히 낮은 변계의 기판을 만드는 데 어려움이 있다. 이러한 문제점을 회피하기 위해, 폴리아크릴아미드는 1-20 kPa 3의 순서로 기판을 쉽게생성하기 때문에 대체품으로 채택되었다. 우리는 최근에 TFM 4에서매우 준수 실리콘을 구현하여 폴리 아크릴 아미드와 동일한 범위의 모듈을 제작 할 수 있지만 불활성 및 견고한 실리콘의 장점을 가지고 있습니다.
TFM 접근은 귀중한 메카노 생물학 발견을 가능하게 했습니다, 그러나, 지속적인 결점은 그들의 복잡성, 수시로 공학 또는 물리 과학 분야의 연구원에게 그들의 사용을 제한합니다. 이는 계약을 정량화하는 데 필요한 세부 교정 및 까다로운 계산에 큰 부분을 차지합니다. 또 다른 중요한 과제는 TFM 방법은 대체로 처리량이 낮기 때문에 많은 다른 조건 이나 인구를 동시에 연구하기에 적합하지 않다는것입니다 5. 이것은 병목 현상을 제시했습니다, 이는 광범위한 생물학 및 약리학 응용으로 전문가 생물 물리학 조정에서 TFM의 전송을 방해했습니다.
우리는 최근에 연구원이 다른 화합물의 충격을 탐구하고 또한 더 적은 시약을 사용하여, 수축메트릭의 빠른 정량화를 위해 그들의 TFM 측정을 병렬화하는 것을 허용하는 다중 웰 포맷 TFM 격판을 개발했습니다4 . 이 방법론은 세포 활동에 대한 화합물의 효과를 평가하는 것에서부터 분화 또는 질병의 수축 변화를 정량화하는 것까지 다양한 메카노생물학 연구에서 광범위한 유용성을 가지고 있습니다.
TFM에서 크게 유익할 생물 의학 연구의 한 지역은 물리적 인 단서가 암세포의 악성 표현형에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 연구입니다. 전이, 암 관련 죽음의 90%를 책임지는, 암 세포가 그들의 본래 종양 사이트를 떠나 이차 사이트를 식민지화하는 특징입니다. 세포가 조직을 통해 이동하고 혈관 시스템 밖으로 통과하는 경우, 그들은 근본적으로 세포 외 매트릭스를 따라 자신의 길을 당기거나 다른 사이에 이동하는 상당한 힘을 생성하는 동안 이러한 물리적 장벽을 통해 짜내 자신의 모양을 변경해야합니다 셀. 이러한 힘은 초점 접착 상호작용2,3을통해 기판으로 전달되고 TFM을 사용하여 정량화될 수 있다. 암은 생화학적으로 매우 다양하지만, 알려진 돌연변이와 단백질 변화의 레퍼토리가 확대되면서 몇 가지 일반적인 물리적 변화가 관찰되었습니다. 유방암, 전립선암 및 폐암을 포함한 다양한 암에서, 전이성 세포는 전이성 세포의 견인력의 2-3배를발휘하는 것으로 나타났다 6,7,8. 이러한 결과는 전이성 진행과 세포에 의해 가해지는 견인력 사이에 강한 상관관계가 있을 수 있음을 시사한다. 그러나, 계약에 있는 상세한 시간 의존적인 변경은 검토하기 어렵습니다.
상피-중간엽 전이(EMT)는 세포가 부착체 및 접합 접매 세포 접착을 감소시켜 더 많은 철새와 침습이 되는 과정입니다. 상처 치유 및 발달 과정을 포함하는 생리적 기능 외에도 EMT는 전이 중에 악용되는 프로세스이기 때문에이 과정을 연구하는 데 유용한 모델 시스템입니다. TGF-β를 사용하여, 우리는 뮤린 유방 상피 세포 (NMuMG)9에서 EMT를 유도하여 이러한 변형 동안 물리적 변화를 직접 정량화하고, EMT 및 세포 수축성에 대한 TGF-β의 시간 및 용량 의존적 효과를 특성화할 수 있다. 이 문서에서는 유도된 EMT 동안의 수축도 변화를 측정하여 이 접근법의 유용성을 입증합니다.
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Protocol
참고: 다음 프로토콜은 그림1에 표시된 다중 웰 TFM 접시를 제작하고 사용하는 연구원을 안내합니다.
1. PDMS 실리콘 기판의 제조
- 시판되는 두 키트의 복합 혼합물에 기초한 PDMS 실리콘 고무 혼합물의 제조.
- PDMS 키트의 파트 A 및 파트 B(예: GEL-8100, 재료 표참조)를 50mL 튜브에 1:1 중량 비로 추가합니다.
참고: 혼합물은 회전하는 동안 혼합물이 앞뒤로 흐를 정도로 느린 속도로 회전자 위에 혼합되어 완전한 혼합을 보장합니다. - 기판의 원하는 계수에 필요한 경화제양을 첨가한다.
참고: 혼합물에 첨가되는 경화제의 양은 기판의 원하는 계수에 따라 달라지며 전형적으로 0.1%에서 1.8%까지 다양할 수 있다. 특정 크로스링커 농도 및 결과 모듈리에 대한 가이드는 표 1 및 그림 3을 참조하십시오. - 30-45 분 동안 회전자 상에 제형을 혼합; 철저한 혼합을 위해 회전이 충분히 느려지는지 확인하십시오.
- PDMS 키트의 파트 A 및 파트 B(예: GEL-8100, 재료 표참조)를 50mL 튜브에 1:1 중량 비로 추가합니다.
- 하단 층 : 유리 슬라이드에 PDMS 기판을 코팅
- 그림 2에 표시된 사용자 지정 척을 스핀 코터에 놓습니다. 에탄올이나 이소프로판올로 유리를 닦고 보풀이 없는 물티슈로 말립니다. 유리 슬라이드를 척에 넣고 진공을 켜서 슬라이드를 제자리에 고정시십시오.
- 가장자리에서 약 1cm 떨어진 경화되지 않은 PDMS를 적용하고 중앙쪽으로 작업합니다. 전체 표면이 덮여 있는지 확인하기 위해 충분한 (3-4 mL) PDMS를 적용합니다.
참고: PDMS가 유리 표면에 고르게 퍼지도록 하기 위해 피펫 팁은 PDMS 혼합물을 중앙에서 가장자리로 확산시키는 데 도움이 될 수 있습니다. - 다음 프로토콜을 통해 PDMS 혼합물로 유리를 스핀 코터에 돌입니다.
- 슬라이드에 경화되지 않은 PDMS를 확산하려면 0에서 200 rpm까지 50 rpm /s로 가속하십시오. 1 분 동안 200 rpm에서 유지합니다.
- 100 μm 두께의 PDMS 층을 얻으려면 50 rpm / s에서 300 rpm으로 가속하고 300 rpm에서 1 분 동안 유지하십시오. 100 μm 이외의 다른 원하는 두께는 특정 속도 값이 필요합니다.
- 제거하려면 50rpm/s에서 0rpm으로 감속합니다. 진공을 비활성화하고 코팅 된 표면에 닿지 않도록주의하면서 코팅 된 슬라이드를 제거하십시오.
참고: 매끄러운 연속 표면을 보장하기 위해 가속 및 감속 단계를 포함하는 것이 중요합니다.
주의: 샘플이 척에서 날아가지 않도록 하려면 맞춤형 홀더를 사용하여 슬라이드를 고정하고 진공 및 기존 플랫 척에 만전을 기해야 합니다. 이 홀더의 세부 사항 및 사양은 그림2에 있습니다.
- 스핀 코팅 샘플을 제조업체 권장 온도(100°C)에서 오븐에 2시간 동안 놓습니다.
참고: 시료가 배치된 오븐의 표면은 시료의 균일한 가열 및 두께를 보장하기 위해 고체(즉, 와이어 랙이 아님) 및 레벨 표면이어야 합니다. 세라믹 또는 강판은 이상적인 표면을 만듭니다.
- 상단 비드 레이어
- 나머지 PDMS 혼합물에 적절한 비율로 비드 용액을 첨가한다.
참고: 이 비율은 스톡 비드 용액의 농도와 샘플의 원하는 비드 밀도에 따라 달라집니다. 일반적인 최종 값은 9.2 x 1011 비드/mL 및 0.05-0.2 비드/μm 2이며, 비드의 과잉은 일반적으로 부적절한 양보다 바람직하다. - 비드 용액을 경화되지 않은 PDMS와 혼합합니다. 이것은 대략 30 분 동안 회전자에 튜브를 배치하고, 1-2 분 동안 소용돌이, 또는 30 분 동안 초음파 처리함으로써 달성 될 수있다. 이러한 방법은 결합될 수 있다.
참고 : 우리의 응용 프로그램에서, 우리는 초음파가 비드 응집체를 파괴에 효과적이며, 회전혼합에 효과적이라는 것을 발견한다. 합성 된 신탁 비드는 저장에 집계 할 수 있습니다. 사용하기 전에 헥산에서 다시 일시 중단하고 초음파 처리할 수 있습니다. 상당한 큰 응집체가 있는 경우, 5 μm 주사기 필터를 통해 비드 현탁액을 필터링할 수 있다. 이 여과 단계는 선택 사항입니다. 그것은 단색 분산 된 구슬로 샘플을 코팅하는 데 도움이되지만, 구슬의 상당한 부분은 필터에서 손실 될 수있다. - 오븐에서 슬라이드를 꺼내 실온으로 식히고 스핀 코터에 놓습니다.
- 코팅된 샘플의 표면에 비드 및 미경 PDMS 혼합물의 3-4 mL를 추가합니다.
참고 : 구슬이 첨가 된 혼합물은 헥산으로 인해 점성이 적습니다. 이미 코팅된 PDMS 기판이 손상될 수 있으므로 기판표면에 닿지 않도록 하십시오. 부가적으로, 비드 혼합물은 처음에 표면을 적시지 않을 수 있다; 혼합물이 경화 된 PDMS 표면에서 즉시 흐르지 않도록주의하십시오. - 다음 프로토콜로 샘플을 회전시면 됩니다.
- 비드 및 경화되지 않은 PDMS 혼합물을 확산하려면 0에서 500 rpm까지 100 rpm /s로 가속하십시오. 1 분 동안 500 rpm에서 유지합니다.
- 비드 내장 PDMS (~ 1 μm)의 얇은 층을 달성하기 위해, 500 ~ 5000 rpm에서 200 rpm / s에서 가속; 10s에 대한 5000 rpm에서 개최.
- 제거하려면 100rpm/s에서 0rpm으로 감속합니다. 진공을 비활성화하고 코팅 된 표면에 닿지 않도록주의하면서 코팅 된 슬라이드를 제거하십시오.
- 스핀 코팅 샘플을 오븐에 100°C에서 1시간 동안 놓습니다.
참고: 100°C 이상의 온도 또는 1시간 보다 긴 지속 시간은 비드 형광을 감소시킬 수 있습니다. 오븐 온도가 100 °C로 설정되어 있지 않은지 확인하십시오. - 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. 샘플을 저장하려면 먼지와 빛노출을 피하기 위해 표면을 덮습니다. 표면에 닿지 않는 지 확인합니다. 샘플은 실온에서 무기한 으로 선반에 안정적입니다.
- 나머지 PDMS 혼합물에 적절한 비율로 비드 용액을 첨가한다.
- 플레이트 조립
- PDMS 엘라스토머 키트의 파트 A(염기) 및 파트 B(예를 들어, 실가드)를 10:1 중량 비로 50 mL 튜브에 추가합니다.
- 30-45 분 동안 회전자에 혼합물을 섞는다.
참고: 한 접시에 5 mL의 베이스를 경화제 0.5 mL와 혼합합니다. 혼합물의 점도를 줄이기 위해 최대 1 mL의 헥산을 첨가 할 수 있습니다. - 혼합물을 분배기 의 바닥에 적용하고 혼합물을 확산시다.
참고: 칸막이는 거꾸로 놓아야 합니다. - 기판을 디바이더에 거꾸로 놓습니다.
- 샘플을 오븐에서 거꾸로 65°C에서 2시간 동안 놓습니다.
- 오븐에서 샘플을 꺼내 70% 에탄올 또는 이소프로판올로 유리 바닥을 청소하여 PDMS 잔여물을 제거합니다.
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. 샘플을 저장하려면 기판에 뚜껑을 놓고 빛에 노출되지 않도록 장치를 알루미늄 호일에 감쌉니까? 샘플은 실온에서 무기한 으로 선반에 안정적입니다. 이 방법에 사용되는 디바이더는 96웰 형식입니다. 그러나, 연구원은 원하는 실험 설정 및 분할 구조의 가용성에 따라 다른 형식 (384 웰, 2 웰, 4 웰, 8 웰 등)을 사용할 수 있습니다. 일부 추가 최적화가 필요할 수 있습니다.
2. 표면 기능화
- 0.1 M HEPES 완충액(pH 7-9)의 40 mL에서 80 μL의 설포-SANPAH 알리쿼트를 용해시다.
참고: 멸균 디메틸 설폭사이드(DMSO)의 2 mL에 설포-SANPAH 분말 100 mg을 용해시켜 설포-SANPAH 알리쿼트준비합니다. 0.22 μm 기공 필터를 통해 멸균 탈이온수 및 필터의 450 mL에 HEPES 의 50 mL을 희석하여 0.1 M HEPES 완충을 준비합니다. - 희석된 설포-SANPAH 용액 200 μL을 96웰 플레이트의 각 웰에 첨가합니다.
- 적절한 거리와 지속 시간에 플레이트를 UV(300-460nm) 광에 노출시다.
참고: 자외선 노출 후에는 용액의 색상이 더 어두워야 합니다. UV 노출 거리와 지속 시간은 UV 램프 전원에 따라 다릅니다. 우리의 응용 프로그램에서, 우리는 5cm의 거리에서 10-15 분 동안 노출. - 우물에서 Sulfo-SANPAH 용액을 제거하고 각 우물에 5 μg/mL fibronectin 용액 200 μL을 추가합니다.
참고: 연구원이 지정한 단백질은 표면 코팅에 사용할 수 있습니다. 몇몇은 일반적으로 이용되는 단백질은 교원질, 섬유넥틴 및 라미닌입니다. 우리는 Sulfo-SANPAH가 가장 효과적인 방법이라는 것을 발견했으며, 때때로 PDMS에 고용되는 동안 플라즈마 세척은 이산화규소 층을 생성하고 표면을 눈에 띄게 손상시키기 때문에 권장되지 않습니다. - 밤새 4 °C에서 접시를 배양.
참고 : 코팅에 사용되는 단백질에 따라 다른 배양 방법을 적용 할 수 있습니다. - 피브로넥틴 용액을 제거하고 인산완충식염수(PBS)로 각각 잘 세척합니다.
- 샘플에 뚜껑을 놓습니다.
- 각 우물에 200 μL의 PBS를 추가합니다.
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. 섬유넥틴 코팅 된 샘플은 최대 2 주 동안 4 °C에서 보관할 수 있습니다.
3. UV 살균
- 30 분 동안 생물학적 안전 캐비닛에서 UV 빛 아래 샘플을 살균하십시오.
참고: 자외선 노출 시간이 길수록 비드 형광에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 모든 후속 단계는 멸균 조건하에서 수행해야 합니다.
4. 세포 배양
- 각 웰에서 PBS를 제거하고 배양 배지에 부유 된 세포의 200 μL을 각 웰에 추가합니다.
- 원하는 세포 밀도로 세포를 플레이트합니다. 세포 밀도는 원하는 실험에 의존한다. 단세포 연구의 경우, 세포는 최소 50 μm 떨어져 있어야 하며 이미징 창 의 가장자리 근처의 셀은 TFM 측정에 포함되지 않아야 합니다. 단층 셀의 경우 이미징 창에는 셀의 결합층으로 덮인 보기 필드가 있어야 합니다.
- 5% FBS, 10 mM HEPES, 10 μg/mL 인슐린, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 1 mML-글루타민, 0.5 μg/mL 암포테리신 B로 DMEM을 보충하여 NMuMG 세포에 대한 완전한 성장 배양 배지를 준비합니다.
- 산성수(130 mL의 빙하 아세트산 2.5mL)를 10 mg/mL의 농도로 재구성하여 인슐린 스톡을 준비합니다. 스톡 용액을 4°C에 보관하십시오. 용액이 명확해질 때까지 기다린 다음 0.22 μm 기공 필터를 통해 필터링합니다.
- TGF-β 추가
- TGF-β 스톡을 제조하려면 TGF-β 2 μg를 100 μL의 100 μL(pH 3.0)에 용해시키고 0.22 μm 의 기공으로 살균하는 필터를 사용합니다. 원하는 볼륨으로 튜브와 알리쿼트 소용돌이. 알리쿼트(aliquots)를 -80°C에 보관하십시오.
- 최종 TGF-β 농도인 3 ng/mL의 세포 배양 배지를 구성하는 완전한 세포 배양 배지의 10 mL에 TGF-β 스톡 용액의 1.5 μL을 첨가한다.
참고 : 10 mM pH 3.0 구연산을 만들려면 물에 산을 희석하고 HCl을 추가하여 pH를 3.0으로 조정하십시오.
5. 데이터 수집
- 각 위치에 대해 수탁자 입자 및 셀의 이미지를 하나 이상 획득합니다. 비드 레이어에 초점을 맞춥니다.
참고: 사용 중인 수탁자 입자의 크기와 이미지 처리 방법에 따라 픽셀 크기를 최적화해야 합니다. 이 응용 프로그램에서 저자는 10x 0.4 NA 목표를 사용하고 이미지는 455 nm / 픽셀과 1024 x 1024 해상도로 획득됩니다. 일반적으로 비드당 최소 1~5픽셀의 해상도를 유지하는 것이 좋습니다. 여기서, 구슬은 폴리 분산이며 300-500 nm의 개별 크기를 가지고있다. 형광 수탁구슬이 TFM 계산에 사용되는 이미지에 초점을 맞추는 것이 중요합니다. 비드의 초점과 이미징 품질은 세포 자체의 이미징보다 우선 순위를 지정해야 합니다. 구슬의 이미징 스펙트럼에 나타나는 신탁 구슬에서 다른 채널, 특히 어떤 형광사이에 크로스 토크가 없어야합니다. - 관심 있는 모든 위치가 기록되면 각 웰에 분리 솔루션을 추가하여 수탁자 입자의 무분별한 참조 이미지를 획득합니다.
- 세포 분리 용액을 준비하려면 2 % TritonX-100, 50 mM 나트륨 아지드 및 500 mM 수산화 칼륨을 포함하는 수성 용액을 혼합하십시오.
참고: 위의 방법은 효과적인 분리 솔루션의 예로 제공됩니다. 연구원의 재량에 따라 다른 분리 솔루션은 기판 표면에서 세포를 분리하는 데 사용될 수 있습니다.
- 세포 분리 용액을 준비하려면 2 % TritonX-100, 50 mM 나트륨 아지드 및 500 mM 수산화 칼륨을 포함하는 수성 용액을 혼합하십시오.
6. 이미지 분석
- 원하는 대로 적절한 이미지 분석을 수행합니다.
참고: 분석 소프트웨어는 사내에서 개발되었습니다. 이미지 분석은 온라인으로 사용할 수 있는 맞춤형 소프트웨어 또는 소프트웨어로 수행할 수 있습니다.
7. 비드 합성
참고: 다음 프로토콜은 Klein et.10에 의해설명된 합성 방법에 기초한다.
- 연기 후드 아래에서 수냉식 환류 응축기로 3넥 플라스크를 준비합니다.
주의: 통풍이 잘 되는 화학 연기 후드에 합성을 설정합니다. - 플라스크에 PDMS 안정제와 불소 0.5 mL를 추가합니다.
- 질소 입구 바늘과 출구 바늘 고무 중격 한 목 장비 와 주사기와 시약을 추가하기위한 고무 중격다른 목을 장비.
- 플라스크에 250 mL에 무수 헥산 100 mL를 추가하고 작은 자기 교반 바를 추가합니다.
- 플라스크를 미네랄 오일 욕조에 75°C로 놓고 질소 가스로 1시간 동안 제거합니다.
- 25 mL 둥근 바닥 플라스크에 메틸메타크릴레이트 6 mL를 추가합니다.
- 둥근 바닥 플라스크에 0.100 g의 2,2'-azobisobutyritrile (AIBN)를 추가하고 1 시간 동안 질소 가스와 혼합물을 제거합니다.
참고: 미리 포장된 컬럼을 통해 메틸라메타크릴레이를 세척하여 사용 전에 억제제가 제거됩니다. 메틸라메타크릴레이트와 AIBN 혼합물을 3넥 플라스크에 추가합니다. - 용액은 처음에는 흐리고 유백색으로 변합니다. 용액이 흐린 후 반응이 3 시간 동안 실행되도록하십시오.
- 3 시간 후, 얼음 물 욕조에 플라스크를 놓습니다.
- 거친 필터 용지로 솔루션을 진공 여과합니다.
- 여과액을 원심분리하고 헥산에서 입자를 다시 현탁한다.
참고: 첨가할 헥산의 부피는 비드 용액의 원하는 농도에 따라 달라집니다. 초음파 처리는 헥산 용액에서 비드 입자의 재분산을 용이하게합니다. 저자에 의해 생산 된 구슬은 약 300-500nm의 폴리 분산 직경을 갖는다. 변위를 결정하기 위해 상호 상관 패턴 추적을 사용하기 때문에 단분산 비드는 필요하지 않습니다.
8. 회병측정 프로토콜
참고: 유변학은 모든 연구자 또는 실험에 필요하지 않지만 PDMS의 새로운 제형에 대한 계수를 정량화하는 데 필요합니다. 이 프로토콜에서는 전단 레오미터를 사용하여 PDMS 샘플의 계수에 대한 크로스링커, 주파수 및 변형의 영향을 측정합니다. 사용 가능한 도구 및 전문 지식에 따라 moduli는 다른 많은 기계적 분석 접근 방식을 사용하여 측정할 수도 있습니다. 또한, 이 프로토콜을 사용하는 연구자들은 표 1, 그림 3및 그림4에 제시된 당사의 게시된 변둘이를 사용하도록 선택하도록 할 수 있습니다.
- 직경 25mm 병렬 플레이트 형상이 있는 레오미터를 사용합니다. 다른 형상을 사용할 수 있습니다.
- 시스템을 초기화하고 장치 및 측정 시스템(병렬 플레이트, d = 25mm)을 교정합니다. 0 간격을 측정한 후 PDMS 샘플을 로드하기 시작합니다.
- PDMS 엘라스토머와 가교제가 혼합되자마자, 레오미터의 바닥 판에 혼합물을 피펫.
- 스핀들이 아래로 이동하여 PDMS 샘플의 상단에 완전히 접촉합니다.
- 적재된 시료를 바닥판에서 조심스럽게 다듬습니다.
- 스트레인 스윕 테스트에서 는 다양한 가교 밀도를 가진 각 컴포지션에 대해 증가하는 균주를 적용하여 모든 전단 측정 중에 폴리머 구조가 선형 점탄성 정권에 남아 있도록 합니다.
참고: 세포 연구와 관련된 변형값은 일반적으로 0.1-10%의 범위에 있습니다. PDMS는 최대 약 100% 변형률까지 선형인 것으로 나타났습니다. - PDMS 네트워크의 동적 전단 저장 계수(G') 및 손실 계수(G′)를 1Hz의 주파수와 100°C에서 0.5%의 진동 전단 변형으로 시간 스윕 테스트로 측정합니다.
- 최종 PDMS 네트워크의 점탄성 및 시간 종속성을 확인하려면 0.1-100Hz 범위의 주파수와 0.5%의 진동 전단 변형을 사용하여 주파수 스윕 테스트를 적용합니다.
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Representative Results
TGF-β를 첨가하기 전에, 세포의 결합 된 단층은 모양과 같은 조약돌을 가지고 단단히 포장된다. TGF-β 처리시, 세포는 세포 영역을 확대하고 더 중간 엽 표현형을 취득, 형태학에서 더 길쭉해진다. 연약한 PDMS 엘라스토머로 제조된 다중 웰 디바이스를 활용하여, 총 17개의 상이한 조건에서 세포의 물성을 연구하였다. 세포를 4개의 상이한 TGF-β 농도(0.5, 1, 2 및 4 ng/mL)와 4개의 상이한 인큐베이션 시간(12, 24, 48, 96 h)으로 처리하였고, 이들 결과는 도5에 요약된다. TGF-β로 처리된 세포는 TGF-β 없이 배양된 세포보다 더 큰 견인 응력 및 변형 에너지를 적용하였다. 96h에 대한 TGF-β로 배양된 세포는 가장 큰 견인 응력 및 변형 에너지를 보였다. 세포는 TGF-β의 더 높은 농도로 취급될 때 더 큰 응력 및 긴장 에너지를 적용했습니다. 견인력과 스트레인 에너지의 차이는 더 긴 배양 시간에 더 뚜렷했다.
기질의 표면은 섬유넥틴 또는 콜라겐과 같은 리간드로 부드럽고 균일하게 코팅되어야 합니다. 긁힌 표면 및/또는 리간드의 균일하지 않은 코팅은 부적절한 셀 부착으로 이어져 부정확한 견인 력 측정을 초래할 수 있습니다. 도 6은 불균일한 기판 표면으로 인한 국부적인 견인 응력을 나타낸다.
그림 1 : 멀티 웰 플레이트 제작 개요. (A) 커스텀 컷 글래스 슬라이드가 시작점입니다. (B) 유리 슬라이드는 두꺼운 코팅 (~ 100 μm PDMS층). (C) 수인제 비드 층(녹색으로 표시)은 이전 층 위에 ~1 μm 두께의 층으로 스핀 코팅됩니다. (D) 멀티 웰 디바이더는 수탁자 비드 층 위에 조심스럽게 놓습니다. (E) 완전한 멀티 웰 플레이트가 조립되어 사용 또는 보관할 준비가 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 스핀 코터를 위한 커스텀 척. 표준 스핀 코터 척에서 바닥 유리(PDMS가 코팅된 경우)가 날아가는 것을 방지하기 위해 맞춤형 홀더를 척에 놓습니다. (A) 스핀 코터 척용 맞춤형 홀더. (B) 모든 치수가 있는 홀더의 엔지니어링 도면. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 크로스 링커 농도 (wt %)를 변경하여 기판 강성. PDMS 혼합물은 설명된 대로 제조되며, 추가적인 가교 율은 1.8 중량 퍼센트(wt%)에서 최대 100 kPa까지 탄성 계수를 증가시킵니다. 크로스 링커. 가이드로서, 가교 링커의 함수로 계수는 선형으로 적합, 이는이 범위 내에서 특정 원하는 모듈러스에서 자신의 혼합물을 공식화하는 연구원에 의해 사용될 수있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 100 °C의 온도에서 가교제의 0, 0.15, 0.36 및 1 wt%를 함유하는 PDMS 탄성중합체의 유병자. 삼각형 기호는 손실 계수(G')를 나타내고 사각형 기호는 저장 계수(G')를 나타냅니다. (A) 1Hz의 주파수에서 진동 시간 스윕및 겔화 시 0.5%의 전단 변형. (B) 0.5%의 전단 변형에서 PDMS 네트워크의 진동 주파수 스윕. (C) 1Hz의 주파수에서 PDMS 네트워크의 스트레인 스윕. 모든 데이터 요소가 세 배로 획득되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 멀티 웰 포맷의 견인 응력 장치를 활용한 대표적인 결과. 상이한 조건에서 세포의 단층은 수축성 및 변형 에너지를 측정하기 위해 다중 웰 장치에서 배양되었다. (A) 다른 TGF-β 농도에 대한 TGF-β 배양 시간이 증가함에 따라 견인 응력그래프. TGF-β 농도 및 인큐베이션 시간이 증가함에 따라 견인 응력이 증가했습니다. 모든 데이터는 다음을 제외한 대조군(즉, TGF-β 없음)에 대하여 통계적으로 유의하다: 12 h-0.5 ng, 12시간 - 1 ng, 48h-1 ng. (B) 상이한 TGF-β 농도에 대한 TGF-β 배양 시간이 증가하면서 변형 에너지의 그래프. TGF-β 농도 및 인큐베이션 시간이 증가함에 따라 스트레인 에너지가 증가했습니다. 샘플 크기범위는 n = 7에서 n = 15입니다. 모든 데이터는 다음을 제외한 대조군(즉, TGF-β 없음)에 대하여 통계적으로 유의하다: 12 h-0.5 ng, 12-1 ng, 24 h-0.5 ng, 24 시간 - 1 ng, 48 h- 1 ng. 통계적 유의는 정규 분포를 가정하지 않는 Kruskal Wallis 시험을 사용하여 결정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 : 대표적인 결과-최적(A, B) 및 만족스러운(C, D) 실험. (A) 기판 표면의 반사 이미지입니다. 먼지 나 섬유를 포함 할 수있는 원치 않는 오염 물질, 또는 스크래치와 같은 재료 결함이 기판 표면에 존재한다. (B) 셀 수축의 응력 맵: 불균일한 표면으로 인해 개체 주변에서 불규칙하고 부정확한 견인 응력이 관찰됩니다. (C) 기판 표면의 반사 이미지입니다. 명백한 오염 물질은 보이지 않습니다. (D) 셀 수축의 응력 맵: 아티팩트 불연속이 표시되지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 크로스링커 농도(wt%) | G'(파) | 표준 편차 | E (kPa) | 표준 편차 |
| 0 | 0.135 | 0.014 | 0.405 | 0.043 |
| 0.15 | 1개 | 0.1 | 3개 | 0.35 |
| 0.36 | 4.027 | 0.245 | 12.081 | 0.73 |
| 0.75 | 16.01 | 0.49 | 48.03 | 1.2 |
| 1개 | 18.44 | 0.989 | 55.32 | 1.94 |
| 1.5 | 27.638 | 0.93 | 82.91 | 1.64 |
| 1.8 | 33.986 | 0.88 | 101.94 | 1.088 |
| 2개 | 33.36 | 0.67 | 100.08 | 1.1 |
표 1: 크로스 링커 농도 (wt %)를 변경하여 기판 강성. 추가 크로스링커 농도를 변경하여 원하는 영의 변장의 PDMS 기판이 제작됩니다. PDMS 전단 계수계를 레오미터로 측정하고 영의 계수모를 결정하였다. 각 데이터 포인트에 대해 3개의 독립적인 준비가 수행되고 표준 편차가 제공됩니다.
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Discussion
이 방법의 성공을 위해 약 100 μm의 일정한 두께의 균일하게 코팅된 샘플을 사용하는 것이 중요합니다. 계수는 관심있는 생물학적 시스템의 물리적 중요성을 검사하기 위해 신중하게 선택해야합니다. 최상위 층을 제작할 때, 변위 및 견인 응력의 정확한 분석을 위해 피소형 입자의 농도를 최적화해야 합니다. 단리된 단일 세포를 분석하려면 최대 단일 층을 측정하는 것보다 밀도가 높은 신탁 층이 필요합니다. 부가적으로, 기판의 표면은 기질 표면에 세포의 적당한 부착을 보장하기 위하여 콜라겐, 섬유넥틴 및 라미닌과 같은 접착 분자의 안정적이고 균일한 코팅이 있어야 한다. 멀티 웰 디바이더를 부착할 때는 각별한 주의를 기울여야 합니다. 그것은 배양 표면에 얼룩에서 밀봉 PDMS 접착제를 방지하기 위해 슬라이딩하지 않고 배치해야하며, 외부 가장자리는 조심스럽게 국경 우물에 누출을 방지하기 위해 유리 치수와 정렬해야합니다.
우물이 새는 것을 방지하기 위해 적절한 양의 PDMS 접착제를 잘 분배기위에 적용하여 제자리에 고정시켜야 합니다. 그러나, 과도 한 양의 사용 세포 배양 표면을 커버 할 것 이다.
스핀 코팅 절차 중에 충분한 양의 PDMS를 추가해야 합니다. 경화 할 때 오븐과 랙은 수평이 되어야합니다. 부적절한 PDMS 또는 평평하지 않은 오븐은 고르지 않은 PDMS 두께로 이어질 수 있습니다.
비드 밀도는 적절한 분석을 위해 최적화되어야 합니다. 비드 밀도가 적절하지 않은 경우, 신탁 PDMS 혼합물에서 비드의 농도를 증가시킬 필요가 있다. 또한 스핀 코팅을 위해 적절한 양의 혼합물을 첨가해야 합니다. 수탁자 비드 입자의 적절한 형광 신호를 보장하려면 경화 상태를 주의 깊게 모니터링해야 합니다. 이 프로토콜에 명시된 것보다 더 긴 시간과 더 높은 온도는 형광을 저하시킬 수 있습니다. 시료 표면에 부적절한 단백질 코팅은 세포 부착이 불량할 수 있습니다. 이를 방지하기 위해 표면을 세척해야 하며 설포-SANPAH 및 리간드와 같은 시약의 만료를 점검해야 합니다. UV 노출 시간과 강도를 최적화해야 합니다. 면역형광 또는 다른 형광 단백질 구성은 균일한 리간드 코팅을 보장하기 위해 시험될 수 있다.
이 방법 및 PDMS 제제 세트로 제조된 장치는 0.4 kPa에서 100 kPa에 이르는 Young의 계수와 함께 기판에만 적용됩니다. 다른 계수는 대체 제형을 사용하여 가능할 수 있지만, 현재 범위는 생리학적으로 관련된 값의 큰 세트에 걸쳐 있다. 이 방법은 다중 웰 제작을 위해 특별히 사용되었지만 개별 슬라이드 또는 기타 슬라이드 형상을 준비하는 데 사용될 수도 있으며 이러한 경우 추가 사용자 문제 해결이 필요할 수 있습니다. 본 실시예에서, 상대적으로 두꺼운(1 mm) 유리 슬라이드가 채택되고, 반전된 현미경상에서 일반적인 높은 수치 조리개(NA) 목표를 배제한다. 얇은 유리를 사용하여 이러한 다중 웰 TFM 접시를 구성하는 것이 기술적으로 가능하지만, 가공 및 조립에서 이러한 것들의 취약성은 파손의 높은 비율을 초래할 수 있으며, 높은 처리량 접근 방식에 반대 실행할 수 있습니다. 더욱이, 표면 코팅은 장치의 광범위한 적용을 위해 더 조사될 수 있다.
멀티 웰 형식을 활용하여 높은 처리량의 실험이 가능합니다. 다중 웰 포맷은 TGF-β 처리를 가진 EMT 도중 NMuMG 세포의 물리적 인 변경을 단 하나 접시에 있는 다른 농도 그리고 다른 배양 시간의 조합으로 검토하는 가능하게 했습니다. 폴리아크릴아미드 겔과 같은 하이드로겔로 견인 응력 장치를 제조하는 방법에는 몇 가지 한계가 있습니다. 하이드로겔은 지배적인 성분이 물이기 때문에 염농도(삼투압), 온도, 습도 및 pH 변화에 민감합니다. 이러한 특성의 변화는 재료의 기계적 특성의 변화로 이어질 수 있으며, 샘플 사용 및 결과 해석에 특별한 주의가 필요합니다. 또한, 물을 갖는 하이드로겔은 감염에 더 취약하므로 특별한주의가 필요합니다. 수성 하이드로겔과 는 달리 실리콘 기반 PDMS는 안정적이고 불활성입니다. 제작이 완료되면 특별한 취급이나 보관 조건 없이 상온에서 무기한 보관할 수 있습니다.
PDMS의 불투과성 특성은 우리가 모놀리식 기판을 제조할 수 있게 해주며, 모든 웰이 기판 두께와 조성에서 진정으로 동일하도록 보장하는 동시에 독특한 생화학을 매체에 적용하거나 다른 세포가 각각 활용될 수 있도록 합니다. 잘. 하이드로겔 기반 표면은 확산 인자가 침투하여 이를 통과할 수 있게 해주며, 교차 오염을 방지하기 위해 분할된 우물에 하이드로겔을 추가해야 합니다.
이 방법을 통해 연구원은 세포 생물학의 기본 및 유비쿼터스 측면인 세포 수축성을 높은 처리량 방식으로 연구하여 보다 효율적이고 재현 가능한 데이터 수집을 가능하게 합니다. 이것은 견인력 현미경 검사를 수축성 힘 검열로 번역하는 것을 돕고, 연구원이 진정으로 세포 활동, 또는 화합물의 효험을 위한 메트릭으로 수축성을 사용하는 것을 허용합니다. 방법론으로, 이것은 세포의 물리학을 이해에서, 표준화된 세포 모형에 대하여 제약 화합물을 특성화하고 시험하는 에서 생물 물리학 및 생물 의학 과학에 걸쳐 광범위한 응용을, 또는 아마도 고도로 전문화했습니다 개인 의학에 대한 개별 세포.
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Disclosures
AJE와 RK는 이 문서에서 설명하는 자료를 제작하는 회사인 라이브 셀 테크놀로지스(Live Cell Technologies)에 관심을 가지고 있습니다.
Acknowledgments
저자들은 톰 코저, 마이클 랜디, 크리스토퍼 제이 배럿에게 비드 합성에 도움을 준 것에 대해 감사를 표한다. A.J.E.는 자연과학 및 공학 연구 위원회가 RGPIN/05843-2014 및 EQPEQ/472339-2015, 캐나다 보건 연구 기관 보조금 제143327호, 캐나다 암 학회 보조금 703930, 캐나다 혁신 재단을 승인합니다. 프로젝트 #32749. R. 크리슈난은 국립 보건원 보조금 없음을 인정합니다. R21HL123522 및 R01HL136209. H.Y.는 폰드 드 레체쉬 산테 퀘벡, 퐁 드 레쉐 네이처 에 테크놀로지스 퀘벡의 지원을 받았습니다. 저자는 비디오와 원고와 Zixin He가 비디오를 준비하는 데 도움을 준 요한난 이디쿨라에게 감사를 표합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plate | |||
| GEL-8100 | Nusil Technology | GEL-8100 | High Purity Dielectric, Soft Silicone Gel kit |
| Dow Corning Sylgard 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | curing agent |
| Custom Cut Glass | Hausser Scientific Company | 109.6mm± x 72.8mm± x 1mm thickness | |
| Target 2TM Nylon Syringe Filter | ThermoFisher Scientific | F2513-4 | |
| 96-well Stripwell Egg Crate Strip Holder | Corning | 2572 | |
| Polystyrene Universal Microplate Lid With Corner Notch | Corning | 3099 | |
| Ethyl alcohol | Greenfield Global | P016EA95 | 0.95 |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 190764 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Surface Coating | |||
| Sulfo-SANPAH Crosslinker | Proteochem | c1111-100mg | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141-1MG | solution, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| PBS, 1X | Wisent | 319-005-CL | pH 7.4, without calcium and magnesium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Cell Culture | |||
| DMEM, 1X | Wisent | 319-005-CL | 4.5g/L glucose, with L-glutamine, sodium pyruvate and phenol red |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Wisent | 080-150 | Premium Quality, Endotoxin <1, Hemoglobin <25 |
| HEPES | Wisent | 330-050-EL | 1M, free acid |
| Human Insulin Recombinant | Wisent | 511-016-CM | USP grade |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Wisent | 450-201-EL | 100 X, sterile filtered for cell culture |
| L-Glutamine solution | Wisent | 609-065-EL | 200mM solution, sterile filtered for cell culture |
| Amphotericine B | Wisent | 450-105-QL | 250μg/ml, sterile filtered for cell culture |
| Recombinant Human TGF-β1 | Peprotech | 100-21 | HEK293 Derived |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 537020 | Glacial, ≥99.85% |
| Cictric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | ACS reagent, ≥99.5% |
| NMuMG | ATCC | CRL-1636 | Mouse Mammary Gland Cell Line |
| Sodium azide | Fisher Schientific | AC190385000 | 99%, extra pure, ACROS Organics |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221473 | ACS reagent, ≥85%, pellets |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | X100 | laboratory grade |
| Bead Synthesis | |||
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) | Sigma-Aldrich | 468495-100MG | 97% |
| Methyl methacrylate | Sigma-Aldrich | M55909-500ML | contains ≤30 ppm MEHQ as inhibitor, 99% |
| Inhibitor Remover | Sigma-Aldrich | 306312-1EA | Prepacked column for removing hydroquinone and monomethyl ether hydroquinone |
| Methacryloxylpropyl Terminated Polydimethylsiloxane | Gelest | DMS-R31 (25,000g/mol) | Polydimethylsiloxane stabilizer, 25,000g/mol, 1,000 cSt |
| 2,2′-Azobis(2-methylpropionitrile) (AIBN) | Sigma-Aldrich | 441090-25G | 98% |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 296090-2L | anhydrous, 95% |
| Hexane, mixture of isomers | Sigma-Aldrich | 227064-1L | anhydrous, ≥99% |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 1 | Sigma-Aldrich | WHA1001055 | circles, diam. 55 mm, |
| Equipment | |||
| Laurell WS-650Mz-23NPPB | Laurell Technologies | ||
| UVP Handheld UV Lamp Model UVGL-58 | VWR | 21474-622 | |
| Rheometer | Anton Paar | MCR 302 WESP |
References
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- Oliver, T., Dembo, M., Jacobson, K.
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- Yoshie, H., Koushki, N., et al. Traction Force Screening Enabled by Compliant PDMS Elastomers. Biophysical Journal. 114 (9), 2194-2199 (2018).
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