Summary
스펙트럼 이미징은 단일 샘플에서 여러 형광 신호를 식별하고 분리하는 신뢰할 수 있는 솔루션이 되었으며 관심 있는 신호를 배경 또는 자동 형광과 쉽게 구분할 수 있습니다. 여기 스캐닝 하이퍼스펙트럼 이미징은 필요한 이미지 수집 시간을 줄이면서 동시에 신호 대 잡음 비를 증가시킴으로써 이 기술을 향상시킵니다.
Abstract
몇몇 기술은 현상을 확인하거나 연구하거나 기능을 해명하기 위하여 형광 신호의 탐지에 의존합니다. 이러한 형광 신호의 분리는 형광 원이 배경 신호 및 자가 형광 (스펙트럼에 대한 지식을 감안할 때)뿐만 아니라 서로 분리 될 수있는 하이퍼 스펙트럼 이미징의 출현까지 성가신 것으로 입증되었습니다. 서명)을 참조하십시오. 그러나 기존의 방출 스캐닝 하이퍼스펙트럼 이미징은 여기및 방출 광을 필터링하는 데 필요한 필터링으로 인해 수집 시간이 느리고 신호 대 잡음 비가 낮습니다. 이전에는 여기-스캐닝 하이퍼스펙트럼 이미징이 필요한 수집 시간을 줄이는 동시에 획득된 데이터의 신호 대 잡음 비를 증가시키는 것으로 나타났습니다. 상용 장비를 사용하는 이 프로토콜은 단일 샘플에서 여러 형광원으로부터 신호를 분리하기 위해 여기 스캐닝 하이퍼스펙트럼 이미징 현미경 시스템을 조립, 교정 및 사용하는 방법을 설명합니다. 세포와 조직의 현미경 이미징에 매우 적합하지만, 이 기술은 화학 적 이미징, 환경 응용 프로그램, 안과 치료, 식품 과학, 법의학, 의학 및 광물학.
Introduction
스펙트럼 이미징은 다양한 방법으로 수행될 수 있으며여러용어1, 2,3,4에의해 지칭된다. 일반적으로 스펙트럼 이미징은 적어도 2개의 공간 치수와 하나의 스펙트럼 차원에서 수집된 데이터를 말합니다. 다중 스펙트럼 및 하이퍼 스펙트럼 이미징은 파장 대역의 수 또는 스펙트럼 밴드가 연속적인지 여부에 따라 가장 자주 구별됩니다 1. 이 어플리케이션의 경우, 하이퍼스펙트럼 데이터는 여기(즉, 5nm)에 사용되는 각 대역통과 필터의 절반 이하의 전체 폭의 절반 이하의 중앙 파장의 간격으로 달성된 연속 파장 대역으로 획득한 스펙트럼 데이터로 정의됩니다. 14-20 nm 대역폭의 밴드패스 필터의 중심 파장 간격). 데이터 대역의 연속적인 특성을 통해 데이터 집합의 오버샘플링을 허용하므로 스펙트럼 도메인을 샘플링할 때 나이퀴스트 기준이 충족됩니다.
하이퍼 스펙트럼 이미징은 첫 번째 위성 위성과 함께 1970 년대와 1980년대에 NASA에 의해 개발되었다 5,6. 여러 연속 스펙트럼 대역에서 데이터를 수집하여 각 픽셀의 복사 스펙트럼을 생성할 수 있었습니다. 개별 부품의 광도 스펙트럼을 식별하고 정의함으로써 특성 스펙트럼에 의한 표면 물질을 감지할 수 있었지만, 이로 인해 신호의 변동과 같은 중간 신호의 제거도 가능해졌습니다. 대기 조건. 1996년 슈뢰크 등은 5개의 다른 형광단과 그 알려진 스펙트럼의 조합을 사용하여 표지된 염색체를 구별하기 위해 그들의 특성 스펙트럼을 사용하여 물질을 검출하는 개념을 생물학적 시스템에 적용했습니다. 스펙트럼 카요티핑7. 이 기술은 2000년에 Tsurui 등에서 조직 샘플의 형광 이미징을 위해 7개의 형광 염료와 단수 값 분해를 사용하여 각 픽셀을 스펙트럼의 선형 조합으로 참조에서 스펙트럼으로 분리하는 데 사용했습니다. 라이브러리8. 원격 감지 대응과 유사하게, 각 공지된 형광포의 기여도는 각 형광포의 스펙트럼에 대한 선행 정보를 감안할 때, 하이퍼스펙트럼 이미지로부터 계산될 수 있다.
Hyperspectral 화상 진찰은 또한 농업9, 천문학10,생물 의학11,화학 화상 진찰12,환경 응용13,안과배려 14,식품 과학15, 법의학16,17,의료 과학18,광물학19,감시20. 현재 형광 현미경 hyperspectral 화상 진찰 시스템의 중요한 한계는 표준 hyperspectral 화상 진찰 기술이 1) 견본 여기를 통제하기 위하여 여기 빛을 첫째로 여과하여 좁은 대역에서 형광 신호를 격리한다는 것입니다, 그 때 2) 나중에 수학적으로 분리 될 수있는 좁은 밴드로 형광 방출을 분리하기 위해 방출 된 빛을 추가로 필터링21. 여기 조명과 방출형광을 필터링하면 사용 가능한 신호의 양이 줄어들어 신호 대 잡음 비가 낮아지고 수집 시간이 길어질 수 있습니다. 낮은 신호와 긴 수집 시간은 진단 도구로 하이퍼 스펙트럼 이미징의 적용을 제한합니다.
하이퍼스펙트럼 이미징을 사용하지만 사용 가능한 신호를 향상시켜 필요한 수집 시간21,22를줄이는 이미징 양식이 개발되었습니다. 여기 스캐닝 하이퍼스펙트럼 이미징이라고 불리는 이 새로운 양식은 여기 파장을 변화시키고 광범위한 방출 광을 수집하여 스펙트럼 이미지 데이터를 수집합니다. 이 기술은 방출 스캐닝 기술21,22에비해 신호 대 잡음 비의 크기 증가를 산출하는 것으로 이전에 나타났다. 신호 대 잡음 비율의 증가는 주로 검출 된 방출 광의 넓은 대역통과 (~ 600 nm)에 기인하며, 특이성은 형광 방출 대신 여기 광만 필터링하여 제공됩니다. 이렇게 하면 모든 방출된 빛(모든 여기 파장)이 검출기21에도달할 수 있습니다. 추가적으로, 이 기술은 외인성 레이블에서 자기 형광을 구별하기 위하여 이용될 수 있습니다. 또한, 증가된 감지 신호로 인해 획득 시간을 단축하는 기능은 광표백의 위험을 감소시킬 뿐만 아니라 스펙트럼 비디오 이미징에 허용되는 수집 속도로 스펙트럼 스캔을 허용합니다.
이 프로토콜의 목표는 여기 스캐닝 하이퍼 스펙트럼 이미징 현미경 검사법에 대한 데이터 수집 가이드역할을 하는 것입니다. 또한, 조명 경로 및 하드웨어를 이해하는 데 도움이 설명이 포함되어 있습니다. 또한 여기 스캐닝 하이퍼 스펙트럼 이미징 현미경을 위한 오픈 소스 소프트웨어의 구현에 대해서도 설명합니다. 마지막으로, NIST 추적 가능한 표준으로 시스템을 교정하고, 정확한 결과를 위해 소프트웨어 및 하드웨어 설정을 조정하고, 감지된 신호를 개별 구성 요소의 기여로 혼합해제하는 방법에 대한 설명이 제공됩니다.
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Protocol
1. 장치 설정
- 광원: 높은 출력과 높은 충돌(이러한 연구에 300W Xe 아크 램프가 사용)을 가진 광대역 스펙트럼 광원을 선택합니다.
- 셔터(선택 사항): 광학 경로에 셔터를 추가하여 시간 경과 이미징을 위해 광표백을 줄입니다.
- 튜닝 가능한 필터 시스템: 원하는 파장 조절 가능한 여기 범위(예: 360-485 nm)를 가능하게 하는 기계적 튜닝 어셈블리 및 박막 튜닝 필터(TFTF) 세트를 통합합니다.
- 현미경: 전동 이색 필터 포탑 및 컨트롤러를 포함한 반전형광 현미경을 사용한다.
- 형광 필터 큐브: 긴 통과 형광 필터 큐브를 어셈블합니다. 최상의 결과를 얻으려면 동일한 파장에서 이색 거울과 장패스 방출 필터를 선택하여 방출 광(예: 495nm)으로부터 최적의 여기분리를 달성하십시오.
- 목표: 실험에 사용된 파장 범위에 대해 균일한 초점을 보장하기 위해 적절한 apochromatic 목표를 사용합니다(이 연구에 60배 의 물 목표가 사용되었습니다).
- 자동 단계(선택 사항): 이미지 스티칭을 통해 여러 시야 및/또는 매우 큰 필드를 빠르게 샘플링하기 위해 자동화된 단계를 사용합니다. 객원과 카메라로 무대를 보정합니다.
- 카메라: 실험의 공간 해상도, 감도 및 노이즈 요구 사항을 달성하기 위해 적절한 카메라를 선택합니다(이 시스템은 고감도 sCMOS 카메라를 사용했습니다).
2. 취득 소프트웨어
- Micro-Manager와 같은 각 하드웨어 구성 요소를 독립적으로 제어할 수 있는 소프트웨어 패키지를 선택합니다.
- 구성 파일 만들기: 구성 파일은 Micro-Manager가 시스템의 하드웨어를 작동하기 위해 로드하는 저장된 계측기 및 지침 집합입니다. 구성 파일을 만들려면 도구 > 하드웨어 구성마법사를 클릭합니다.
- 1단계에서 새 구성 만들기 > 다음을 클릭하여 계속합니다. 사용자가 이미 사용 가능한 경우 기존 구성을 수정하거나 탐색하도록 선택할 수 있습니다.
- 2단계에서사용 가능한 장치 목록을 탐색하여 현미경, 램프, 스테이지, 셔터 및 카메라와 같은 Micro-Manager를 통해 제어할 장치를 찾습니다. 강조 표시가 강조 표시되면 추가를 클릭합니다... 버튼을 눌러 장치를 설치된 장치 목록에 추가합니다. 그러면 새 창이 열립니다.
- 레이블 상자에 장치의 레이블을 지정합니다. (예: sCMOS 카메라)
- 값에서 각 장치에 적합한 COM 포트를 선택합니다. 이렇게 하면 장치 속성 목록이 창 아래쪽에 나타납니다.
- 장치 속성을 기본 설정에 둡니다. 각 장치 속성에 대한 사용자 지정 값을 원하는 대로 입력할 수 있습니다.
- 각 장치가 추가되면 다음 단추를 클릭하여 다음 단계로 계속합니다. 장치를 생소하거나 변경해야 하는 경우 2.1.1.1 단계에서 설명한 대로 구성 파일을 나중에 수정할 수 있습니다.
- 3단계에서는 드롭다운 메뉴를 사용하여 기본 카메라, 셔터 및 초점 단계를 선택합니다. 자동 셔터가 필요한 경우 초점 단계 드롭다운 목록 아래의 확인란을 클릭합니다. Z 단계의 초점 방향을 알고 있는 경우 스테이지 포커스 방향(고급)에서드롭다운 목록에서 포커스를 선택합니다. 그렇지 않으면 기본값을 알 수없음으로 둡니다.
- 4단계에서는 지연 [ms] 제목 아래의 상자를 두 번 클릭하여 램프, 스테이지 및 셔터에 대한 100ms 지연과 같은 자동화된 장치와 관련된 지연을 설정하고, 기계 튜닝 어셈블리에 대한 명령에 대한 250ms 지연을 고려하여 필터 간 기계적 스위칭 시간.
- 5단계에서상태 장치에 대한 레이블을 할당합니다. 여기 스캐닝 현미경 시스템에 대한 구성은 필터 블록의 라벨을 사용하여 각 형광 필터 큐브를 식별합니다(예를 들어, 상태 0은 브라이트,브라이트 필드 이미징 중에 사용되는 빈 필터 큐브; 상태 3은 495 nm에서 여기 및 방출 광을 분리하는 데 사용되는 라벨 495 nm 및 사용자 정의 495 nm 이색 필터 큐브에 해당합니다. 라벨은 또한 각 여기 파장에 대한 스위칭 명령을 저장하기 위해 기계 튜닝 어셈블리에 사용됩니다(예: 상태 0은 기계 튜닝 어셈블리에 대한 340 nm 여기 파장 튜닝 명령에 해당).
- 6단계에서 구성 파일 상자 옆의 찾아보기 단추를 클릭하여 구성 파일에 대한 저장 위치 및 파일 이름을 선택합니다. 완료를 클릭하여 구성 파일을 저장합니다.
- 시작 그룹 및 사전 설정: Micro-Manager는 각 구성 파일 내에 서로 다른 그룹을 저장하여 하드웨어의 하위 집합을 활성화하거나 변경할 수 있습니다. 예를 들어 "시스템 시작" 그룹 및 사전 설정 조합은 카메라의 비닝 크기 및 판독속도와 같은 기본 설정을 저장합니다.
- 그룹 하위 섹션의 기본 창에서 +를 클릭하여 그룹(예: 시스템)을 만듭니다.
- 그룹에서 어떤 사용을 확인? 설정해야 하는 기본값을 필요로 하는 그룹 내의 상자(예: 연결된 기본 카메라의 비닝).
- 사전 설정 하위 섹션의 기본 창에서 +를 클릭하여 새 사전 설정(예: "시작")을 만듭니다.
- 2단계에서 선택된 각 상자는 여기에 미리 설정된 옵션으로 표시됩니다. 선택된 각 상자에 대해 로드할 기본값을 선택합니다.
- 여기 파장에 대한 그룹 및 사전 설정: Micro-Manager는 각 여기 파장을 자체 파장 스위칭 명령으로 자체 채널로 처리합니다. 따라서 각 집합은 자체 사전 설정으로 저장해야 합니다.
- 원하는 여기 파장 집합을 포함하는 새 그룹 만들기(예: "495 nm 이색")
- VF-5 장치에 해당하는 레이블이라는 이름의 그룹 사용 상자를 선택합니다.
- 각 여기 파장(예: "340nm")에 대해 명명된 새 사전 설정을 만듭니다.
- 각 미리 설정된 적절한 속성 이름과 사전 설정 값(예: 속성 이름: "Label"; 사전 설정 값: "340 nm")을 할당합니다.
- 다차원 수집 도구:멀티 D Acq.한 번의 버튼 클릭으로 각 여기 파장에서 샘플 이미지를 캡처하는 데 사용할 수 있는 사용자 지정 도구를 엽니다. 원하는 대로 수집을 구성하는 몇 가지 사용자 지정 옵션이 있습니다.
- 시간 점(이 예에서 사용되지 않음): 시간 경과 구성 요소가 없는 스터디의 경우 확인란을 선택하지 않은 상태로 둡니다. 시간 경과 스터디를 원하는 경우 이 확인란을 선택합니다. 이 옵션을 선택한 경우 번호 상자에 나머지 수집 설정을 수행할 횟수를 입력합니다. 간격 상자에 기간을 입력하여 연속 획득 사이의 시간을 설정하고 적절한 단위(밀리초, 초 또는 분, 보통 초)를 선택합니다.
- 여러 위치(XY; 이 예제에서는 사용되지 않음): 단일 XY 위치를 연구하는 경우 상자를 선택하지 않은 상태로 둡니다. 여러 XY 위치가 필요한 경우 확인란을 선택하여 위치 목록 편집 단추를 클릭하여 별도의 창을 엽니다. 스테이지를 원하는 각 위치로 이동하고 마크 버튼을 클릭하여 소프트웨어에 해당 위치를 저장합니다. 원하는 모든 XY 위치가 표시될 때까지 반복합니다. 계속하려면 이 창을 닫습니다.
- Z-스택(슬라이드; 이 예제에서는 사용되지 않음): 단일 Z 위치스터디의 경우 상자를 선택하지 않은 상태로 둡니다. 여러 Z 위치가 필요한 경우 확인란을 선택합니다. 스테이지를 원하는 시작 Z 위치로 이동하고 Z 시작 상자 옆의 설정 버튼을 클릭합니다. 스테이지를 원하는 끝 Z 위치로 이동하고 Z 끝 상자 옆에 있는 설정 버튼을 클릭합니다. Z-스텝 상자에 원하는 스텝 크기(미크론)를 입력합니다.
- 채널: 채널 확인란이 선택되어 있는지 확인합니다. 여기서 채널은 개별 여기 파장에 주어진 이름입니다. 사용 가능한 "채널"은 단계 2.1.2 및 2.1.3에 설명된 "그룹"에 해당합니다.
- 그룹: 드롭다운 목록을 클릭하여 사용 가능한 여기 파장(예: 495nm 이색)을 선택할 그룹을 선택합니다.
- 셔터 열기 유지 상자를 클릭하여 각 채널의 획득 사이에 셔터를 열어 두십시오. 이 확인란을 선택하면 주 창에서 자동 셔터 옵션도 선택되어 있다고 가정하면 셔터가 연속적인 스펙트럼 스캔 사이에 계속 닫힙니다.
- 새 단추를 클릭하여 획득 목록에 채널을 추가합니다. 제거 버튼을 사용하여 더 이상 원하지 않는 채널을 제거할 수 있으며 위쪽 및 아래쪽을 사용하여 선택한 채널의 순서를 다시 정렬할 수 있습니다.
- 스펙트럼 스캔에서 원하는 각 파장에 대해 사용 확인란이 선택되어 있는지 확인합니다.
- 구성: 구성 아래의 드롭다운 목록을 클릭하고 원하는 스펙트럼 범위(예: 340nm)의 첫 번째 파장을 선택합니다.
- 노출: 노출 아래의 상자를 두 번 클릭하고 선택한 파장에 대해 원하는 노출 시간을 입력합니다(예: 100ms의 경우 "100"). 적절한 노출 시간을 선택하려면 섹션 5("데이터 수집")를 참조하십시오.
- Z 오프셋(스펙트럼 스캔에는 적용되지 않음): 스펙트럼 스캔을 수행할 때 이 상자를 비워 둡니다(0).
- Z 스택: Z 스택을 수행하는 경우 이 상자가 스펙트럼 범위의 각 파장에 대해 선택되었는지 확인합니다.
- 스킵 Fr. (스펙트럼 스캔에 적용되지 않음): 스펙트럼 스캔을 수행할 때 이 상자를 비워 둡니다(0). 하나 또는 몇 개의 여기 파장이 다른 파장보다 훨씬 더 강력하거나 개별 여기 파장이 특히 광독성으로 판명되는 경우 프레임을 선택적으로 건너뛰는 것이 유용할 수 있습니다.
- 색상: 스펙트럼 스캔을 수행할 때 이 상자를 비워 둡니다. 데이터 시각화를 위해 개별 파장 대역에 색상을 선택할 수 있지만 이후의 스펙트럼 언혼합에는 색상이 적합하지 않습니다.
- 지정된 스펙트럼 스캐닝 범위 내에서 원하는 각 여기 파장이 추가될 때까지 이 단계를 반복합니다.
- 획득 순서: 드롭다운 목록을 클릭하여 위의 옵션(2.1.4.1-2.1.4.5)을 수행할 순서를 선택합니다. 여기에 표시된 것과 같은 스펙트럼 스캔의 경우 획득 순서는 단순히 채널입니다. 추가 옵션은 다차원 수집 도구 [타임포인트, 다중 위치(XY) 및 Z-스택(슬라이스)] 내에서 추가 상자가 선택되어 위치 또는 시간 중 하나를 먼저 선택할 수 있도록 하고 슬라이스 또는 슬라이스 또는 다음에 추가 옵션을 선택할 때 나타납니다. 채널.
- 자동 초점(이 예제에서는 사용되지 않음): 여러 위치(XY)를 선택한 경우 여러 가지 유형의 자동 초점 조정을 사용할 수 있습니다. 옵션 단추를 클릭하고 닫기 버튼 옆의 드롭다운 목록에서 자동 초점 방법을 선택합니다.
- 요약: 이 창을 검토하여 시간점 수, XY 위치, Z 슬라이스, 채널, 총 이미지 수, 총 메모리, 스캔 기간 및 수집 순서를 요약하여 나열된 정보가 예상 수집 설정과 일치하는지 확인합니다.
- 이미지 저장: 다차원 수집 도구를 사용하여 수집된 데이터를 저장하려면 이 확인란을 선택거쳤습니다.
- 를 클릭합니다. 파일을 저장할 디렉토리 루트를 선택하려면 디렉터리 루트 옆에 있는 단추를 누를 수 있습니다. 실험의 관련 세부 사항(예: GCaMP 기도 평활근 세포)을 설명하는 방식으로 디렉토리 루트의 이름을 지정합니다.
- 현재 이미지 수집을 설명하는 이름 접두사 옆에 있는 상자에 이름을 입력합니다(예: FOV1_100ms_60X_495nDichroicFilter). 뷰 필드와 노출 시간을 식별하는 이름 접두사와 사용된 개체 및 이색 필터와 같은 기타 관련 정보를 만드는 것이 좋습니다. 이러한 설정을 사용하여 촬영한 첫 번째 이미지 스택은 이름 접두사 다음에 "_1"로 저장됩니다. 동일한 디렉터리 루트 및 이름 접두사로 가져온 후속 스택은 "_n"으로 저장되며, 이 때 "n"은 디렉터리에서 이 이름으로 스택을 수행한 횟수입니다.
- 각 여기 파장에서 생성된 이미지가 저장되도록 이미지 파일 분리를 클릭합니다.
- 로 저장: 다차원 수집 도구의 오른쪽 상단 근처에 있는 로 저장 버튼을 클릭하여 나중에 쉽게 사용할 수 있도록 이러한 수집 설정을 저장합니다. 디렉터리 루트 및 이름 접두사도 저장됩니다.
- 획득 : 마지막으로, 취득을 클릭! 버튼을 눌러 위에서 선택한 획득 설정에 따라 이미지 수집을 시작합니다.
- 구성 파일 만들기: 구성 파일은 Micro-Manager가 시스템의 하드웨어를 작동하기 위해 로드하는 저장된 계측기 및 지침 집합입니다. 구성 파일을 만들려면 도구 > 하드웨어 구성마법사를 클릭합니다.
3. 스펙트럼 응답 보정 (선택 사항):
- 스펙트럼 출력 보정은 NIST 추적 가능한 램프 또는 기타 NIST 추적 가능한 표준 또는 계측기와 같은 알려진 표준에 대한 시스템의 스펙트럼 응답을 교정하기 위해 수행될 수 있습니다. 이 단계는 결과가 다른 스펙트럼 이미징 기기, 분광기 또는 다른 실험실 과 비교되는 경우에 특히 중요합니다. 이 프로세스는 이전에21,23에상세히 보고되었습니다.
- NIST 추적 가능한 광원(예: LS-1-CAL-INT, 해양 광학) 또는 기타 NIST 추적 가능한 표준으로 보정된 분광계를 사용하여 샘플 단계에서 측정된 조명의 분광방사전력을 획득합니다. 광원 설정, 이색 미러 및 대물렌즈의 각 조합에 대해 별도의 보정을 수행합니다. 분광계에 결합된 통합 구를 사용하여 현미경 대물렌즈에서 광각 조명을 정확하게 측정합니다.
- 사다리꼴 규칙과 같은 통합 방법을 사용하여 조명된 파장에 대한 분광 대사 데이터를 통합합니다. 중심 파장을 중심으로 한 통합을 위한 40nm 대역폭은 반최대(FWHM)에서 14-20nm 전체 폭 사이의 명목 대역폭을 가진 대부분의 필터에 충분합니다. 통합 값은 각 여기 파장 대역에서 스펙트럼 조명의 강도를 나타냅니다.
- 각 파장 대역의 통합 강도를 여기 중심 파장의 함수로 플롯하여 스펙트럼 조명 강도 프로파일을 시각화할 수 있습니다.
- 가장 낮은 통합 강도로 파장 대역을 결정합니다.
- 각 파장 대역의 통합 강도로 가장 낮은 통합 강도를 나누어 스펙트럼 조명 강도 프로파일을 정규화하여 파장 의존적 보정 계수를 생성합니다.
4. 견본 준비
- "빈" 샘플을 준비합니다(예: 유리 커버슬립을 셀 챔버에 놓고 1 mL의 버퍼를 추가). 이 버퍼는 이전에24에설명되어 있습니다.
- 임의의 시료 자동형광을 결정하기 위해 라벨이 부착되지 않은 샘플을 준비한다(예를 들어, 표지되지 않은 기도 평활근 세포25,26를 포함하는 유리 커버슬립을 세포 챔버에 넣고 1 mL의 버퍼를 추가한다).
- 실험에 사용된 각 형광 라벨에 대해 별도의 단일 라벨 샘플을 준비합니다.
- 희석된 미토콘드리아 라벨을 버퍼링하여 100 nM 농도를 달성합니다. 이 버퍼를 기도 평활근 세포가 들어 있는 커버슬립에 추가합니다. 20-25 °C에서 20 분 동안 배양하십시오. 커버슬립을 셀 챔버로 옮기고 1 mL의 버퍼를 추가합니다. 미토 콘 드리 아 라벨의 최적의 농도 제조 업체 등 요인에 따라 달라 집니다., 관련 된 색상, 그리고 원하는 특이성.
- GCaMP프로브(27)로 침범된 기도 평활근 세포를 포함하는 커버슬립을 세포 챔버에 옮기고 1 mL의 버퍼를 추가한다.
- 원하는 형광 라벨의 혼합물을 포함하는 하나 이상의 실험 샘플을 준비한다.
- GCaMP 프로브로 형질전환된 기도 평활근 세포를 포함하는 커버슬립에 완충액 1mL(미토콘드리아 라벨 100 nM 농도)를 넣고 20-25°C에서 20분 동안 배양합니다. 커버슬립을 셀 챔버로 옮기고 1 mL의 버퍼를 추가합니다.
5. 데이터 수집:
- 적절한 이색 빔스플리터(예: 495nm 이색 필터 큐브), 목표(예: 60x 물 대물) 및 카메라(sCMOS 카메라)가 선택되어 있는지 확인합니다.
- 샘플을 스테이지에 로드합니다.
- 노출 [ms] 옆의 상자를 두 번 클릭하고 "100"을 입력하여 노출 시간을 100 ms로 설정하면 샘플의 형광 강도에 따라 노출 시간을 늘리거나 줄여야 할 수 있습니다.
- 초기 샘플 보기를 위해 Micro-Manager 메인 창의 드롭다운 메뉴에서 475nm를 선택합니다. 475 nm은 샘플 보기 또는 이미지 스택 전체에서 과포화가 발생하는지 여부를 결정하기 위한 최적의 파장이 아닐 수 있습니다.
- 샘플을 보려면 라이브를 클릭합니다.
- 창 하단의 히스토그램 옆에 있는 자동 강도 보기 범위 자동 버튼을 클릭하여 최소 값과 최대값을 의미 있는 시각적 범위로 가져옵니다.
- 현미경의 초점 노브를 사용하여 샘플에 초점을 맞춥니다. 초점을 맞추는 데 도움이 되는 샘플의 가장자리를 찾는 것이 유용한 경우가 많습니다. 이미지의 가장자리 피처가 선명하게 나타나면 샘플에 포커스가 표시됩니다. 형광 이미지를 보는 데 도움이 되도록 초점을 맞추는 동안 자동 단추를 여러 번 클릭해야 할 수 있습니다. 또한, 일부 사용자는 현미경이 전송 모드에있는 경우 샘플에 집중하는 것이 더 쉬울 수 있습니다.
- 변속기 모드에서 초점을 맞추는 경우 안전을 위해 먼저 송신 이미징을 위해 광 경로를 조정하기 전에 스펙트럼 광원이 안구에 빛을 전달하지 않도록 하십시오. 또한 전송 및 형광 이미지의 초점 사이에 작은 편차가있을 수 있습니다. 허용 가능한 초점이 달성되면 스펙트럼 형광 이미징을 위한 광 경로를 재구성합니다.
- 멀티 D Acq를클릭합니다. 창 왼쪽 상단 에 있는 버튼을 눌러 다차원 수집 도구를 엽니다(섹션 2에서 설명및 구성).
- 다차원 수집 도구 창의 오른쪽 상단에 있는 로드 버튼을 클릭하고 여기 설정으로 이동하여 스펙트럼 수집(예: 495nm 이색 필터의 경우 360-485nm)에 적합한 스펙트럼 범위를 선택합니다. 이전에 저장했습니다(2.1.4.10 단계). 적절한 스펙트럼 범위에 대한 자세한 내용은 토론을 참조하십시오.
- 배경 및 노이즈 빼기에 사용할 형광 데이터가 없는 배경/빈 이미지를 수집합니다. 이는 빈 샘플(단계 4.1)을 사용하거나 실험 샘플의 빈 영역으로 이동하여 수행할 수 있습니다. 5.6단계에서 설명한 바와 같이, 이는 시료의 가장자리를 찾은 다음 에지가 시야 내에 중심이 되도록 배치함으로써 가장 쉽게 달성됩니다.
- 수집 설정이 확인되고 배경 영역이 표시되면 Acquire! 버튼을 클릭하여 나중에 빼기위해 사용할 배경 및 노이즈가 포함된 스펙트럼 이미지 스택을 획득합니다. 견본은 견본의 가장자리에서 멀리 더 강렬한 형광이 있기 위하여 확률이 높다는 것을 주의해야 합니다. "가장 밝은" 영역을 찾고 적절한 수집 시간을 결정하고 과다 노출을 피하기 위해 여러 테스트 이미지 스택을 수행하기 위해 샘플을 이동하는 것이 좋습니다.
- 파장의 조합과 노출 시간이 과다 노출되는 것을 보장하기 위해 강렬한 형광이 있는 것으로 보이는 샘플 영역에 단일 이미지 스택을 가져가라.
- ImageJ를 사용하여 노출 과다 노출된 픽셀이 없는지 확인합니다.
- ImageJ에서 파일 > 가져오기 > 이미지 시퀀스를 클릭하고 5.10단계에서 촬영한 스펙트럼 이미지가 포함된 폴더로 이동합니다. 그러면 새 창이 열립니다. 이미지 수 옆에 있는 상자를 클릭하고 스펙트럼 스캔에 포함된 파장 수를 입력합니다(예: 26). 시작 이미지와 증분을 "1"로 둡니다. 계속하려면 확인 버튼을 클릭합니다.
- 키보드의 M을 눌러 ImageJ의 측정 기능을 활용합니다. Max 아래에 나열된 숫자가 카메라의 상위 감지 제한이 아닌지 확인합니다(예: 65,535). 스펙트럼 스캔의 각 이미지에 대해 반복합니다. 카메라의 감지 제한은 카메라 자체에 따라 다릅니다. 상한은 MicroManager의 메인 창에 있는 히스토그램의 오른쪽 상단에 표시됩니다. 또는 이미지J에서 이미지를 열고 이미지 > 조정 > 밝기/대비로이동하여 상한을 결정할 수 있습니다. 결과 팝업 창에서 설정 단추를 클릭하고 표시된최대값 옆의 빈에 지나치게 큰 값(예: 999,999)을 입력하고 확인을 클릭하여 계속합니다. 새 히스토그램에 표시되는 최대 값은 카메라의 최고 감지 한계여야 합니다.
- 이미지에 카메라의 상한 값(예: 65,535)이 포함된 경우 스펙트럼 스캔의 노출 시간을 조정하여 스펙트럼 범위 전체의 최대 신호가 카메라의 동적 범위를 초과하지 않도록 합니다.
- 레이블이 지정되지 않은 샘플에서 스펙트럼 이미지 데이터를 수집하여 자가형광을 결정합니다. 실험의 나머지 부분과 동일한 파장 범위 및 카메라 설정을 사용하여 레이블이 지정되지 않은 샘플에 대한 스캔을 획득합니다(예: 파장당 100ms에서 360-485 nm).
- 단일 레이블이 지정된 샘플에서 스펙트럼 이미지 데이터를 수집하여 스펙트럼 컨트롤로 사용하여 스펙트럼 라이브러리를 빌드합니다. 동일한 파장 범위, 노출 시간 및 카메라 설정을 사용하여 각 레이블에 대한 스캔을 수행합니다. 일부 샘플의 경우 잡음 기여도가 최소로 정확한 라벨 스펙트럼 검출이 필요하게 될 수 있습니다.
- 실험 샘플(예: GCaMP 프로브 및 미토콘드리아 라벨이 있는 인간 기도 평활근 세포)에 대한 측정을 수행합니다.
- 현미경에 실험 샘플을 포함하는 슬라이드 또는 커버 슬립을 놓습니다.
- 조직의 적절하게 표지된 세포가 있는 시야를 선택합니다.
- 전술한 바와 같이 원하는 수집 설정을 사용하여 스펙트럼 이미지 데이터를 획득한다.
6. 이미지 분석
- 이미지를 평평한 스펙트럼 응답으로 수정합니다.
- 섹션 5.9에서 얻은 배경 스펙트럼을 빼고 섹션 3.1.5에서 결정된 보정 계수를 곱합니다. 이 작업은 간단한 MATLAB 스크립트 또는 ImageJ 루틴으로 수행할 수 있습니다. 빼기/보정 MATLAB 코드(이 예에서 사용)는 사우스 앨라배마 대학교 바이오이미징 리소스 웹사이트에서 확인할 수 있습니다.
- MATLAB에서 빼기/보정 코드를 로드합니다.
- 편집기 탭에서 실행을 클릭합니다. 그러면 Bsq 보정 버튼이 포함된 새 창이 열립니다. Bsq 수정 단추를 클릭하여 디렉토리, 백그라운드 파일, 수정 요소 파일 및 수정되지 않은 tiff 폴더에 대한 선택 사항이 포함된 다른 창을 엽니다.
- 찾아보기 사용... 작업 디렉토리 옆에 있는 단추를 클릭하여 후속 창이 열리는 파일 경로를 선택합니다. 저장된 배경 스펙트럼이 포함된 폴더로 이동합니다(.dat 형식).
- 찾아보기 사용... 6.1.1.1.2.1 단계에서 선택한 디렉토리를 열고 원하는 배경 파일 (.dat 형식)을 선택하려면 배경 파일 (.dat) 옆에 있는 버튼을 누를 수 있습니다. 열기 버튼을 클릭하여 계속합니다.
- 보정 계수(.dat) 옆의 찾아보기 단추를 사용하여 수정 계수를 선택합니다. 보정 계수에 대한 디렉토리는 부모 MATLAB 코드의 위치로 기본설정됩니다. 필요한 경우 수정 계수 파일이 포함된 하위 폴더(.dat 형식)로 이동합니다. 적절한 보정 계수 파일을 강조 표시하고 열기 단추를 클릭하여 계속합니다.
- 6.1.1.2.1 단계에서 선택한 디렉토리를 열고 배경 빼기 및 이미지 보정을 위해 폴더를 선택하려면 수정되지 않은 Tiff 폴더 옆에 있는 찾아보기 단추를 사용합니다(일반적으로 원시 가 포함되는 Pos0 폴더입니다. 스펙트럼 이미지)를 참조하십시오. 열기 버튼을 클릭하여 계속합니다.
- 스펙트럼 보정 을 위한 클릭 단추를 클릭합니다. 처리가 완료되면 "Bsq 수정 완료"라는 메시지와 함께 창이 열립니다. 계속하려면 확인 버튼을 클릭합니다. 보정 이미지는 원래 원시 스펙트럼 이미지 폴더와 추가 "_Corrected"(예: Pos0_Corrected)로 명명된 새 폴더에 저장됩니다.
- 섹션 5.9에서 얻은 배경 스펙트럼을 빼고 섹션 3.1.5에서 결정된 보정 계수를 곱합니다. 이 작업은 간단한 MATLAB 스크립트 또는 ImageJ 루틴으로 수행할 수 있습니다. 빼기/보정 MATLAB 코드(이 예에서 사용)는 사우스 앨라배마 대학교 바이오이미징 리소스 웹사이트에서 확인할 수 있습니다.
- 스펙트럼 라이브러리를 생성합니다. 여러 소프트웨어 패키지를 사용하여 ImageJ를 비롯한 이미지에서 스펙트럼 데이터를 추출할 수 있습니다. 최상의 결과를 얻으려면 가장 강렬한 값을 가지는 파장 대역을 결정하고 각 파장 대역에서 측정값을 최대 값으로 나누어 각 종단원을 가장 큰 강도의 파장 대역으로 정규화합니다. 또한 자동 형광 샘플 내에서 생성 된 단일 라벨 컨트롤은 추가 수정28,29,30,31,32가필요하다는 점에 유의해야합니다. 자세한 내용은 6.2.4 단계 및 토론을 참조하십시오.
- ImageJ에서 파일 > 가져오기 > 이미지 시퀀스를클릭합니다. 그러면 새 창이 열립니다. 수정된 스펙트럼 이미지가 포함된 폴더로 이동합니다. 폴더의 이미지 파일을 두 번 클릭하여 새 창을 엽니다. 이미지 수 옆에 있는 상자를 클릭하고 스펙트럼 스캔에 포함된 파장 수를 입력합니다(예: 26). 시작 이미지와 증분을 "1"로 둡니다. 계속하려면 확인 버튼을 클릭합니다.
- ImageJ 기본 창에서 다각형 선택 아이콘을 클릭한 다음 이미지를 클릭하여 마우스 포인터를 사용하여 형광 데이터가 포함된 영역 주위에 다각형을 만듭니다. 초기 파장에는 형광 데이터가 거의 또는 전혀 없을 수 있습니다. 다른 파장 이미지로 이동하거나 밝기/대비 도구(이미지> adjust > 밝기/대비 >자동)를 사용하여 관심 있는 형광 데이터가 포함된 영역을 더 잘 시각화합니다.
- 다각형이 그려진 경우 이미지 > 스택 > 플롯 Z축프로파일을 클릭하여 Z축 프로파일을 생성합니다. 그러면 새 창이 열립니다. 저장을 클릭하여 스펙트럼 데이터를 .csv 파일로 저장합니다.
- 자가형광 오염이 없는 순수 라벨이 있는 적절한 스펙트럼 라이브러리를 보장하기 위해 빼기를 수행합니다. 다음 방정식29를 사용하여 단일 라벨과 형광의 혼합물에서 순수 스펙트럼을 분리합니다.
(1)
여기서: S퓨어는 라벨의 순수 스펙트럼이고, S혼합은 자가형광으로 오염된 시료의 측정 스펙트럼이며, S autoFL은 측정된 자가형광 스펙트럼, "a"는 스칼라입니다. 자동형광 스펙트럼의 승수는(예: 0과 1 사이, 0.4) 및 "오프셋"은 오프셋(일반적으로 0)입니다. 자동 형광의 명백한 기여에 대해 0에 가까운 값이 달성 될 때까지 "a"용어를 변경합니다. 추가 정보는 여러 간행물28,29,30,31,32에서찾을 수 있습니다.
- 스펙트럼 이미지 데이터를 언믹스합니다. 혼합을 해제하는 단계는 각 형광 라벨에 대해 풍부한 이미지를 생성하며, 여기서 풍부는 각 라벨로부터 이미지내의 상대형광 신호의 양이다. 여러 혼합 알고리즘은 ImageJ33,34,35와함께 사용할 수 있습니다. 또한, 스펙트럼 혼합 해제 MATLAB 코드 (이 예에서 사용) 사우스 앨라배마 대학 바이오 이미징 리소스 웹 사이트에서 사용할 수 있습니다. 스펙트럼 언혼합에 대한 보다 포괄적인 개요는36을사용할 수 있습니다.
- MATLAB에서 스펙트럼 혼합 해제 코드를 로드합니다.
- 실험 조건에 맞게 Wavelength.mat 및 Library.mat 파일을 편집합니다(예: "파장"을 5단위로 360-485로).
참고: 해당 파장에 해당하는 값은 각 형광 레이블(및 자동 형광)에 대해 "라이브러리"에 로드되어야 합니다. Endmember_Name은 "라이브러리"의 열 값과 동일한 순서로 레이블을 나열해야 합니다. Library.mat 파일에는 "라이브러리" 및 "Endmember_Name" 변수가 모두 포함되어야 합니다. - 편집기 탭에서 실행을 클릭합니다. 이렇게 하면 사용자가 디렉터리를 선택할 수 있는 새 창이 열립니다. 혼합되지 않을 스펙트럼 이미지가 포함된 폴더로 이동합니다. 이 옵션을 선택하면 새 창이 열립니다.
- 결과 블랭크에서 이미지 이름(예: GCaMP 및 Mito FOV1이 있는 HASMC), 파장 대역 수(예: 26), 타임포인트 수(예: 1) 및 FRET 측정이 필요한지 여부(예: n)를 각각의 공백에 입력합니다. FRET에 대해 "n"을 선택한 경우 최종 멤버 공백을 모두 비워 둡니다. 확인을 눌러 계속하면 새 창이 열립니다.
- Wavelength.mat 파일이 포함된 폴더로 이동합니다. 이 옵션을 선택하면 열기를 클릭하여 계속하면 새 창이 열립니다.
- Library.mat 파일이 포함된 폴더로 이동합니다. 일단 선택, 계속 열기를 클릭, 스펙트럼 이미지를 포함 하는 디렉토리 안에 새로운 "혼합 되지 않은" 폴더에 혼합 되지 않은 이미지를 저장 합니다.
- 혼합되지 않은 스펙트럼 이미지의 품질을 검사합니다.
- 혼합되지 않은 각 이미지를 열어 순수 구성 요소의 분포를 시각적으로 검사합니다.
- 오류 이미지의 크기를 혼합되지 않은 이미지의 크기와 비교합니다(5.11단계와 유사하게 ImageJ의 측정 기능을 통해 수행할 수 있음). 오차 이미지의 크기가 혼합되지 않은 풍부한 이미지와 크기가 비슷하면 스펙트럼 라이브러리 및 선형 스펙트럼 언혼합 프로세스에 의해 정확하게 설명되지 않는 스펙트럼 이미지 데이터에 신호가 있을 수 있습니다.
- 오류 이미지를 혼합되지 않은 이미지와 비교하여 식별되지 않은 잔류 구조가 있는지 확인합니다.
- 혼합되지 않은 각 이미지를 열어 순수 구성 요소의 분포를 시각적으로 검사합니다.
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Representative Results
이 프로토콜의 몇 가지 중요한 단계는 정확하고 이미징 및 스펙트럼 아티팩트가 없는 데이터의 수집을 보장하는 데 필요합니다. 이러한 단계를 건너뛰면 중요한 것처럼 보이지만 다른 스펙트럼 이미징 시스템으로 는 확인하거나 재현할 수 없는 데이터가 생성되어 해당 데이터로 이루어진 결론을 효과적으로 무효화할 수 있습니다. 이러한 중요한 단계 중 가장 중요한 단계는 적절한 스펙트럼 출력 보정(섹션 3)입니다. 보정 계수는 조정 가능한 여기 시스템의 스펙트럼 출력의 파장 의존적 변동을 보상합니다. 이는 광학 조명 전력이 낮은 전력 여기를 가진 파장에 필적하도록 높은 전력 여기로 파장을 스케일링하여 평평한 스펙트럼 여기 프로파일을 달성함으로써 달성됩니다. 부적절한 보정 계수의 예로는 하나 이상의 파장에서 매우 낮은 값(예: lt;0.001)을 포함하는 것이 있으며, 이는 평평한 스펙트럼 응답을 얻기 위해 해당 파장에서 측정된 강도 값을 크게 감쇠해야 함을 나타냅니다.
NIST 추적 가능한 표준으로 시스템을 교정하면 여기 스캐닝 스펙트럼 이미징 시스템으로 수집된 데이터가 NIST 추적 가능한 표준에 따라 보정된 다른 시스템과 비교할 수 있습니다. 따라서 모든 수정 요소가 수집된 데이터를 적절하게 조정하도록 해야 합니다. NIST 추적 형광과 같은 형광 표준을 사용하여 보정 계수의 정확도를 확인할 수 있습니다. 그림 1은 그래픽 및 이미지 데이터를 통해 시각화된 적절하고 부적절한 보정 계수를 보여 줍니다. 이 경우 340 nm의 스펙트럼 출력은 나머지 스펙트럼 범위에 비해 거의 존재하지 않았으며, 그 결과 거의 모든 파장에 대해 거의 0(&0.001) 값이 생성되었습니다. 이미지 스택에 적용하면 대부분의 픽셀에 대해 대부분의 이미지 스택을 통해 거의 0에 가까운 값이 생성됩니다.
섹션 5에 명시된 바와 같이, 여기 범위, 선택된 형광류 및 획득 설정은 하나 또는 여러 개의 여기 파장 이미지 밴드가 과포화 픽셀을 포함할 가능성을 생성할 수 있다. 그림 2는 여러 여기 파장에 대해 노출 시간이 너무 길게 설정되어 후속 이미지에 과포화 픽셀이 포함되는 예제를 보여 줍니다. 그림에서 볼 수 있듯이 개별 이미지와 잘못된 색상의 이미지가 모두 시각적으로 허용 가능한 강도 범위 내에 있는 것처럼 보일 수 있으므로 주의해야 합니다.
NIST 추적 가능한 스펙트럼 보정 전에 카메라 노이즈 또는 미광 요소를 제거하기 때문에 빼기 위한 배경 영역의 적절한선택은 시스템 간의 데이터 비교에도 중요합니다(그림 3). 이미지 내의 스펙트럼 특징을 시각화하기 위해 스펙트럼 이미지 스택의 RGB 가색 이미지를 생성하는 후속 이미지 처리 및 데이터 분석 단계에 종종 유용합니다. 도 4는 선택된 3개의 파장 대역(370 nm = 파란색, 420 nm = 녹색, 470 nm = 빨간색)을 병합하여 생성된 RGB 가색 이미지를 나타낸다.
스펙트럼 언혼합은 각 개별 형광 소스의 스펙트럼 프로파일에 대한 지식을 필요로 한다. 여기 스캐닝 하이퍼스펙트럼 이미징의 경우, 이것은 각 형광부(및 자가형광)에 대한 스펙트럼 이미지 스택을 획득함으로써 수행됩니다. 도 5는 스펙트럼 라이브러리를 생성하기 위해 단일 레이블 컨트롤에서 영역을 선택하는 예제로 포함되어 있습니다. 각 측정은 피크 파장으로 정규화되었음을 유의해야 합니다.
올바르게 수행되면 스펙트럼 언혼합 프로세스를 통해 스펙트럼 이미지 스택을 각 형광 라벨의 각 기여도로 분리할 수 있습니다. 도 6은 기도 평활근 세포 자동형광, GCaMP 프로브 및 미토콘드리아 라벨의 각각에 대한 개별 이미지와 함께 혼합되지 않은 스펙트럼 이미지 세트를 나타낸다. 스펙트럼 언혼합과 관련된 오차도 도시되어 있으며, 오차의 강도 수준을 혼합되지 않은 신호의 강도 수준과 비교하기 위해 검사할 수 있습니다. 이 오류의 계산 및 해석은 이전에37에대해 설명했습니다. 도6에 도시된 바와 같이, 세포의 핵 및 아위핵 영역과 관련된 높은 오차가 있는데, 이는 이들 영역의 측정된 스펙트럼이 스펙트럼 라이브러리의 스펙트럼에 의해 잘 설명되지 않음을 나타낸다. 오차의 한 가지 잠재적인 원인은 GCaMP 및 미토콘드리아 라벨에 대한 단일 라벨 대조군이 높은 네이티브 자가형광을 가지는 기도 평활근 세포를 사용하여 제조되었다는 것일 수 있다. 따라서, GCaMP 및 미토콘드리아 라벨은 순수한 종단원 스펙트럼을 나타내지 않을 수 있다. 또한, 자동형광 신호는 제대로 설명되지 않은 방식으로 두 개의 다른 라벨에 대한 라이브러리 스펙트럼에 영향을 미칠 수 있으며, 그 결과 라벨이 거의 또는 전혀 없는 세포주를 사용하여 획득된 경우보다 정확도가 떨어집니다. 자동 형광. 또한, 스펙트럼 라이브러리의 구성 요소가 너무 적거나 너무 많은 경우, 스펙트럼 이미지 데이터의 과적합 및 과적합을 초래하는경우(그림 6, 그림7, 도8) 도9, 및 표1).
섹션 6.2 및 구체적으로 단계 6.2.4에서 언급한 바와 같이, 또한 자가형광인 표지된 세포로부터 수집된 "순수한" 스펙트럼은 순수 성분에 대한 스펙트럼 프로파일을 오염시킬 가능성이 있다. 따라서 관심 있는 레이블의 순수 스펙트럼을 자가형광 호스트와 분리하는 데 주의를 기울여야 합니다. 도 10은 6.2.4단계에서 기재된 방법에 의해 계산된 순수 스펙트럼과 자동형광(mixed)으로 오염된 "순수" 스펙트럼과의 혼합의 차이를 나타낸다. 차이는 주로 자동 형광 신호를 혼합하지 에서 발생합니다. 적절한 신호 분리(예: GCaMP 스펙트럼에서 자가형광 오염 의 감산)가 없으면, 자동 형광 및 GCaMP 라이브러리 구성 요소는 각 픽셀에서 동일한 스펙트럼 데이터를 위해 경쟁하여 특징적인 구멍이나 다크 스팟을 생성합니다. 자기형광 이미지에서 볼 수 있습니다.
그림 1 : 이미지를 평평한 스펙트럼 응답으로 보정하는 데 사용되는 부적절하고 적절한 보정 요소의 예. (A) 부적절하고 적절한 수정 요인을 플롯. (B) (A)에서 부적절한 보정 계수를 사용하여 생성된 RGB 이미지입니다. (C) 적절한 보정 계수를 사용하는 경우를 제외하고(B)와 동일한 시야로 생성된 RGB 이미지입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 적절한 수집 설정의 중요성을 보여 주는 예제입니다. (A,B) 적절한 수집 시간(A, 100ms)과 동일한 시야에 의해 생성된 RGB 이미지(B, 500ms). RGB 이미지는 가색이 있을 때 동일하게 나타납니다. (C) (A) 및 (B)의 가장 강렬한 영역에서 강도 값을 조사하기 위해 선택한 관심 영역입니다. (D) 100ms 노출 시간 이미지(A, 검정선) 및 500ms 노출 시간(B, 빨간색 선)으로부터 파장당 강도 값을 플로팅합니다. 500 ms 노출 시간의 픽셀 강도는 370 nm에서 검출기 (65,535 AU)의 동적 범위의 한계에 도달했으며 스펙트럼 아티팩트의 결과로 525 nm까지 감소하지 않는다는 점에 유의해야합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 배경 빼기 관심 영역 선택. (A) 원시 파장 합계 강도 이미지입니다. (B) 빨간색으로 표시된 배경 빼기를 위한 픽셀 평균 배경 스펙트럼을 결정하기 위해 선택한 이미지의 영역입니다. (C) 배경감, 보정 및 합산된 강도 이미지입니다. (D) 수정된 이미지(C)의 RGB 색칠. RGB 가색 이미지를 생성하는 프로세스는 그림 4에나와 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : RGB 가색 이미지를 생성하는 프로세스입니다. (A-C) 스펙트럼 수집 범위에 걸쳐 균등하게 간격을 둔 3개의 파장 대역은 거짓 착색을 위해 선택되었다(파란색 = 370 nm, 녹색 = 420 nm, 적색 = 470 nm). (D) 이미지 큐브의 모든 파장 대역에서 픽셀 강도를 추가하여 생성된 합계 강도 이미지입니다. (E-G) 각 가색 조회 테이블이 적용된 패널(A-C)의 이미지입니다. (H) (E-G)의 결과 병합 된 이미지입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 스펙트럼 라이브러리 생성을 위한 단일 레이블 컨트롤의 영역 선택입니다. (A)기도 평활근 (ASM) 세포 자동 형광의 RGB 가색 이미지. (B) 스펙트럼 라이브러리의 자가형광 성분에 대해 선택된 (A)의 영역을 빨간색으로 표시합니다. (C) RGB 가색 ASM 세포는 미토콘드리아 라벨로 표지된다. (D) 스펙트럼 라이브러리의 미토콘디랄 라벨 성분에 대해 선택된 (C)의 적색 영역으로 나타났다. 핵 근처에 국한된 ASM 세포의 자가형광으로 인해, 작은 영역은 핵으로부터 멀리 떨어져 미토콘드리아 라벨 스펙트럼을 식별하기 위해 선택되었다. (E) GCaMP 프로브에 감염된 RGB 가색 ASM 세포. (F) 스펙트럼 라이브러리의 GCaMP 성분에 대해 선택된 (E)의 영역은 빨간색으로 표시됩니다. (D)와 유사하게, 핵으로부터 떨어져 있는 영역을 선택하였다. (G) A-F로부터 얻어진 스펙트럼 라이브러리는, 가장 강한 신호와 파장에서 통일의 값으로 정규화된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 : 각 라이브러리 컴포넌트에서 혼합되지 않은 상대 신호 기여도를 시각화할 수 있는 혼합되지 않은 이미지 데이터의 예입니다. (A-D) GCaMP, 미토콘드리아 라벨, 자가형광 및 오류 용어의 혼합되지 않은 풍부함. (E-G) 각 가색 조회 테이블이 적용된 패널(A-C)의 이미지입니다. (H) 합성, 병합, 가색 이미지입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7 : 적절하게 정의된 스펙트럼 라이브러리에서 총 형광의 평균 강도 및 백분율을 포함한 혼합되지 않은 상대 신호 기여도. (A-D) 자가형광, GCaMP, 미토콘드리아 라벨 및 오류 용어에 대한 혼합되지 않은 풍부함. 오차 기간은 측정된 총 형광 신호의 10% 미만을 포함한다는 점에 유의해야 한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8 : 샘플에 포함되는 것으로 알려진 성분이 누락된 스펙트럼 라이브러리로부터 의 평균 강도 및 총 형광의 백분율을 포함하는 혼합되지 않은 상대 신호 기여도(즉, 정의되지 않은 스펙트럼 라이브러리). (A-C) 자가형광, 미토콘드리아 라벨 및 오류 용어의 혼합되지 않은 풍부함. 스펙트럼 라이브러리에서 GCaMP가 누락되면 도7과 비교할 때 라이브러리 컴포넌트로부터 계산된 상대 신호 기여도뿐만 아니라 오류 용어도 증가했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9 : 샘플에서 누락된 것으로 알려진 추가 성분을 포함하는 스펙트럼 라이브러리로부터 의 평균 강도 및 총 형광의 백분율을 포함하는 혼합되지 않은 상대 신호 기여도(즉, 과도하게 정의된 스펙트럼 라이브러리). (A-E) 자가형광, GCaMP, 미토콘드리아 라벨, 핵 라벨 및 오류 용어의 혼합되지 않은 풍부. 스펙트럼 라이브러리에 핵 라벨을 추가하면 도7과 비교할 때 자동 형광으로부터 계산된 상대 신호 기여도가 감소했습니다. 또한 오류 용어는 올바르게 정의된 스펙트럼 라이브러리에서 지정한 백분율 오류 미만으로 줄어듭니다. 이는 과도하게 정의된 라이브러리가 샘플에서 없는 것으로 알려진 구성 요소에 대한 풍부한 신호가 (실제로) 과도하게 정의하는 아티팩트임에도 불구하고 제대로 정의된 라이브러리보다 실험 데이터에 더 잘 맞을 수 있기 때문입니다. 스펙트럼 라이브러리. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 10 : 적절한 자가형광 오염 신호 빼기 전후에 라이브러리를 사용할 때 혼합되지 않은 이미지의 비교. (a) 6.2.4단계에서 상세히 상세히 설명된 스케일링된 감산 전에 고도로 자가형광기도 평활근 세포에서 단일 라벨 대조군으로부터 유래된 본래의 "순수한" 스펙트럼. (B-D) (A)를 라이브러리로 사용하여 생성된 혼합되지 않은 자동형광, GCaMP 및 핵 라벨 이미지. (E) 고도로 자가형광 기도 평활근 세포에서 단일 라벨 대조군으로부터 유래된 수정된 순수 스펙트럼은 빼기 후. (F-H) (E)를 라이브러리로 사용하여 생성된 혼합되지 않은 자동형광, GCaMP 및 핵 라벨 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 평균 강도(AU) | |||
| 적절한 피팅 | 언더피팅 | 오버 피팅 | |
| 자동 형광 | 187 | 299 | 164 |
| GCaMP | 139 | - | 140 |
| 미토콘드리아 라벨 | 246 | 318 | 248 |
| 핵 라벨 | - | - | 26 |
| RMS 오류 | 53 | 126 | 43 |
| 표준 편차(AU) | |||
| 적절한 피팅 | 언더피팅 | 오버 피팅 | |
| 자동 형광 | 362 | 442 | 315 |
| GCaMP | 168 | 168 | |
| 미토콘드리아 라벨 | 344 | 388 | 345 |
| 핵 라벨 | - | - | 93 |
| RMS 오류 | 62 | 126 | 44 |
| 최대 강도(AU) | |||
| 적절한 피팅 | 언더피팅 | 오버 피팅 | |
| 자동 형광 | 6738 | 7409 | 6738 |
| GCaMP | 1336 | - | 1336 |
| 미토콘드리아 라벨 | 5098 | 5194 | 5098 |
| 핵 라벨 | - | - | 1257 |
| RMS 오류 | 1050 | 1286 | 910 |
| 총 형광의 % | |||
| 적절한 피팅 | 언더피팅 | 오버 피팅 | |
| 자동 형광 | 30% | 40% | 26% |
| GCaMP | 22% | 43% | 23% |
| 미토콘드리아 라벨 | 39% | - | 40% |
| 핵 라벨 | - | - | 4% |
| RMS 오류 | 8% | 17% | 7% |
표 1: 적절한 스펙트럼 라이브러리와 정의되지 않은 또는 과도하게 정의된 스펙트럼 라이브러리의 혼합되지 않은 풍부도 이미지당 평균, 표준 편차 및 최대 혼합되지 않은 풍부도 값과 전체 형광의 백분율을 비교한 테이블입니다. 혼합되지 않은 풍부한 이미지(각 이미지에 대한 최소 혼합되지 않은 풍부한 강도는 항상 0). 그림 7, 그림 8및 그림 9에서가져온 데이터 .
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Discussion
여기-스캐닝 하이퍼스펙트럼 이미징 셋업의 최적 사용은 광경로의 구성에서 시작됩니다. 특히 광원, 필터(튜닝 및 이색), 필터 스위칭 방법 및 카메라의 선택은 사용 가능한 스펙트럼 범위, 가능한 스캔 속도, 검출기 감도 및 공간 샘플링을 결정합니다. 머큐리 아크 램프는 많은 여기 파장 피크를 제공하지만 평평한 스펙트럼 출력을 제공하지 않으며 NIST 추적 가능한 응답(38)으로 스펙트럼 이미지데이터를 다시 보정하기 위해 출력 피크에서 상당한 신호 감소를 요구합니다. Xe 아크 램프 및 백색광 초등부 레이저와 같은 대체 광원은, 여기-스캐닝 하이퍼스펙트럼이미징(38,39,40)에더 적합한 보다 균일한 스펙트럼 출력을 제공할 수 있다. 광원, 튜닝 가능한 필터 및 이색 필터의 선택은 사용 가능한 스펙트럼 범위를 결정합니다. 이 범위는 실험 샘플의 원하는 스펙트럼 정보를 신중하게 고려하여 선택해야 합니다.
또한, 이러한 요인이 잠재적인 샘플링 속도 41에 영향을 미치기 때문에 튜닝 가능한 필터에 사용되는 스위칭 메커니즘과 양자 효율, 픽셀 크기 및 사용 가능한 프레임 속도와 같은 다양한 카메라 요소를 고려해야합니다. ,42,43. 그러나, 다른 모든 요인들은 일정하고, 여기-스캐닝 접근법의 활용은 대부분의 방출 스캐닝 스펙트럼 이미징 접근법21에비해 증가된 감도 및 빠른 이미징 능력을 제공해야 한다.
소개에서 언급했듯이, 하이퍼스펙트럼 이미징은 여기서 획득한 데이터의 연속적이고 스펙트럼적으로 겹치는 특성을 지칭한다. 따라서 시스템의 기능은 필터의 FWHM 거리의 절반 미만인 여기 중심 파장의 간격을 사용하여 데이터를 수집할 수 있어야 합니다. 이전에 보고된 바와 같이, 신중하게 선택된 박막 튜닝 가능한 필터 배열은 중심 파장이 5nm 간격으로 데이터를 수집할 수 있게 해주며, 14-20nm 사이의 FWHM이 있는 필터를 가진 여기 스펙트럼을 오버샘플링하기에 충분한 거리입니다. 이러한 간격은 스펙트랄 데이터 수집에 약간의 중복성을 제공하며 혼합되지 않은 프로세스의 정확도가 향상될 수 있습니다. 정확한 언혼합을 위한 스펙트럼 범위 와 필요한 최소 파장 채널 수의 고려는 이전에 논의되었다44,45,46. 이를 위해, 이러한 필터의 대역폭을 감안할 때, 여기 범위는 이색 빔 스플리터의 컷오프 파장보다 다소 낮은 파장(5-10 nm 이하)에서 끝나도록 선택되어야 한다. 이렇게 하면 여기 조명의 전체 대역폭이 이색 빔 스플리터(예: 495 이색 필터의 경우 360-485 nm)의 차단 파장 아래에 있는 것을 확인하여 여기 방출 크로스 토크를 방지할 수 있습니다.
고속 스펙트럼 이미징 스캔을 달성하기 위해 하드웨어의 각 구성 요소를 독립적으로 제어하는 소프트웨어가 필요합니다. 이 소프트웨어는 셔터를 작동하고, 여기 파장을 선택하고, 실험 조건을 충족하기에 충분히 빠른 속도로 이미지를 수집 할 수 있어야합니다 (정확한 샘플 속도 요구 사항은 실험이 다양하지만 예제 목표는 4 개의 분당 스펙트럼 이미지 스택완료). 더 복잡한 실험은 여러 이색 거울, 목표 또는 XYZ 위치를 사용할 수 있습니다. 데이터 수집47,48에사용할 수 있는 여러 소프트웨어 패키지가 있습니다. Micro-Manager는 다양한 사용자 지정 옵션을 제공하는 현미경 자동화를 위한 무료 오픈 소스 소프트웨어입니다. 또한 Micro-Manager에는 기본 사용자 인터페이스 내에서 사용할 수 없는 추가 사용자 지정을 위한 스크립팅 패널이 포함되어 있습니다. 예를 들어, 필터 휠이 새로운 튜닝 가능한 필터로 회전하는 파장 전환을 제외한 모든 여기 파장에서 튜닝 가능한 필터 스위처의 250ms 지연을 10ms로 줄이는 사용자 지정 스크립트를 사용하여 효과적인 이미징을 줄일 수 있습니다. 대부분의 파장에 대한 파장 당 240ms에 의해 시간. 이 사용자 정의는 4 s 에서 최대 30 파장의 취득을 허용하고있다. 마지막으로, 마이크로-매니저는 MATLAB과 같은 다른 환경과 함께 작동하여 현미경 장치 제어를 더욱 맞춤화할 수 있습니다.
샘플 보기 및 후속 데이터 수집을 위한 적절한 스펙트럼 여기 범위, 수집 시간 및 초기 파장을 결정하는 것은 매우 중요합니다. 그러나 시스템의 개별 구성 요소를 잘못 작동하려면 추가 문제 해결이 필요할 수 있습니다. 광학 경로의 각 구성 요소는 획득한 이미지 데이터에 기여합니다. 따라서 특히 전체 시스템 응답을 최적화하려는 경우 광 경로 내에서 광학 부품의 스펙트럼 응답 및 광학 전송을 확인하는 것이 중요합니다. 광원은 종종 가변 강도 설정을 가지며 전구(40)의 수명 동안 전력이 감소할 수 있다. 샘플이 어둡게 나타나면 광원에서 출력이 감소될 수 있습니다. 마이크로 매니저의 자동 셔터 기능은 우리의 경험에서 100 % 작동하지 않습니다. 신호가 부족하여 셔터가 닫혀 있음을 나타낼 수 있습니다. Micro-Manager의 구성 파일에 저장된 초기 여기 파장은 도1에 표시된 340nm 예제와 같이 스펙트럼 출력이 거의 없거나 전혀 없는 파장으로 기본값일 수 있습니다.
또한 장거리 이색 빔스플리터의 차단 파장 위에 있는 여기 파장을 실수로 선택하는 것은 드문 일이 아니며, 이로 인해 추가적인 크로스 토크 및/또는 여기광이 카메라에 직접 전달될 수 있습니다. 카메라 센서가 손상될 수 있습니다. 유사하게, 전송 화상 진찰을 위한 광 경로를 조정하는 것은 현미경의 구성에 따라서 카메라에 신호의 손실을 초래할 수 있습니다. 또한 그림2에 표시된 것처럼 샘플 보기를 위한 초기 여기 파장 및 노출 시간을 선택하는 것이 적절해 보일 수 있지만 실제로는 다른 여기 파장에서 과포화 된 픽셀을 초래할 수 있습니다. 픽셀 채도가 각 이미지에 대해 확인되지 않는 한 이 사실은 명백하지 않으므로 가장 강렬한 형광을 포함하는 것으로 보이는 샘플 영역에서 테스트 이미지 스택을 수행하는 것이 신중합니다.
또한 배경 영역에 대해 선택한 이미지에 가변 강도가 있을 수 있다는 점도 주목할 필요가 있습니다. 후속 데이터 수정 단계는 샘플의 다른 영역에서 수집된 이미지 데이터에서 이 신호를 빼므로 이러한 영역이 실제로 관련 이미지 데이터를 포함하지 않도록 주의해야 합니다. 때로는 전송 설정을 사용하거나 노출 시간을 크게 늘려 샘플 배경을 측정하기 위해 선택한 영역이 실제로 샘플이 없는지 확인해야 합니다. 마찬가지로 혼합되지 않은 이미지는 자가형광 이미지에 다크 스팟이나 구멍이 있을 수 있습니다. 이는 단일 표지 된 세포에서 "순수한"스펙트럼 신호의 자동 형광 "오염"으로 인한 부적절한 라이브러리 때문일 수 있습니다. 이는 자가형광을 포함하는 샘플에서 수집된 모든 "순수" 스펙트럼 신호가 미량으로도 자동형광 스펙트럼 자체의 일부를 변함없이 포함하기 때문입니다. Mansfield등28,29,30에 의해 여러 경우에 설명 된 바와 같이 적절한 스펙트럼 라이브러리를 보장하기 위해 단일 레이블이 붙은 컨트롤에서 자동 형광 신호를 빼기 위해주의를 기울여야합니다. 31,32
이 문서에서 설명하지는 않았지만, 여기 스캐닝 스펙트럼 이미징 시스템은 여러 초점 평면에서 여러 XY 위치(또는 이미지 스티칭으로 인한 큰 시야)를 통해 타임랩스 이미징 및 이미징에도 사용할 수 있습니다. 이러한 옵션이 단일 실험에 필요한 경우, 획득 순서의 중요성과 광표백의 잠재적 효과에 주의를 기울여야 합니다. 또한 실제 촬영 시간이 예상 시간(예: 이미지 스택이 예상 10초가 아닌 획득하는 데 11초가 걸리는 경우)을 초과하는 경우 Micro-Manager는 선택한 시간 및/또는 위치를 계속 획득합니다. 이러한 오산은 여러 타임포인트와 복합화되고 계산된 시간 샘플링을 변경하여 데이터에서 만든 결론을 왜곡할 수 있습니다.
이 예는 145 nm 여기 스캐닝 범위 내에서 3개의 형광 소스를 분리하는 기능을 보여 준다. 이 시스템을 사용한 이전 실험은 동일한 범위 내에서 최대 5개의 형광 원을 분리할 수 있었습니다. 이 이미지 수집에 필요한 시간은 1분 미만이며, 이는 대부분의 방출 스캐닝 스펙트럼 이미징 시스템보다 훨씬 빠릅니다. 고속 여기 파장 튜닝과 같은 광 경로의 개선은 이 이미징 기술을 비디오 속도 스펙트럼 이미징에 충분한 속도로 발전시킬 수 있습니다.
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Disclosures
Drs. Leavesley와 Rich는 스펙트럼 이미징 기술을 상용화하기 위해 설립된 신생 기업인 SpectraCyte LLC에 대한 재정적 지분을 공개합니다.
Acknowledgments
저자는 NSF 1725937, NIH P01HL066299, NIH R01HL058506, NIH S10OD020149, NIH UL1 TR001417, NIH R01HL1370, AHA 18PRE34060, AHA 18PRE3406016의 지원을 인정하고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Airway Smooth Muscle Cells | National Disease Research Interchange (NDRI) | Isolated from human lung tissues obtained from NDRI | Highly autofluorescent, calcium sensitive cells |
| Automated Shutter | Thorlabs Inc. | SHB1 | Remote-controllable shutter to minimize photobleaching |
| Automated Stage | Prior Scientific | H177P1T4 | Remote-controllable stage for automated multiple field of view or stitched image collection. |
| Automated Stage Controller (XY) | Prior Scientific | Proscan III (H31XYZE-US) | For interfacing automated stage with computer and joystick |
| Buffer | Made in-house | Made in-house | 145 mM NaCl, 4 mM KCl, 20 mM HEPES, 10 mM D-glucose, 1 mM MgCl2, and 1mM CaCl2, at pH 7.3 |
| Cell Chamber | ThermoFisher Scientific | Attofluor Cell Chamber, A7816 | Coverslip holder composed of surgical stainless steel and a rubber O-ring to seal in media and prevent sample and/or objective contamination |
| Excitation Filters | Semrock Inc. | TBP01-378/16 | Center wavelength range (340-378 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.88) |
| Semrock Inc. | TBP01-402/16 | Center wavelength range (360-400 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8) | |
| Semrock Inc. | TBP01-449/15 | Center wavelength range (400-448.8 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8) | |
| Semrock Inc. | TBP01-501/15 | Center wavelength range (448.8-501.5 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.84) | |
| Semrock Inc. | TBP01-561/14 | Center wavelength range (501.5-561 nm), Bandwidth (Minimum 14 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.83) | |
| Fluorescence Filter Cube Dichroic Beamsplitter | Semrock Inc. | FF495-Di03 | Separates excitation and emission light at 495 nm (>98% reflection between 350-488 nm, >93% transmission between 502-950 nm), Filter effective index (1.78) |
| Fluorescence Filter Cube Longpass Filter | Semrock Inc. | FF01 496/LP-25 | Allows passage of light longer than 496 nm ( >93% average transmission between 503.2-1100 nm), Refractive index (1.86) |
| GCaMP Probe | Addgene | G-CaMP3; Plasmid #22692 | A single-wavelength GCaMP2-based genetically encoded calcium indicator |
| Integrating Sphere | Ocean Optics | FOIS-1 | Used for accurate measurement of wide-angle illumination |
| Inverted Fluorescence Microscope | Nikon Instruments | TE2000 | Inverted microscopes allow direct excitation of sample without the need to penetrate layers of media and/or tissue. |
| Mitotracker Green FM | ThermoFisher Scientific | M7514 | Labels mitochondria |
| NIST-Traceable Calibration Lamp | Ocean Optics | LS-1-CAL-INT | A lamp with a known spectrum for use as a standard |
| NIST-Traceable Fluorescein | ThermoFisher Scientific | F36915 | For verifying appropriate spectral response of the system |
| NucBlue | ThermoFisher Scientific | R37605 | Labels cell nuclei |
| Objective (10X) | Nikon Instruments | Plan Apo λ 10X/0.45 ∞/0.17 MRD00105 | Useful for large fields of view |
| Objective (20X) | Nikon Instruments | Plan Apo λ 20X/0.75 ∞/0.17 MRD00205 | Most often used for tissue samples |
| Objective (60X) | Nikon Instruments | Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27 | Most often used for cell samples |
| sCMOS Camera | Photometrics | Prime 95B (Rev A8-062802018) | For acquiring high-sensitivity digital images |
| Spectrometer | Ocean Optics | QE65000 | Used to measure spectral output of excitation-scanning spectral system |
| Tunable Filter Changer | Sutter Instrument | Lambda VF-5 | Motorized unit for automated excitation filter tuning/switching |
| Xenon Arc Lamp | Sunoptic Technologies | Titan 300HP Lightsource | Light source with relatively uniform spectral output |
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